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Procédé perfectionné pour éviter la dégradation d'un principe actif
La présente invention concerne un procédé perfectionné pour éviter la
dégradation d'un principe actif.
Que ce soit en cosmétique, en pharmacie, en détergence ou encore en
agroalimentaire, la fonctionnalité d'un produit est généralement due à la
présence
d'une molécule dite matière active ou agent actif. A titre d'exemple, on peut
citer
les vitamines, utilisées en agro-alimentaire et en pharmacie, les enzymes
utilisées
en détergence, les organo-phosphorés utilisés comme insecticides, ou encore
les
arômes et parfums utilisés dans (hygiène, fagro-alimentaire ou la cosmétique.
L'une des caractéristiques essentielles d'un produit industriel ou
pharmaceutique, outre son activité et son efficacité, est sa stabilité, de
manière à
obtenir un produit ayant une durée de vie suffisante. Malheureusement, de
nombreuses matières actives sont des molécules particulièrement fragiles, dont
la
dégradation sous (effet des contraintes d'environnement est trop rapide pour
obtenir la durée de vie souhaitée du produit la contenant. C'est le cas de
certaines
vitamines comme les vitamines C, A ou E, de beaucoup d'enzymes comme par
exemple les protéases, et plus généralement de beaucoup de protéines et de
molécules biologiques, ou encore dans le domaine des insecticides, du
malathion
et des pyréthrinoïdes, et, d'une manière pius générale, des molécules
réductrices
ou oxydantes.
De nombreuses stratégies ont été élaborées pour éviter la dégradation
de ces molécules actives fragiles. Ces stratégies dépendent de la nature de la
réaction provoquant Ia dégradation. Les réactions les plus souvent incriminées
sont soit (hydrolyse soit foxydo-réduction. D'autres réactions plus
spécifiques ont
aussi lieu, comme fautoprotéolyse dans le cas des protéases.
Dans le cas où l'eau est une cause directe ou indirecte de la
dégradation, une solution simple consiste à éviter le contact de la molécule
active
avec un milieu aqueux. C'est le cas par exemple d'insecticides dissous dans un
solvant organique, et mis en aeuvre en aérosol. Malheureusement cette
possibilité
n'existe pas toujours, comme par exemple pour la cosmétique ou fagro
alimentaire, qui, pour des raisons évidentes, ne peuvent utiliser les sôlvants
organiques. De plus, la tendance actuelle, pour des raisons écologiques et de
santé
publique, est à Ia suppression de l'utilisation de solvants organiques dans
toutes les
branches de (industrie.
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Lorsque l'eau n'est qu'une cause indirecte, par exemple par effet
d'oxydation par l'oxygène dissous, on peut travailler avec une eau dégazée.
D'une
manière plus générale, on peut travailler en atmosphère inerte, à la fois pour
la
fabrication et la conservation du produit final. Cette solution est souvent
employée
en agro-alimentaire, où les produits liquides enrichis en vitamines sont
conditionnés soit sous vide d'air, soit sous atmosphère inerte.
Malheureusement
cette méthode ne permet de limiter la dégradation que jusqu'à l'ouverture du
contenant. Elle n'est donc pas applicable dans le cas de produits nécessitant
une
longue durée de vie après ouverture.
Les enzymes sont des protéines qui catalysent de manière très
spécifique des réactions chimiques. Elles sont très utilisées
industriellement, par
exemple dans les lessives pour dégrader les protéines (protéases), les lipides
(lipases) ou les résidus amylacés (amylases), facilitant ainsi le nettoyage.
Ces
protéines sont en général instables en solution, et sont donc surtout
utilisées dans
les lessives en poudre. Leur utilisation en lessive liquide (pour le linge ou
la
vaisselle) est très limitée par leur instabilité à long terme.
De même, une tendance actuelle est à l'utilisation d'enzymes en
cosmétique, par exemple des protéases pour aider à la desquamation de la peau,
et
donc à son renouvellement. Là encore (instabilité des enzymes empêche leur
utilisation simple.
L'immobilisation d'enzymes est un sujet très développé, au moins en
recherche, les applications industrielles n'étant pas encore très nombreuses.
Les
travaux sur l'encapsulation d'enzymes font partie de ceux du domaine de la
bioencapsulation qui comprend aussi fencapsulation d'organismes "vivants"
(levures, bactéries...). En général il est fait appel à des polymères qui
forment une
matrice immobilisant l'enzyme.
Dans ces travaux, il s'agit généralement d'immobiliser (enzyme (ou la
levure) pour l'avoir sous forme facilement manipulable, comme par exemple des
microbilles que l'on peut extraire du milieu de réaction, après usage, par
simple
filtration ou tamisage suivant leur taille. Par conséquent la forme encapsulée
de
(enzyme doit garder son activité. Le matériau d'encapsulation doit être
suffisamment poreux pour laisser diffuser le substrat et les produits de
réaction.
Une revue de ces développements peut être trouvée dans "Bioencapsualtion in
biotechnology, Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., 21, 291-297 (1993)".
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Les principales réactions conduisant à la perte d'activité d'une enzyme
sont la dégradation chimique, la perte de configuration spatiale ou
(agrégation de
plusieurs enzymes. Les méthodes typiquement utilisées pour éviter ou limiter
les
excès de ces dégradations sont la modification chimique de la molécule et
l'immobilisation.
La protection d'enzymes vis à vis de leur dénaturation par
encapsulation est moins courante. En effet, les matrices polymères utilisées
dans
l'immobilisation laissant diffuser les substrats, elles sont trop poreuses
pour
réellement protéger l'enzyme. Les principales réactions de dégradation sont
celles
touchant les protéines. Il s'agit, en particulier, d'hydrolyses spécifiques
des liaisons
entre acides aminés et de réactions conduisant à une dénaturation par
changement
de conformation n'impliquant pas de liaisons covalentes, mais entrainant une
perte
d'activité de l'enzyme, par modification de l'accessibilité du site catalyseur
par
exemple. Ainsi dans l'article "Prolonged retention of cross-linked trypsin in
calcium alginate microspheres, J. Microencapsulation, 14, 51-61 (1997)", il
est
montré qu'il est nécessaire de réticules préalablement (enzyme par du
glutaraldéhyde pour assurer sa protection, ce qui induit une perte de 50 % de
son
activité.
Dans le cas des enzymes, par exemple dans les lessives liquides ou
dans les crèmes cosmétiques, il n'est pas possible d'utiliser un solvant non
aqueux,
à la fois pour des raisons de sécurité et de coût. L'introduction d'enzymes
dans ce
type de produit se heurte donc à des difficultés réelles. Une solution,
parfois
adoptée en cosmétique consiste à utiliser un emballage sophistiqué, constitué
de
deux réservoirs indépendants, fun contenant la molécule active, (autre
contenant
le reste de la préparation. Le mélange est effectué extemporanément au moment
de
l'utilisation du produit, grâce à un système de double pompe doseuse sur le
flacon.
Cette solution est assez onéreuse, et peu commode d'utilisation. Cette
solution a
aussi été mise en oeuvre dans le cas de la cosmétique pour proposer des
produits
de beauté contenant des vitamines.
Une autre méthode consiste aussi à séparer l'actif de son milieu, mais
de manière microscopique en le microencapsulant dans des microsphères de
polymère, ou en l'enrobant, par exemple par une technique d'enrobage en lit
fluidisé, dans une matrice polymère. Cette technique peut s'avérer
intéressante, en
particulier pour des produits destinés à être incorporés dans des formes
sèches.
Elle présente (inconvénient de nécessiter la rupture de la coque ou de
l'enrobage
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polymère pour libérer l'actif. Elle est donc peu adaptée à des produits
cosmétiques
où la libération de l'actif doit se faire spontanément au moment de
l'application du
produit, ou à des produits alimentaires, qui doivent libérer leur actif en
bouche.
Lorsque l'instabilité de la matière active est modérée, l'utilisation de
molécules protectrices peut s'avérer intéressante. C'est le cas des agents
anti-
oxydants largement utilisés dans les crèmes cosmétiques et les produits
alimentaires. Ils sont en général simplement additionnés à la préparation,
mais du
fait de la dilution il est nécessaire d'en ajouter une quantité plus
importante que
nécessaire pour obtenir un effet. D'autre part, comme beaucoup d'additifs,
leur
usage tend à être de plus en plus réglementé, et les doses autorisées
diminuées.
Il est connu d'encapsuler des principes actifs dans des vésicules à base
de tensioactifs.
Ces vésicules présentent généralement une ou plusieurs bicouches. On
parlera de vésicules unilamellaires lorsqu'elles sont constituées d'un coeur
aqueux
entouré d'une bicouche de tensioactifs et de vésicules paucilamellaires ou
multilamellaires lorsqu'elles présentent plusieurs bicouches. Parmi les
vésicules
multilamellaires, on distingue celles que fon désignera ci-après par
"vésicules
multilamellaires ou MLV de type classique" et des vésicules de structure bien
particulière que l'on désignera ci-après par "vésicules multilamellaires à
structure
en oignon". Ces deux types de vésicules multilamellaires se distinguent par
trois
différences fondamentales
1°. Leurprocédé d'obtention
Le procédé d'obtention des MLV classiques fait généralement appel à
un mélange préliminaire en milieu solvant organique des lipides et autres
composants constituant (enveloppe desdites MLV, puis à l'évaporation du
solvant
pour obtenir un film sec. Les vésicules sont ensuite obtenues par
réhydratation de
ce film de lipides par une solution aqueuse contenant l'agent actif à
encapsuler.
Les vésicules multilamellaires à structure en oignon sont, quant à
elles, obtenues par cisaillement d'une phase lamellaire cristal-liquide
comprenant
l'actif à encapsuler.
2°. Leur structure
Du fait de Leur mode de préparation, les MLV classiques sont des
agrégats de feuillets multilamellaires de type lipidique rassemblés au sein
d'une
membrane lipidique approximativement sphérique. Cette structure apparaît très
clairement dans le cliché donné dans le brevet US 4,975,282.
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Les liposomes sont le plus souvent obtenus à partir des MLV
classiques décrits ci-dessus, après application d'un très fort cisaillement
(par
ultrasons ou presse de French), les transformant en vésicules unilamellaires
ou
paucilamellaires caractérisées par la présence d'un coeur aqueux.
Les vésicules multilamellaires à structure en oignon se présentent,
quant à elles, sous forme d'un empilement régulier de bicouches concentriques
allant du coeur même des vésicules jusqu'à leur périphérie.
3°. Leur nature thermodynamique
A l'intérieur des vésicules multilamellaires classiques, le nombre de
feuillets multilamellaires, leur nombre de couches, le nombre de repliements
et
leur arrangement sont des caractéristiques qui dépendent du mode de
préparation
et en particulier de phénomènes cinétiques intervenant lors de la
réhydratation du
film lipidique. La structure interne des vésicules n'est pas uniforme au sein
d'une
vésicule (zones de faible courbure, zones de forte courbure, zones
multilamellaires, zones continues). Une telle structure n'est donc pas à
l'équilibre
thermodynamique. De plus, chaque vésicule a une constitution différente, et il
n'y
a donc pas uniformité de structure sur tout (échantillon.
Il a été décrit, en particulier dans la demande WO 96/31194 des
liposomes de type classique paucilamellaire constitués de quelques couches
entourant un coeur aqueux, au sein desquels se trouvent associés une molécule
et
son stabilisant.
Des compositions dans lesquelles un agent actif se trouve encapsulé au
sein de vésicules multilamellaires à structure en oignon, constituées, de leur
centre
jusqu'à leur périphérie, d'une succession de couches lamellaires séparées par
un
milieu liquide se trouvent déjà décrites dans différents brevets référencés ci
dessous. Ces vésicules peuvent être obtenues par un procédé comprenant la
préparation d'une phase lamellaire cristal-liquide et sa transformation par
application d'un cisaillement. Un tel procédé est en particulier décrit dans
le brevet
WO 93/19735 issu du brevet français FR 2 689 418 ou WO 95/18601 introduits
ici par référence.
Selon le brevet français FR 2 689 418, cette transformation peut être
faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la pâte cristal-liquide, ce
qui
conduit à des vésicules encore appelées micro-capsules de taille contrôlée.
Toutefois, en jouant sur la formulation de la phase lamellaire cristal-
liquide, en
particulier sur la nature des tensioactifs entrant dans sa composition, ta
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transformation de cette phase cristal-liquide en vésicules peut être obtenue
par
simple sollicitation mécanique, en particulier lors du mélange des
constituants.
Différentes applications de ce type de vésicules ont été décrites par la
demanderesse. On citera, en particulier, la demande internationale WO 95/19707
qui décrit des compositions odorantes dans lesquelles un produit odorant se
trouve
incorporé au sein de telles vésicules multilamellaires, l'effet d'une telle
encapsulation étant d'augmenter la rémanence de (odeur, du fait du
ralentissement
de l'évaporation. On citera également la demande française FR 2 735 658 qui
décrit des compositions à usage alimentaire dans lesquelles un produit ou un
additif à usage alimentaire se trouve inclus au sein de telles vésicules
multilamellaires, avec pour effet essentiel d'obtenir un relargage contrôlé
particulièrement avantageux du produit encapsulé, la présence de la vésicule
multilamellaire permettant en outre de protéger, avant leur introduction dans
les
compositions, les molécules souvent fragiles qui se trouvent incorporées en
son
1 S sein.
Toutefois, une telle composition, même si elle apporte dans certains
cas un effet déjà sensible sur la stabilisation des molécules fragiles, peut
s'avérer
insuffisante pour des molécules particulièrement sensibles ou dont on cherche
à
obtenir une stabilisation particulièrement accrue à (égard d'un environnement
a
priori défavorable.
Ainsi les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert
que l'action de protection de molécules fragiles déjà observée dans le cas
particulier de certains produits du domaine alimentaire, pouvait être
considérablement accrue par incorporation au sein des vésicules
multilamellaires à
structure en oignon d'un agent destiné à stabiliser ces molécules fragiles.
Une telle
présentation du couple produit actif/agent stabilisant permet d'obtenir une
stabilisation accrue, donc une durée de vie des produits incorporant (agent
actif
accrue avec des concentrations nettement plus faibles en agent stabilisant, ce
qui
est un avantage considérable de la présente invention.
Cette invention s'avère particulièrement intéressante dans tous les
domaines où fon cherche à protéger un agent actif vis-à-vis d'une action de
dégradation. Elle s'applique à tous les produits connus pour leur fragilité
et, tout
particulièrement, aux vitamines et aux enzymes.
En ce qui concerne les enzymes, l'invention fournit un moyen
particulièrement efficace permettant d'assurer à la fois la fonction
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d'immobilisation d'une enzyme et sa protection vis-à-vis du milieu extérieur
en
vue d'améliorer sa stabilité.
Ainsi, la présente invention offre une solution particulièrement
économique et efficace aux problèmes liés à la stabilisation de matières
actives
fragiles avec, en outre, tous les avantages liés à la technique
d'encapsulation
utilisée
- grande souplesse de formulation,
- grande variété des tensioactifs utilisables,
- capacité de mettre en oeuvre simultanément plusieurs actifs,
- possibilité de recourir à plusieurs agents, en vue d'augmenter encore
la stabilisation,
- stabilité accrue en milieu aqueux, aussi bien simple que complexe
(gel, détergent, émulsion).
Ainsi, selon tune de ses caractéristiques essentielles, l'invention
concerne des compositions contenant un agent actif encapsulé au sein de
vésicules
multilamellaires présentant une structure en oignon et constituées, de leur
périphérie jusqu'à leur centre, de membranes concentriques sous forme de
bicouches comprenant au moins un agent tensioactif; lesdites membranes étant
séparées par un liquide interstitiel, lesdites vésicules contenant au moins un
agent
destiné à éviter la dégradation dudit agent actif.
Par structure en "oignon", on entend, comme exposé précédemment,
une structure multilamellaire, dans laquelle les vésicules de forme
sensiblement
sphérique sont constituées d'une succession de bicouches concentriques et,
cela,
du centre à la périphérie des vésicules, d'où le nom de structure en oignon
utilisé
par analogie, pour qualifier de telles structures.
Ces structures peuvent être mises en évidence par examen
microscopique des compositions. L'observation se fait en utilisant un
microscope
optique en lumière polarisée, dans lequel une phase lamellaire, biréfringente
est
visible. Elle se manifeste par une texture caractéristique, liée à la présence
des
défauts (joints de grains) entre les domaines de phase orientés différemment.
Dans
le cas de la phase concentrée de vésicules, la texture est caractérisée par
son
caractère uniforme et fin, relié à la taille des vésicules. Dans la phase
dispersée de
vésicules, celles-ci sont visibles sous la forme de points plus ou moins
résolus (en
fonction de la taille), légèrement biréfringents. La biréfringence ne
s'observe que
lorsque la dispersion n'est pas trop diluée. Il y aura donc lieu, si la
dispersion est
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relativement diluée de procéder à une opération préalable de concentration
pour
mettre clairement en évidence la biréfringence caractéristique de la présence
des
vésicules à structure en oignon.
Le principe de (invention consiste à utiliser les vésicules comme des
micro-récipients contenant la molécule à protéger, et empêchant la réaction de
dégradation de se produire. Pour cela, le rôle de la vésicule est double :
d'une part
isoler la molécule active de son environnement, et d'autre part apporter les
additifs
nécessaires à la stabilisation, ce qui s'avère particulièrement intéressant
pour les
molécules sensibles. L'un des avantages majeurs de la vésicule est de confiner
la
molécule fragile et sa protection dans un petit volume, beaucoup plus faible
que le
volume total de la préparation, et donc d'éviter ainsi (effet de dilution,
permettant
de ce fait l'utilisation d'une plus faible quantité de molécule protectrice.
Selon une variante avantageuse, le liquide interstitiel est de l'eau et
l'agent actif est inclus dans les membranes des vésicules lorsqu'il est
hydrophobe
ou dans le liquide interstitiel lorsqu'il est hydrophile.
Selon une autre variante avantageuse de (invention, les vésicules ont
des dimensions comprises entre 0,1 et 50 p.m, de préférence entre 0,2 et 10
pm.
De telles structures sont avantageusement obtenues par incorporation
de l'agent actif et de (agent destiné à le stabiliser dans une phase
Lamellaire cristal
liquide comprenant au moins un agent tensioactif puis transformation, par
application d'un cisaillement, de cette phase cristal-liquide lamellaire en
une phase
dense de vésicules multilamellaires de petite taille.
Ce cisaillement pourra être un cisaillement homogène, ce qui présente
l'avantage de conduire à des vésicules de taille parfaitement homogène.
Toutefois,
une simple agitation mécanique pourra s'avérer suffisante pour conduire à la
formation des vésicules multilamellaires de l'invention.
Selon le brevet français FR-2 689 418, cette transformation peut être
faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la phase cristal-liquide,
ce qui
conduit à des vésicules ou microcapsules de taille contrôlée. Toutefois, en
jouant
sur la formulation de la phase lamellaire cristal-liquide, en particulier sur
la nature
des tensioactifs entrant dans sa composition, la transformation de cette phase
cristal-liquide en vésicules peut être obtenue par simple sollicitation
mécânique,
en particulier lors du mélange des constituants.
Comme cela ressort en particulier des exemples illustratifs de
(invention, le choix des agents tensioactifs utilisables pour former les
membranes
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des vésicules multilamellaires de l'invention est très large. Toutefois, on
choisira
ces agents tensioactifs en fonction du domaine d'utilisation de la composition
visée. Dans de nombreux cas, (application envisagée comporte des contraintes
qui
limitent le choix des tensioactifs. Il s'agit souvent de contraintes
législatives ou
liées à des normes. Ainsi, dans le domaine de la cosmétique, le catalogue de
fINCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredients) fournit la liste
des
produits autorisés, dans le cas de l'agro-alimentaire on se réfère à la liste
positive
des additifs autorisés, ou dans celui de la pharmacie, à la pharmacopée.
La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de
molécules tensioactives. Il est généralement utilisé au moins deux
tensioactifs
différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet
de
régler en continu les propriétés des bicouches et ainsi de contrôler
l'apparition de
(instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires.
Selon une variante particulièrement avantageuse de (invention, on
utilisera un mélange de deux agents tensioactifs dits respectivement agent
tensioactif lipophile, présentant une balance hydrophile-lipophile (HLB)
comprise
entre 3 et 7, et agent tensioactif hydrophile, présentant une HLB comprise
entre 8
et 15.
Selon une autre variante avantageuse de (invention, les membranes
des vésicules contiennent au moins un agent tensioactif polymère ou un
polymère
présentant des propriétés amphiphiles.
C'est le cas par exemple des poloxamères, et autres dérivés
copolymères de l'oxyde d'éthylène et de l'oxyde de propylène éventuellement
modifiés par adjonction de chaînes hydrophobes.
On peut citer à titre d'exemples non exhaustifs la famille des Pluronic~
et Lutrol~ (BASF), les hydroxystéararate de polyéthylène (Solutol~ de BASF ou
MYRJ~ de ICI).
L'invention s'applique de façon particulièrement avantageuse à tout
type d'agent actif connu pour sa fragilité. Il s'agit en particulier d'agents
sensibles à
l'oxydation ou à la réduction, à (hydrolyse ou à des réactions plus
spécifiques
telles que fautoprotéolyse dans le cas des protéases.
A titre d'agents actifs fragiles auxquels s'adresse tout particulièrement
la présente invention, on citera les molécules réductrices, oxydantes,
sensibles à
(hydrolyse, en particulier les vitamines, les enzymes, les protéines, les
molécules
biologiques d'une façon générale.
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Un domaine où elle trouve des applications également très
intéressantes est celui des insecticides. En effet, les insecticides se
classent en
plusieurs grandes familles parmi lesquelles on peut citer les
organophosphorés, les
organochlorés et les pyréthrénoïdes. La tendance actuelle est d'utiliser des
molécules suffisamment biodégradables pour être rapidement détruites dans
l'environnement. Les organochlorés par exemple sont quasiment tous interdits à
cause de leur trop grande persistance dans l'environnement. Se pose alors le
problème de la stabilité dans le temps des molécules utilisées. C'est le
problème
posé par certains organophosphorés qui sont assez rapidement hydrolysés ou les
pyréthrénoïdes (dérivés synthétiques du pyrèthre, extrait d'un chrysanthème)
qui
sont instables. Le procédé de l'invention s'avère particulièrement intéressant
pour
stabiliser tous ces produits particulièrement instables. C'est le cas en
particulier
des pyréthrénoïdes.
Un autre domaine où (invention trouve des applications
1 S particulièrement intéressantes est celui de la cosmétique et de la
dermatologie où
de nombreux actifs sont connus pour leur fragilité. C'est le cas en
particulier des
vitamines A, E et C, par exemple, et également des molécules comme la DHA
(dihydroxyacétone, agent autobronzant), des oligomères procyanidoliques, des
enzymes.
Un autre domaine où (invention trouve une application
particulièrement intéressante est celui des médicaments pour lesquels les
notions
de fragilité de la molécule, et de limitation des additifs autorisés sont
encore plus
pertinentes que dans la cosmétique.
Un autre exemple où l'invention trouve des applications intéressantes
est celui de la stabilisation de fhydroquinone et de ses dérivés qui sont des
produits très utilisés dans le domaine de la photographie en tant que
développateur
mais aussi en cosmétique et qui souffrent tout particulièrement de la
sensibilité à
l'oxydation du fait de leur propriétés réductrices.
L'agent destiné à stabiliser (agent actif sera choisi en fonction de la
nature de cet agent actif et du type de dégradation que fon cherche à éviter
et, cela,
en tenant compte en outre du type d'application visée.
Ainsi, le(s) additifs) nécessaires) à la stabilisation peut (peuvent) être
un (des) composés) spécifiquement conçus) pour apporter la protection de
(actif.
C'est le cas où (agent actif est un produit sensible à l'oxydation et l'agent
destiné à
éviter sa dégradation, un agent connu comme agent anti-oxydant.
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C'est ie cas également lorsque le produit actif voit sa stabilité modifiée
par une variation de pH susceptible, par exemple, de provoquer une réaction
d'hydrolyse ou encore de modifier le potentiel redox du produit actif. On
choisira
alors d'encapsuler un agent stabilisateur permettant de modifier localement le
pH,
de façon à accroître la stabilité du produit actif.
Lorsque l'on souhaite améliorer la stabilité d'un produit actif sensible à
l'oxydation, la vésicule contient avantageusement un produit connu pour ses
propriétés anti-oxydantes du fait de ses propriétés réductrices ou du fait de
son
action pour diminuer le risque d'oxydation par effet séquestrant, par exemple
par
effet séquestrant des traces d'ions métalliques catalyseurs de l'oxydation
contenus
dans le milieu, ou par action sur ie pH du milieu lorsque le potentiel redox
dépend
du pH.
Ainsi, on citera de façon non exhaustive à titre d'agents anti-oxydants
l'acide ascorbique et ses dérivés,
(acide citrique et ses dérivés (aussi utilisés comme séquestrant),
l'acide glutamique, les glutamates et leurs dérivés,
l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) (séquestrant),
l'acide lactique et ses dérivés (aussi utilisés pour ajuster le pH),
(acide tartrique et ses dérivés (aussi utilisés pour ajuster le pH et comme
agent
séquestrant),
la benzophénone,
les bioflavonoïdes,
le butylhydroxy hydroxyanisol,
le butylhydroxy hydroxytoluène,
le carotène et ses dérivés,
le chlorobutanol,
les gallates de propyle, d'octyle ou de dodécyle,
le sulfite de sodium ou de potassium, et les composés apparentés tels que le
bisulfite ou le pyrosulfite,
les tocophérols (alpha, delta ou gamma) et leurs dérivés,
d'une manière générale tous les additifs alimentaires des classes E3xx et E22x
de
la classification européenne des additifs alimentaires.
A titre d'exemple, la vitamine C et ses dérivés sont bien connus pour
leur sensibilité à l'oxydation. On a clairement mis en évidence qu'on pouvait
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améliorer leur stabilité en les co-encapsulant avec un agent anti-oxydant.
A titre d'agent anti-oxydant, on poun:a utiliser du bisulfite de sodium
et/ou un agent séquestrant permettant d'éliminer les traces de métaux
oxydants,
par exemple l'acide éthylène diamine tétraacétique {EDTA).
A titre d'exemple d'agent permettant d'éviter (hydrolyse par effet de
modification locale du pH, on citera le tartrate de sodium qui pourra être co-
encapsulé avec de l'ascorbylphosphate de magnésium (APG) en vue d'augmenter
sa stabilité par modification locale du pH.
L' agent destiné à stabiliser le produit actif peut également faire partie
de la membrane de la vésicule, s'il a des propriétés amphiphiles. C'est le cas
de la
vitamine E ou de ses dérivés qui peuvent être co-encapsulés avec un actif
sensible
à l'oxydation, afin de jouer le rôle d'anti-oxydant donc protecteur. Mais la
vitamine
E (acétate de tocophérol) est un produit amphiphile de par sa nature
moléculaire.
On pourra donc tirer avantage de cette propriété pour adapter la formulation
de la
phase cristal-liquide. Ainsi, la vitamine E est incorporée dans la membrane de
tensioactif et joue un rôle actif dans la formulation de cette membrane
permettant
de conférer à la phase cristal-liquide les caractéristiques adéquates pour
obtenir les
vésicules par cisaillement.
Il existe également d'autres cas où l'agent stabilisant jouera également
le rôle d'agent tensioactif participant à la formulation des membranes des
vésicules. De tels exemples seront donnés plus loin à propos de la
stabilisation des
enzymes.
Selon une autre variante de (invention, on pourra choisir comme agent
destiné à stabiliser ledit agent actif un agent qui, en lui-même, constitue un
second
agent actif de la composition. C'est le cas par exemple de la vitamine E qui,
du fait
de ses propriétés anti-radicalaires, constitue dans une composition cosmétique
où
elle est associée avec de la vitamine A ou de la vitamine C, non seulement un
agent destiné à stabiliser cette vitamine A comme indiqué précédemment, mais
également un second agent actif de ladite composition.
Dans le cas particulier où la molécule à stabiliser est une enzyme, on
utilisera comme agent stabilisant, d'une façon générale, soit un additif connu
pour
stabiliser ou protéger les protéines, désigné ci-après par additif protecteilr
non
spécifique des enzymes, soit un agent spécifique destiné à stabiliser
spécifiquement une enzyme.
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- WO 99/27907 13 PCT/FR98/02579
Ainsi, dans le cas des protéases, un inhibiteur de protéases permettra
d'éviter l'autoprotéolyse.
Selon une première variante, où l'on utilise un additif protecteur non
spécifique, celui-ci est choisi avantageusement parmi les produits qui sont
connus
pour agir sur la conformation de l'enzyme. A titre d'exemple de tels produits,
on
citera en particulier des ions dont l'effet est d'augmenter la force ionique
et de se
fixer sur certains sites chargés de l'enzyme ou des molécules susceptibles
d'engager des liaisons faibles avec la protéine.
L'homme du métier comprendra aisément que les ions les plus
efficaces sont les ions relativement gros, par exemple des ions ammoniums et
ammoniums quaternaires en ce qui concerne les cations et des sulfates,
phosphates, carboxylates et polyacides carboxyliques en ce qui concerne les
anions. L'homme du métier comprendra aisément que son choix pour obtenir la
meilleure efficacité devra se porter sur des ions suffisamment gros ou
attachés à
une molécule suffisamment grosse.
Parmi les ions particulièrement intéressants pour stabiliser les
enzymes, on citera l'ion calcium bien connu pour intervenir spécifiquement
dans
la réactivité de beaucoup d'enzymes, en particulier des protéases.
Dans la variante selon laquelle on utilise des molécules spécifiques
stabilisatrices, on choisit avantageusement des molécules portant des
fonctions
susceptibles de se lier à l'enzyme, par exemple des molécules qui ont la
possibilité
de former des liaisons hydrogènes avec l'enzyme. Parmi ces molécules, on
citera
en particulier les alcools et les polyols, avantageusement des polyols
associés à un
dérivé du bore, en particulier à un ion borate, des amines éthoxylées et des
oxydes
d'amines. On pourra également choisir de recourir à des tensioactifs
comportant
plusieurs oxydes d'éthylène. De tels tensioactifs entreront dans la
formulation des
membranes des vésicules de l'invention et participeront à la stabilisation des
enzymes.
Ainsi donc, on pourra citer à titre d'agents destinés à stabiliser des
enzymes incorporées au sein de ces vésicules, des tensioactifs et des
molécules
amphiphiles contenant les fonctions suivantes ou substitués par les groupes
suivants
ammoniums quaternaires,
' amines et éthanolamine,
' molécules portant une fonction phosphate, en particulier phospholipides,
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' sels et esters d'acides gras,
' sels de polyacides,
' alcools,
' glycérol et ses esters (les glycérides),
' polyols (polyglycérides, polyéthylèneglycol, polypropylèneglycol),
' sucres (sorbitol, glucose, lactose, saccharose...).
Les agents stabilisants des enzymes seront avantageusement choisis
parmi les dérivés polymères qui contiennent des fonctions d'un des types
précédents, en particulier
0 les polysaccharides modifiés ou non tels que
* agarose,
* gommes guar,
* carraghénanes,
* acide alginique et alginate,
* pectine,
* chitosan,
0 les polyvinylpyrrolidones, éventuellement substituées,
0 les celluloses et dérivés de celluloses (alkylés ou fonctionnalisés),
0 les polyacrylates,
0 les polyvinylalcools (PVA) et les dérivés partiellement hydrolysés des
polyvinylacétates,
0 les polyacrylamides,
0 les polyamides.
Les essais réalisés par les inventeurs de la présente invention montrent
que la présence dans les vésicules multilamellaires incorporant une enzyme, en
tant qu'agent destiné à éviter la dégradation de ladite enzyme, soit d'un
tensioactif
ou d'une molécule amphiphile présentant au moins une fonction azotée, soit
d'un
polymère présentant également une fonction azotée, permet d'améliorer
considérablement la stabilisation de (enzyme.
Lorsqu'on recourt comme agent de stabilisation d'une enzyme à un
agent tensioactif comportant au moins une fonction azotée, on choisit de
préférence un agent tensioactif, dans iequel la fonction azotée fait partie de
la tête
polaire dudit agent tensioactif.
Selon cette variante où les fonctions azotées font partie de la tête
polaire du tensioactif, la queue hydrophobe est avantageusement constituée
d'une
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ou piusieurs chaînes carbonées. On peut donc définir indépendamment la nature
de la partie hydrophobe qui ne varie pas beaucoup d'un tensioactif à l'autre :
au
moins une (deux en général) chaîne alkyle de 1 à 22 carbones, linéaire ou
ramifiée, simple ou substituée, éventuellement portant un résidu cyclique ou
aromatique, saturée ou portant une ou plusieurs insaturations, éventuellement
substituée par d'autres fonctions. La ou les chaïnes formant la partie
hydrophobe
de (agent tensioactif peuvent être soit directement liées à (atome d'azote de
la
fonction azotée, soit, le cas échéant, liées à fun des substituants de
l'azote.
Lorsqu'on recourt, pour stabiliser une enzyme, à l'utilisation d'un
polymère portant au moins une fonction azotée, on le choisit avantageusement
dans la liste suivante
- polyacrylamides et produits de polymérisation ou de
copolymérisation des dérivés de l'acrylamide,
- dérivés amidés de polysaccharides en particulier gommes guar
quaternisées telles que le chlorure de guar hydroxypropyltrimonium.
- dérivés de la chitine tels que chitosan, sels de poly D-glucosamine,
les contre-ions de ces polymères pouvant contenir une fonction amine ou
dérivée
(glutamate, par exemple),
- polyamides.
Dans le cas spécifique où l'on cherche à stabiliser une enzyme en
évitant son autoprotéolyse, on co-encapsule avantageusement un inhibiteur de
protéase, par exemple fEDTA, le phénylméthanesulfonylfluorure, la 3,4-
dichloroisocoumarine, la chymostatine.
Afin de renforcer le rôle de confinement joué par la vésicule, il peut
étre avantageux d'ajouter dans sa formulation un ou des polymères ou molécules
à
haut point de fusion, qui vont renforcer l'étanchéité de la vésicule. Ce
renforcement de (étanchéité peut aussi être obtenu par tout moyen permettant
de
diminuer l'échange avec le milieu de dispersion final, en particulier en
enrobant la
vésicule avec un polymère ou une cire, éventuellement une cire
autoémulsifiable.
Ainsi, (invention couvre également selon une variante avantageuse des
compositions dans lesquelles les vésicules comprennent en outre au moins un
agent destiné à renforcer leur étanchéité, cet agent étant encapsulé au séin
des
vésicules ou constituant un enrobage externe de ces mêmes vésicules.
Selon une variante particulièrement avantageuse de (invention, on
pourra choisir comme agent destiné à stabiliser le produit actif un agent qui
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simultanément améliore (étanchéité de la vésicule. Ainsi, pour stabiliser la
vitamine C, on ia co-encapsulera avec de la pectine qui, en se liant à la
vitamine
C, la stabilise et qui simultanément améliore l'étanchéité de la vésicule.
En résumé l'invention consiste à utiliser la microvésicule
multilamellaire comme un milieu de confinement d'une molécule fragile et des
additifs permettant sa stabilisation, éventuellement en renforçant son
étanchéité.
Selon un autre de ses aspects, (invention couvre également le procédé
de préparation d'une composition telle que définie précédemment comprenant Ies
étapes de
- préparation d'une phase lamellaire cristal-liquide comprenant au
moins un agent tensioactif et incorporant au moins un agent actif et un agent
destiné à éviter la dégradation dudit agent actif,
- transformation de ladite phase cristal-liquide en vésicules
multilamellaires à structure en oignon, par cisaillement.
Ce cisaillement sera avantageusement un cisaillement homogène tel
qu'enseigné dans le brevet FR 2 689 418.
La transformation de la phase lamellaire cristal-liquide en vésicules
multilamellaires à structure en oignon pourra être facilitée en jouant sur le
choix
tensioactifs. On pourra, en particulier, choisir comme indiqué précédemment un
tensioactif présentant une haute HLB et un agent tensioactif présentant une
basse
HLB.
Par ailleurs, certains tensioactifs sont particulièrement adaptés pour
favoriser cette transformation. Ainsi, c'est le cas par exemple des
poloxamères, et
autres dérivés copolymères de (oxyde d'éthylène et de l'oxyde de propylène
éventuellement modifiés par adjonction de chaînes hydrophobes. Ces composés
sont particulièrement intéressants car ils apportent à la fois l'adaptation
des
propriétés élastiques de la membrane de tensioactifs et sa stabilisation par
effet
stérique. On peut citer à titre d'exemples non exhaustifs la famille des
Pluronic° et
Lutrol° (BASF), les hydroxystéararate de polyéthylène
(Solutol° de BASF ou
MYRJ° de ICI).
Enfin selon un dernier aspect, (invention concerne également un
procédé pour améliorer la stabilité d'un produit actif et éviter sa
dégradation,
caractérisé en ce qu'il consiste à encapsuler ledit produit actif au sein de
vésicules
multilamellaires telles que définies précédemment, présentant une structure en
oignon et constituées, de leur périphérie jusqu'à leur centre, de membranes
sous
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forme de bicouches concentriques comprenant au moins un agent tensioactif,
lesdites membranés étant séparées par un liquide interstitiel, lesdites
vésicules
incorporant en leur sein au moins un agent destiné à éviter la dégradation
dudit
produit actif.
Pour les raisons exposées précédemment l'invention trouve une
application particulièrement intéressante dans la stabilisation et/ou
l'immobilisation des enzymes.
Ainsi, (invention porte tout particulièrement sur un procédé pour
protéger et/ou immobiliser une enzyme selon lequel on encapsule ladite enzyme
au sein des vésicules multilamellaires à structure en oignon telles que
définies
précédemment, lesdites vésicules contenant en leur sein au moins un agent tel
que
défini précédemment destiné à éviter la dégradation de ladite enzyme.
Les excellents résultats obtenus en ce qui concerne la stabilisation
d'une l'enzyme, lorsque celle-ci se trouve incorporée au sein d'une vésicule
multilamellaire comprenant au moins un agent stabilisant choisi parmi les
tensioactifs, les molécules amphiphiles et les polymères, portant au moins une
fonction susceptible de se üer à ladite enzyme, ont semblé clairement liés à
l'existence d'une liaison par laquelle l'enzyme se trouve en quelque sorte
complexée à l'un des constituants des membranes de la vésicule. Ces résultats
ont
suggéré qu'une interaction du mëme type pourrait se produire entre la surface
d'une vésicule multilamellaire incorporant dans ses membranes un tel agent
stabilisant. Cette hypothèse a pu être confirmée par le fait qu'on a pu
également
constater un net effet de stabilisation d'une enzyme lorsque celle-ci se
trouve mise
en contact au sein d'une composition avec des vésicules multilamellaires à
structure en oignon dont la formulation est telle que leurs membranes
comprennent au moins un produit stabilisant choisi parmi les molécules
amphiphiles, les tensioactifs et les polymères, portant au moins une fonction
susceptible de se lier à ladite enzyme.
Ainsi donc, selon un autre aspect de la présente invention, elle
concerne également un procédé pour protéger et/ou immobiliser une enzyme selon
lequel on met ladite enzyme en présence de vésicules multilamellaires à
structure
en oignon, c'est-à-dire de vésicules constituées, de leur périphérie jusqu'à
leur
centre, de membranes sous forme de bicouches concentriques comprenant au
moins un agent tensioactif, lesdites membranes étant séparées par un liquide
interstitiel, lesdites vésicules incorporant en leur sein au moins un composé
dit
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agent stabilisant, portant au moins une fonction susceptible de se lier à
ladite
enzyme. Cet agent stabilisant est choisi parmi les molécules amphiphiles, les
tensioactifs et les polymères cités précédemment comme agent ayant un effet
stabilisant sur une enzyme encapsulée.
Les exemples qui suivent donnés à titre purement illustratif de
l'invention montrent comment il a été possible selon l'invention d'améliorer
ia
stabilité de différents actifs réputés fragiles.
Ces exemples font également référence aux figures 1 à 4
- la figure 1, donnée en référence à (exemple 1, donne les variations
de la concentration en vitamine C non dégradée en fonction du temps pour une
composition où la vitamine C est encapsulée, en comparaison avec une
composition où elle est libre ;
- la figure 2, donnée en référence à (exemple 3, illustre la stabilisation
de fascorbylphosphate de magnésium (APG) par co-encapsulation avec un agent
modifiant son pH ;
- la figure 3, donnée en référence à l'exemple 5, illustre ia stabilisation
de la trypsine par encapsulation dans des vésicules multilamellaires à
structure en
oignon contenant, à titre d'agent stabilisant, un agent tensioactif portant
une
fonction ammonium ;
- la figure 4, donnée en référence à (exemple 6, illustre la stabilisation
de la trypsine par encapsulation dans une vésicule multüamellaire à structure
en
oignon incorporant un tensioactif de la famille des esterquats.
EXEMPLES
Dans les exemples qui suivent, sauf indications contraires, les
proportions sont données en pourcentages en poids.
Exemple 1
Vitamine C
La vitamine C est très sensible à l'oxydation. La stabilisation a pu être
obtenue par encapsuiation dans des microvésicules multilamellaires, renforcées
par un polymère naturel réticulé (pectine) et co-encapsulation d'additifs
permettant
la stabilisation : séquestrant éliminant les traces d'ions métalliques
catalyseurs de
l'oxydation (EDTA), anti-oxydant (bisulfite de sodium) en procédant comme
indiqué ci-dessous
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a) Formulation
Com osants A
Pol sorbate 60 24
olate de sorbitan 20
Actate de vitamine E 5
Conservateur 1
Com osants B
Eau 37,5
Acide th lne diamine ttra acti0,08
ue
bisulfite de sodium 0,82
ectine 1,6
Acide ascorbi ue 10
b) Mode opératoire
S Les ingrédients B sont mélangés 30 min à température ambiante sous
agitation dans l'ordre de la liste. On obtient un gel translucide.
Les ingrédients A sont mélangés à température ambiante sous
agitation, puis le mélange B est ajouté en maintenant (agitation et la
température
ambiante. L'agitation est maintenue 2 h.
On obtient une pâte épaisse, qu'il faut disperser à 50% dans une
solution de chlorure de calcium, destinée à réticuler la pectine. Pour cela
une
solution aqueuse contenant 20 g/1 de CaCl2 est additionnée lentement à la pâte
maintenue sous agitation. On obtient une dispersion fluide laiteuse, dont
(observation au microscope montre la présence de vésicules biréfringentes.
c) Dosage
La dispersion de vésicules est rediluée dans Peau pour atteindre une
teneur en vitamine C de 5%. Cette dispersion est placée en étuve à 45°C
pour
suivre la stabilité. La teneur en vitamine C dans (échantillon est mesurée par
un
dosage à (iode.
Le résultat de la stabilisation est illustré par la courbe de la figure 1
donnant le taux de vitamine C en fonction du temps à 45°C pour la
dispersion de
vésicules (notée "encapsulée" sur La figure 1 ) dont la préparation est
décrite ci-
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dessus, en comparaison avec les résultats obtenus pour une simple dispersion
de
vitamine C à même concentration initiale dans l'eau (notée "libre" sur la
figure).
On remarque que, alors que la solution de vitamine C se dégrade
continuellement, la vitamine C encapsulée reste à 80% de sa quantité initiale
pendant plus de 45 jours à 45°C.
Exemple 2
Vitamine A et vitamine E
a) Formulation
Com osant
A Palmitate de saccharose40
B Linolate de 1 crol9
C Palmitate de Vitamine15
A
D Actate de vitamine1
E
E Eau 34
F Conservateur 1
b) Mode opératoire
B, C, D et F sont mélangés à température ambiante pendant 10 min.
On additionne ensuite délicatement A en maintenant l'agitation. Lorsque A est
complètement incorporé, on additionne E puis la température est augmentée à
65°C et maintenue pendant 1 h. La température est ensuite baissée à 40
°C en
maintenant l'agitation, sur un intervalle de temps de 2 h.
On obtient une pâte homogène biréfringente montrant en observation
au microscope une texture fine et réguliëre caractéristique.
c) Résultats
Le suivi par HPLC a clairement permis de mettre en évidence
l'amélioration de la stabilité de la vitamine A du fait de son encapsulation
dans des
vésicules contenant, en outre, de la vitamine E.
Exemple 3
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- WO 99/27907 2I PCT/FR98/02579
Ascorbyl phosphate de magnésium (APGI
Ce composé est un dérivé de la vitamine C, plus stable que l'acide
ascorbique, mais cependant peu stable en dessous de pH = 7,5. Cela pose un
problème en cosmétique car le pH de la peau est de 5,5, et il est préférable
que le
produit cosmétique ait un pH voisin de celui de la peau.
Dans ce cas, l'encapsulation est effectuée dans des microvésicules de
tensioactifs non-ioniques. L'APG est préalablement dissous dans un milieu
tartrate
de sodium, co-encapsulé dans les vésicules, apportant la stabilisation, en
procédant comme indiqué ci-dessous. La courbe de dégradation à 45°C, de
l'APG
libre et encapsulé, à pH= 5,5 est donnée sur la figure 2 qui donne le
pourcentage
d'APG non dégradé en fonction du temps.
a) Formulation
Composant
Pol sorbate 60 12
Starate de sorbitan 34
Actate de toco hrol 4
Solution A 49
Conservateurs 1
Solution A
Acide tartrique : 2.88%
APG : 28%
Eau : 69. I2%
b) Mode opératoire
La solution A est préparée préalablement par dissolution de l'acide
tartrique dans l'eau, ajustement du pH à 7,3-7,5 par addition de soude 6N, et
introduction lente sous agitation à température ambiante de fAPG en poudre.
Les tensioactifs, la vitamine E et le conservateur sont mélangés sous
agitation à 70°C. Lorsque le mélange est fondu et homogène, la solution
A est
ajoutée lentement sous agitation à cette température. Lorsque l'incorporation
est
complète, Ie chauffage est arrêté, et la température abaissée jusqu'à
l'ambiante,
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sous agitation, pendant 1 h.
c) Stabilité
La stabilité du produit est suivie par dosage à l'iode de la vitamine C
dans une dispersion aqueuse à 3% d'APG, soit libre, soit encapsulé dans les
vésicules multilamellaires. Les résultats sont donnés sur la figure 2.
On constate que la dégradation de l'APG encapsulé est plus de 10 fois
plus lente que celle de fAPG libre à ce pH (par la mesure du temps de demi
dégradation).
Exemple 4
Hydroquinone et ses dérivés
L'hydroquinone et ses dérivés stint couramment utilisés en
photographie comme développateur, mais aussi en cosmétique comme agent
éclaircissant de la peau. Ce sont des molécules fortement réductrices, qui
s'oxydent donc facilement à l'air ou en milieu aqueux.
De la méthylhydroquinone a été encapsulée dans des vésicules de
tensioactifs non ioniques encapsulant du bisulfite de sodium comme anti-
oxydant.
a) Formulation
Vésicules
Composant
Pol sorbate 60 10
Starate de sorbitan 40
GI crol 34
Mth 1 h dro uinone 16
Dispersion
Composant
Pte de vsicules 50,0
Bisulfite de sodium . 0,05
Conservateur 0, g
Eau ermute 49,15
b) Mode opératoire
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Toutes les opérations (préparation, transfert et dispersion) sont
effectuées sous atmosphère d'argon.
La méthyl-hydroquinone est préalablement dissoute dans le glycérol, à
raison de 32 % de méthyl-hydroquinone pour 68 % de glycérol par mélange à
S 90°C pendant 30 min
Dans un émulsionneur muni d'une agitation mécanique avec une pale
râcleuse, on mélange les deux tensioactifs et on chauffe à 70°C.
Lorsque les
tensioactifs sont fondus, on additionne la solution de méthyl-hydroquinone
dans le
glycérol et on maintient le mélange 30 min à cette température. Le chauffage
est
ensuite arrêté pour laisser la température revenir à l'ambiante sous
agitation. On
obtient une pâte homogène blanche, dont l'observation en microscopie optique
en
lumière polarisée montre la texture biréfringente caractéristique de la
présence de
microvésicules.
La dispersion est effectuée par addition lente dans un erlenmeyer muni
1 S d'une pâle d'agitation mécanique de la solution de dispersion (eau dégazée
et
bisulfite de sodium) sur la pâte précédente, à température ambiante sous
agitation
continue. Le conservateur est additionné en une seule fois à la fin de
l'addition de
solution aqueuse. L'agitation est maintenue environ 2 h pour obtenir une
dispersion complète. L'observation au microscope optique montre une dispersion
de vésicules légèrement biréfringentes.
c) Résultats
Le produit encapsulé ne montre qu'une légère coloration rose alors
qu'une solution de méthylhydroquinone noircit rapidement.
Exemple 5
Stabilisation d'une enzyme par encapsulation dans une vésicule contenant un
tensioactif portant une fonction ammonium
1) Principe du test de mise en évidence de la stabilisation des enzymes
Pour démontrer l'effet de stabilisation des enzymes, on mesure
(activité d'une enzyme encapsulée, en fonction du temps de vieillissement, par
comparaison avec (enzyme simplement mise en solution dans les mêmes
conditions de vieillissement. L'enzyme encapsulée étant inaccessible, il faut
préalablement la libérer pour pouvoir mesurer son activité. L'expérience
comporte
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donc quatre étapes
* préparation des échantillons
* encapsulation de l'enzyme et dispersion des vésicules contenant
(enzyme
* mise en solution à la même concentration de l'enzyme témoin
* mise en vieillissement de la dispersion de vésicules et de la solution
témoin
* libération de l'enzyme des vésicules
* mesure de l'activité enzymatique de (échantillon testé et de (échantillon
témoin.
L'activité enzymatique est évaluée par une méthode classique de suivi
de la réaction de dégradation d'un substrat caractéristique de l'enzyme.
2) Conditions de l'essai
a) Enzyme
L'enzyme utilisée est la trypsine, c'est une sérine protéase (comme les
protéases utilisées dans les détergents). Sa masse est de 23000 g/mol et sa
taille est
comprise entre 20 et 40 ~.
Conditionnée sous forme lyophilisée, on la solubilise dans du tampon
sous forme d'une solution à 4% en masse. C'est cette solution à 4% qui est
utilisée
dans les préparations.
Pour les mesures, les échantillons témoins sont préparés en prenant
50.1 (SO mg) de cette solution pour 5 g de solution finale soit une teneur en
enzyme dans la solution finale de 0.04% en masse.
b)Vésicules
La teneur massique en enzyme dans les vésicules est de 0.15%. Sauf
indication contraire, les vésicules sont préparées par mélange à température
ambiante des tensioactifs puis incorporation de la solution aqueuse d'enzyme.
On
obtient ainsi une pâte visqueuse, de texture biréfringente caractéristique
(observation au microscope optique en lumière polarisée). Cette pâte est
dispersée
par addition lente d'eau sous agitation à température ambiante.
Pour les mesures d'activité, toutes les dispersions de vésicules ont une
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teneur de 2% en vésicules. La teneur en enzyme de la dispersion de vésicules
est
donc de 0,04%.
c) Tampon
C'est un tampon phosphate de composition
NaCI : 8 g/1
KCl : 0.2g/1
Na2HP04 : 1.15 g11
KH2PO4 : 0.2 g/1
Le pH est compris entre 7.5 et 8 .
d) Substrat
On utilise comme substrat le N-Benzoyl L arginyl ethyl ester (BASE)
qui est un substrat classiquement utilisé pour étudier l'activité de la
trypsine dans
la mesure où l'on sait que sa décomposition est catalysée par la trypsine. Le
produit de réaction absorbe dans fW.
e) Mesure d'activité
Elle est réalisée de la façon suivante
e 1. Destruction des vésicules
On prélève 251 d'échantillon et on ajoute 20 pl de solution de triton
X100 {Sigma) à 10%. On laisse agir environ 30 secondes.
e2. Mesure de l'activité enzymatigue
On prélève 371 de solution de substrat à 0,024 moUl, on ajoute 950 pl
de tampon et 22,5 pl d'échantillon. On suit la cinétique pendant 10 minutes à
une
longueur d'onde de 253 nm et à 20°C.
Le vieillissement des échantillons est effectué en étuve, à la
température de 37°C.
3) Formulation testée
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Agents tensioactifs utilisés
Polysorbate 60 : Polyoxyéthylène (20) sorbitan monostéarate.
DODMAB : bromure de diméthyl dioctadécyl ammonium.
Formulation
~ 15% solution aqueuse d'enzyme.
~ 35% eau
~ 25% DODMAB.
~ 25% Polysorbate 60.
Préparation
Les tensioactifs et la solution d'enzyme sont mélangés grossièrement à
température ambiante, puis le mélange est introduit dans une cellule de type
Couette en procédant selon le brevet W093/19735.
Le cisaillement est réalisé à 25 °C pendant 20 minutes, à un taux
compris entre 50 et 100 s-~ .
4) Résultats
La dégradation de l'enzyme est suivie par spectroscopie UV.
La figure 3 représente les variations de (activité enzymatique au cours
du temps pour l'enzyme encapsulée, en comparaison avec les variations
observées
pour l'enzyme libre. L'activité initiale est fixée arbitrairement à 100 pour
le tracé
de la courbe.
La figure 3 met clairement en évidence la stabilisation de (enzyme du
fait de son encapsulation.
Exemple 6 : Stabilisation d'une enz~me_par encapsulation dans une vésicule
contenant un esterquat
On procède comme dans l'exemple 5. Le tensioactif utilisé dans cet
exemple fait partie de la famille des esterquat. Il s'agit du : N ,N di(" acyl
" oxy-2-
éthyl), N-hydroxy-2-éthyl, N-méthyl amonium methosulfate en solution dans
fisopropanol commercialisé par CECA sous la marque Noxamium 920.
Formulation (en pourcentages en poids)
CA 02313029 2000-06-O1
_ - WO 99/27907 2~ PCT/FR98/02579
solution aqueuse d'enzyme 15%
eau 35%
Noxamium 920 50%
Préparation
La préparation des vésicules est analogue à celle de (exemple 5.
La figure 4 représente les variations de l'activité enzymatique au cours
du temps pour l'enzyme encapsulée en comparaison avec les variations observées
pour l'enzyme Libre. L'activité initiale est arbitrairement fixé à 100.
Cette figure met clairement en évidence la stabilisation de l'enzyme du
fait de son encapsulation.
