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Variants d'épissage du récepteur sérotoninergique 5-HT4 humain et leurs
applications, notamment pour le criblage
La présente invention a trait à des nouveaux variants d'épissage
s du récepteur sérotoninergique 5-HT4 chez l'homme.
La sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) est un
neurotransmetteur localisé dans le système nerveux central et périphérique
des vertébrés où il exerce différents rôles physiologiques médiés par des
io sous-types distincts de récepteur (Saxena, 1995). Les récepteurs 5-HTd
représentent un membre de la famille des récepteurs à sept domaines
transmembranaires (7TM) couplés à une protéine G qui est positivement
couplée à l'adénylate cyclase (Hedge et Eglen, 1996). Les récepteurs 5-HT4
sont exprimés dans une large variété de tissus incluant le cerveau humain et
is le cerveau des rongeurs (Eglen et al., 1995), le tractus aastro-intestina~
d'humain, de chien, de porc et de rongeur, le coeur de porc et d'humain
(Hedge et Eglen, 1996). Dans le cerveau de mammifère, les récepteurs 5-HT4
contribuent à la sécrétion de dopamine (Bonhomme et al., 1995) et régulent
l'apprentissage et la mémoire à long terme par le biais de la modulation de la
20 libération d'acétylcholine (Marchetti-Gauthier et al., 1997). Dans les
tissus
périphériques, les récepteurs 5-HT4 se sont avérés réguler la motilité du
tractus gastro-intestinal, la sécrétion électrolytique intestinale, ia
sécrétion
surrénale de corticostéroïdes, ia contraction de la vessie et la contractilité
de
l'oreillette (Edge et Eglen, 1996).
Les récepteurs 5-HT4 sont impliqués dans une large variété de
désordres centraux et périphériques incluant les arythmies cardiaques
(Kaumann, 1994) et les désordres neuro-dégénératifs (Reynolds et al., 1996;
Wong et al., 1996). De plus, le développement d'agonistes et d'antagonistes
des récepteurs 5-HT4 peut avoir des applications thérapeutiques dans le
3o système nerveux central pour le traitement de désordres neuro-
psychiatriques
associés à un dysfonctionnement du système dopaminergique central tel que
la maladie de Parkinson (Bonhomme et al., 1995) ou 1e traitement de
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déficiences mnésiques tels que présentées chez les patients atteints de la
maladie d'Alzheimer (Marchetti-Gauthier et al., 1997). De tels médicaments
pourraient aussi ëtre utiles dans le traitement de désordres périphériques
tels
que le syndrome du colon irritable, la gastroparésie, l'incontinence urinaire
et
s les arythmies cardiaques (Hedge et Eglen, 1996).
Les récepteurs 5-HT4 présentent une pharmacologie unique qui
est clairement différente de celle des autres membres de la famille des
récepteurs 5-HT (Ford et Clarke, 1993). La plupart des études
pharmacologiques et transductionneiles sur les récepteurs 5-HT4 ont été
io réalisées sur le système nerveux central et le tractus gastro-intestinal de
rongeurs et chez les coeurs porcin et humain (Eglen et al., 1995 ; Hedge et
Eglen, 1996). Bien que la pharmacologie des récepteurs 5-HT4 présents dans
ces préparations soit très similaire, des différences inexpliquées existent.
Ainsi, les benzamides, tels le renzapride et le cisapride, se comportent comme
is des agonistes puissants et entiers des récepteurs 5-HT4 dans les neurones
des colliculi de ia souris mais sont des agonistes moins puissants et
seulement partiels dans le coeur humain (Fond et Clarke, 1993 ; Hoyer et al.,
1994) et le muscle détruseur isolé à partir de la vessie humaine (Fond et
Clarke, 1993 Hoyer et al., 1994 ; Candura et al., 1996). La 5-
2o méthoxytryptamine (5-MeOT), agoniste 5-HT4, présente une action agoniste
inhabituellement faible pour les récepteurs 5-HT, du muscle détruseur humain
(Candura et al., 1996). Le ML10302, agoniste du récepteur 5-HT4 qui imite
l'effet de la 5-HT sur la relaxation de l'oesophage du rat ainsi que sur la
contraction provoquée électriquement chez l'iléon du cobaye (Langlois et al.,
2s 1994), présente un effet agoniste faible combiné avec un net antagonisme de
la 5-HT sur la réponse AMPc générée par le récepteur 5-HT~e~ humain cloné à
partir de l'oreillette humaine (Blondes et al., 1997) et un effet antagoniste
dans
les neurones du colliculus (Ansanay et al., 1996). De plus, les mécanismes de
désensibilisation pour les récepteurs 5-HT4 sont aussi tissu-dépendants. En
3o effet, une désensibilisation homologue rapide et entière (AMPc
indépendante)
des récepteurs 5-HT4 est observée dans' les neurones des colliculi de la
souris
(Ansanay et al, 1996) et l'oesophage de rat (Rondé et al., 1996) tandis que ce
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type de récepteur est désensibilisé dans une moindre mesure dans l'oreillette
humaine (Kaumann et al., 1991 ).
Le premier récepteur 5-HT4 a été cloné à partir du cerveau de rat
s (Geraid et al, 1995) et deux variants d'épissage (r5-HT4S et r5-HT4~) ont
été
identifiés. Ces variants diffèrent dans la longueur et la séquence de
l'extrémité
carboxy-terminale. La forme longue (r5-HT4~) qui a aussi été clonée dans les
neurones de colliculi de souris (m5-HT4~), a des transcrits dans
approximativement chaque partie du cerveau (Claeysen et al., 1996). Une
io observation intéressante vient de la distribution périphérique des
transcrits de
r5-HT4~ et r5-HT~ chez le rat. Alors que les deux formes sont exprimées dans
le tractus gastro-intestinal (iléon et colon), seul le transcrit r5-HT~ est
trouvé
dans le coeur (Gerald et al., 1995). De plus, r5-HT~ a été trouvé
exclusivement
dans l'oreillette (Gerald et al., 1995). Les homologues humains des récepteurs
is r5-HT4S et r5-HT4~, appelés ici h5-HT~a~ et h5-HT~b~, ont été clonés
récemment. Le récepteur h5-HT~,~ a été cloné à partir de coeur humain
(Blondel et al., 1997 ; Claeysen et al., 1997) ; le récepteur h5-HT~b~ a été
cloné à partir d'une bibliothèque (Van de Wyngaert et al., 1997). Ces deux
récepteurs h5-HT,~a~ et h5-HT~b~ transitoirement exprimés dans les cellules
2o COS-7 présentent un profil pharmacologique 5-HT4 classique. Cependant, les
affinités du récepteur cloné h5-HT~e~ pour les agonistes tels que ML10302,
BIMU1, renzapride et zacopride sont inférieures à celles trouvées dans le
cerveau.
2s Les inventeurs ont à présent montré l'existence de deux
nouveaux sous-types de récepteur à la sérotonine chez l'homme, appelés
récepteurs h5-HT~~~ et h5-HT~d~.
L'analyse des homologies de séquences suggère que les formes
3o h5-HT~a~ et h5-HT,~b~ sont respectivement les correspondants humains des
formes r5-HT~ et r5-HT4~ chez le rat, tandis que les formes h5-HT,~~a et h5-
HT«d~ représentent deux nouvelles isoformes du récepteur. L'isoforme h5-
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HT~~1 présente un nombre élevé de sites de phosphorylation putatifs (un pour
la protéine kinase C, un pour la protéine kinase A/protéine kinase G, et deux
pour la caséine kinase II), tous contenus dans les derniers 25 résidus de la
séquence d'acides aminés.
s La phosphorylation de l'extrémité carboxy-terminale des
récepteurs à sept domaines transmembranaires par la protéine kinase A
régule la désensibilisation du récepteur et l'association du récepteur avec la
protéine G en réponse à des concentrations croissantes d'AMPc (Dohlman et
al., 1991 ).
io De plus, la phosphoryiation du récepteur par des protéines
kinases non-AMPc dépendantes telles que les kinases du récepteur ~i-
adrénergique (~iARK1 et aARK2) ou la rhodopsine kinase permet ia
désensibilisation homologue activée par un substrat dans les récepteurs à
sept domaines transmembranaires tels que les récepteurs (i~- et ~i2-
is adrénergiques (Pei et al., 1994 ; Freedman et al., 1995) et le récepteur 5-
HT2
(Westphal et al., 1995). Le nombre et fa nature des sites de phosphorylation
présents à l'extrémité C-terminale des variants d'épissage de récepteur 5-HT4
sont donc susceptibles d'influencer ia régulation négative de la fonction
récepteur.
20 . Des différences de mécanismes de désensibilisation des
récepteurs 5-HT4 tissu-dépendantes ont été reportées (Ford et Clarke, 1993),
et pourraient ëtre reliées aux profils restreints de l'expression des
isoformes du
récepteur 5-HT4 dans les différents tissus. Ainsi, le mécanisme de
désensibilisation des récepteurs 5-HT4 dans les neurones de colliculi de
souris
2s ressemble à celui décrit pour les récepteurs a-adrénergiques et apparaît
être
indépendant de la voie de l'AMPc. II a été proposé qu'une kinase "aARK-like"
média la phosphorylation spécifique du récepteur 5-HT4 dans ces cellules
neuronales (Ford et Clarke, 1993). La phosphorylation C-terminale de
l'isoforme 5-HT~~~ par la caséine kinase II ou la PKC pourrait ainsi expliquer
la
3o désensibilisation AMPc- indépendante observée dans ces cellules.
La forme 5-HT,~da est caractérisée par une extrémité C-terminale
très courte, avec une séquence codante finissant deux acides aminés après
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Leur. Des similarités de structure entre les extrémités C-terminales 5-HT4 et
l'extrémité C-terminale 5-HT~ (même nombre de variants, incluant une
isoforme riche en sites de phosphorylation et une isoforme tronquée près du
site d'épissage), malgré l'absence d'une homologie de séquence claire,
s suggèrent des similarités dans la régulation de l'activité fonctionnelle
parmi les
récepteurs 5-HT couplés positivement à l'adénylate cyclase.
La présente invention a pour objet un polypeptide isolé constitutif
de variants d'épissage du récepteur humain sérotoninergique dont la
io séquence d'acides aminés est choisie parmi ia séquence SEQ ID N° 2
du
polypeptide variant 5-Hr4c~~, ou la séquence SEQ ID n° 4 du polypeptide
variant
5-HT4cd~, ou tout fragment polypeptidique ou dérivé biologiquement actif de
celui-ci.
is La présente invention concerne donc plus particulièrement un
polypeptide isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5-
HT~~~. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un polypeptide h5-
HT4c~>
ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID n° 2, ou tout fragment
polypeptidique ou dérivé de celui-ci bioiogiquement actif.
2o La présente invention a également pour objet un polypeptide
isolé constitutif du récepteur humain sérotoninergique de type 5-HT4~d~. Plus
particulièrement, l'invention a pour objet un potypeptide h5-HT~d~ ayant la
séquence d'acides aminés SEQ ID n° 4, ou tout fragment polypeptidique
ou
dérivé de celui-ci biologiquement actif.
2s La séquence SEQ ID n°2 représente la séquence d'acides
aminés du polypeptide h5-HT~~~ et la séquence SEQ ID n°4 représente la
séquence d'acides aminés du polypeptide h5-HT~d~.
Par " dérivé ", on entend tout pofypeptide variant du polypeptide
3o de séquence SEQ ID n° 2 ou n°4 ou toute molécule résultant
d'une
modification de nature génétique etlou chimique de la séquence SEQ ID
n° 2
ou n°4, c'est-à-dire obtenue par mutation, délétion, addition,
substitution etlou
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modification chimique d'un seul ou d'un nombre limité d'acides aminés, ainsi
que toute séquence isoforme, c'est-à-dire une séquence identique à la
séquence SEQ ID n° 2 ou n°4, à l'un de ses fragments ou
séquences
modifiées, contenant un ou plusieurs acides aminés sous la forme
s d'énantiomère D, lesdites séquences variantes, modifiées ou isoformes ayant
conservé au moins l'une des propriétés les rendant bioiogiquement actives.
L'expression "biologiquement actif' signifie que le composé
auquel elle se rapporte est capable de se lier à la sérotonine ou à des
ligands
apparentés à la sérotonine etlou de participer à la transduction du signai
induit
io par la sérotonine au niveau de la membrane cellulaire, en particulier à
l'activation de l'adénylate cyclase, etlou capable d'induire des anticorps qui
reconnaissent le polypeptide h5-HT~~~ ou h5-HT~d~ selon l'invention. Des
exemples de ligands apparentés à la sérotonine sont notamment la 5-
méthoxytryptamine, le GR113808, le BlMU1,...
is
L'invention comprend donc également tout polypeptide ayant une
séquence d'acides aminés essentiellement identique à la séquence ID n°
2 ou
n°4 dans laquelle un ou plusieurs résidus ont été substitués de manière
constitutive par un résidu fonctionnellement similaire et qui démontre son
2o habilité à mimer le récepteur h5-HT~~~ ou hSHT~dy comme décrit dans la
présente invention. Des exemples de substitutions conservatives incluent la
substitution d'un résidu hydrophobe tel que l'isoleucine, la valine, la
leucine ou
la méthionine par un autre résidu hydrophobe, la substitution d'un résidu
hydrophile polaire tel que l'arginine par la lysine, fa giutamine par
l'asparagine,
2s la glycine par la serine, la substitution d'un résidu basique comme ia
lysine,
l'arginine ou fhistidine par un autre résidu basique ou la substitution d'un
résidu~acide tel que l'acide aspartique et l'acide glutamique par un autre
résidu
acide.
De même, l'invention comprend tout pofypeptide ayant un ou
3o plusieurs résidus chimiquement dérivés par réaction d'un groupe
fonctionnel.
Les polypeptides de la présente invention incluent aussi tout polypeptide
ayant
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une ou plusieurs additions etlou suppressions de résidus par rapport à la
séquence ID n° 2 ou n°4 dans la mesure où l'activité biologique
est maintenue.
Les polypeptides h5-HT4~~~ et h5-HT,~d~ de la présente invention
peuvent ëtre synthétisés par toutes les méthodes bien connues de l'homme du
métier, y compris les techniques d'ADN recombinant. Les polypeptides h5-
HT4~~~ ou h5-HT~d~ peuvent être synthétisés par les techniques de la chimie de
synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour
des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits
secondaires non désirés et pour sa facilité de production.
io
L'invention a également pour objet la séquence nucléotidique
isolée choisie parmi la séquence SEQ ID n°1, la séquence SEQ iD
n°3, les
séquences nucléotidiques dérivées de la séquence SEQ ID n°1 ou de la
séquence SEQ ID n°3 du fait de la dégénérescence du code génétique, de
is mutation, de délétion, ou d'insertion, et les séquences nucléotidiques
capables
de s'hybrider spécifiquement avec la séquence SEQ 1D n°1 ou la séquence
SEQ ID n°3.
La séquence SEQ ID n°1 représente la séquence nucléotidique
du poiypeptide h5-HT~~~ et la séquence SEQ ID n°3 représente la
séquence
2o nucléotidique du polypeptide h5-HT~d~.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent
être d'origine artificielle ou non. II peut s'agir de séquences d'ADN ou
d'ARN,
obtenues par criblage de banques de séquences au moyen de sondes
élaborées sur la base de la séquence SEQ ID n° 1 ou n°3. De
telles banques
2s peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie
moléculaire,
connues de l'homme de l'art.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent
également ëtre préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes
mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences
30 obtenues par criblage des banques.
Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de
sondes nucléotidiques, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID
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n°1 ou n°3 selon l'invention. Les conditions d'hybridation
appropriées
correspondent aux conditions de température et de force ionique usuellement
utilisées par l'homme du métier, de préférence à des conditions de
température comprises entre (Tm moins 5°C) et (Tm moins 30°C) et
de
s préférence encore, à des conditions de température comprises entre (Tm
moins 5°C) et (Tm moins 10°C) (forte stringence), Tm étant la
température
théorique de fusion, définie comme étant la température à laquelle 50 % des
brins appariés se séparent. De telles sondes font également partie de l'inven-
tion. Elles peuvent ëtre utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la
io détection, par des expériences d'hybridation, notamment d'hybridation "in
situ",
de transcrits spécifiques des polypeptides de l'invention dans des
échantillons
biologiques ou pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anoma-
lies génétiques résultant d'ûn polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais
épissage.
is Les sondes de l'invention comportent au minimum 10
nucléotides, et de préférence au moins 14 nucléotides, préférentiellement au
moins 20 nucléotides, préférentiellement encore au moins 50 nucléotides, et
au maximum comportent la totalité de la séquence nucléotidique SEQ ID
n° 1
ou SEQ ID n°3 ou de leur brins complémentaires. Afin de s'hybrider
2o spécifiquement avec les séquences SEQ 1D n° 1 ou SEQ ID n°3
codant pour
les récepteurs h5-HT~°~ ou h5-HT~d~ respectivement, et non avec les
séquences nucléotidiques codant pour les récepteurs h5-HT~e~ ou h5-HT~b?,
les sondes selon l'invention doivent contenir une séquence spécifique de
l'extrémité 3' des séquences SEQ ID n°1 ou n°3 codant pour les
extrémités C-
2s terminales des récepteurs h5-HT,~°~ ou h5-HT~d}.
Préférentiellement, les sondes de l'invention sont marquées,
préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la
portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent,
radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
3o Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes
nucléotidiques sont mises en oeuvre pour la détection de synthèses
aberrantes ou d'anomalies génétiques, telles que la perte d'hétérozygotie et
le
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réarrangement génique, au niveau des séquences nucléiques codant pour un
polypeptide h5-HT4~~~ ou h5-HT~d~ ou un fragment biologiquement actif, sont
incluses dans la présente invention.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de
l'expression du récepteur humain 5-HT4~~~ ou 5-HT~d~ dans un échantillon
cellulaire ou tissulaire, comprenant les étapes consistant à
- préparer l'ARN dudit échantillon ;
- mettre en contact ledit ARN obtenu avec une sonde ayant une
séquence nucféotidique capable de s'hybrider spécifiquement respectivement
io avec la séquence SEQ ID n°1 ou la séquence SEQ ID n°3, telle
que définie
précédemment ;
- détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde,
indicatrice de l'expression du récepteur h5-HT~~~ ou h5-HT~d~.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de
is l'expression du récepteur humain 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ dans des cellules ou un
tissu par hybridation in situ, comprenant les étapes consistant à
- mettre en contact lesdites cellules ou ledit tissu avec une sonde
ayant une séquence nucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement
respectivement avec la séquence SEQ ID n°1 ou la séquence SEQ ID
n°3,
2o telle que définie précédemment ;
- détecter la présence d'ARNm hybridant avec cette sonde,
indicatrice de l'expression du récepteur 5-HT,~~~ ou 5-HT~dy.
Les sondes d'ADNc de l'invention sont en outre
2s avantageusement utilisables pour la détection d'anomalies chromosomiques.
Les séquences nucléotidiques de l'invention sont égaiement
utiles pour la fabrication et l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques sens
et/ou antisens pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique
selon la technique dite de PCR (réaction de polymérisation en chaînes ou
3o toute autre variante de celle-ci.
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Les séquences nucléotidiques selon l'invention ont par ailleurs
des utilisations dans fe domaine thérapeutique, pour la réalisation de
séquences antisens, capables de s'hybrider spécifiquement avec une
séquence d'acide nucléique, y compris un ARN messager, utilisables en
s thérapie génique. L'invention a ainsi pour objet des séquences antisens
capables d'inhiber, au moins partiellement, la production de polypeptides 5-
HT~~~ ou 5-HT~d~, tels que définis précédemment. De telles séquences sont
avantageusement constituées par celles qui constituent le cadre de lecture
codant pour 5-HT.~~~ ou 5-HT,~d~ au niveau du transcrit.
lo
Les séquences nuctéotidiques selon l'invention peuvent par
ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants ayant
une activité de récepteur 5-HT,~~~ ou 5-HT,~d~ tels que précédemment définis.
Ces polypeptides peuvent ëtre produits à partir des séquences
ls nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de
produits recombinants connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence
nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle
2o est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son
expression, tels que notamment des promoteurs etlou terminateurs de
transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences
2s nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont
choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences
nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à
réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de
l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon tes méthodes couramment
3o utilisées par l'homme du métier, et tes clones en résultant peuvent être
introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par
exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.
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Les vecteurs de clonage etlou d'expression tels que décrits ci-
dessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention
font égaiement partie de la présente invention. Un tel vecteur d'expression
peut ëtre notamment un plasmide (tel que pRcJCMV, disponible chez
s Invitrogen, Carlsbad, CA, ou pUC18, disponible chez Pharmacia, Piscataway,
NJ), un cosmide, un pliage (tel que le pliage Lambda), ou tout type de virus
recombinant
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de
lo manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules
peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes
ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que
défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des
conditions
permettant la réplication etlou l'expression de la séquence nucléotidique
ls transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment les cellules
de mammifères telles que les cellules COS-7, CHO, NIH3T3, HeLa, LM(tk-),
HEK293, etc. Les cellules hôtes peuvent être en particulier des lignées
cellulaires telles que les cellules C6 de gliome.
L'invention a donc plus particulièrement pour objet les lignées
cellulaires exprimant le polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ selon l'invention de
manière stable.
De manière préférentielle, mais non exclusive, les cellules hôtes
2s pour l'expression du récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT,~dy recombinant fonctionnel
expriment des protéines G et des adënylate cyclases, endogènes ou
recombinantes.
Les cellules hôtes selon l'invention sont utilisables dans un
procédé de production d'un polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT~d~, procédé dans
lequel on cultive des cellules transfectées selon l'invention dans des
conditions permettant l'expression d'un polypeptide de séquence SEQ ID
n° 2
ou n°4 ou tout fragment, ou dérivé biologiquement actif de celui-ci, et
que ion
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récupère ledit polypeptide, fragment ou dérivé de celui-ci biologiquement
actif,
que l'on purifie.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du
s métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de
lysats
et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes
utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement,
les
méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anti-
corps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
lo
L'invention a également pour objet des anticorps poly- ou
monoclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués.
Ces anticorps ou fragments sont caractérisés en ce qu'ils sont obtenus à
partir
d'un polypeptide récepteur tel que défini précédemment, dérivé, ou fragment
ls polypeptidique de celui-ci, administré à un animal, et sont capables de
reconnaître spécifiquement un polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT~d~.
Des anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du
sérum d'un animal immunisé contre le récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ selon les
modes opératoires usuels.
2o Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser
comme antigène un fragment peptidique approprié, pouvant ëtre couplé par
l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide,
portant
un épitoge T dépendant. Des lapins sont immunisés avec l'équivalent de 1 mg
de l'antigène peptidique selon la procédure décrite par Benoit et al (1982). A
2s des intervalles de quatre semaines, les animaux sont traités par des
injections
de 200 Ng d'antigène et saignés 10 à 14 jours plus tard. Après la troisième
injection, fanti-sérum est examiné pour déterminer sa capacité à se lier au
peptide antigène radiomarqué à l'iode, préparé par la méthode chloramine-T et
est ensuite purifié par une chromatographie sur colonne échangeuse d'ion
3o carboxyméthyl cellulose (CMC). Les molécules d'anticorps sont ensuite
recueillies dans les mammifères et isolées jusqu'à la concentration souhaitée
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par les méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple, en utilisant
DEAE Sephadex pour obtenir la fraction IgG.
Un autre protocole d'obtention d'anticorps polyclonaux est décrit
dans l'exemple 8.
s Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonai, les anticorps
peuvent ëtre purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant
des polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact
avec le polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante
de façon à faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps
afin
lo de former un complexe immunologique en phase solide.
Les anticorps monoclonaux peuvent ëtre obtenus selon Ja
méthode classique de culture d'hybridomes décrite par KiShier et Milstein
( 1975).
ls Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention sont par
exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des
fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent égaiement se présenter sous forme
d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués. Par exemple, ils peuvent être
associés à une toxine, telle la toxine diphtérique ou à un produit radioactif.
ao Ces immunotoxines peuvent dans ce cas constituer des agents thérapeutiques
utilisables pour le traitement de certaines pathologies impliquant une
surexpression du récepteur 5-HT~~t ou 5-HT~d~.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps
monoclonaux, peuvent également être utilisés pour l'analyse par
2s immunohistochimie des récepteurs 5-HT~~a ou 5-HT,~d~ sur des coupes de
tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or,
immunoperoxydase...
Les anticorps anti-5-HT~~~ ou 5-HT~d~ peuvent être
avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récep
3o teur 5-HT,~~~ ou 5-HT~d~ doit étre observée (surexpression anormale, suivie
de
la régulation de l'expression membranaire, etc.).
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1-4
L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic
in vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de récepteur 5-HT~~~
ou 5-HT~d~ dans un prélèvement biologique et/ou pour la mesure du taux
d'expression de celui-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en contact
d'au moins un anticorps tel que défini précédemment avec ledit prélèvement
biologique dans des conditions permettant la formation éventuelle de
complexes immunologiques spécifiques entre un récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~
et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes immunologiques
spécifiques éventuellement formés.
io L'invention a également pour objet un kit pour le diagnostic in
vitro d'une expression anormale du récepteur 5-HT4~~~ ou 5-HT~d~ dans un
prélèvement biologique etlou pour la mesure du taux d'expression du
récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ dans ledit prélèvement comprenant
- au moins un anticorps spécifique du récepteur 5-HT,~~~ ou S-
is HT4~d~, éventuellement fixé sur un support ;
- des moyens de révélation de la formation de complexes
antigènes/anticorps spécifiques entre ie récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT4~d~ et
ledit
anticorps etlou des moyens de quantification de ces complexes.
2o L'invention a également pour objet l'utilisation du polypeptide 5-
HT,~~~ ou 5-HT~d~ selon l'invention pour détecter la présence d'autoanticorps
anti-récepteur dans des pathologies associées au dysfonctionnement des
récepteurs.
25 L'invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant un polypeptide récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~,
dérivé; ou fragment polypeptidique tel que défini précédemment, une
séquence nucléotidique telle que définie précédemment, ou un anticorps tel
que défini précédemment associé à un véhicule pharmaceutiquement
3o acceptable.
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L'invention a en particulier pour objet une composition
pharmaceutique qui contient un anticorps dirigé contre le récepteur 5-HT4~~~
ou
5-HT~d~, en quantité efficace pour bloquer la liaison des substrats naturels
au
récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
5
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être
notamment administrée par voie orale, parentérale, intraveineuse,
intramusculaire sous-cutanée, percutanée ou par administration intra-nasale.
La préparation de compositions pharmaceutiques qui contiennent
lo des principes actifs dissous ou dispersés dans ces dernières, est bien
connue
de l'homme du métier. Généralement, ces compositions sont préparées sous
la forme de solutions ou de suspensions injectables. Cependant, elles peuvent
aussi être sous des formes solides appropriées pour préparer des solutions,
ou des suspensions extemporanément. Les préparations peuvent aussi être
ls émulsifiées.
Les modes d'administration, les posoiogies et les formes
galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être
déterminés selon les critères généralement pris en compte pour
l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par
2o exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état
général, la
tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.
L'invention a également pour objet une méthode de traitement
thérapeutique chez un sujet atteint de troubles ou désordres qui sont
attenués,
2s votre éliminés, par la réduction de l'expression des récepteurs 5-HT~~~ ou
5-
HT~d~, ladite méthode comprenant l'administration audit sujet d'une quantité
efficace de la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus. La
liaison de l'anticorps au récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ empëche en effet
l'activation du récepteur, et neutralise ainsi les effets d'une surexpression
3o anormale de ces récepteurs.
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L'invention a également pour objet un procédé de criblage de
composés susceptibles de se lier au polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT4~d~ selon
l'invention dans lequel on met en contact lesdits composés avec ledit
polypeptide 5-HT4~~~ ou 5-HT~d~ et on évalue le taux de liaison entre lesdits
s composés et ledit polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT~d~.
Un grand nombre de composés peut ainsi ëtre criblë rapidement
pour tester la capacité de ces composés à se lier au récepteur 5-HT~~~ ou 5-
HT~d~ selon l'invention.
Ces tests de liaison peuvent être également appliqués à la
lo détermination de la présence ou de l'absence de sérotonine dans un
échantillon biologique, ainsi qu'à l'isolement de nouveaux ligands endogènes.
L'invention a donc également pour objet un procédé
d'identification de ligands du récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ comprenant les
étapes consistant à
ls a) mettre en contact un échantillon biologique susceptible de
contenir des ligands du récepteur avec un polypeptide 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ ou
une cellule hôte exprimant ledit polypeptide,
b) isoler les complexes ligand-récepteur formés,
c) identifier les ligands du récepteur 5-HT,~~~ ou 5-HT~d~.
L'invention a également pour objet une méthode de diagnostic in
vitro d'une expression ou d'une accumulation anormale de la sérotonine ou de
ses analogues dans un prélèvement biologique etlou de mesure du taux
d'expression de celle-cilceux-ci dans ledit prélèvement comprenant la mise en
2s contact d'un polypeptide selon l'invention avec ledit prélèvement
biologique
dans des conditions permettant la formation de complexes immunologiques
spécifiques entre un ledit polypeptide et la sérotonine ou ses analogues et la
détection des complexes immunologiques spécifiques formés.
3o Les tests de liaison utilisés dans le cadre de ia présente
invention peuvent être réalisés selon des méthodes bien connues de l'homme
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du métier. On peut notamment marquer préalablement les composés
susceptibles de se lier au polypeptide récepteur, qui peuvent être utilisés
seuls
ou en compétition avec d'autres composés non marqués.
Plus particulièrement, on peut réaliser par exemple des tests de
s liaison compétitifs, des tests de type ELISA ou IRMA.
Dans le cadre de l'invention, on peut utiliser des moyens de
marquage pour détecter le polypeptide récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ selon
l'invention, les anticorps asti-5-HT~~~ ou 5-HT~dy etlou les ligands du
récepteur
l0 5-HT~~~ ou 5-HT,~d~.
Les moyens de marquage utilisés peuvent être notamment un
agent de marquage fluorescent qui se lie chimiquement à des anticorps ou à
des antigènes sans dénaturation pour former un fluorochrome colorant qui est
un indicateur immunofluorescent utile. L'agent de marquage peut aussi être
ls une enzyme, telle que la peroxydase (HRP) ou la glucose oxydase. Des
éléments radioactifs peuvent être également utilisés comme agents de
marquage.
Les inventeurs ont par ailleurs étudié la répartition tissulaire des
Zo quatre différents variants d'épissage du récepteur 5-HT4, à savoir 5-HT~,~,
5
HT~b~, 5-HT4t~~ et 5-HT~d~.
Le profil d'expression de chaque variant d'épissage de 5-HT4
n'est pas restreint à un tissu donné à l'exception de 5-HT~d~ qui se trouve
uniquement dans les intestins. Certains tissus (oreillette humaine, cerveau,
2s intestin) expriment trois ou quatre isoformes 5-HT4, tandis que d'autres
(vessie, rein) expriment seulement une isoforme. Ainsi, la vessie n'exprime
spécifiquement que la forme 5-HT~e~. Dans deux tissus (les ventricules du
coeur et le foie) aucun transcrit codant pour un quelconque variant d'épissage
5-HT4 n'a pu ëtre amplifié. La présence du récepteur h5-HT~d~ exclusivement
3o dans les intestins en fait une cible thérapeutique potentielle pour le
traitement
des troubles digestifs associés à ce récepteur, sans effet secondaire sur les
organes exprimant les autres isoformes. La localisation cérébrale de
l'isoforme
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5-HT~~~, quoique non exclusive, permet d'envisager que cette isoforme
participe aux effets neuronaux de la sérotonine. En effet, il a été montré que
les récepteurs 5-HT4 des neurones de coiliculi de souris, à l'inverse des
récepteurs 5-HT4 de l'oreillette humaine (Kaumann et al., 1991 ), se
s désensibilisent rapidement en présence de sérotonine (Ansanay et al, 1996).
Or, l'isoforme h5-HT~~~ est seule à posséder des sites de phosphorylation suc
son extrémité C-terminale, la rendant plus sensible à la désensibilisation
homologue.
L'invention a ainsi plus particulièrement pour objet l'utilisation
lo d'un polypeptide récepteur 5-HT~~~ selon l'invention pour le criblage de
molécules utiles pour la fabrication de médicament destiné à traiter les
troubles du système nerveux central associés à l'expression anormale du
récepteur 5-HT~~}.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide
ls récepteur 5-HT,~d~ selon l'invention pour le criblage de molécules utiles
pour la
fabrication de médicament destiné à traiter les troubles du tractus gastro
intestinal associés à l'expression anormale du récepteur 5-HT~d~.
Les inventeurs ont en outre étudié le profil pharmacologique des
2o récepteurs 5-HT.~~~ ou 5-HT.~d~ selon l'invention. Tandis que les sous-
types 5-
HT4~e~, 5-HT~b~ et 5-HT~d~ exprimés dans les cellules COS-7 présentent une
capacité similaire au couplage avec fadénylate cyclase quant elles sont
exposées à 5-HT, l'expression de l'isoforme 5-HT~~~ donne une activation
constitutive de l'adénylate cyclase qui résulte dans l'augmentation du niveau
2s basal d'AMPc. Le degré de couplage constitutif est en outre augmenté par la
surexpression de l'isoforme 5-HT~~~ en utilisant plus d'ADN plasmidique pour
la transcription. Un tel couplage constitutif a été décrit dans plusieurs
autres
situations, par exemple ~) dans la famille du récepteur métabotropique au
glutamate, certains variants d'épissage étant couplés spontanément aux
3o protéines G (Prezeau et al:, 1996) ; 2) dans des mutations pathologiques ou
expérimentales spécifiques conduisant à une activité constitutive dans
certains
récepteurs (Coughlin, 1994) ; s) dans la surexpression des récepteurs à 7
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domaines transmembranaires (Kenakin, 1996) tel que le récepteur m5-HT4~
(Claeysen et al., 1996) conduisant à une activation constitutive de Gs.
Tous les sous-types des récepteurs h5-HT4 exprimés dans les
cellules COS-7 présentent un profil de récepteur 5-HT4 classique en termes
d'ordre de puissance de divers ligands sérotoninergiques testés (Noyer et al.,
1994). Aucune différence majeure n'a pu être trouvée entre les isoformes (a),
(b) et (c) en ce qui concerne les constantes d'affinité des agonistes et
antagonistes 5-HT4. Cependant, fisoforme (d) présente toujours une affinité
supérieure pour n'importe quel ligand 5-HT4 testé en comparaison avec les
lo autres isoformes (tableau 1 ). Puisque le récepteur 5-HT~d~ est le plus
court
des quatre isoformes du récepteur, ce résultat suggère que les modifications
de la séquence protéique C-terminale des récepteurs 5-HT4 peuvent induire
des changements dans les propriétés de liaison. La question se pose de
savoir si ces modifications participent à la variabilité des constantes
d'affinité
ls pour les différents ligands 5-HT4 observés dans les différents tissus des
espèces animales (Blondel et al., 1997). Des mécanismes alternatifs pour ces
variabilités peuvent inclure des différences d'espèces pour les isoformes du
récepteur 5-HT4 ou l'existence de variants d'épissage internes (Ullmer et al.,
1995) qui pourraient affecter plus directement le site de liaison au ligand.
L'invention a égaiement pour objet un procédé d'évaluation des
propriétés pharmacologiques des composés capables de se üer au
polypeptide récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT,~d~, appelés ligands du récepteur 5-
HT~~~ ou 5-HT~d~, comprenant les étapes consistant à
a) cultiver des cellules exprimant le polypeptide 5-HT,~~~
etlou 5-HT.~d~, en présence d'au moins un ligand du récepteur 5-HT~~~ etlou 5-
HT~d~ ; et
b) évaluer la capacité du ligand à moduler la transduction du
signal.
Plus particulièrement, on peut évaluer la capacité d'un ligand à
moduler la transduction du signal en déterminant la concentration en
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AMPcyclique (AMP~) intracellulaire formé par l'activation de i'adénylate
cyclase, ou l'activité de l'adényiate cyciase.
Selon une variante de ce mode de réalisation, on peut de
s manière avantageuse cultiver lesdites cellules en présence
- soit de concentrations accrues d'au moins un ligand du
récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ dont la capacité à moduler la transduction du
signal est recherchée et d'une concentration: déterminée d'au moins un
agoniste connu de 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ ;
io - soit de concentrations accrues d'au moins un agoniste connu de
5-HT~~~ ou 5-HT~d~ et d'une concentration déterminée d'au moins un ligand du
récepteur 5-HT~~a ou 5-HT,~d~ dont la capacité à moduler la transduction du
signal est recherchée.
La capacité dudit ligand à moduler la transduction du signal est
is alors évaluée en déterminant de manière quantitative !'expression dudit
gène
rapporteur, en fonction de la concentration dudit ligand.
Les tests biologiques selon l'invention tels que décrits ci-dessus
permettent ainsi d'évaluer le profil pharmacologique des composés testés,
notamment de déterminer si les composés testés sont capables d'agir comme
2o agonistes ou antagonistes du récepteur 5-HT~~~ ou 5-HT~d~ selon
l'invention.
Les présents inventeurs ont ainsi montré que, de manière
surprenante, ML10375, tout en antagonisant la réponse AMPc induite par la 5-
HT médiée par toutes tes isoformes 5-HT4, réduit l'activité adénylate cyclase
2s basale seulement dans les cellules transfectées par le récepteur 5-HT4~~~
et
HT~d~. Ce phénomène est médié par un effet agoniste inverse de ML10375.
Ce phénomène représente le premier de ce genre dans la famille des
récepteurs 5-HT4, et ü suggère que la structure de l'extrémité C-terminale du
récepteur à 7TM peut participer au développement d'un effet agoniste inverse
3o d'un 'antagoniste donné. Le composé ML10375 de formule 4-amino-5-chloro-2-
méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthylpipéridino)éthyl est particulièrement
utile pour la préparation de médicaments à action agoniste inverse envers le
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zi
récepteur 5-HT4~~~ ou 5-HT4~d~. Cette propriété agoniste inverse est
différente
de la propriété d'antagoniste sélectif des récepteurs 5-HT4 déjà connue pour
le
composé ML10375 (demande de brevet EP 683 161 ). En effet, un antagoniste
simple n'agit que par compétition avec le ligand naturel (ia sérotonine) en
s empêchant l'action de ce dernier. L'agoniste inverse peut, quant à lui,
abaisser
une activité trop élevée des récepteurs en !'absence de ligand naturel. Ainsi,
dans le cas d'une surexpression pathologique de récepteurs 5-HT4~~~ ou 5-
HT4~d~ dans le cerveau (pour 5-HT~~~), le coeur (pour 5-HT4~~~) ou la sphère
digestive (pour les 5-HT4~~~ et 5-HT4td~), le ML10375 peut normaliser la
réponse
io en réduisant l'activité intrinsèque des récepteurs. Un tel effet ne peut
être
obtenu par une autre molécule qui agirait comme un simple antagoniste
sélectif de ces récepteurs.
Les exemples et les figures dont les légendes suivent illustrent
l'invention sans la limiter
Zs
LEGENDE DES FIGURES
- La figure 1 A représente les séquences d'acides aminés de
zo l'extrémité C-terminais déduites des variants d'épissage de récepteur 5-HT4
chez le rat et l'homme. Dans les deux espèces, la séquence diverge apr8s
Leur. Les différences d'acides aminés entre le rat et l'homme sont encadrés.
Les cercles blancs correspondent au site consensus protéine kinase, les
cercles noirs au site consensus caséine kinase II et le triangle noir à un
site
2s consensus protéine kinase Alprotéine kinase G. L'astérisque correspond au
codon stop terminal.
- La figure 1 B représente les séquences comparées d'acides
aminés des variants 5-HT4~~~ et 5-HT4~dy.
Les sept domaines transmembranaires potentiels (TM1 à TM7)
3o des protéines sont soulignés, et les sites de phosphorylation putatifs sont
indiqués par des symboles appropriés.
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- La figure 2 représente l'analyse par RT-PCR réalisée avec 50
ng d'ARNm à partir de divers tissus humains. Les produits de PCR ont été
séparés sur un gel d'agarose à 1,5 % et analysés par Southern Blot en
utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique marquée au 32P,
s amorce commune à 5-HT~e~, 5-HT~b~, 5-HT~°~ et 5-HT4~d~. Une
exposition de 8
heures de l'autoradiogramme est présentée. Un contrôle positif a été réalisé
en utilisant des amorces d'actine de rat sur des échantillons d'ARNm traités
avec (+ RT) ou sans (-RT) transcriptase inverse. Les produits de PCR de
l'expérience de contrôle ont été analysés sur un gel d'agarose à 1,5 °~
et une
io photographie du gel coloré au bromure d'éthidium est présentée. Les amorces
de PCR utilisées pour cette analyse sont décrites dans les exemptes 1 et 2.
(O: oreillette, V : ventricule, C : cerveau, G : tractus gastro-intestinal, P
poumon, R : rein, v : vessie).
- La figure 3 représente l'analyse par saturation de la liaison de
is [3H]GR113808 sur des préparations membranaires de cellules COS-7
exprimant des isoformes 5-HT,~a~ (A), 5-HT~b~ (B), 5-HT~°~ (C) et 5-
HT~~~ (D).
Les membranes recueillies à partir des cellules COS-7 transfectées de
manière transitoire ont été incubées avec 8 concentrations de [3H]GR113808
(0,02-3,5 nM) pendant 30 minutes à 25°C. La liaison non spécifique a
été
2o définie par 10 NM de ML10375. Les résultats sont issus d'expérience unique
mais sont représentatives de trois expériences identiques. Les valeurs de IC~,
et B",~ sont déterminées par analyse de régression non linéaire assistée par
ordinateur (GraphPad, Prism software).
- La figure 4 représente l'inhibition de la liaison spécifique de
2s [3H]GR113808 aux récepteurs 5-HT,~$~ (figure 4A), 5-HT.~b~ (figure 4B), 5-
HT4t°~ (figure 4C) et 5-HT~d~ (figure 4D) clonés par 5-HT. Les
membranes des
cellules COS-7 transfectées de manière transitoire ont été incubées avec une
concentration de [3H]GR113808 égale à 50 % de la valeur de Kd de chaque
isoforme du récepteur. La liaison non spécifique a été définie par 10 NM de
3o ML10375. Les résultats sont présentés comme un pourcentage de liaison
spécifique en l'absence de 5-HT : les données ont été analysées par analyse
de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism software).
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23
- La figure 5 représente les réponses d'AMPc à divers agonistes
et antagonistes du récepteur 5-HT4 en utilisant les récepteurs 5-HT4te~, 5-
HT~b~, 5-HT~~~ et 5-HT~d~ exprimés transitoirement dans les cellules COS-7 ou
dans les cellules transfectées " à blanc ". Les cellules ont été préincubées
s avec 5 mM de théophylline et 10 NM de pargyline pendant 15 minutes, puis
incubées avec 1 NM d'agonistes (5-HT : A, C, D et E ; ML10302 : B et C ;
renzapride : B et D) etlou antagonistes (ML10375 : B et E), ou 10 NM de
forskoline (A) pendant 15 minutes. L'effet de l'agoniste ou de l'antagoniste
sur
l'accumulation d'AMPc induite par 5-HT a été testé par addition de l'agoniste
io ou de l'antagoniste pendant la période de 15 minutes de préincubation,
suivi
par l'addition de 5-HT pendant 15 minutes. Les valeurs sont des valeurs
moyennes ~ SEM de 7 à 12 expériences. NS : non significatif : *, p< 0,05 et
"*,
p<0,01.
- La figure 6 représente les réponses d'AMPc de 5-HT (1 NM), de
i3 forskoline (10 NM) et d'antagoniste 5-HT4 ML10375 (1 NM) en utilisant le
récepteur 5-HT~~~ exprimé transitoirement dans les cellules COS-7 ou dans les
cellules transfectées " à blanc " comme contrble. Les cellules sont
transfectées
en utilisant 4 à 8 Ng par puits (A et B), ou 6 Ng par puits (C et D) d'ADN
plasmidique. Les conditions d'incubation sont identiques à celle décrite aux
2o figures 5C et D : les réponses sont étudiées en présence ou en l'absence
d'une préincubation de 16 heures avec PTX (100 nglml). Les valeurs sont des
valeurs moyennes t SEM de 6 à 11 expériences. NS : non significatif : *, p<
0,05et*",p<0,01.
- La figure 7 représente l'analyse par saturation de la liaison de
2s [3H]GR113808 sur des préparations membranaires de cellules CHO exprimant
des isoformes 5-HT~~~ (A) et 5-HT4~d~ (B). Les membranes recueillies à partir
des cellules CHO transfectées de manière stable ont été incubées avec 8
concentrations de [3H]GR113808 (0,01-2,5 nM) pendant 30 minutes à 25°C.
La
liaison non spécifique a été dénie par 10 pM de ML10375. Les résultats sont
3o issus d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences
identiques. Les valeurs de Kd et B,r,~ (fig. 7 C et 7D) sont déterminées par
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2-t
analyse de régression non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism
software).
- La figure 8 représente fes réponses d'AMPc à la sérotonine en
utilisant les récepteurs 5-HT4~~~ et 5-HT4~d~ exprimés de manière stable dans
s les cellules CHO ou dans les cellules transfectées "à blanc". Les cellules
ont
été préincubées avec 5 mM de théophylline et 10 NM de pargyline pendant 15
minutes, puis incubées avec 1 NM de 5-HT. Les résultats sont issus
d'expérience unique mais sont représentatives de trois expériences
identiques.
io - La figure 9 représente un test ELISA sur des sérums de lapins
immunisés avec les peptides correspondant à différentes séquences dërivées
des isoformes du récepteur 5-HT4. Les séquences de ces peptides sont
données dans l'exemple 8.
La figure 9 donne les valeurs en densité optique d'un essai
ts immunoenzymatique sur les peptides respectifs adsorbés (5 Nglml dans un
tampon carbonate à pH=9.5) sur des plaques MAXisorb (Nunc, Danemark).
Les antisérums ont été incubés une heure à 37°C et révélés par un
conjugat
anticorps anti-IgG de lapin de chèvre couplé à la peroxydase (dilution
1/10000) et le substrat HZOz-ARTS (indicateur colorimétrique d'oxydoréduction
2o pour la peroxydase).
- La figure 10 met en évidence par Western blot la présence du
récepteur 5-HT, dans les cellules CHO exprimant de manière stable les
isoformes 5-HT4~a~ (ligne 2) et 5-HT4~~~ (ligne 3). Les cellules CHO ont été
transfectées avec les vecteurs d'expression codant pour les formes (a) et (c)
2s du récepteur 5-HT4 et sélectionnées pour leur résistance à la néomycine.
Cinquante Ng de protéines provenant d'extraits membranaires sont séparés
sur un gel de polyacrylamide à 10% puis transférés sur membrane de
nitrocellulose. Après 16 h d'incubation en présence de 60 Ng d'anticorps anti-
5-HT4 (G21V), le blot est révélé par chimioluminescence (ECL, Amersham) et
3o scanné. La ligne 1 indique le résultat obtenu sur les cellules CHO
contrôles,
ou aucun marquage n'est détecté ; les lignes 2 et 3 proviennent de clones de
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cellules CHO surexprimant respectivement les récepteur 5-HT4~8~ et 5-HT4~~>.
Une bande migrant approximativement à la taille de 60 kDa est visualisée.
- La figure 11 met en évidence par Western blot la présence des
récepteurs h5-HT4 dans les cellules CHO exprimant de manière stable les
s isoformes h5-HT4(c) (figure 11 a) et 5-HT4(d) (figure 11 b}. Les cellules
CHO
ont été transfectées avec les vecteurs d'expression codant pour les. formes
(c)
et (d) du récepteur h5-HT4 et sélectionnées pour leur résistance à la
néomycine. Seize Ng de protéines venant de cellules CHO sont séparés sur un
gel de polyacrylamide à 10% puis transférës sur membrane de cellulose.
io Après 16h d'incubation en présence de 16 Ng d'anticorps anti-h5HT4(c) (anti-
C21 S, figure 11 a) ou anti-5HT4p (anti-C7F, figure 11 b), en absence (18'8
ligne} ou en présence (2"~° ligne) de 50 Ng des peptides
correspondants, les
blots sont révélés par chimioluminescence (ECL, Amersham) et scannés. La
seconde ligne indique les bandes non-spécifiques du rëcepteur, puisque non-
is inhibées par les peptides correspondants. L'anticorps anti-C21 S reconnaît
deux bandes spécifiques à 44 et 60 kDa. L'anticorps anti-C7F reconnaît une
bande spécifique à 40 kDa. La bande à 60 kDa correspond au récepteur
glycosylé, les bandes à 44 et 40 kDa au récepteur non-glycosylé.
EXEMPLE 1
Structure primaire des variants d'épissage du récepteur 5-
HT4 humain
2s
Matériels
Les PCR ont été réalisées sur un appareil GeneAmp 2400
(Perkin Elmer). L'ADN polymérase HiTaq et le tampon associé ont été obtenus
chez Bioprobe Systems. Dans toutes les réactions de PCR, les dNTps et les
amorces spécifiques étaient à une concentration finale de 200 NM et 1 NM,
respectivement. L'ADN double brin a été séquencé avec un kit de séquençage
d'ADN polymérase T7 (Pharmacie) selon les instructions du fabricant.
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1. Amalification rapide et cionaae des extrémités de l'ADNc
La séquence du récepteur humain 5-HT,~e~ caractérisé par
Blondel et al. 1997 a été utilisée pour synthétiser les deux amorces HHT45 [5'-
CGGTGCTTATTTCCTGTAATG-3'] et HTS3 [5'-ATGGTCAACAAGCCCTAC-3']
correspondant au début de la séquence du récepteur et au cinquième domaine
transmembranaire respectivement. Pour obtenir les ADNc à partir des
extrémités 5' générées par ie gène 5-HT4, la technique d'extension par RACE
"amarrée" (anchored-RACE) a été appliquée comme décrit dans Newton et
to Graham, 1994. 50 ng d'ARN total de cerveau humain et d'ileon ont subi une
transcription inverse en utilisant une amorce oligo (dt) contenant deux
séquences d'ancrage et la transcriptase inverse Superscript (GIBCO/BRL).
Les produits de réaction de ces deux tissus ont été ensuite recueillis et
utilisés
comme matrice pour une réaction RACE utilisant l'amorce HHT45 avec la
is première ancre. Le produit de la première réaction PCR a été utilisé comme
matrice pour la réaction dé RACE "nichée" (nested-RACES utilisant l'amorce
HTS3 (modifiée pour inclure une séquence de restriction Hindlll) avec la
seconde "ancre" (contenant une séquence de restriction EcoRl). Ces deux
réactions PCR ont été réalisées au moyen de 25 cycles d'amplification dans
20 les conditions suivantes : dénaturation pendant 1 minute à 94°C,
hybridation
pendant 1 minute à 54°C et extension pendant 2 minutes à 72°C
avec une
extension finale pendant 8 minutes. Les températures d'hybridation étaient de
52°C pour la réaction RACE et de 54°C pour la réaction nested-
RACE. Les
fragments d'ADN ont été séparés sur un gel d'agarose à 1,5 %, clonés dans
2s pGEM-7Z (coupé par HindIIIIEcoRI) et séquencés.
2. Clonage des ADNc de aieine longueur
L'ADNc total correspondant aux variants d'épissage 5-HT~b~, 5
HT~~} et 5-HT.~d~ a été amplifié en utilisant le pool original de
transcription
3o inverse de cerveau humain et d'ileon, et une stratégie de nested-PCR.
L'amorce HHT45 (modifiëe pour inclure un site de restriction Hindlll) a été
utilisée comme amorce sens dans toutes les réactions PCR. Les amorces
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inverses pour le premier cycle d'amplification était F81 [5'-
GCCTCAGGTGAAGAGAAT-3'], F61 [5'-TGGCATTAGGATGGTTTGGTCA-3']
et F71 [5'-GCAATAAGAATTGGCCAC-3'] pour 5-HT4~b~, 5-HT,~°~ et 5-HT~d~
respectivement. Les amorces inverses pour le second cycle d'amplification, qui
s contiennent toutes un site de restriction EcoRl à leur extrémité 5' étaient
F82
[5'-GTCTTCTGGGTCATTGTC-3'], F62 [5'-TTAGGATGGTTTGGTCA-3'] et
F72 [5'-CTCAAGGAGCTCAAAATC-3'] pour 5-HT~b~, 5-HT4~°~ et 5-HT~da
respectivement. Les conditions de PCR étaient les mêmes que celles utilisées
pour les deux cycles d'amplification de RACE-PCR. Les fragments
io correspondants aux ADNc de pleine longueur ont été purifiés sur un gel
d'agarose à 1,5 %, sous-cloné dans pGEM-7Z (coupé par HindIIIIEcoRI) et
séquencés pour confirmer l'intégrité de la séquence codante.
3. Structure primaire des variants d'épissaae du récepteur 5-HTg
is humain.
La séquence d'acides aminés déduite des différents variants
d'épissage est illustrée figure 1 à partir du site d'épissage Leur. A
l'intérieur
de cette région du récepteur, 5-HT,~a~ partage 93 °~ d'identité
protéique avec la
forme courte du récepteur du rat 5-HT~ (Blondel et al., 1997). La région
ao comprise entre Leur et le dernier acide aminé de 5-HT,~b~ présente 74
d'identité protéique avec la région correspondante de ia forme longue du
récepteur du rat 5-HT4~. Cependant, l'extrémité carboxy de 5-HT~b~ s'est
avérée présenter 18 acides aminés de moins que son correspondant chez le
rat, et le site consensus de phosphorylation par la PKC décrit du côté C-
Zs terminal chez le récepteur 5-HT4~ du rat manque (Gérald et al., 1995).
Les variants d'épissage 5-HT~°~ et 5-HT~d~ n'ont jamais été
décrits chez aucune espèce. II est intéressant de noter que l'extrémité
carboxy
du récepteur 5-HT~°~ présente un nombre inhabituellement élevé de sites
de
phosphoryiation putatifs : deux sites caséine kinase II et un site protéique
3o kinase C et une séquence consensus pour la phosphoryfation par ia protéine
kinase Alprotéine kinase G. L'isoforme 5-HT,~d~ correspond à une forme
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ultracourte du récepteur, avec une troncature d'extrémité carboxy seulement
deux acides aminés après le site d'épissage sur la Leu35g.
s EXEMPLE 2
Expression tissulaire spécifique des variants d'épissage de
récepteur 5-HT4
Les expressions des différents transcrits 5-HT4 ont été analysées
io par amplification d'ADNc dérivé d'ARN isolé à partir de divers tissus
humains
en utilisant une technique de nested RT-PCR. La distribution tissulaire a été
examinée en utilisant deux paires d'amorces spécifiques de chaque type de
variants et deux cycles successifs d'amplification de PCR, conformément aux
conditions décrites dans l'exemple 1. Les produits amplifiés ont été
identifiés
is en utilisant une sonde oligonucléotidique interne spécifique (figure 2).
Les
isoformes 5-HT~a~, 5-HT~b~, et 5-HT~~i sont tous exprimés dans l'oreillette,
le
cerveau et les intestins. La vessie et le foie expriment chacun des niveaux
détectables de seulement un sous-type de récepteur (5-HT~e~ et 5-HT4~b~
respectivement}. L'expression de 5-HT~d~ a été détectée uniquement dans les
20 intestins. Enfin, les ventricules et les poumons n'expriment pas de
quantités
détectables d'un quelconque isoforme 5-HT4. II a été également démontré la
présence dans tous les tissus d'ADNc correspondant au gène de ø-actine
exprimé de manière constitutive, ainsi que l'absence de produits de PCR de ~i-
actine dans des expériences de contrôle sans transcriptase inverse (figure 2).
2s
EXEMPLE 3
Caractérisation pharmacologique des variants d'épissage
des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules
3o COS-7
Matériels
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Le PEI (polyéthylèneimine MW 800 Ko} a étë obtenu chez Fluka
(L'Isle d'Abeau Chesnes, France). ML 10302 (4-amino-5-chloro-2-
méthoxybenzoate de 2-{1-pipéridinyl)éthyl) et ML 10375 (4-amino-5-chloro-2-
méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthylpipéridino}éthyl) ont été synthétisés
s selon Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997. GR113808 (1-méthyl-1H-
indole-
3- carboxylate de ([1-[2-(méthylsulfonyi)aminoJéthyl]4-pipéridinyl]méthyl a
été
obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware, Hertfordshire, U.K.) et
[3H]GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham (Arlington, Heights,IL).
io 1. Transfection de l'ADN
La région codante entière des ADNc de 5-HT,~a~, 5-HT,~b~, 5-HT~°~
et 5-HT~d~ a été sous-clonée dans un vecteur d'expression de mammifère
pRCICMV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Les transfections ont été réalisées en
utilisant le polyéthylènimine (PEI) tel que décrit dans Boussif et ai. (1995).
Les
is cellules ont été transfectées en utilisant un mélange d'ADN et de PEI dans
un
rapport de 20 Nmoi de PEl/mg d'ADN dans 0,9 °~ de NaCI. Pour les tests
de
liaison aux radioligands, tes cellules COS-7 ont été ensemencées un jour
avant la transfection dans des flacons de culture de 1,5 x 104 mm2 à une
densité de 1 x 10' celluleslflacon, incubées pendant six heures avec de l'ADN
2o plasmidique (150 Nglflacon) et recueillies 48 heures après transfection.
Pour la
mesure de la formation d'AMPc, les cellules COS-7 ont été ensemencées un
jour avant la transfection sur des plaques à douze puits à une densité de 5 x
105 ceilules/puits, incubées pendant six heures avec de l'ADN plasmidique (4
à 8 Nglpuits selon les expériences), et testées 24 heures après la
transfection.
2s Les cellules transfectées avec les constructions d'ADNc du récepteur 5-HT4
ont été comparées avec les cellules transfectées " à blanc" qui ont été
exposées au plasmide pRCICMV non modifié.
2. Préparation membranaire
so Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un
radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules
ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le
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culot a été resuspendu dans 2,5 ml de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4)
et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite
centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le culot résultant a
été
resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4). Les
s préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées
dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les
concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al.,
1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard.
io 3. Tests de liaison du radioliaand
Les études de liaison du radiofigand ont été réalisées dans 50.0
NI de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) contenant 20 NI d'un agent compétiteur
(pour les études de compétition de drogues), ou de ML 10375, pour donner
une concentration finale de 10 NM (pour la détermination de la liaison non
is spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et
20 NI
de [3H]GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de
i~, et 50 NI (100-200 Ng) de préparation membranaire. Les études de
saturation ont été conduites en utilisant [3H]GR113808 à 9 concentrations
différentes aüant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25°C
pendant
20 30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à
travers
un papier filtre Whatman GFIB en utilisant le récolteur de cellules 48R
Brandel. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour
réduire la liaison aux filtres. Les fitres ont été ensuite lavés avec un
tampon
glacé (50 mM Tris-HCI, pH 7,4) et placés une nuit dans 4 ml de cocktail de
2s scintillation "ready safe" (Beckman, Fullerton, CA). La radioactivité a été
mesurée en utilisant un compteur de scintillation liquide Beckman LS 6500 C.
Les données de liaison ont été analysées par analyse de régression non
linéaire assistée par ordinateur (Graph Pad Prism Program, Graph Pad
Software, Inc., San Diego, CA).
4. Résultats des tests de liaison
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L'analyse de saturation utilisant [3H]GR113808 a révélé des sites
de haute affinité saturables, uniques pour les quatre variants d'épissage du
récepteur (figure 3). Les valeurs similaires de Kd pour [3H]GR113808 ont été
trouvées entre les quatre isoformes (5-HT4te~, 0,23 ~ 0,06 ; 5-HT4~b~ 0,62 ~
0,05;
s 5-HT~~~ 0,30 ~ 0,08 ; 5-HT~d~ 0,14 ~ 0,05 nM). Cependant, la densité des
récepteurs exprimés transitoirement dans les cellules COS-7 (B~) varie
largement entre les tests de transfection {5-HT~e~, 214 ~ 10 ; 5-HT~b~ 1411 ~
55 ; 5-HT~~~, 77,5 t 5,8 ; 5-HT~d~ 31,4 ~ 2,8 fmollmg de protéine). La liaison
non spécifique augmente non linéairement avec l'augmentation de la
lo concentration en ligand (figure 3). Une série d'agonistes et d'antagonistes
5-
HT4 inhibe complètement la liaison spécifique de [3H]GR113808 à tous les
isoformes clonés du récepteur 5-HT4. Toutes les courbes de déplacement sont
monophasiques, donnant un coefficient de Hill de 0,6 à 1,1. Les données
résumées au tableau I démontrent que les profils pharmacologiques de toutes
ls les isoformes clonées des récepteurs 5-HT4,en terme d'ordre des puissances
des ligands testés, sont très similaires à ceux trouvés pour les récepteurs 5-
HT4 étudiés in situ dans l'oreillette de l'homme (Kaumann et al., 1996) et
l'oreillette du porcelet {Kaumann et al., 1995) ; le striatum humain {Reynolds
et
al., 1995) et le noyau caudé humain (Waeber et al., 1993), le striatum de rat
20 (Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997) et le striatum de cochon d'fnde
(Ansanay et al., 1996) ; les colliculi de souris (Ansanay et al., 1996) ou
après
expression des isoformes clonées dans des fibroblastes cultivés (r5-HT4~
(Gérald et al., 1995 ; Adham et al., 1996) ; m5-HT4~ (Claeysen et al., 1996).
On
peut par ailleurs noter que, alors que chacun des composés testés se liait aux
2s isoformes a, b et c du récepteur 5-HT4 avec une affinité similaire,
l'affinité pour
fisoforme 5-HT~d~ était le plus souvent supérieure d'un facteur de 2 à 4
(tableau I).
3o EXEMPLE 4
Stimulation de la production d'AMPc par les variants
d'épissage 5-HT4 exprimés de manière transitoire dans les cellules COS-1
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Matériels
DMEM a été obtenu chez GIBCO-BRL. La toxine pertussique
(PTX) a été obtenue chez Calbiochem, BIMU1 (endo-N-8-méthyi-8-
j azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)-2,3-dihydro-3-éthyl-2-oxo-1H-benzimidazole-1-
carboxamide) et le zacopride (4-amino-5-chioro-2-méthoxy-N-{1-
azabicyclo[2,2,2]octo-3-yl)benzamide, HCI), ont été synthétisés en laboratoire
par les auteurs de la présente invention. Le renzapride (BRL 24924) (~) endo-
4-amino-5-chloro-2-méthoxy-N-{1-azabicyclo[3.3.1]non-4-yl)benzamide, HCl) a
io été obtenu chez SmithKline Beecham. La 5-hydroxytryptamine (5-HT), la 5-
méthoxytryptamine (5-MeOT) ont été obtenus chez Aldrich (L'Isle d'Abeau
Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez Sigma
(L'Isle d'Abeau Chesnes, France).
is 1. Mesure de la formation d'AMPc
Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les
cellules COS-7 transfectées de manière transitoire sont incubées 24 heures
après transfection dans du milieu de Eagle modifié par Dulbelcco (DMEM)
contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 NM de pargyline
2o pendant 15 minutes à 37°C en présence de 5 % de C02. La 5-HT (1
~rM), ou
d'autres agents sérotoninergiques (1 NM) ou la forskoline (10 NM) ont été
ajoutés et incubés pendant 15 minutes supplémentaires à 37°C en
présence
de 5 % de C02. La réaction a été stoppée par aspiration du milieu et addition
de 500 NI d'éthanol refroidi dans de la glace. Après une heure à température
2s ambiante, les cellules ont été grattées et l'ensemble a été recueilli et
lyophilisé. Le culot a été resuspendu dans 350 girl de PBS et centrifugé
pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été quantifié dans le surnageant en utilisant
un test radioimmunologique (E.R.LA. kit de dosage de Pasteur Diagnostics
79830). Les tests t de Student ont été réalisés en utilisant le logiciel Quick
3o TTEst.
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33
2. Stimulation de la production d'AMPc.
Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à
être couplés à l'adénylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des
cellules COS-7 transfectées transitoirement avec les ADNc de 5-HT~a~, 5-
s HT4~b~, 5-HT~o~, et 5-HT~d~. Les valeurs d'AMPc basales n'étaient pas
significativement différentes dans les cellules transfectées " à blanc" et les
cellules exprimant les récepteurs 5-HT~e~, 5-HT~by et 5-HT~d~, indiquant que
ces isoformes exprimées du récepteur n'avaient pas d'activité intrinsèque
quant à la formation d'AMPc dans des cellules transfectées transitoirement en
io l'absence d'agonistes (figure 5a). Cependant, l'expression transitoire de
l'isoforme 5-HT~°~ a conduit à une augmentation significative du niveau
d'activité basal de l'adénylate cyclase en l'absence d'agonistes 5-HT4 (figure
5a). Le dernier résultat indique que l'expression de 5-HT~°~ dans le
système
décrit génère un état de réceptéur spontanément actif. La 5-HT (1 NM) n'a pas
is d'effet sur l'activité basale d'adénylate cyclase dans les cellules COS-7
transfectées "à blanc" (figure 5a), indiquant que les récepteurs
sérotoninergiques couplés à l'adénylnate cyclase endogènes ne sont pas
présents dans ces cellules. Dans les cellules exprimant 5-HT~B~, 5-HT~b~, 5-
HT~°~, et 5-HT~d~, l'addition de 5-HT (1 NM) augmente
significativement la
20 concentration d'AMPc de 82 %, 85 %, 64 °~ et 77 % respectivement
(figure
5a). La forskoline (10 NM), un activateur direct de l'adénylate cyclase,
induit
des augmentations similaires des concentrations d'AMPc dans les cellules
exprimant les isoformes du récepteur 5-HT4 et dans les cellules COS-7
transfectées "à blanc" (figure 5A) indiquant que le potentiel d'activation
2s maximale de l'adénylate cyclase n'a pas été affecté dans les cellules
exprimant les récepteurs 5-HT4. Les agonistes des récepteurs 5-HT4
ML10302 et renzapride, et l'antagoniste des récepteurs 5-HT4, ML10375 n'a
pas d'effet significatif sur les niveaux d'AMPc basais dans les cellules COS-7
transfectées "à blanc" (figure 5B). Dans les cellules exprimant les isoformes
du
3o récepteur 5-HT4, ML10302 se conduit comme un agoniste 5-HT4 faible, et
présente seulement 28 à 34 % de l'effet stimulateur de 5-HT (figure 5C), en
dépit d'une haute affinité pour le récepteur (tableau 1 ). En outre, la
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3.1
préincubation des cellules avec 1 NM de ML10302 préalablement à l'addition
de 5-HT ( 1 NM) antagonise significativement la capacité de 5-HT à augmenter
les niveaux d'AMPc basais (figure 5C). Comme décrit par Blondel et al. (1997),
ie renzapride se conduit aussi comme un agoniste 5-HT4 faible dans les
s cellules exprimant i'isoforme du récepteur 5-HT~ay et augmente la formation
d'AMPc par seulement 5fi % dans ces cellules (figure 5D), en dépit d'une
affinité pour le récepteur 5-HT~ay similaire à celle de 5-HT (tableau 1 ).
Cependant, le renzapride se comporte comme un agoniste total dans les
cellules exprimant les isoformes 5-HT4~by, 5-HT4~°y et 5-HT~dy, dans la
mesure
io où la formation d'AMPc induite par le renzapride médiée par ces variants
d'épissage du récepteur, n'était pas significativement diff~rente de la
formation
d'AMPc induite par la 5-HT (figure 5D). L'antagoniste 5-HT4, ML10375, (Yang
et al., 1997) à une concentration de 1 ~rM n'avait pas d'effet significatif
sur les
niveaux basais d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes de
is récepteurs 5-HT~ay et 5-HT~by mais a réduit significativement les niveaux
basais d'AMPc dans les cellules exprimant les isoformes des récepteurs 5-
HT4~°y et 5-HT.~dy (par respectivement 21 °~ et 24 °~,
figure 5E). De plus, la
préincubation des cellules exprimant les isoformes de récepteur 5-HT4 avec 1
pM de ML10375 préalablement à l'addition de 5-HT (1 NM) antagonise la
2o capacité de 5-HT d'augmenter significativement les niveaux d'AMPc basais
(figure 5E).
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TABLEAU 1: Comparaison des affinités de liaisons de divers agonistes et
antagonistes des récepteurs 5-HT4 sur les récepteurs 5-HT~ay, 5-HT~by, 5-
HT4~~y et 5-HT~dy.
K; (nM)
5-HT,~ey 5-HT~by 5-HT~~y 5-HT,~dy
5-HT 772 f 278 1151 170 481, 9 112 330 113
5-MeOT 2080 t 508 2443 510 1020 236 553 149
ML10302 8,4 1,5 10,72 t 2,9 7,98 2,77 3,69 1,25
BIMU1 373 119 123,4 9,0 66 t 8,37 38,85 12
Renzapride 635 148 1179 142 636 91 173 40
Zacopride 7750 t 1615 11490 950 10630 2160 3599 1835
GR113808 0,33 0,033 0,53 t 0,10 0,41 t 0,13 0,078 t 0,24
ML10375 0,56 t 0,11 1,62 t 0,82 0,61 0,08 0,41 0,10
s
Les expériences correspondent à la compétition de divers
composés pour la liaison de [3H]GR113808 à des membranes de cellules
COS-7 transfectées de manière transitoire. Pour chaque isoforme du récepteur
5-HT4 humain, la concentration de [3H]GR113808 a été ajustée à 50 °r6
de la
io valeur du Kd. Les estimations d'affinité sont données comme des valeur de
K;
en nM et sont déterminées à partir de valeur ICI obtenues par analyse de
courbe non linéaire assistée par ordinateur (GraphPad, Prism Software). Les
valeurs de K, sont représentatives d'au moins deux déterminations. L'ordre des
puissances des drogues testées est identique pour les quatre isoformes 5-HT4
is et sont : GR113808 > ML10375 > ML10302 > BIMU1> Renzapride = 5-HT> 5-
MeOT> Zacopride.
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36
EXEMPLE 5
ML10375 : Agoniste inverse du récepteur 5-HT4
ML10375 est capable de réduire les niveaux d'AMPc dans les
cellules exprimant les isoformes 5-HT~°~ et 5-HT.~d~ en l'absence d'une
quelconque simulation du récepteur par des agonistes 5-HT4. Pour tester
l'hypothèse que ML10375 puisse constituer un agoniste inverse pour le
récepteur 5-HT4 humain, l'isoforme 5-HT~o~ a été surexprimée dans des
io cellules COS-7 afin d'augmenter la fréquence de l'état du récepteur
spontanément actif. Les cellules COS-7 ont été transfectées avec 4 à 8 pg
d'ADN plasmidique par puits afin d'obtenir une augmentation des niveaux
d'expression du récepteur 5-HT4~°~. La transfection des cellules COS-7
en
utilisant 4 Ng et 8 Ng d'ADN plasmidique a augmenté le niveau basal d'AMPc
i; de 59 % et de 235 °~ respectivement (figure 6A). La 5-HT (1 NM) a
induit une
augmentation de 64 % du niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées
avec 4 Ng d'ADN plasmidique mais n'a pas augmenté significativement le
niveau basal d'AMPc dans les cellules transfectées avec 8 Ng d'ADN
piasmidique (figure 6A). Ce dernier résultat indique que dans les cellules
2o surexprimant l'isoforme du récepteur 5-HT~o~, la fréquence du récepteur
spontanément actif empëche l'effet stimulateur de la 5-HT sur l'activité
adénylate cyclase. La forskoline (10 NM) a induit des augmentations similaires
des concentrations en AMPc dans les cellules transfectées par soit 4 Ng soit 8
Ng d'ADN plasmidique et dans les cellules transfectées "à blanc" (figure 6A),
2; indiquant que le potentiel d'activation maximal de l'adénylate cyclase n'a
pas
été affecté dans les cellules surexprimant fisoforme 5-HT~°~. Dans les
cellules
COS-7 transfectées avec 4 Ng et 8 Ng d'ADN plasmidique, ML10375 (1 NM) a
diminué les valeurs basales d'AMPc de 24 °~ et 62 %, respectivement
(figure
6B). Dans les cellules transfectées avec 4 Ng d'ADN pfasmidique, la
3o préincubation avec ML10375 (1 NM) a antagonisé l'effet stimulateur de 5-HT
(1
NM) sur l'AMPc basal (figure 6B). Dans les cellules transfectées avec 8 Ng
d'ADN plasmidique, la préincubation avec ML10375 (1 NM) a induit une
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diminution de 47 % du niveau d'AMPc basal même en présence de 1 NM de 5-
HT (figure 6B).
Pour tester si l'effet de ML10375 sur le niveau d'AMPc
correspond à une activation des récepteurs 5-HT4~~~ spontanément actifs ou à
s une inhibition de l'activité adénylate cyclase par la voie régulatrice
médiée par
la protéine Gi, l'effet de ML10375 a été examiné dans les cellules COS-7
transfectées avec 6 Ng d'ADN plasmidique 5-HT4~~~ en présence ou en
l'absence de PTX (100 nglml). Le traitement par PTX n'a modifié ni le niveau
basal d'AMPc ni la stimulation d'AMPc induite par la 5-HT et la forskoline
dans
io les cellules transfectées (figure 6C). De plus, le traitement par PTX n'a
pas
modifié significativement la réduction d'AMPc basal induite par ML 10375 dans
les cellules transfectées (figure 6D).
is EXEMPLE 6
Caractérisation pharmacologique des variants d'épissage
des récepteurs 5-HT4 exprimés de manière stable dans les cellules CHO
Matériels
Zo Le milieu HAM-F12 a été obtenu chez Gibco-BRL. ML 10375 (4-
amino-5-chloro-2-méthoxybenzoate de 2-(cis-3,5-diméthyipipéridino)éthyl) a
été synthétisé selon Langlois et al., 1994 ; Yang et al., 1997. GR113808 {1-
rnéthyi-1H-indole-3-carboxylate de ([1-[2-(rnéthylsulfonyl)amino]éthyl]4-
pipéridinyl]méthyl) a été obtenu grâce au groupe de recherche Glaxo (Ware,
2s Hertfordshire, U.K.) et [3H]GR113808 a été obtenu auprès d'Amersham
(Arüngton, Heights,IL). L'électroporateur utilisé était un Gene Pusler obtenu
auprès de Biorad.
1. Transfection de l'ADN
3o La région codante entière des ADNc de 5-HT~°~ et 5-HT,~d~ a été
sous-clonée dans un vecteur d'expression de mammifère pRC/CMV
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Les cellules CHO sont transfectées de façon
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stables par électroporation (250 V, 960 NF) avec le plasmide PRcICMV
contenant le clone h5-HT~°~ ou h5-HT~d~ coupé par l'enzyme de
restriction
Kpn1 (10Ng de plasmide pour 10' cellules). Les cellules sont cultivées dans du
milieu HAM-F12 complémenté avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par
s la chaleur. Après 48 heures, la généticine (1.25 mg/ml) est ajoutée dans le
milieu. Douze jours plus tard, les clones sont individualisés et cultivés dans
des plaques 12 puits. La sélection des clones s'effectue en étudiant la
stimulation de I'AMPc formé en présence de 1 NM de sérotonine. Pour les tests
de liaison aux radioligands ou pour la mesure de la formation d'AMPc, les
io cellules transfectées avec les constructions d'ADNc des récepteur 5-HT4 ont
été comparées avec les cellules transfectées "à blanc" qui ont été exposées
au plasmide pRCICMV non modifié.
2. Préparation membranaire
is Chaque flacon de cellules destinées aux tests de liaison avec un
radioligand a été lavé deux fois avec un tampon phosphate (PBS). Les cellules
ont été grattées, recueillies et centrifugées à 300 g pendant cinq minutes. Le
culot a été resuspendu dans 2,5 ml de tampon HEPES glacé (50 mM, pH 7,4)
et homogénéisé avec un broyeur de tissus Ultraturax. Le lysat a été ensuite
20 centrifugé à 40 000 g pendant 20 minutes à 4°C. Le culot résultant a
été
resuspendu dans 15 volumes de tampon HEPES (50 mM, pH 7,4). Les
préparations membranaires ont été conservées dans de la glace et utilisées
dans les deux heures pour des tests de liaison avec radioligands. Les
concentrations protéiques ont été déterminées par la méthode de Lowry et al.,
2s 1951 en utilisant de la sérum albumine bovine comme standard.
3. Tests de liaison du radioliaand
Les études de liaison du radioligand ont été réalisées dans 500
pl de tampon (HEPES 50 mM, pH 7,4) 20 pl de ML 10375, pour donner une
3o concentration finale de 10 uM (pour la détermination de la liaison non
spécifique) ou d'un tampon (pour la détermination de la liaison totale) et 20
NI
de [3H]GR113808 pour donner une concentration finale de 50 % de valeurs de
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Kd et 50 NI (100-200 Ng) de préparation membranaire. Les études de
saturation ont été conduites en utilisant [3H]GR113808 à 9 concentrations
différentes allant de 0,01 à 3,5 nM. Les tubes ont été incubés à 25°C
pendant
30 minutes. La réaction a été stoppée par filtration rapide sous vide à
travers
s un papier filtre Whatman GFIB en utilisant le récolteur de cellules 48R
Brandel. Les filtres ont été prétrempés dans une solution de PEI (0,1 %) pour
réduire la liaison aux filtres. Les filtres ont été ensuite lavés avec un
tampon
glacé (50 mM Tris-HCI, pH 7,4) et placés une nuit dans 4 ml de cocktail de
scintillation "ready safe" (Beckman, Fullerton, CA). La radioactivité a été
io mesurée en utilisant un compteur de scintillation liquide Beckman LS 6500
C.
Les données de liaison ont été analysées par analyse de régression non
linéaire assistée par ordinateur (Graph Pad Prism Program, Graph Pad
Software, Inc., San Diego, CA).
is 4. Résultats des tests de liaison
L'analyse de saturation utilisant [3HjGR113808 a révélé des sites
de haute affinité saturables, uniques pour les deux variants d'épissage du
récepteur (figure 7). Les valeurs similaires de ICd pour [3H]GR113808 ont été
trouvées entre les deux isoformes (5-HT,~°~, 0,42 t 0,04 nM ; 5-HT~d~,
0,23 ~
20 0,03 nM). La densité des récepteurs exprimés dans les cellules CHO (Bm,~)
est
de 568.1 t 17.4 fmollmg de protéine pour 5-HT4~~~, et 179.9 t 5.8 fmol/mg de
protéine pour 5-HT,~d~. La liaison non spécifique augmente non linéairement
avec l'augmentation de la concentration en ligand (figure 7).
EXEMPLE 7
Stimulation de la production d'AMPc par les variants
d'épissage 5-HT4 exprimés de manière stable dans les cellules CHO
3o Matériels
Les milieux DMEM et HAM-F12 ont étë obtenus chez GIBCO-
BRL. La 5-hydroxytryptamine (5-HT) a été obtenue chez Aldrich (L'Isle
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.l0
d'Abeau Chesnes, France) et toutes les autres drogues ont été obtenues chez
Sigma (L'Isle d'Abeau Chesnes, France).
1. Mesure de fa formation d'AMPc
3 Pour la mesure de l'accumulation d'AMPc intracellulaire, les
cellules CHO transfectées de manière stable sont incubées dans le milieu
HAM-F12 contenant 5 mM de théophylline, 10 mM de HEPES et 10 NM de
pargyline pendant 15 minutes à 37°C en présence de 5 % de C02. La 5-HT
(1
NM) a été ajoutée et les cellules incubées pendant 15 minutes
io supplémentaires à 37°C en présence de 5 °~ de C02. La
réaction a été
stoppée par aspiration du milieu et addition de 500 NI d'éthanol refroidi dans
de la glace. Après une heure à température ambiante, les cellules ont été
grattées et l'ensemble a été recueilli et lyophilisé. Le culot a été
resuspendu
dans 350 girl de PBS et centrifugé pendant 5 min à 300 g. L'AMPc a été
is quantifié dans le surnageant en utilisant un test radioimmunologique
(E.R.LA.
kit de dosage de Immunotech, Marseille). Les tests t de Student ont été
réalisés en utilisant le logiciel Quick TEst.
2. Stimulation de la production d'AMPc.
2o Pour examiner et comparer la capacité des récepteurs 5-HT4 à
être couplés à fadénylate cyclase, la synthèse d'AMPc a été testée dans des
cellules CHO transfectées de manière stable avec les ADNc de h5-HT,~°~
et
h5-HT~d~. Les valeurs d'AMPc basales étaient supérieures dans les cellules
exprimant les récepteurs h5-HT~°~ (9,8 ~ 1,6 pmoieslpuits) et h5-HT~d~
(12,1 t
2s 0,9 pmoleslpuits) que dans les cellules transfectées "à blanc" (3,6 ~ 0,4
pmol/puits), indiquant que ces isoformes exprimées du récepteur possèdent
une activité intrinsèque quant à la formation d'AMPc dans des cellules
transfectées de manière stable, en l'absence d'agoniste. Dans les cellules
exprimant h5-HT~°~ et h5-HT~d~, l'addition de 5-HT (1 NM) augmente
3o significativement la concentration d'AMPc (respectivement de 91 % pour h5-
HT~~~ et de 118% pour h5-HT,~d~, figure 8) alors que la 5-HT n'a pas d'effet
sur
les cellules CHO transfectées " à blanc " (figure 8).
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.~ 1
EXEMPLE 8
Obtention d'anticorps polyclonaux de lapin anti-peptides
s synthétiques dérivés des séquences des isoforn~es du récepteur h5-HT4.
Le tableau ci-après présente la séquence des peptides
synthétiques préparés à partir des isoformes du récepteur 5-HT4
SEQ DsignationSquence Domaine
ID du e tide cornes ondant
F26V FGAIELVQDIWIYGEVFCLVRTSLDV boucle I
extracl-
lulaire
G21V GIICLIEKRKFNQNSNSTYCV Boucle II
extracel-
lulaire
7 C2-1T CGQWESQBHPPATSPLVAAQPSDT PartieC-terminale
isoforme
a
g Y23F YGHHQELEKLPIHNDPESLESCF PartieC-terminale
isoforme
b
9 C21S CGTETDRRNFGIRKRRLTKPS PartieC-terminale
isoforme
c
I 0 C7F C-Ah.c- T H V L R F Partie C-terminale
isoforme
d
Ah~ = acide aminohexanoi ue
Des lapins ont été immunisés avec 250 Ng des peptides F26V et
G21 V, correspondant à la première et la seconde boucle extracel lulaire du
récepteur h5-HT4 et avec 250 Ng de peptides C24T et C21 S, correspondant
ls respectivement à ia partie C-terminale des isoformes h5-HT4~a) et h5-
HT4~c).
Ces peptides ont été injectés tels quels en présence de 3 mg de sérum
albumine bovine méthylée et 1 ml d'adjuvant complet de Freund. Trois
semaines après, les lapins ont reçu les mëmes immunogènes en présence
d'adjuvant de Freund incomplet et suivi de la même immunisation un mois
2o après. Les antisérums ont été prélevés une semaine après (a dernière
injection.
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Les peptides Y23F, correspondant à la partie C-terminale de
l'isoforme 5-hHT4(b) et C7F, correspondant à la partie C-terminale de
l'isoforme h5-HT4(d) ont été couplés à la sérum albumine bromoacétylée avant
immunisation avec 2.3 ~rmoles de peptides couplées à 3.4 mg d'albumine
s sérique bovine modifiée. La première immunisation en adjuvant complet de
Freund est suivie de deux autres injections en adjuvant incomplet de Freund
comme décrit dans le paragraphe précédent. Les antisérums ont été prélevés
une semaine après la dernière injection.
La figure 9 donne les valeurs en densité optique d'un essai
lo immunoenzymatique de type ELISA sur les peptides respectifs adsorbés (5
Nglml dans un tampon carbonate à pH=9.5) sur des plaques MAXlsorb (Nunç,
Danemark). Les antisérums ont été incubés une heure à 37°C et
révélés par
un conjugat anticorps anti-IgG de lapin de chèvre couplé à ia peroxydase
(dilution 1!10000) et le substrat H20z-ABTS.
EXEMPLE 9
Mise en évidence à l'aide de l'anticorps anti-G21V de la
présence du récepteur 5-HT~°~ dans les cellules CHO transfectées de
2o manière stable
La présence du récepteur 5-HT4~~~ dans les cellules CHO
exprimant de manière stable cette isoforme du récepteur a été mise en
évidence en Western blot grâce à l'anticorps commun G21V développé dans
2s le cadre de cette étude. les isoformes 5-HT~,~ (figure 10, ligne 2) et 5-
HT4~~~
(figure 10, ligne 3). Les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur
d'expression codant pour la forme (c) du récepteur 5-HT4 et sélectionnées
pour leur résistance à la néomycine. Pour comparaison, d'autres cellules CHO
ont été transfectées avec le vecteur d'expression codant pour la forme (a) du
3o récepteur 5-HT4. Cinquante Ng de protéines provenant d'extraits
membranaires sont séparés sur un gel de polyacrylamide à 10% puis
transférés sur membrane de nitrocellulose. Après 16 h d'incubation en
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présence de 60 Ng d'anticorps anti-5-HT4 (G21V), le blot est révélé par
chimioluminescence (ECL, Amersham, Arlington, Heights,IL) et scanné. La
ligne 1 de la figure 10 indique le résultat obtenu sur les cellules CHO
contrôles, ou aucun marquage n'est détecté ; fes lignes 2 et 3 proviennent de
s clones de cellules CHO surexprimant respectivement les récepteur 5-HT4~8~ et
5-HT4t~y. Une bande migrant approximativement à la taille de 60 kDa est
visualisée.
lo EXEMPLE 10
Mise en évidence à l'aide des anticorps anti-C21 S et anti-C7F
de la présence respectivement du récepteur h5-HT4~~~ et h5-HT4~d~ dans les
cellules CHO transfectées de manière stable.
i3 Utilisant des anticorps dirigés contre la séquence C-terminale
spécifique du récepteur h5-HT4(c) (anti-C21 S) et du récepteur h5-HT4(d)
(anti-C7F), la présence de ces récepteurs respectifs sur des homogénats de
cellules exprimant les deux isoformes a pu ëtre démontrée. La spécificité des
bandes protéiques reconnues a été déterminée par l'extinction de la réponse
2o en immunoblot en présence des peptides inhibiteurs (Figure 11 a et 11 b,
secondes lignes). L'isoforme h5-HT4(c) est reconnue sous sa forme
glycosylée et non glycosylée (correspondant à des poids moléculaires de 60 et
44 kDa); fisoforme h5-HT4(d) est reconnue sous sa forme non-glycosylée
(correspondant à un poids moléculaire de 40 kDa) (Figure 11 a et 11 b,
2s premières lignes).
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Wong E. H., Reynolds G. P., Bonhaus D. W., Hsu S., and Egien
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Zs brain tissues from patients with neurodegenerative disorders. Behav. Brain
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CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/Z8456 PCTIFR98/02560
.~9
Yang D., Soulier J. L., Sicsic S., Mathé- Allainmat M., Brémont B.,
Croci T., Cardamone R., Aureggi G., and Langlois M. (1997] New esters of 4-
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CA 02310541 2000-OS-25
WU 99128456 PCT/FR9810Z560
1
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) REPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75013
(ii) TITRE DE L' INVENTION: variants d'épissage du récepteur 5-HT4
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
{i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1170 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
{vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT: 19..1158
(xi)DESCRIPTION LA 1:
DE SEQUENCE:
SEQ
ID
NO:
CGGTGCTTAT GAC AAACTT GCT GTG AGTTCT GAG 51
TTCCTGTA GAT AAT
ATG
Met Asp LysLeu Aia Val SerSer Glu
Asp Asn
1 5 10
GAGGGT TTC TCA GAG AAGGTG CTG ACG TTTCTC TCG 99
GGG GTG GTG CTC
GluGly Phe Ser Glu LysVal Leu Thr PheLeu Ser
Gly Val Val Leu
15 20 25
ACGGTT ATC ATG ATC TTGGGG CTG GTG ATGGTG GCT 147
CTG GCC AAC CTG
ThrVal Ile Met Ile LeuGly Leu Val MetVal Ala
Leu Ala Asn Leu
30 35 40
GTGTGC TGG AGG CTC AGGAAA AAA AAT TATTTC ATT 195
GAC CAG ATA ACA
ValCys Trp Arg Leu ArgLys Lys Asn TyrPhe Ile
Asp Gln Ile Thr
45 50 55
GTATCT CTT TTT GAT CTGCTG TCG CTt GTGATG CCC 243
GCT GCG GTT GTG
ValSer Leu Phe Asp LeuLeu Ser Leu ValMet Pro
Ala Ala Val Val
CA 02310541 2000-OS-25
WfJ PCTIFR98/02560
99!28456
2
60 65 70 75
TTTGGTGCC ATTGAG CTG CAA GAC TGGATTTAT GGGGAG 291
GTT ATC GTG
PheGlyAla IleGlu LeuValGln AspIle TrpIleTyr Gly
Glu
Val
80 85 90
TTTTGTCTT GTTCGG ACATCTCTG GACGTC CTGCTCACA ACGGCA TCG 339
PheCysLeu ValArg ThrSerLeu AspVal LeuLeuThr ThrAla Ser
95 100 105
ATTTTTCAC CTGTGC TGCATTTCT CTGGAT AGGTATTAC GCCATC TGC 387
IlePheHis LeuCys CysIleSer LeuAsp ArgTyrTyr AlaIle Cys
110 115 120
TGCCAGCCT TTGGTC TATAGGAAC AAGATG ACCCCTCTG CGCATC GCA 435
CysGlnPro LeuVal TyrArgAsn LysMet ThrProLeu ArgIle Ala
125 130 135
TTAATGCTG GGAGGC TGCTGGGTC ATCCCC ACGTTTATT TCTTTT CTC 483
LeuMetLeu GlyGly CysTrpVal IlePro ThrPheIle SerPhe Leu
140 145 150 155
CCTATAATG CAAGGC TGGAATAAC ATTGGC ATAATTGAT TTGATA GAA 531
ProIleMet GlnGly TrpAsnAsn IleGly IleIleAsp LeuIle Glu
160 165 170
AAGAGGAAG TTCAAC CAGAACTCT AACTCT ACGTACTGT GTCTTC ATG 579
LysArgLys PheAsn GlnAsnSer AsnSer ThrTyrCys ValPhe Met
175 180 185
GTCAACAAG CCCTAC GCCATCACC TGCTCT GTGGTGGCC TTCTAC ATC 627
ValAsnLys ProTyr AlaIleThr CysSer ValValAla PheTyr Ile
190 195 200
CCATTTCTC CTCATG GTGCTGGCC TATTAC CGCATCTAT GTCACA GCT 675
ProPheLeu LeuMet ValLeuAla TyrTyr ArgIleTyr ValThr Ala
205 210 215
AAGGAGCAT GCCCAT CAGATCCAG ATGTTA CAACGGGCA GGAGCC TCC 723
LysGluHis AlaHis GlnIleGln MetLeu GlnArgAla GlyAla Ser
220 225 230 235
TCCGAGAGC AGGCCT CAGTCGGCA GACCAG CATAGCACT CATCGC ATG 771
SerGluSer ArgPro GlnSerAla AspGln HisSerThr HisArg Met
240 245 250
AGGACA ACCAAA GCAGCCAAG ACCCTG TGCATCATC ATGGGT TGC 819
GAG
ArgThrGlu ThrLys AlaAlaLys ThrLeu CysIleIle MetGly Cys
255 260 265
TTCTGCCTC TGCTGG GCACCATTC TTTGTC ACCAATATT GTGGAT CCT 867
PheCysLeu CysTrp AlaProPhe PheVal Thr Ile ValAsp Pro
Asn
270 275 280
TTC ATA GAC TAC ACT GTC CCT GGG CAG GTG TGG ACT GCT TTC CTC TGG 915
Phe Ile Asp Tyr Thr Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp
285 290 295
CTC GGC TAT ATC AAT TCC GGG TTG AAC CCT TTT CTC TAC GCC TTC TTG 963
Leu Gly Tyr Ile Asn Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99128456 PCTIFR98/02560
3
300 305 310 315
AATAAGTCT TTTAGA CGTGCC TTCCTCATC CTCTGC TGTGAT GAT 1011
ATC
AsnLysSer PheArg ArgAla PheLeuIle LeuCys CysAsp Asp
Ile
320 325 330
GAGCGCTAC CGAAGA CCTTCC ATTCTGGGC ACTGTC CCTTGT TCA 1059
CAG
GluArgTyr ArgArg ProSer IleLeuGly ThrVal ProCys Ser
Gln
335 340 345
ACCACAACC ATTAAT GGATCC ACACATGTA AGTTCT GGAACT GAA 1107
CTA
ThrThrThr IleAsn GlySer ThrHisVal SerSer GlyThr Glu
Leu
350 355 360
ACCGACAGA AGAAAC TTTGGA ATAAGGAAG AGATTG ACCAAA CCA 1155
AGA
ThrAspArg ArgAsn PheGly IleArgLys ArgLeu ThrLys Pro
Arg
365 370 375
TCCTAATGCCAAA 1170
AA
Ser
380
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 380 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé,
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu Glu Gly Phe Gly Ser
1 5 10 15
Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser Thr Val Ile Leu Met
20 25 30
Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala Val Cys Trp Asp Arg
35 40 45
Gln Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Phe Ile Val Ser Leu Ala Phe
50 55 60
Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro Phe Gly Ala Ile Glu
65 70 75 80
Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Cys Leu Val Arg
85 90 95
Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser Ile Phe His Leu Cys
100 105 110
Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys Cys Gln Pro Leu Val
115 120 125
Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala Leu Met Leu Gly Gly
I30 135 140
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/28456 PCTlFR98102560
4
Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe Ile Ser Phe Leu Pro Ile Met Gln Gly
145 150 155 160
Trp Asn Asn Ile Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu Lys Arg Lys Phe Asn
165 170 175
Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met Val Asn Lys Pro Tyr
180 185 190
Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile Pro Phe Leu Leu Met
195 200 205
Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala Lys Glu His Ala His
210 215 220
Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Arg Pro
225 230 235 240
Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met Arg Thr Glu Thr Lys
245 250 255
Ala Ala Lys Thr Leu Cys Ile Ile Met Gly Cys Phe Cys Leu Cys Trp
260 265 270
Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro Phe Ile Asp Tyr Thr
275 280 285
Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ile Asn
290 295 300
Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asn Lys Ser Phe Arg
305 310 315 320
Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp Glu Arg Tyr Arg Arg
325 330 335
Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser Thr Thr Thr Ile Asn
340 345 350
Gly Ser Thr His Val Leu Ser Ser Gly Thr Glu Thr Asp Arg Arg Asn
355 360 365
Phe Gly Ile Arg Lys Arg Arg Leu Thr Lys Pro Ser
370 375 380
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 1208 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(Dy CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(A) NOM/CLE: CDS
iB) EMPLACEMENT: 19..1098
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/28456 PCT/FR98102560
(xi1DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID
NO:
3:
CGGTGCTTAT CTT TCT GAG 51
TTCCTGTA GAT
ATG GCT
GAC AAT
AAA GTG
AGT
Met Leu SerSer Glu
Asp Asp
Lys Ala
Asn
Val
1 5 10
GAGGGT TTCGGG GTGGTG CTC TTTCTC TCG 99
TCA CTG ACG
GTG
GAG
AAG
GluGly PheGly Val Glu ValVal LeuLeu PheLeu Ser
Ser Lys Thr
15 20 25
ACGGTT ATCCTG GCC ATC GGGAAC CTGCTG GTGATGGTG GCT 147
ATG TTG
ThrVal IleLeu Ala Ile GlyAsn LeuLeu MetVal Ala
Met Leu Val
30 35 40
GTGTGC TGGGAC CAG CTC AAAATA AAAACA AATTATTTC ATT 195
AGG AGG
ValCys TrpAsp Gln Leu LysIle LysThr AsnTyrPhe Ile
Arg Arg
45 50 55
GTATCT CTTGCT GCG GAT CTGGTT TCGGTG CTGGTGATG CCC 243
TTT CTG
ValSer LeuAla Ala Asp LeuVal SerVal LeuValMet Pro
Phe Leu
60 65 70 75
TTTGGT GCCATT CTG GTT GACATC TGGATT TATGGGGAG GTG 291
GAG CAA
PheGly AlaIle Leu Val AspIle TrpIle TyrGlyGlu Val
Glu Gln
80 85 90
TTTTGT CTTGTT ACA TCT GACGTC CTGCTC ACAACGGCA TCG 339
CGG CTG
PheCys LeuVal Thr Ser AspVal LeuLeu ThrThrAla Ser
Arg Leu
95 100 105
ATTTTT CACCTG TGC ATT CTGGAT AGGTAT TACGCCATC TGC 387
TGC TCT
IlePhe HisLeu Cys Ile LeuAsp ArgTyr TyrAlaIle Cys
Cys Ser
110 115 120
TGCCAG CCTTTG TAT AGG AAGATG ACCCCT CTGCGCATC GCA 435
GTC AAC
CysGln ProLeu Tyr Arg LysMet ThrPro LeuArgIle Ala
Val Asn
125 130 135
TTAATG CTGGGA TGC TGG ATCCCC ACGTTT ATTTCTTTT CTC 483
GGC GTC
LeuMet LeuGly Cys Trp IlePro ThrPhe IleSerPhe Leu
Gly Val
140 145 150 155
CCTATA ATGCAA TGG AAT ATTGGC ATAATT GATTTGATA GAA 531
GGC AAC
ProIle MetGln Trp Asn IleGly IleIle AspLeuIle Glu
Gly Asn
160 165 170
AAGAGG AAGTTC CAG AAC AACTCT ACGTAC TGTGTCTTC ATG 579
AAC TCT
LysArg LysPhe Gln Asn AsnSer ThrTyr CysValPhe Met
Asn Ser
175 180 185
GTCAAC AAGCCC GCC ATC TGCTCT GTGGTG GCCTTCTAC ATC 627
TAC ACC
ValAsn LysPro Ala Ile CysSer ValVal AlaPheTyr Ile
Tyr Thr
190 195 200
CCA CTCCTC GTG CTG TATTAC CGCATC TATGTCACA 675
TTT ATG GCC GCT
ProPhe LeuLeu Val Leu TyrTyr ArgIle TyrValThr Ala
Met Ala
205 210 215
AAG CATGCC CAG ATC TTA CAA GCA TCC 723
GAG CAT CAG ATG CGG GGA
GCC
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/28456 PCT/FR98/02560
6
Lys Glu His Ala His Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser
220 225 230 235
TCCGAGAGC AGGCCTCAG TCGGCA GACCAGCAT AGCACTCAT CGCATG 771
SerGluSer ArgProGln SerAla AspGlnHis SerThrHis ArgMet
240 245 250
AGGACAGAG ACCAAAGCA GCCAAG ACCCTGTGC ATCATCATG GGTTGC 819
ArgThrGlu ThrLysAla AlaLys ThrLeuCys IleIleMet GlyCys
255 260 265
TTCTGCCTC TGCTGGGCA CCATTC TTTGTCACC AATATTGTG GATCCT 867
PheCysLeu CysTrpAla ProPhe PheValThr AsnIleVal AspPro
270 275 280
TTCATAGAC TACACTGTC CCTGGG CAGGTGTGG ACTGCTTTC CTCTGG 915
PheIleAsp TyrThrVal ProGly GlnValTrp ThrAlaPhe LeuTrp
285 290 295
CTCGGCTAT ATCAATTCC GGGTTG AACCCTTTT CTCTACGCC TTCTTG 963
LeuGlyTyr IleAsnSer GlyLeu AsnProPhe LeuTyrAla PheLeu
300 305 310 315
AATAAG TTT AGA GCCTTC ATC CTC TGTGAT GAT 1011
TCT CGT CTC ATC TGC
AsnLys Phe Arg AlaPhe Ile Leu CysAsp Asp
Ser Arg Leu Ile Cys
320 325 330
GAGCGC CGA AGA TCCATT GGC ACT CCTTGT TCA 1059
TAC CCT CTG CAG GTC
GluArg Arg Arg SerIle Gly Thr ProCys Ser
Tyr Pro Leu Gln Val
335 340 345
ACCACA ATT AAT TCCACA GTA AGA TGAGCTCCTT 1108
ACC GGA CAT CTA TTT
ThrThr Ile Asn SerThr Val Arg
Thr Gly His Leu Phe
350 355 360
GAGGACTGTG GCCAATTCTT GTGCCCAACA CAGGTTTTTT 1168
ATTGCTCATT
TTTTTTCTTA
TGCACTGAAG TTATCAAATA 1208
AATTCATTGG
ATGTA<4AAAA
(2)INFORMATION SEQID NO: 4:
POUR
LA
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 360 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé,
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Met Asp Lys Leu Asp Ala Asn Val Ser Ser Glu Glu Gly Phe Gly Ser
1 5 10 15
Val Glu Lys Val Val Leu Leu Thr Phe Leu Ser Thr Val Ile Leu Met
20 25 30
Ala Ile Leu Gly Asn Leu Leu Val Met Val Ala Val Cys Trp Asp Arg
35 40 45
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99128456 PCT/FR98/02560
7
Gln Leu Arg Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Phe Ile Val Ser Leu Ala Phe
50 55 60
Ala Asp Leu Leu Val Ser Val Leu Val Met Pro Phe Gly Ala Ile Glu
65 70 75 80
Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val Phe Cys Leu Val Arg
85 90 95
Thr Ser Leu Asp Val Leu Leu Thr Thr Ala Ser Ile Phe His Leu Cys
100 105 110
Cys Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Tyr Ala Ile Cys Cys Gln Pro Leu Val
115 120 125
Tyr Arg Asn Lys Met Thr Pro Leu Arg Ile Ala Leu Met Leu Gly Gly
130 135 140
Cys Trp Val Ile Pro Thr Phe Ile Ser Phe Leu Pro Ile Met Gln Gly
145 150 155 160
Trp Asn Asn Iie Gly Ile Ile Asp Leu Ile Glu Lys Arg Lys Phe Asn
165 170 175
Gln Asn Ser Asn Ser Thr Tyr Cys Val Phe Met Val Asn Lys Pro Tyr
180 185 190
Ala Ile Thr Cys Ser Val Val Ala Phe Tyr Ile Pro Phe Leu Leu Met
195 200 205
Val Leu Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr Val Thr Ala Lys Glu His Ala His
210 215 220
Gln Ile Gln Met Leu Gln Arg Ala Gly Ala Ser Ser Glu Ser Arg Pro
225 230 235 240
Gln Ser Ala Asp Gln His Ser Thr His Arg Met Arg Thr Glu Thr Lys
245 250 255
Ala Ala Lys Thr Leu Cys Ile Ile Met Gly Cys Phe Cys Leu Cys Trp
260 265 270
Ala Pro Phe Phe Val Thr Asn Ile Val Asp Pro Phe Ile Asp Tyr Thr
275 280 285
Val Pro Gly Gln Val Trp Thr Ala Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ile Asn
290 295 300
Ser Gly Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Leu Asn Lys Ser Phe Arg
305 310 315 320
Arg Ala Phe Leu Ile Ile Leu Cys Cys Asp Asp Glu Arg Tyr Arg Arg
325 330 335
Pro Ser Ile Leu Gly Gln Thr Val Pro Cys Ser Thr Thr Thr Ile Asn
340 345 350
Gly Ser Thr His Val Leu Arg Phe
355 360
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99128456 PCTIFR98/02560
8
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 26 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi.) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Phe Gly Ala Ile Glu Leu Val Gln Asp Ile Trp Ile Tyr Gly Glu Val
1 5 10 15
Phe Cys Leu Val Arg Thr Ser Leu Asp Val
20 25
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Gly Ile Ile Cys Leu Ile Glu Lys Arg Lys Phe Asn Gln Asn Ser Asn
1 5 10 15
Ser Thr Tyr Cys Val
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(Vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/28456 PCT/FR98I02560
9
Cys Gly Gln Trp Glu Ser Gln Asx His Pro Pro Ala Thr Ser Pro Leu
1 5 10 15
Val Ala Ala Gln Pro Ser Asp Thr
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 8:
Tyr Gly His His Gln Glu Leu Glu Lys Leu Pro Ile His Asn Asp Pro
1 5 10 15
Glu Ser Leu Glu Ser Cys Phe
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Cys Gly Thr Glu Thr Asp Arg Arg Asn Phe Gly Ile Arg Lys Arg Arg
1 5 10 15
Leu Thr Lys Pro Ser
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID N0: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 8 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
'' (D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(vi) ORIGINE:
CA 02310541 2000-OS-25
WO 99/28456 PCT/FR98102560
ia
(A) ORGANISME: non pertinent
(ix) CARACTERISTIQUE
(C)AUTRES RENSEIGNEMENTS :Xaa en position 2= acide aminohexanoïque
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID N0: 10:
Cys Xaa Thr His Val Leu Arg Phe
