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NOUVEAUX AGENTS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLÉIQUES.
COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention concerne de nouveaux composés utiles comme agents
de transfert d'acides nucléiques dans les cellules. Ces nouveaux composés sont
plus
particulièrement apparentés à la famille des lipopolyamines, et comportent au
moins
une fonction amidine cyclique. Ils sont utiles pour la transfection des acides
nucléiques dans différents types cellulaires, aussi bien in vitro que ex vivo
ou in vivo.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer
efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une
nécessité. Il peut
s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par
exemple pour la
production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la
régulation
de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation
impliquant
l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des
cellules in
vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de
vaccins,
des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut
encore
s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des
approches de
greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le
transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur
réadministration ultérieure.
Différents types de vecteurs synthétiques ont été développés pour améliorer le
transfert des acides nucléiques dans les cellules. Parmi ces vecteurs, les
lipides
cationiques possèdent des propriétés intéressantes. Ces vecteurs sont
constitués d'une
partie polaire, cationique, interagissant avec les acides nucléiques, et d'une
partie
lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire. Des exemples
particuliers
de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques (DOTMA
Lipofectin~), certains détergents cationiques (DDAB), les lipopolyamines et en
particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5-
carboxyspermylamide
de la palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES), dont Ia préparation a été
décrite
par exemple dans la demande de brevet EP 394 111. Une autre famille de
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lipopolyamines est représentée par les composés tels que décrits dans la
demande de
brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence, et sont illustrës à
la figure
1.
Mais jusqu'à présent, les injections dans les tissus, et notamment les
muscles,
étaient souvent faites avec de l'ADN non-formulé afin de faciliter son entrée
dans les
cellules, l'association à des vecteurs synthétiques conduisant à des complexes
de taille
trop importante pour être incorporés dans les cellules.
C'est un des principaux problèmes que ta présente invention se propose de
résoudre. En effet, les composés selon l'invention possèdent l'avantage
inattendu de
présenter un niveau de transfection in vivo dans le muscle au moins équivalent
à celui
obtenu avec l'ADN non-formulé et en tout état de cause un très bon niveau de
transfection dans les autres tissus. L'association avec un composé selon
l'invention
protège l'ADN des dégradations par les nucléases et/ou des détériorations au
cours de
la lyophilisation, ce qui contribue à améliorer significativement la stabilité
des
formulations nucléolipidiques. De plus, une telle association permet une
libération
contrôlée lente des acides nucléiques.
Par ailleurs, les composés selon la présente invention appartiennent à la
famille
des lipides cationiques et portent une région cationique originale qui confère
aux dits
composés des propriétés améliorées, notamment une cytotoxicité réduite par
rapport
aux vecteurs cationiques de l'art antérieur. Cette partie cationique est en
effet plus
précisément réprésentée par une ou plusieurs polyamine particulière(s),
portant une ou
plusieurs fonctions amidine cycliques qui ont très probablement pour effet de
« délocaliser » les charges positives, rendant le composé globalement moins
cationique, avec les effets bénéfiques qui en découlent su le plan de la
toxicité.
Ainsi, un premier objet de l'invention concerne de nouveaux composés sous
forme D, L, ou DL, de formule générale (I)
CA-Rep R (I)
pour laquelle
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~O CA représente un groupement cycloamidine et ses formes mésomères de
formule générale (II)
,: .
,--~I--Rt (II)
~CHz m\X/~C~)n
pour laquelle
~ m, et n sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris entre 0 et 3
inclus et tels
que m+n est supérieur ou égal à I,
~ R, représente un groupement de formule générale (III)
--~(CH2)p y~(*) (III)
pour laquelle p et q sont des entiers indépendants l'un de l'autre compris
entre 0 et 10
inclus, Y représente un groupement carbonyle, amino, méthylamino, ou bien
méthylène, Y pouvant avoir des significations différentes au sein des
différents
groupements [(CH2)P Y], et (*) représente soit un atome d'hydrogène, soit est
le lieu
de liaison au groupement Rep,
étant entendu que RI peut être lié à n'importe quel atome de la formule
générale (II), y
compris Z, et qu'il y a un unique groupe Rl dans la formule (II),
~ X représente un groupement NR2 ou bien CHR2, R2 étant soit un atome
d'hydrogène
soit la liaison au groupe Rl tel que défini précédemment,
Z
~ Le groupement --' ~ -- représente
W
* I" cas : un groupement de formule générale (IV)
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NH
R'NI 'W' (I~
pour laquelle W' représente CHR"' ou bien NR"', et R" et R"' représentent
indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogëne, un méthyle, ou la liaison
au
groupe Rl tel que défini précédemment, ou bien
* 2""' cas : un groupement de formule générale (V)
NHR'
N~W' (V)
pour laquelle W' représente CHR"' ou bien NR"', et R' et R"' représentent
indépendemment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un méthyle, ou la liaison
au
groupe R~ tel que défini précédemment,
D Rep est absent ou est un répartiteur de formule générale (VI)
O
--~N--(CHy t (VI)
Ra R3
dont l'atome d'azote est rattaché aux atomes X, V, W, ou Z ou au substituant Y
du
groupe R, selon les cas, et
~ t est un entier compris entre 0 et 8 inclus,
~ r est un entier compris entre 0 et 10 inclus, r pouvant avoir des
significations
différentes au sein des différents groupements -NR,,-(CH)T ,
~ R3, qui peut avoir des significations différentes au sein des différents
groupements
IVR.~-(CH)~R3, représente un atome d'hydrogène, un groupement méthyle, ou un
groupement de formule générale (VII)
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-~-(CH2~--N-~g (VII)
Rs
pour laquelle u est un entier compris entre 1 et 10 inclus, s est un entier
compris entre
2 et 8 inclus pouvant avoir des significations différentes au sein des
différents
groupements -(CHZ)S NRs, et Rs est un atome d'hydrogène, un groupement CA tel
que
5 définis précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants
les
uns des autres et peuvent être différents, ou bien un groupement de formule
générale
(VII) étant entendu que les groupements de formule générale (VII) sont
indépendants
les uns des autres et peuvent avoir des significations différentes,
~ R4 est défini de la même façon que R3 ou bien représente un groupement CA
tel que
défini précédemment étant entendu que les groupements CA sont indépendants les
uns
des autres et peuvent être différents, et
m R est lié a la fonction carbonyle du groupement Rep de formule générale
(VI), ou bien si Rep est absent R est lié directement au groupement CA, et
représente
* soit un groupement de formule NR6R~ pour laquelle R6 et R~ représentent
indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un radical aliphatique
saturé
ou non, linéaire ou ramifiée, éventuellement fluoré, contenant 1 à 22 atomes
de
carbone, avec l'un au moins des deux substituants R6 ou RT différent de
l'hydrogène et
l'autre contenant entre 10 et 22 atomes de carbone,
* soit un dérivé de stéroïde,
* soit un groupement de formule générale (VIII)
-~NH (CHz)~Q (VIII)
pour laquelle x est un entier compris entre 1 et 8 inclus, y est un entier
compris entre 1
et 10 inclus, et soit Q représente un groupement C(O)NR~R~ pour lequel R6 et
R~ sont
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définis comme précédemment, soit Q représente un groupement C(O)RS pour lequel
Rg représente un groupement de formule (IX)
R
R6
~N~N~O~~ (IX)
l''~~ ~z
O
pour laquelle z est un entier compris entre 2 et 8 inclus, et R9 est un
radical aliphatique
S saturé ou non , éventuellement fluoré, contenant 8 à 22 atomes de carbone,
ou un
dérivé de stéroïde, et les deux substituants R6 sont, indépendamment l'un de
l'autre,
définis comme précédemment,
ou bien Rg représente un groupement -O-R9 pour lequel R9 est défini comme ci-
dessus.
Selon une variante de l'invention, le groupement R~ est lié soit à Z soit à V
d'une part et au groupement Rep d'autre part par l'intermédiaire de Y.
Avantageusement, le groupement cycloamidine CA de formule (II) comporte
S, 6, 7 ou 8 chaînons.
Par ailleurs, dans une autre variante de l'invention, Rep est un répartiteur à
1,
2, ou 3 « bras ». On peut par exemple citer les répartiteurs suivants
s a F~ s
HN N~ HN N
O O
JdN l ld a la
Jd 1a
N,
iJ' Ra ''~N'Rn
~'N ~ j
N O
Ra N v Ra
H
I~IH
Rs R
1S
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4
~~""N
~a O Rs N O
b N
~N~
R4
Selon une seconde variante de l'invention, R3 représente un atome d'hydrogène
ou un méthyle et R4 est tel que défini précédemment, ou bien R3 et R.~ présent
dans la
formule (VI) représentent des atomes d'hydrogène, ou bien R,, est un atome
d'hydrogène et R3 est un groupement de formule (VII) dans laquelle RS
représente un
groupement CA
Préférentiellement, dans la formule (V), p et q sont choisis indépendamment
l'un de l'autre parmi 2, 3 ou 4.
De manière générale, le groupement R contient au moins un segment
hydrophobe. On entend au sens de l'invention par « segment hydrophobe » tout
groupement de type lipidique, favorisant la pénétration cellulaire. En
particulier, le
groupement R contient au moins une chaîne aliphatique ou au moins un dérivé de
stéroïde.
Selon une variante préférée, le groupement R représente un groupement de
formule NR6R~, R6 et R~ étant définis comme précëdemment, ou bien représente
un
groupement de formule générale (VIII) dans laquelle Q représente un groupement
C(O)NR6R~, R6 et R~ étant définis comme précédemment.
Préférentiellement, R6 et/ou R, représentent indépendamennt l'un de l'autre
une chaîne aliphatique linéaire saturée ou insaturée contenant 10 à 22 atomes
de
carbone, de préférence en 12, 14, 16, 17, 18, ou 19 atomes de carbone. II
s'agit par
exemple des groupements (CH2)"CH3, (CH2),3CH;, (CH2)isCH3, (CH2)mCH3, oléyl
etc.. .
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les groupes Rb et R~ sont
identiques ou différents et représentent chacun une chaîne aliphatique saturée
ou non,
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linéaire ou ramifiée, éventuellement fluorée, contenant 10 à 22 atomes de
carbone,
telle que définie au paragraphe précédent.
Lorsque R représente un dérivé de stéroïde, celui-ci est avantageusement
choisi
parmi le cholestérol, le cholestanol, le 3-a-5-cyclo-5-a-cholestan-6-(3-0l,
l'acide
cholique, le cholestérylformiate, le chotestanylformïate, le 3a,5-cyclo-Sa-
cholestan-
6[3-yl formiate, la cholestérylamine, la 6-(I,5-diméthylhexyl)-3a,5a-diméthyl-
hexadécahydrocyclopenta[aJcyclopropa[2,3 Jcyclopenta[ 1,2-fJnaphta-lèn-10-
ylamine,
ou la cholestanylamine.
Ces nouveaux composés de formule générale (I) peuvent se présenter sous
forme de sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non
toxiques
comprennent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique,
sulfurique,
bromhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides
acétique,
propionique, succinique, maléfique, hydroxymaIéique, benzoïque, fumarique,
méthanesulfonique ou oxalique) ou avec les bases minérales (soude, potasse,
lithine,
chaux) ou encore avec les bases organiques (amines tertiaires comme la
triéthylamine,
la pipéridine, la benzylamine).
A titre d'exemple illustrant des composés préférés selon l'invention, on peut
citer les composés de formules suivantes
n
HN"N
~NH
Composé (1)
N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2-imino-tétrahydro-pyrimidin-
1-yl)-butylamino)propylamino }-acétamide
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n
.~~H-~,~r'''
composé (2)
N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2- { 3-[4-(2-imino-tétrahydro-pyrimidin-
1-yl)-butylamino)propylamino}-acétamide
0
~~N~Ni~N~N~N~N
CN H H H O
H
Composé (3)
2-(3-{4-[3-(4, 5-dihydro-1 H-imidazol-2-ylamino)-propylamino)-butyIamino }-
N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acétamide
n
NYNH
HN
O
~~N~N~N~N~N
~'N,H H ~O
Composé (4I
2-(3-{bis-[3-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-ylamino)-propyl)-amino }
-propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acétamide.
0
N~N~N~N~N~N
~NH H ~O
Composé (5)
N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{ 3-[3-( I,4, 5,6-tétrahydropyrimidin
-2-ylamino)-propylamino)propylamino }-acétamide
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0
N~N~N~N~~~N
~NH ~O
Composé (6)
N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-t 3-[3-( 1,4, 5,6-tétrahydropyrimidin
-2-ylamino)-propylamino]propylamino }-acétamide
Les composés de l'invention peuvent être préparés de différentes façons. Selon
une première méthode, les composés de l'invention peuvent être obtenu par
synthèse
des lipopolyamines analogues (c'est-à-dire la même structure mais sans
groupement
5 cycloamidine), la cyclisation en groupements cycloamidine étant effectuée
dans un
second temps. Les lipopolyamines analogues peuvent être obtenues par toute
méthode
connue de l'homme du métier, et notamment selon les méthodes décrites dans la
demande WO 97/18185 ou par des méthodes analogues. La cyclisation des têtes
amidine peut par exemple être effectuée par réaction entre une et/ou plusieurs
amines
10 primaires de la lipopolyamine et des réactifs tels que l'hydrogénosulfate
d'O-
méthylisourée sulfate [J. Med. Chem., 1995, 38(16), pp. 3053-3061] ou le
semisulfate
de S-méthylisothiourée [Int. J. Pept. Prot. Res., 1992, 40, pp. 119-126]. De
préférence, on opère en milieu aqueux en présence d'une base à chaud [J. Med.
Chem., 1985 , pp. 694-698 et J. Med. Chem., 1996, pp. 669-672]. A titre de
solvant
préféré, on peut citer les mélanges eau/alcool ou le diméthylformamide. A
titre de
base, on peut utiliser la triéthylamine, la N-éthyldüsopropylamine, la soude,
la potasse
etc... La température est comprise de préférence entre 40°C et
60°C, et encore plus
préférentiellement, la réaction est mise en oeuvre à 50°C.
Une autre méthode consiste à effectuer une synthèse de briques portant la
fonction cycloamidine qui sont ensuite greffées) sur des lipides équipés de
répartiteurs. Cette méthode présente l'avantage d'accéder à un nombre
important de
produits. Au sens de l'invention, on entend par « briques » tout segment
fonctionnel de
la molécule. Par exemple, le groupement cycloamidine CA tel que défini dans la
formule générale (II), Rep ou encore R constituent des briques distinctes les
une des
autres au sens de l'invention.
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A titre d'exemple, on peut par exemple procéder de la façon suivante
1) Synthèse de fa brique R
a) Lorsque R représente -NR6R,, soit il est disponible commercialement, soit
il peut
être synthétisé selon l'une des méthodes suivantes
~ par réduction alkylative entre une amine portant le groupe R6 et un aldéhyde
portant
le groupe R~. On opère de préférence dans un solvant chloré (par exemple le
dichloromethane, le chloroforme, le dichloro-1,2-éthane etc... [J. Org. Chem.,
1996,
pp. 3849-3862]) ou dans tout autre solvant organique compatible avec la
réaction (par
exemple du tétrahydrofuranne), en présence de triacétoxyborohydrure de sodium,
cyanoborohydrure de sodium ou ses dérivés (par exemple le cyanoborohydnure de
lithium) [J.Am. Chem. Soc., 1971, pp. 2897-2904] et d'acide acétique.
~ ou bien par substitution d'un groupe partant porté par R6, par une amine
portant le
groupe R~. A titre d'exemple de groupe partant, on peut citer les atomes
d'halogène
(Br, Cl, I) ou les substituants tosyl, mésyl, etc... On opère de préférence en
présence
d'un réactif basique, par exemple du carbonate de sodium, de la potasse, de la
soude
de la triéthylamine etc..., dans un alcool (par exemple l'éthanol) au reflux
[J. Am.
Chem. Soc., 1996, pp. 8524-8530]
~ ou bien par couplage entre un acide gras (ou ses dérivés comme les chlorures
d'acide
gras par exemple ) et une amine grasse. L'amide obtenu est alors réduit par un
hydrure,
par exemple l'hydrure de lithium aluminium ou tout autre hydrure connu de
l'homme
du métier, dans un éther (par exemple le tétrahydrofuranne (THF), le t-
butylméthyléther (TBME), le diméthoxyéthane (DME), etc...).
b) Lorsque R représente un groupement de formule générale (VIII), on effectue
le
couplage peptidique entre le groupement Q et H-[NH-(CH2)X]YCOOH. Le couplage
peptidique est effectué selon les méthodes classiques connues de l'homme du
métier
(Bodanski M., Principles and Practices of peptide Symhesis, Ed. Springe-
Verlag)
ou par toute méthode analogue connue. Notamment, la réaction peut s'effectuer
en
présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables
(comme le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone,
l'acétonitrile,
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le dichlorométhane etc...), à température comprise entre 0 et 100 °C,
le pH étant
ajusté entre 9 et 11.
Q est soit disponible commercialement, soit lorsque Q représente un groupement
C(O)R8 avec R8 de formule (IX), il peut être synthétisé par réaction entre un
chloroformiate commercial (par exemple le cholestérylchloroformiate) ou obtenu
selon
les méthodes classiques connues de l'homme du métier à partir d'un
chloroformiate
commercial, et une diamine commerciale (par exemple la N-éthylènediamine) ou
obtenue selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. De
préférence,
on opère dans un solvant chloré (par exemple le dichloromethane, le
chloroforme, le
dichloro-1,2-éthane etc...) ou dans tout autre solvant organique compatible
avec la
réaction comme par exemple le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde,
l'acétonitrile
etc...
Le groupement H-[NH-(CH2)x]y-COOH est un acide aminé commercial lorsque y est
égal à 1, ou bien est obtenu par une ou plusieurs réactions de cyanoéthylation
selon les
méthodes décrites ci-après dans la synthèse de Rep lorsque y est supérieur à
1.
2) Synthèse de la brique Rep
Le groupement Rep est obtenu par cyanoéthylation ou par dicyanoéthylation
(selon
que l'on souhaite obtenir une structure de Rep linéaire ou branchée) d'un
acide aminé
de formule HOOC-(CH2)r NH2 puis par réduction des fonctions nitriles en
amines.
a) mono- ou di-cyanoéthylation
CN
r-1 CN r-1
HOOC-(CH2)r-NH2 + 1 ou 2 ~ R~ H
ou CN
R'
r-1
. R'-N
r-
CN
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De préférence, on opère en milieu aqueux basique. Par exemple, la réaction est
effectuée dans des solvants comme l'eau, les alcools (par exemple le méthanol
,
l'éthanol etc...) en présence d'une base telle que la soude, la potasse , la
triéthylamine
etc... Dans le cas de la monocyanoéthylation, on travaille de préférence à
froid [J. Am.
Chem. Soc., 1950, pp. 2599-2603]. Dans le cas de la dicyanoethylation, on
travaille de
préférence à chaud et avec un excès d'acrylonitrile [J. Am. Chem. Soc., 1951,
pp.
1641-1644]
b) La réduction des fonctions nitriles en amines est effectuée par
hydrogénation
catalytique en milieu basique ou par toute autre méthode connue de l'homme du
métier. A titre d'exemple, on peut utiliser de l'oxyde de platine ou encore du
nickel de
Raney [J. Org. Chem., 1988, pp. 3 I 08-3 I I 1 ] comme catalyseur. De
préférence, le
solvant choisi est un alcool (par exemple le méthanol, l'éthanol etc...) en
présence
d'une base, par exemple de la soude, de la potasse etc...
3) Synthèse de la brique Rep-R
La brique Rep-R est obtenu par couplage peptidique entre l'acide Rep et
l'amine R
obtenus aux étapes précédentes.
Le couplage peptidique est effectué selon les méthodes classiques connues de
l'homme
du métier (Bodanski M., Principles and Practices of peptide Synthesis, Ed.
Springe-
Verlag) ou par toute méthode analogue connue. Notamment, la réaction peut
s'effectuer en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants
aprotiques
convenables (comme le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone,
l'acétonitrile, le dichlorométhane etc...), à température comprise entre 0 et
100 °C, le
pH étant ajusté entre 9 et 1 I.
4) Synthèse des composés seton l'invention CA-Rep-R
Les composés selon l'invention sont obtenus selon plusieurs méthodes possibles
a) par couplage en milieu basique entre l'amine terminale présente sur Rep-R
obtenu à
l'étape précédente, et CA-S-CH~, selon les méthodes classiques connues de
l'homme
du métier. On opère de préférence dans un solvant chloré (par exemple le
dichlorométhane, le chloroforme etc...) ou dans d'autres solvants organiques
compatibles avec la réaction comme par exemple l'eau, les alcools, le
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diméthylformamide etc..., en présence d'une base (par exemple la
triéthylamine, la
soude, la potasse, la N-éthyldüsopropylamine etc...). et à température
ambiante (20°C
environ).
La brique CA-S-CH3 est soit disponible commercialement (c'est le cas par
exemple de
l'hydroiodure de 2-méthylthio-2-imidazoline}, soit elle peut être obtenue par
action
d'un disulfure de carbone sur une diamine appropriée (c'est-à-dire choisie en
fonction
du groupement cycloamidine qu'on souhaite obtenir), suivie d'une méthylation.
Par
exemple, le schéma réactionnel peut être illustré de la façon suivante
n ~z CSZ ~ n NH
N/ _S
H
n NH MeX ~ n N
N/\S
H H
De préférence, le processus réactionnel est mis en oeuvre dans un alcool (par
exemple
l'éthanol). L'étape de méthylation est effectuée par action d'un
halogénométhyle,
l'atome d'halogène pouvant être par exemple un atome d'iode [J. Am. Cem. Soc.,
1956, pp. 1618-1620 et Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, pp. 351-354].
b) par cyclisation interne du groupement cycloamidine à partir des fonctions
amino
présentes sur Rep-R, par action d'hydrogénosulfate d'O- méthylisourée ou de
semisulfate de S-méthylisothiourée. De préférence, on opére en milieu aqueux
en
présence d'un base à chaud [J. Med. Chem., 1985 , pp. 694-698 et J. Med.
Chem.,
1996, pp. 669-672). A titre de solvant préféré, on peut citer les mélanges
eau/alcool
ou le diméthylformamide. A titre de base, on peut utiliser la triéthylamine,
la N-
éthyldüsopropylamine, la soude, la potasse etc... La température est comprise
de
préférence entre 40°C et 60°C, et encore plus
préférentiellement, la réaction est mise
en oeuvre à 50°C.
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c) par couplage peptidique entre CA-COOH et Rep-R selon les méthodes
classiques
connues de l'homme du métier, comme décrit précédemment.
La brique CA-COOH peut être obtenue de différentes manières
~ par action d'une brique CA-S-CH3 sur un acide aminé ou un acide polyaminé
S selon les méthodes connues de l'homme du métier ou par tout autre méthode
analogue
[J. Am. Chem. Soc., 1956, pp. 1618-1620]. La brique CA-S-CH3 est obtenue de la
même façon que précédemment, et l'acide aminé ou polyaminé est choisi en
fonction
du composé selon l'invention souhaité, ou bien
~ par action d'un S,S-diméthyl-tosyl-iminothiocarbonimidate ou de l'un de ses
10 dérivés sur un acide polyaminé selon les méthodes connues de l'homme du
métier ou
par tout autre méthode analogue [J. Org. Chem., 1971, pp. 46-48J. De
préférence on
opère en milieu éthanolique en presence d'une base (par exemple la soude) et à
la
température de reflux du mélange.
A titre d'exemple de briques CA-COOH pouvant être obtenues par l'une des
15 méthodes décrites ci-dessus, on peut citer les briques suivantes
H H
N~H N ll
O N ~N~
O OH
OH ~H~
a b oH c
~O
N
OH
O
oH
d e
H
N ~O
fN
O OH
OH
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Dans toutes les réactions exposées précédemment, lorsque les substituants
amino présents dans les différents groupements peuvent interférer avec les
réactions
mises en oeuvre, il est préférable de les protéger préalablement par des
radicaux
compatibles pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au reste de la
molécule.
A titre d'exemple, les radicaux protecteurs peuvent être choisis parmi Ies
radicaux
décrits par T.W. GREENE, Protective Gror~ps in Organic Synihesis, J. Wiley-
Interscience Publication ( 1991 ) ou par McOmie, Protective Groups irr Organic
Chemistry, Plenum Press ( 1973 ).
Un autre objet de l'invention concerne une composition comprenant au moins
un composé de formule (I) tel que défini précédemment. En particulier un autre
objet
selon la présente invention comprend un composé de formule (I) tel que défini
ci-avant
et un acide nucléique. Lorsque un composé selon l'invention et un acide
nucléique
sont mis en présence, ils forment un complexes par interaction entre les
charges
positives présentes à pH physiologique sur le composé selon l'invention et les
charges
négatives de l'acide nucléique. Ce complexe est appelé « complexe
nucléolipidique »
dans toute la suite. Préférentiellement, le composé selon l'invention et
l'acide nucléique
sont présents en quantités telles que le rapport des charges positives du
composé sur
les charges négatives de l'acide nucléique soit compris entre 0,1 et S0, de
préférence
entre 0,1 et 20. Ce rapport peut être ajusté aisément par l'homme du métier en
fonction du composé utilisé, de l'acide nucléique, et des applications
recherchées
(notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par « acide nucléique » aussi bien un acide
désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences
naturelles
ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire
(ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique
(ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-
synthétiques,
d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être
d'origine
humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc... Ils peuvent être
obtenus par toute
technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques,
par
synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification
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chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Tls
peuvent
être modiftés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent
être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou des
séquences
plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont avantageusement
constitués par
des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes d'expression, etc...
Ces acides
désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de réplication fonctionnelle
ou non
dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences
régulatrices de la
transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des
séquences
antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants
cellulaires,
etc...
De préférence, l'acide nucléique comprend une cassette d'expression constituée
d'un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle d'un ou
plusieurs
promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules
cibles.
On entend au sens de l'invention par « cassette d'expression d'un gène
d'intérêt » un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sîtes
de
restriction spécifiques. Le fragment d'ADN comprend une séquence d'acide
nucléique
codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt et comprend en outre les
séquences
nécesaires à l'expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de
polyadénylation
etc...) de ladite séquence. La cassette et les sîtes de restriction sont
conçus pour
assurer une insertion de la cassette d'expression dans un cadre de lecture
approprié
pour la transcription et la traduction.
Il s'agit généralement d'un plasmide ou d'un épisome portant un ou plusieurs
gènes d'intérêt thérapeutique. A titre d'exemple on peut citer les plasmides
décrits dans
les demandes de brevet WO 96/26270 et WO 97/10343 incorporées à la présente
par
référence.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment
tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le
produit
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protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce
produit
protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule
cible, c'est-
à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque
celle-ci ne
présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet
par
exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression
d'une
protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore
de
surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder
pour un
mutant çi'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité
modifiée, etc...
Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule
cible. Dans
ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une
activité
déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou
stimuler
une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut
citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones,
les
lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc... (FR 92/03120), les
facteurs de
croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de
synthèse, les
facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS,
HARP/pléiotrophine, etc...) les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc...,
FR
93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine
CFTR
associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb,
RaplA,
DCC, k-rev, etc..., FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués
dans la
coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation
de
l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de
l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du
métabolisme,
catabolisme etc...
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une
séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler
l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles
séquences
peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN
complémentaires
d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la
technique
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décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprenent
également les
séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire
sélectivement des
ARN cibles (EP 321 201 ).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou
plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez
l'homme
ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en
oeuvre,
l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements
immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des
microorganismes, des virus ou des cancers. II peut s'agir notamment de
peptides
antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Ban, du virus HIV, du virus de
l'hépatite B
(EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus",
d'autres virus
ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences
permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant
pour le
1 S peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des
séquences qui
sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces
séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. II peut
également
s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression
d'autres protéines,
ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de
gènes
eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices
issues du
génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de
séquences
promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par
exemple les
promoteurs des gènes E 1 A, MLP, CMV, RS V, etc... En outre, ces séquences
d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de
régulation, etc... Il peut aussi s'agir de promoteur, inductibie ou
répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en
amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le
produit
thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
Cette séquence
signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais
il peut
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également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une
séquence signal
artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal
dirigeant
le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la
cellule.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou plusieurs
5 adjuvants capables de s'associer aux complexes formés entre le composé selon
l'invention et l'acide nucléique, et d'en améliorer le pouvoir transfectant.
Dans un autre
mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions
comprenant un acide nucléique, un composé de formule (I) tel que défini ci-
avant et un
ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes nucléolipidiques
composé
10 (I)/acide nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence
de ce type
d'adjuvants (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre
avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés.
Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre
comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres. De telles compositions sont
15 particulièrement avantageuses, notamment lorsque le rapport de charges R
est faible.
La Demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet
d'améliorer
la formation des particules nucléolipidiques et de favoriser la pénétration de
la
particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la
présente
20 invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière
particulièrement
avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques
ou
dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. II peuvent
être
choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine
(DOPE),
l'oléoylpaimitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), Ies di-stéaroyl, -palmitoyl,
-
mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3
fois, les
phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les
cérébrosides
(tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que
notamment
les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les
asialoGMl et GM2).
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Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par
extraction
à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques
classiques bien
connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides
naturels peut être
réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger,
Biochemistry).
Plus récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également
particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un produit
intervenant ou
non directement au niveau de la condensation de l'acide nucléique (WO
96/25508). La
présence d'un tel produit, au sein d'une composition selon l'invention, permet
de
diminuer la quantité de composé de formule (I), avec les conséquences
bénéfiques qui
en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à
l'activité
transfectante. Par produit intervenant au niveau de la condensation de l'acide
nucléique, on entend définir un produit compactant, directement ou non,
l'acide
nucléique. Plus précisément, ce produit peut soit agir directement au niveau
de (acide
nucléique à transfecter soit intervenir au niveau d'un produit annexe qui lui
est
directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De
préférence, il
agit directement au niveau de l'acide nucléique. Par exemple, le produit
précompactant
peut être n'importe quel polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode
de
réalisation préféré, ce produit intervenant au niveau de la condensation de
l'acide
nucléique dérive en tout ou partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une
nucléoline
et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel produit peut également être constitué,
en tout ou
partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des
motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon
l'invention,
ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils
peuvent
être séparés par des liens de nature biochimique, par exemple par un ou
plusieurs
acides aminés, ou de nature chimique.
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20
équivalents d'adjuvant(s) pour un équivalent d'acides nucléiques en moUmol et,
plus
préférentiellement, de 0,5 à 5.
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Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions de
la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage permettant
d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être
un élément
de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'ADN vers
certains,
types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules
hépatiques,
cellules hématopoiétiques...}. II peut également s'agir d'un élément de
ciblage
intracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers
certains
compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau etc...). L'élément
de
ciblage peut être lié au composé selon l'invention ou également à l'acide
nucléique
comme cela a été précisé précédemment.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on
peut
citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les
lipides, les
neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés.
Préférentiellement, il
s'agit de sucres de peptides ou de protéines tels que des anticorps ou des
fragments
d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-
ci, des
récepteurs ou des fragments de récepteurs, etc... En particulier, il peut
s'agir de ligands
de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines, de
récepteurs de
type lectines cellulaires, ou de ligands à séquence RGD avec une affinité pour
les
récepteurs de protéines d'adhésion comme les intégrines. On peut également
citer les
récepteurs de la transferrine, des HDL et des LDL, ou le transporteur du
folate.
L'élément de ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des
lectines tels
que les récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux syalydés tel que le sialyde
Lewis X,
ou encore un fragment Fab d'anticorps, ou un anticorps simple chaîne (ScFv}.
L'association des éléments de ciblage aux complexes nucléolipidiques de
l'invention peut être effectuée par toute technique connue de l'homme du
métier, par
exemple par couplage à une partie hydrophobe ou à une partie qui interagit
avec
l'acide nuciéique du composé de formule générale (I} selon l'invention, ou
encore à un
groupement qui interagit avec le composé de formule générale (I) selon
l'invention ou
avec l'acide nucléique. Les interactions en question peuvent être, selon un
mode
préféré, de nature ionique ou covalente.
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Selon une autre variante, les compositions de l'invention peuvent aussi
incorporer au moins un agent dé surface non-ionique en quantité suffisante
pour
stabiliser la taille des particules de complexes nucléolipidiques composé de
formule
générale (I)/acide nucléique. L'introduction d'agents de surface non-ionique
prévient la
S formation d'agrégats, ce qui rend la composition plus particulièrement
adaptée à une
administration in vivo. Les compositions selon l'invention incorporant de tels
agents de
surface présentent un avantage sur ie plan de l'innocuité. Elles présentent
également un
avantage supplémentaire en ce sens qu'elles diminuent le risque
d'interférences avec
d'autres protéines compte tenu de la réduction de la charge globale des
compositions
de complexes nucléolipidiques.
Les agents de surface sont constitués avantageusement d'au moins un segment
hydrophobe, et d'au moins un segment hydrophile. Préférentiellement, Le
segment
hydrophobe est choisi parmi les chaînes aliphatiques, les polyoxyalkylène, les
polyester
d'alkylidène, les polyéthylène glycol à tête polyéther benrylique et le
cholestérol, et le
segment hydrophile est avantageusement choisi parmi les polyoxyalkylène, les
alccols
polyvinyliques, les polyvinylpyrrolidones ou les saccharides. De tels agents
de surface
non-ioniques ont été décrits dans la demande WO 98/34648.
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés de formule
générale (I) tels que définis ci-avant pour fabriquer un médicament destiné à
soigner
les maladies par transfert d'acides nucléiques (et plus généralement de
polyanions)
dans les cellules primaires ou dans les lignées établies. II peut s'agir en
particulier de
cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrcytes,
cellules glyales),
hépatiques, de la lignée hématopoiétique (lymphocytes, CD34, dendritiques
etc...),
épithéliales, etc..., sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Une telle utilisation est particulièrement avantageuse car les composé de
formule générale (I) selon l'invention présentent une cytotoxicité réduite par
rapport
aux lipides cationiques de l'art antérieur. La Demanderesse a notamment mis en
évidence qu'à des rapports de charges très élevés entraïnant habituellement la
mort des
animaux consécutivement à la transfection, aucune cytotoxicité apparente
n'était
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décelée. Les composés selon l'invention peuvent être utilisés notamment pour
la
transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'acides nucléiques. Pour des
utilisations in
vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la
création
de modèles animaux de pathologies, les compositions selon (invention peuvent
être
formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale,
vaginale,
parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée,
intraoculaire,
transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc... De préférence, les
compositions
de (invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une
formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de
l'organe
désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse).
Il peut
s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions
sèches,
notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de
sérum
physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses
d'acide
nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations
peuvent être
adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du
mode
d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou
encore de
la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le
mode
d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus,
par exemple
au niveau des tumeurs, ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de
cellules en
culture suivi de leur réimplantation irr vivo, par injection ou greffe. Les
tissus
concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles,
la peau,
le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le
coeur, la
lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie,
l'estomac, les
intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les
yeux, les glandes,
les tissus conjonctifs, etc... Avantageusement, les tissus transfectés sont
les muscles et
les poumons.
L'invention concerne en outre une méthode de transfert d'acides nucléiques
dans les cellules comprenant les étapes suivantes
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé de formule
générale (I) tel
que défini ci-avant, pour former un complexe nucléolipidique, et
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(2) la mise en contact des cellules avec le complexe nucléolipidique formé en
(1).
La mise en contact des cellules avec le complexe nucléolipidique peut être
réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour des
utilisations in vitro
ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des
utilisations in
5 vivo). L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de
0,01 à
1000 pg d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo,
des
doses d'acide nucléique comprises entre 0,01 et 10 mg peuvent par exemple être
utilisées.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou
10 plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont
préalablement mélangés au composé de formule générale (I) selon l'invention ou
bien à
l'acide nucléique.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse
pour le traitement des maladies par administration d'un acide nucléique codant
pour
15 une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à
corriger ladite
maladie, ledit acide nucléique étant associé à un composé de formule générale
(I) tel
que défini précédemment, dans les conditions définies ci-avant. Plus
particulièrement,
cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un
produit
protéique ou nucléique, l'acide nucléique administré codant pour ledit produit
20 protéique ou étant transcrit en un produit nucléique ou encore constituant
ledit produit
nucléique.
L'invention s'étend à toute utilisation d'un composé de formule (I) selon
l'invention pour la transfection itt vivo, ex vivo, ou in vitro de cellules.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également
25 d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et
figures qui
suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en
limiter la
portée. Notamment, la Demanderesse propose à titre non-limitatif divers
protocoles
opératoires ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis
en oeuvre
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-02-200 FR 009900740
.. . .. .. .. ..
.. .. . . .. . .. . . ..
... . . . .. . . .. ..
. . . ..
.. ... .. .... .. ..
26
pour préparer les composés de formule générale (I). Bien entendu, il est à la
portée de
l'homme du métier de s'inspirer de ces protocoles et/ou produits
intermédiaires pour
mettre au point des porcédures analogues en vue de conduire à d' autres
composés de
formule générale (n selon l'invention.
S FIGURES
Figure 1 : Structure des vecteurs synthétiques dénommé lipide A, lipide B et
lipide C
dans la présente invention et décrits dans la demande de brevet WO 97/18185
incorporée à la présente par référence.
Fil Représentation schématique du plasmide pXI~774.
hisures 3 : Diagramme de phase des complexes nucléolipidiques composé (1)/ADN.
La liaison du composé (1) à fADN a été déterminée en suivant la diminution de
la
fluorescence (en %, 104°lo étant la fluorescence de fADN nu) du bromure
d'éthidium
(EtBr) (symbole ~, ligne pleine), comme décrit selon Taxe y situé à droite. La
taille
des particules de complexes (en nm) est indiquée sur Taxe y situé à gauche.
L'axe x
représente le rapport de charge agents de transfert/ADN. La taille des
complexes
nucléolipidiques sans co-lipide est représenté par le symbole t en ligne
pleine. La
taille des complexes nucléolipidiques contenant 25% de cholestérol est
représenté
par le symbole ~ en ligne discontinue. La taille des complexes
nucléolipidiques
contenant 40% de DOPE est représenté par le symbole ~ en ligne discontinue. La
méthode ne permet pas de déterminer la taille des particules au delà de 3 Eun.
Fisure 4 : Activité de transfert de gène in vitro dans des cellules HeLa des
complexes
nucléolipidiques cornenant le composé (1) selon la présente invention sans co-
lipide
barre du milieu en gris foncé), avec 25% de cholestérol (barre de gauche en
gris
moyen), et avec 40% molaire de DOPE (barre de doite en gris clair),
comparativement à fADN nu. Seuls les complexes nucléolipidiques dans lesquels
l'ADN est complètement saturé en composé selon l'invention et dont la taille
est
comprise entre 100 nm et 300 nm ont été utilisés.
FEUILLE MODIFI E
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Figure 5 : Activité de transfert de gène in vitro des complexes
nucléolipidiques
formés à partir du composé (3), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure
l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse,
figure le
rapport de charges entre le composé (3) et l'ADN en nmoUpg. L'expression a été
mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles}, avec
DOPE et
avec du cholestérol.
Figure 6 : Activité de transfert de gène in vitro des complexes
nucléolipidiques
formés à partir du composé (5), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure
l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse,
figure le
rapport de charges entre le composé (5) et l'ADN en nmoUUg. L'expression a été
mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles), avec
DOPE et
avec du cholestérol.
Fir~ure 7 : Activité de transfert de gène in vitro des complexes
nucléolipidiques
formés à partir du composé (6), dans des cellules HeLa. En ordonnée figure
l'expression de la luciférase, exprimée en pg par puit transfecté. En absisse,
figure le
rapport de charges entre le composé (6) et l'ADN en nmol/ug. L'expression a
été
mesurée à chaque fois pour des formulations sans co-lipide (micelles), avec
DOPE et
avec du cholestérol.
FiQUre 8 : Activité de transfert de gène in vivo après injection directe dans
le muscle
des complexes contenant le composé ( 1 ) selon la présente invention ou le
composé
de formule H2N(CH2)3NH(CH2)dNH(CH2)3NHCH2COArgN[(CH2)~7CH3j2 (appelé
lipide A » dans toute la suite) sans co-lipide (barre en gris foncé), avec 25%
de
cholestérol (barre en gris moyen), et avec 40% molaire de DOPE (barre en gris
clair), comparativement à l'ADN nu. Seuls les complexes dans lesquels l'ADN
est
complètement saturé en lipide et dont la taille est comprise entre 100 nm et
300 nm
ont été utilisés .
Figure 9 : L'importance de l'invention est illustrée en comparant l'activité
de transfert
de gène de deux lipides différents, le composé ( 1 ) selon l'invention et le
lipide A, et
de l'ADN nu via deux routes d'administration : par voie intraveineuse (iv) et
par voie
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intramusculaire (im). Seuls les complexes dans lesquels l'ADN est complètement
saturé en lipide et dont la taille est comprise entre 100 nm et 300 nm ont été
utilisés.
Fig-ure 10 : Activité de transfert de gène iu vivo 48 heures après injection
i.m. des
complexes nucléolipidiques contenant les composés (5) ou (6) selon la présente
invention sans co-lipide et à rapport de charge 0,25/1, comparativement à
l'ADN nu.
L'expression est exprimée en pg de luciférase par ml.
En partant de la gauche, les barres représentent : (a) contrôle négatif ; (b)
ADN nu ;
(c) Composé (5)et (d) composé (6).
MATERIEL ET METHODES
A\ MATÉRIEL
- Les acides aminés, polyaminés (ou leur dérivés) de départ sont disponibles
commercialement. C'est le cas par exemple de la N-(3-aminopropyl)glycine, N-(2-
cyanoethyl)glycine, ou encore de l'acide 2,4-diaminobutyric, ou peuvent être
synthétisées par des méthodes classiques connue de l'homme du métier.
- Les isothiourées cycliques sont également des produits commerciaux, comme
par
exemple l'hydroiodure de 2-méthylthio-2-imidazoline, ou peuvent être
synthétisées par
des méthodes classiques connues de l'homme du métier.
- Les amines substituées par un/des lipides) sont commerciales ou bien
synthétisées à
partir des amines et aldéhydes correspondants par réduction alkylative.
- Les produits tels que la triéthylamine, l'acide trifluoroacétique,
l'hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yloxytrïs(diméthylamino)phosphonium
(BOP), la diméthylaminopyridine (DMAP), le chloroformate de benzyle, le
dicarbonate
de di-tert-butyle sont des produits commerciaux. Les solutions de chlorure de
sodium
et de carnbonate de sodium sont saturées. La solution de sulfate de potassium
est
concentrée à 0, 5 M.
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B\ MÉTHODES
1) Mesures Phvsiaues.
Les spectres de RMN Proton ont été enregistrés sur des spectromètres Bruker
400 et
600 MHZ.
Les spectres de masse ont été réalisés sur un API-MS/III.
21 Méthodes de huritication et d'analyse
al Conditions de chromatographie en phase directe
- Les chromatographies sur couche mince (CCM) ont été effectuées sur des
plaques
de gel de silice Merck de 0,2 mm d' épaisseur.
Elles sont révélées soit aux U.V. (254 nm), à la ninhydrine, en vaporisant
(spray
léger) une solution éthanolique de ninhydrine (40 mg/100 cm3 d'éthanol) pour
révéler
les amines ou les amides en chauffant à 150°C, à la fluorescamine, en
vaporisant une
solution (40 mg/100 cm3 d'acétone) pour révéler les amines primaires, au vert
de
bromocrésol, en vaporisant une solution (0, I % dans le propanol-2) pour
révéler les
1 S acides, à la vanilline en vaporisant (spray léger) une solution
éthanolique de vanilline
(3 %) avec 3 % d'acide sulfurique suivi d'un chauffage à 120°C, ou à
l'iode en
recouvrant la plaque de poudre d'iode.
- Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur gel de silice 60
Merck de
granulométrie 0,063-0,200 mm.
bl Conditions de purification CLHP (Chromatographie Li~c uide Haute
Performance)
préparative
L'appareillage est un ensemble pour la chromatographie en phase liquide en
mode
gradient permettant une détection U. V. Cette chaîne préparative est composée
des
éléments suivants
Pompe A : G1LSON modèle 305 équipée d'une tête 50 SC.
Pompe B : GILSON modèle 303 équipée d'une tête 50 SC.
Boucle d'injection. : 5 ml.
Module de pression : GILSON modèle 806.
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Mélan~aeur : GII,SON modèle 811 C équipé d'une tête de 23 ml.
Détecteur UV : GIL,SON modèle 119 équipé d'une cellule préparative.
Collecteur de fraction : GILSON modèle 202 équipé de portoirs n° 21 et
de tube en
verre de 10 ml.
5 Intésrateur : SHIMADZU modèle C-R6A.
Colonne : Colonne C4 (10 mm) en acier inoxydable de 25 cm de longueur et de
2.2 cm
de diamètre commercialisée par VYDAC modèle 214 TP 1022.
La solution de produit à purifier est chargée sur la colonne par
l'intermédiaire de la
boucle d'injection, l'éluat est recueilli par fractions de un tube en 30
secondes. Le
10 détecteur est réglé aux longueurs d'onde de 220 nm et 254 nm.
les phases mobiles sont ainsi définie
Solvant A Solvant B
Eau déminéralisée 2500 cm3 Acétonitrile pour HPLC 2500 cm3
Acide trifluoroacétique 2 cm3 Acide trifluoroacétique 2,5 cm3
Gradient
Temps en minutes% de solvant % de solvantDbit en cm'/min
A B
0 90 10 18
10 90 10 18
110 0 100 18
120 0 100 18
cl Techniques de chromatoeraphie Analvtique
- Les analyses CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) ont été
réalisées
15 sur un appareil Merck-Hitachi équipé d'un intégrateur calculateur D 2500
HITACHI,
d'un autosampler AS-2000A, d'une pompe inteligent L-6200A, et d'un détecteur
UV-
vis L-4000 avec longueur d'onde réglable mise à 220 nm.
Les cotonnes pour les séparations analytiques sont des colonnes Browlee en
acier
inoxydable de 3 cm de longueur et de 0,46 cm de diamètre commercialisées par
20 APPLIED BIOSYSTEM.
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La phase stationnaire est constituée par de fAquapore Butyl ? micron. Les
phases
mobiles sont l'eau (avec de l'acide trifluoroacétique) et facétonitrile (avec
de l'acide
trifluoroacétique). Les injection sont de 20 pl d'une solution d'environ 1
mg/cm3 dans
une vanne à boucle de 0,1 cm3. Le débit pour les analyses est réglé entre 1
cm'/min et
4 cm3/min. La pression est de 180 bars environ.
Les conditions de separation sont résumées ci-dessous
Solvant A Solvant B
Eau déminéralisée 2500 cm3 Acétonitrile pour HPLC 2500 cm3
Acide trifluoroacétique 2 cm3 Acide trifluoroacétique 2.5 cm3
Gradient
Temps en minutes% de solvant % de solvant Dbit en cm /minute
A B
0 60 40 I
3 60 40 1
0 100 I
35 0 100 1
35.1 60 40 4
36.1 60 40 4
3 6.2 60 40 2
44 60 40 2
EXEMPLES
A\ SYNTH~SES DES COMPOSÉS SELON L'INVENTION
Exemple 1 : synthèse du composé (1) (N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-[3-[4-(2-
imino-tétrahydro-pyrimidin-1-yl)-butyiamino]-propylamino}-acétamide) à partir
du
15 lipide cationique de formule condensée NH2(CH2)3NH(CH2)a
NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2),~CH~]2 appelé « lipide B » dans la suite (dont la
préparation a été décrite dans la demande de brevet WO 97/18185 et dont la
structure
est représentée à la figure 1 ).
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Dans un ballon équipé d'un barreau magnétique, on dissout 0,784 mmol de lipide
B
dans 25 cm3 de méthanol, et on ajoute 10,21 mmol de triéthylamine. Puis on
coule
lentement (S minutes) sur le mélange une solution de O-Methylisourée et
d'acide
sulfurique (1,173 mmol) dans de l'eau (9 cm3). Le mélange est maintenu à
50°C dans
S un bain d'huile pendant vingt heures.
Ensuite, le mélange est concentré à sec au rotoévaporateur. On solubilise
l'extrait sec
avec une solution d'eau (4 cm3), d'éthanol (4 cm3), et d'acide
trifluoroacétique
( 1 cm3). Cette solution est injectée en deux fois en CLHP préparative.
Les fractions intéressantes (déterminées par CLHP analytique} sont regroupées,
congelées et lyophilisées. On obtient ainsi 194 mg ( 0,163 mmol ) de produit
salifié.
Rendement : 20,8
CLHP analytique : Rt = 15,99 minutes.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)ZSO d6, b en ppm) : 0,88 (t, 3 = 6,5 Hz, 6H
CH3 des chaînes grasses) ; 1,24 (mt, 60H : CH2 centraux des chaînes grasses) ;
de
1,35 à 1,70 (mt, 4H : 1 CHZ de chaque chaîne grasse) ; 1,57 (mt, 4H : (CHZ)a
centraux du butyle) ; 1,88 et 1,96 (2 mts, 2H chacun: CHZ central du propyle
et CH2
central du cycle) ; de 2,85 à 3,35 (2 mts, 16H en totalité : les 8 NCH2) ;
3,81 (s large,
2H : NCHZCON) ; 4,03 (d, J = 5 Hz, ZH : CONCH2CON du glycyle) ; 7,25 et 7,84
(respectivement s et s large, 1H chacun : les 2 NH du cycle) ; 8,61 (t, J =
5,5 Hz, 1H
NHCO) ; 8,70 et 9,02 (2 mfs, 1H chacun : les 2 NH).
MH+= 846
Exemple 2 : synthèse du composé l2) (N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{3-[4-(2-
imino-tétrahydro-pyrimidin-1-yl)-butylamino]-propyiamino}-acétamide) à partir
du
composé de formule condensée NH2(CH2),NH(CH2)4
NH(CH2)3NHCH2COGIyN[(CH2)lzCH3]2 appelé « lipide C » dans la suite (dont la
préparation a été décrite dans la demande de brevet WO 97/ 18185 et dont la
structure
est représentée à la figure 1 ).
Dans un ballon équipé d'un barreau magnétique on dissout 1,036 mmol de lipide
C
dans 30 cm3 de méthanol, et on ajoute 13,13 mmol de triéthylamine. Puis on
coule
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lentement (5 minutes) sur le mélange une solution de O-Methylisourée et
d'acide
sulfurique (1,554 mmol) dans de l'eau (9 cm3). Le mélange est maintenu à
50°C dans
un bain d'huile pendant une vingtaine d'heures. Puis, le mélange est concentré
à sec au
rotoévaporateur. On solubilise l'extrait sec avec une solution d'eau (3 cm3),
d'éthanol
S (2 cm3), et d'acide trifluoroacétique (0,5 cm3). Cette solution est injectée
en CLHP
préparative.
Les fractions intéressantes (déterminées par CLHP analytique) sont regroupées,
congelées et lyophilisées. On obtient finalement 218 mg (0,2022 mmol) de
produit salifié.
Rendement : R = 19,5
CLHP analytique : Rt = 10.76 minutes.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3)ZSO d6, 8 en ppm) : 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H
CH3 des chaînes grasses) ; de 1,15 à 1,40 (mt, 44H : (CHZ)" centraux des
chaînes
grasses) ; 1,45 et de 1,50 à 1.65 (2 mts, 2H chacun : 1 CHZ de chaque chaîne
grasse) ;
1,59 (mt, 4H : les 2 CH2 centraux du butyle) ; 1,91 et 1,97 (2 mts, 2H chacun
: CH2
central des propyles) ; de 2,85 à 3,10 (mt, l OH : les 2 NCH2 du butyle - les
2 NCHZ
d'un des 2 propyles - et 1 des 2 NCH2 de l'autre propyle) ; 3,23 et de 3,30 à
3,50 (2
mts, respectivement SH et 1H : l'autre NCH2 de l'autre propyle et NCH2 des
chaînes
grasses) ; 3,79 (mf, 2H : NCHZCON) ; 4,03 (d, J = S Hz, 2H : CONCH2CON du
glycyle) ; 7.27 et de 8,40 à 9,30 (respectivement s large et mf, 2H et 4H :
NH2,.
CF3C00', NH+ CF3C00- et =NH) ; 7,88 et 8,61 (respectivement s et s large, 1H
chacun : respectivement NHC=N et CONH).
MH+= 734
Exemple 3 : synthèse du composé (3) (2-(3-{4-[3-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-
ylamino)-propylaminoJ-butylamino}-propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl-
acétamide) à partir du lipide C (voir exemple 2 et figure 1 pour sa
structure).
Dans un ballon equipé d'un compte-bulle et d'un barreau magnétique, on dissout
0,36 mmol de iodure de 2-méthylmercapto-2-imidazolinium dans 0,36 cm3 de soude
1N. A cette solution on ajoute 0,36 mmol de lipide C préalablement dissout
dans
1,44 cm3 de soude 1N, 5 cm3 d'eau, et 4 cm3 d'éthanol. Le mélange est maintenu
sous
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agitation jusqu'à l'arrêt de dégagement de méthyl mercaptan {24 heures). Le
mélange
est ensuite concentré à sec au rotoévaporateur. On solubilise l'extrait sec
avec une
solution d'eau (4 cm3), d'éthanol (4 cm3), et de d'acide trifluoroacétique
(0,5 cm3).
Cette solution est injectée en deux fois en CLHP préparative.
Les fractions intéressantes {déterminées par CLHP analytique) sont regroupées,
congelées et lyophilisées. On obtient finalement 213 mg ( 0,1727 mmol ) de
produit salifié.
Rendement : R = 48
HPLCa~,,n~q"~ : Rt = 8,90 minutes.
Spectre de RMN 1H (400 MHz, (CD3}ZSO d6 avec ajout de quelques gouttes de
CD3COOD d4, 8 en ppm) : 0,87 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de
1;15
à 1,40 (mt, 44H : (CH2)1, centraux des chaînes grasses) ; 1,45 et 1,55 (2 mts,
2H
chacun : 1 CH2 de chaque chaîne grasse) ; 1,65 (mt, 4H : les 2 CH2 centraux du
butyle) ; de 1,80 à 1,95 (mt, 4H : CH2 central des propyles) ; de 2,80 à 3,05
(mt, lOH
les 2 NCH2 du butyle - les 2 NCHZ d' un des 2 propyles - et 1 des 2 NCHZ de
l'autre
propyle) ; 3,24 (mt, 6H : l'autre NCH2 de l'autre propyle et NCHZ des chaînes
grasses)
3,56 (s, 2H : NCHZCON) ; 3,62 (s, 4H : NCH2CHZN) ;4,02 (d, J = 5 Hz, 2H
CONCH2CON du glycyle).
MH+= 777
Exemple 4 : Synthèse du comeosé (4) (2-(3-{bis-[3-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-
ylamino)-propylJ-amino}-propylamino)-N-ditétradécylcarbamoylméthyl-acetamide)
par la méthode de synthèse de « briques ».
I) SYNTH~SE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a)
Le groupement Gly dont les amines sont protégées par des groupements Boc
(10 mmol) et la ditétradécylamine (10 mmol) sont introduit dans un ballon de
250 ml,
et on ajoute 100 cm3 de dichlarométhane. Le mélange est agité jusqu'à
dissolution
complète. 30 mmol de N-éthyldüsopropylamine (DIEA) et 11 mmol de phosphonium
de benzotriazol-1-yloxytrisdiméthylamine (BOP) sont ensuite ajoutés. Le pH est
maintenu à 10 grâce au DIEA, et le mélange est agité pendant 2 heures. Lorsque
la
réaction est achevée, (suivie par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane est
évaporé et
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le solide obtenu est repris dans l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase
organique est
lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100 cm3), de carbonate
de
sodium (4 fois 100 cm3}, et de chlorure de sodium (4 fois 100 cm3). La phase
organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée
sous vide.
S Le produit (a) est obtenu avec un rendement de 93 %.
CCM : Rf= 0,9 (CHCIs/MeOH, 9:1)
MH+ : 567
II) SYNTH~SE DE [Z-NH(CHZ)3]a-N-(CH2)3-NH-Boc-CH2-COOH (b)
1) Synthèse de NC-(CH=)Z-NH-Boc-CHi-COOH (c)
10 L'amine de la N-(cyanoéthyl)-glycine (0,1 mol/amine, commerciale) est
solubilisée dans de la soude 1N (200 cm3/amine) et du dioxane (200 cm3). La
solution est agitée dans un bain de glace, puis on ajoute goutte à goutte une
solution de O-(t-butoxucarbonyl)Z ou de p-chlorobenzyloxycarbonyle (C1Z,
0,14 mol/amine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH est maintenu à une valeur
15 supérieure à 9. Puis le mélange est agité à environ 20°C pendant une
nuit. Le
dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aide
d'une
solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de
l'acétate
d'éthyle (3 fois 100 cm3) puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2
fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée
et
20 évaporée sous vide. Le produit (c) de formule NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH
est obtenu avec un rendement de 98%.
CCM : Rf= 0,66 (CHC13/MeOH, 8:2)
MH+ : 229
2) Synthèse de NHz-(CHZ)3-NH-Boc-CHI-COOH (d)
25 Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit 50 mmol de produit (c)
de
formule NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH. On prépare en même temps dans un
bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %) et de 3,3 g de soude (80 mol).
Lorsque la soude est dissoute, on introduit 2 cm3 de Nickel de raney sur
charbon. L'autoclave est fermé. La pression initiale d'hydrogénation est de
30 52 bar environ , et elle descend à environ 48, 5 bar en une nuit à
température
ambiante (20°C). La suspension est filtrée sur papier, le filtre est
lavé à l'éthanol
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(4 fois 25 cm'), et les filtrats sont concentrés à sec sous vide. On obtient
le
produit (d) qui est utilisé sans autre purification dans la suite.
CÇM : Rf= 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+ : 233
3) Synthèse de [NC(CH=)Z]Z-N-(CH=)3-NH-Boc-CH2-COOH (e)
Dans un ballon, le produit (d) de formule NHz-(CHz)3-NH-Boc-CHz-COOH
(0,05 mol) et de la soude (0,1 mol) sont solubilisés dans 150 cm3 d'eau. La
solution est refroidie dans un bain de glace. Sous vive agitation, on coule
lentement de l'acrylonitrile (0,12 mol) en gardant la température de la masse
inférieure à 20°C. Le mélange de réaction est maintenu une nuit à
température
ambiante (20°C). Puis le mélange est maintenu à 50°C pendant 2
heures. Le
solvant est évaporé sous vide, puis le mélange est acidifié à pH 3 avec une
solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de
l'acétate
d'éthyle (3 fois 200 cm3), puis lavé avec une solution de chlorure de sodium
(2
fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis
filtrée et évaporée sous vide. Le « brut » est éventuellement purifié sur une
colonne de silice. On obtient 1e produit (e) avec un rendement de 50%.
CCM : Rf= 0,75 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+ : 339
4) Synthèse de [Z-NH-(CH2)3]Z-N-(CH2)3-NH-Boc-CHI-COOH (b)
Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit le produit (e) de formule
[NC(CHz)z]z-N-(CHz)3-NH-Boc-CHz-COOH (50 mmol). On prépare en même
temps dans un bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %) et de 3,3 g de
soude (80 mol). Lorsque la soude est dissoute, on introduit cette solution
dans
l'autoclave. Un courant d'azote est passé dans l'autoclave et on introduit 2
cm3
de Nickel de Raney sur charbon. L'autoclave est fermé. La pression initiale
d'hydrogénation est de 52 bar environ, et elle descend à 48,5 bar environ en
une
nuit à température ambiante (20°C). La suspension est filtrée sur
papier, le filtre
est lavé avec de l'éthanol (4 fois 25 cm3), et les filtrats sont concentrés à
sec
sous vide. On obtient un solide blanc qui est utilisé sans autres
purifications
après une analyse CCM.
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CCM : Rf= 0,14 (CHC13/MeOH, 6:4)
Le solide obtenu précédemment est solubilisé dans de la soude 1N (200
cm3/amine) et du dioxane (200 cm3). La solution est agitée dans un bain de
glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution de (t-butoxycarbonyl)ZO ou
de
p-chlorobenryloxycarbonyl (0,14 moUamine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH
est maintenu à une valeur supérieure à 9. Puis, le mélange est agité à
température ambiante (20°C) pendant une nuit. Le dioxane est évaporé
sous
vide, puis on acidifie le mélange à pH 3 à l'aïde d'une solution de sulfate de
potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois
100
cm3) puis lavé avec une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La
phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous
vide. Les produits sont analysés par CCM et/ou CLHP.
Le Produit brut est purifié sur une colonne de silice
(dichlorométhane/méthanol,
8:2).
On obtient le produit (b) avec un rendement de 66% par rapport au produit (d).
CCM : Rf= 0,42 (CHC13/MeOH, 6:4)
MH+ : 615
III) SYNTI~SE DE [Z-NH(CHZ)3]2-N-(CH2)3-NH-Boc-CHZ-COGIyN[(CH2)13-CHs]2
(
Le produit (a) dont les amines sont protégées par des groupements Boc (1 mmol)
est
introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm' d'acide
trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée
pendant une heure.
Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide
trifluoroacétique
est évaporé sous vide puis le produit est séché par coévaporation avec 3 fois
30 cm3
d' éther éthylique.
CLHP : Rt = 12,86 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]). .
Le produit obtenu (Gly-ditétradécylamine, 10 mmol} et le produit (b) (10 mmol)
sont
introduit dans un ballon de 250 cm3, du diclorométhane ( 100 cm3) est ajouté
et le
mélange est agité jusqu'à dissolution complète. 30 mmol de N-
éthyldüsopropylamine
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(DIEA) et 11 mmol d'hexafluorophosphate de BOP sont ensuite ajoutés. Le pH est
maintenu à 10 grâce au DIEA et le mélange est agité pendant deux heures.
Lorsque la
réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane est
évaporé et
le solide obtenu est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase
organique est
lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100 cm3), de carbonate
de
sodium (4 fois 100 cm3), et de chlorure de sodium (4 fois 100 cm3). La phase
organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide.
Les
produits sont utilisés sans autres purifications. Le produit (f) est obtenu
avec un
rendement de 75 % après purification sur une colonne de silice
(dichlorométhane/méthanol, 8:2).
CCM : Rf= 0,86 (CHC13/MeOH, 8:2)
CLHP : Rt = 17,44 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
I'~ SYNTH~SE DE [NHZ(CH2)3]2-N-(CHZ)3-NH-BOC-CH2-COGIyN[(CHz)j3-CH3]2
(g)
Le produit (f) dont les amines sont protégées, est introduit dans un ballon
équipé d'un
barreau magnétique et dissous dans 10 cm3 de méthanol par gramme de produit.
Du
palladium sur charbon ( 10 %, 1 g/g de produit) et du formiate d'ammonium ( 1
g/g de
produit) sont ajoutés à température ambiante. L'hydrogénolyse est suive par
CLHP.
Après deux heures, la réaction est achevée, le mélange est filtré, et le
filtre lavé avec 3
fois 10 cmi de méthanol par gramme de produit. De l'eau bi-distillée est
ajoutée et la
solution est congelée et lyophilisée, ou bien le filtrat est concentré à sec
et le solide est
repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3). La phase organique est lavée par
une
solution de carbonate de sodium (2 fois 100 cm'), et une solution de chlorure
de
sodium (2 fois 100 cm3), puis elle est séchée sur sulfate de magnésium,
filtrée et
évaporée sous vide. Les produits sont analysés par CLHP et sont utilisés sans
autres
purifications. Le produit (g) est obtenu avec un rendement de 40 % par rapport
au
produit (f).
CLHP : Rt = 9,62 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
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MH+ : 795.
V) SYNTH~SE DU COMPOSÉ (4)
le produit (g) qui contient l'amine primaire à modifier (1 mmoUamine) est
solubilisé
dans du dichlorométhane (10 cm3), puis on ajoute de l'hydroiodure de 2-
méthylthio
S imidazoline (1,2 mmol/amine) et de la triéthylamine (1,3 mmol/amine). Le
mélange est
agité à température ambiante (20 °C) jusqu'à l'arrét du dégagement de
sulfure de
méthyle. A la fin de la réaction (suivie par CLHP), le dichlorométhane est
évaporé
sous vide.
Le produit obtenu, dont les amines sont protégées par des groupements Boc, (1
mmol)
est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm3 d'acide
trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée
pendant une heure.
Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide
trifluoroacétique
est évaporé sous vide puis le produit est séché par coévaporation avec 3 fois
30 cm3
d'éther éthylique.
Le produit obtenu est purifié par CLHP préparative et les fractions analysées
par
CLHP. On obtient ainsi le composé (4) selon la présente invention avec un
rendement
de 34 %.
CLHP : Rt = 10,07 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
Spectre de R M N 1H (400 MHz, (CD3)2S0 d6 à une température de 383K, d en
ppm) : 0,92 (t, J = 7 Hz, 6H : CH3 des chaînes grasses) ; de 1,25 à 1,45 (mt,
44H
(CH2),1 centraux des chaînes grasses) ; 1,57 (mt, 4H : 1 CH2 de chaque chaîne
grasse)
de 1,70 à 1,90 (mt, 6H : CHZ central des propyles) ; de 2,50 à 3,40 (mt, 16H :
les 2
NCH2 des propyles et les NCHZ des chaînes grasses) ; 3,68 (s, 8H : les 2
NCH2CH2N)
; 3,72 (s large, 2H : NCHZCON) ; 4,06 (s, 2H : CONCHZCON du glycyle).
MH+ : 831
Exemple 5 : Synthèse du composé (5) : (N-ditétradécylcarbamoylméthyl-2-{3-[3-
(1,4,5,6-tétrahydropyrimidin-2-ylamino)-propylamino]propylamino}-acetamide)
par la
méthode de synthèse de « briques ».
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I) SYNTH~SE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a)
On opère de la même façon que dans l'exemple précédent. Le produit (a) est
obtenu
avec un rendement de 93 %.
CÇM : Rf= 0,9 (CHC13/MeOH, 9:1)
5 MH+ : 567
II) SYNTH~SE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CHZ)~-N-Boc-CH2-COOH (b)
1) Synthèse de NC-(CH2)2-NH-Boc-CH2-COOH (c)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 4. Le produit (c)
est obtenu avec un rendement de 98 %.
10 CCM : Rf= 0,66 (CHCI3/MeOH, 8:2)
MH+ : 229
2) Synthèse de NHZ-(CHz)3-NH-Boc-CHI-COOH (d)
Le produit (d) est obtenu de la même façon que précédemment dans l'exemple 4.
CCM : Rf= 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
15 MH+ : 233
3) Synthèse de NC(CHZ)Z-N-Boc-(CHZ)3-NH-Boc-CHZ-COOH (e)
Dans un ballon, le produit (d) (0,05 mol) et de la soude (0,1 mol) sont
solubilisés
dans 150 cm3 d'eau. La solution est refroidie dans un bain de glace. Sous vive
agitation, on coule lentement de l'acrylonitrile (0,05 mol) en gardant la
20 température de la masse inférieure à 20°C. Le mélange de réaction
est maintenu
une nuit à température ambiante (20°C).
Le solvant est évaporé sous vide, puis le mélange est acidifié à pH 3 avec une
solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait avec de
(acétate
d'éthyle (3 fois 200 cm3), puis lavé avec une solution de chlorure de sodium
(2
25 ~ fois 100 cm3). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium,
puis
filtrée et évaporée sous vide. Le produit obtenu est éventuellement purifié
sur
une colonne de silice.
Le produit obtenu (0,1 mol/amine) est solubïlisé dans de la soude 1N (200
cm3/amine) et du dioxane (200 cm'). La solution est agitée dans un bain de
30 glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution de (Boc)20 ou de p-
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chlorobenzyloxycarbonyl (0,14 moUamine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH est
maintenu à une valeur supérieure à 9. Puis, le mélange est agité à température
ambiante (20°C) pendant une nuit. Le dioxane est évaporé sous vide,
puis on
acidifie le mélange à pH 3 à l'aide d'une solution de sulfate de potassium. Ce
qui
est insoluble est extrait avec de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm3) puis
lavé avec
une solution dechlorure de sodium (2 fois 100 cm3). La phase organique est
séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits
sont
analysés par CCM et/ou CLHP.
Le produit (e) est ainsi obtnu avec un rendement est de 93 %.
CCM : Rf= 0,75 (CHCI~/MeOH, 8:2)
MH+ : 386
4) Synthèse de Z-NH-(CHZ)3-N-Boc-(CHZ)3-N-Boc-CHz-COOH (b)
Dans un autoclave en inox de 1 litre, on introduit le produit (e) (SO mmol).
On
prépare en même temps dans un bêcher une solution de 10 cm3 d'éthanol (95 %)
et de 3,3 g de soude (80 mol). Lorsque la soude est dissoute, on introduit
cette
solution dans (autoclave. Un courant d'azote est passé dans l'autoclave et on
introduit 2 cm3 de Nickel de Raney sur charbon. L'autoclave est fermé. La
pression initiale d'hydrogénation est de 52 bar environ, et elle descend à
48,5 bar
environ en une nuit à température ambiante (20°C). La suspension est
filtrée sur
papier, le filtre est lavé avec de l'éthanol (4 fois 25 cm3), et les filtrats
sont
concentrés à sec sous vide. On obtient un solide blanc qui est utilisé sans
autres
purifications après une analyse CCM.
CCM : Rf= 0,14 (CHC13/MeOH, 6:4)
Le produit obtenu (0,1 moUamine) est solubilisé dans de la soude 1N
(200 cm3/amine) et du dioxane (200 cm3). La solution est agitée dans un bain
de
glace, puis on ajoute goutte à goutte une solution p-chlorobenzyloxycarbonyle
(0,14 mol/amine) dans 200 cm3 de dioxane. Le pH est maintenu à une valeur
supérieure à 9. Puis, le mélange est agité à température ambiante
(20°C) pendant
une nuit. Le dioxane est évaporé sous vide, puis on acidifie le mélange à pH 3
à
(aide d'une solution de sulfate de potassium. Ce qui est insoluble est extrait
avec
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de l'acétate d'éthyle (3 fois 100 cm3) puis lavé avec une solution de chlorure
de
sodium (2 fois 100 cm'). La phase organique est séchée sur sulfate de
magnésium filtrée et évaporée sous vide. Le produit obtenu est purifié sur une
colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 9:1 ). Les produits sont analysés
S par CCM et/ou CLHP. Le produit (b) est obtenu avec un rendement de 32
par rapport au produit (d).
CCM : Rf= 0,63 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+ : 523
III) SYNTH~SE DU 2-méthylsulfanyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine (f)
Dans un ballon sous agitation et courant d'azote, le 3,4,5,6-tétrahydro-2-
pyrimidinethiol (0,0103 mol) est chargé, et 5 cm' de méthanol et 0,65 cm'
d'iodure de
méthyle (0,0105 mol) sont ajoutés. Le mélange est porté au reflux durant 1
heure puis
est laissé à refroidir à température ambiante (20°C). Le produit est
précipité par ajout
de S cm3 d'éther éthylique. Le précipité est filtré puis lavé à l'éther
éthylique. Le
produit est ensuite séché une nuit sous une pression de 34 mbar.
On obtient 1,5 g (0,0041 mol) de produit (VI), soit une rendement de 40 %.
CCM : Rf= 0,25 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+ : 131
d) SYNTH~SE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)3-N-Boc-CHZ-COGIyN[(CH2)i3-CHa]2
(g)
Le produit (a) dont les amines sont protégées par des groupements Boc (1 mmol)
est
introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique. 30 cm3 d'acide
trifluoroacétique à 4°C sont ajoutés, puis la solution est agitée
pendant une heure.
Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), l'acide
trifluoroacétique
est évaporé sous vide puis le produit obtenu est séché par coévaporation avec
3 fois
cm3 d'éther éthylique.
CLHP : Rt = 12,86 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]}.
Le produit obtenu ( 10 mmol) et le produit (b) ( 10 mmol} sont introduit dans
un ballon
30 de 250 cm3. Du dichlorométhane (100 cm~) est ajouté et le mélange est agité
jusqu'à
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dissolution complète. 30 mmol de DIEA et 11 mmol de BOP sont ensuite ajoutés.
Le
pH est maintenu à 10 grâce au DIEA et le mélange est agité pendant deux
heures.
Lorsque la réaction est achevée (suivi par CCM et/ou CLHP), le dichlorométhane
est
évaporé et le solide obtenu est repris dans de l'acétate d'éthyle (300 cm3).
La phase
organique est lavée avec une solution de sulfate de potassium (4 fois 100
cm3), de
carbonate de sodium (4 fois 100 cm3), et de chlorure de sodium (4 fois 100
cm3). La
phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous
vide.
Les produits sont utilisés sans autres purifications.
Après purification sur colonne de silice (dichlorométhane/méthanol, 8:2), on
obtient le
produit (g) avec un rendement de 85%.
CCM : Rf= 0,9 (CHC13/MeOH, 9:1)
CLHP : Rt = 19,79in, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
V) SYNTH~SE DE NHZ(CHZ)3]2-N-Boc-(CHZ)3-NH-Boc-CH2-COGIyN[(CH2)13-
CH3]2 (h)
Le produit (g) est introduit dans un ballon équipé d'un barreau magnétique et
dissous
dans 10 cm3 de méthanol/g de produit. Du palladium sur charbon (10 %, lg/g de
produit) et du formiate d'ammonium (1 g/g de produit) sont ajoutés à
température
ambiante (20°C). L'hydrogénolyse est suive par CLHP. Après deux heures,
la réaction
est achevée, le mélange est filtré, et le filtre lavé avec 3 fois 10 cm3 de
méthanol/g de
produit. De l'eau bi-distillée est ajoutée, et la solution est congelée et
lyophilisée, ou
bien le filtrat est concentré à sec et le solide est repris dans de l'acétate
d'éthyle (300
cm3). La phase organique est lavée par une solution de carbonate de sodium (2
fois
I00 cm3), et une solution de chlorure de sodium (2 fois 100 cm3), puis elle
est séchée
sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Les produits sont
analysés par
CLHP et sont utilisés sans autres purifications. Le produit (h) est obtenu
avec un
rendements de 93 % par rapport au produit (g).
CCM : Rf= 0,42 (CHCl3/MeOH, 6:4)
CLHP : Rt = 14,66 min, (H20/MeCN : 3 min [40160], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
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MH+ : 838
VI) SYNTHESE DU COMPOSÉ (5)
Le produit (h) contenant l'amine primaire à modifier (1 mmoUamine) est
solubilisé
dans du dichlorométhane (10 cm3), puis on ajoute le produit (f) (1,2
mmol/amine) et la
triéthylamine (I,3 mmol/amine). Le mélange est agité à température ambiante
(20°C)
jusqu'à l'arrêt du dégagement de sulfure de méthyle. A la fin de Ia réaction
(suivie par
CLHP}, le dichlorométhane est évaporé sous vide.
Le produit obtenu est purifié par CLHP préparative et les fractions analysées
par
CLHP. Le composé (5) est ainsi obtenu avec un rendement de 38 %.
CLHP : Rt = 8,42 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
Spectre de R M N 1H (400 MHz, (CD3)2S0 db, 8 en ppm) : 0,86 (t, J = 7 Hz, 6H
CH3 des chaînes grasses) ; de 1,10 à 1,35 (mt, 44H : (CH2), ~ centraux des
chaînes
grasses) ; 1,44 et 1,53 (2 mts, 2H chacun : 1 CH2 de chaque chaïne grasse) ;
de 1,80 à
2,00 (mt, 6H : CHZ central des propyles et CH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-
pyrimidine) ;
de 2,80 à 3,10 (mt, lOH : NCH2 des propyles et NCH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-
pyrimidine) ; de 3,15 à 3,45 (mt : les 6H correspondant au =NCHZ de la 1,4,5,6-
tetrahydro-pyrimidine et aux NCHZ des chaînes grasses) ; 3,81 (mf, 2H
NCH2CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,89 - 8,62 - 8,75
et
9,01 (4 mfs, 8H en totalité : les échangeables et OH des CF~COOH}.
MH+ : 720
Exemple 6 : Synthèse du composé (6) : (N-dioctadécylcarbamoylméthyl-2-{3-[3-
(1,4,5,6-tétrahydropyrimidin-2-ylamino)-propylamino]propylamino}-acetamide)
par la
méthode de synthèse de « briques ».
I) SYNTH~SE DU BOC-GLY-DITÉTRADÉCYLAMINE (a)
On opère de la même façon que dans l'exemple précédent. Le produit (a) est
obtenu
avec un rendement de 93 %.
CCM : Rf= 0,9 (CHC13/MeOH, 9:1)
MH+ : 567
II) SYNTH~SE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc-(CH2);-N-Boc-CH2-COOH (b)
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1) Synthèse de NC-(CH=)2-NH-Boc-CHI-COOH (c)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple S. Le produit (c)
est obtenu avec un rendement de 98 %.
CCM : Rf= 0,66 (CHCI3/MeOH, 8:2)
5 MH+ : 229
2) Synthèse de NH=-(CH~)3-NH-Boc-CHZ-COOH (d)
Le produit (d) est obtenu de la même façon que précédemment dans l'exemple 5.
CCM : Rf= 0,12 (CHCl3/MeOH, 6:4)
MH+ : 233
10 3) Synthèse de NC(CH2)2-N-Boc-(CH=)3-NH-Boc-CHZ-COOH (e)
On opëre de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. Le produit (e)
est ainsi obtenu avec un rendement est de 93 %.
CCM : Rf= 0,75 (CHCI~/MeOH, 8:2)
MH+ : 386
15 4) Synthèse de Z-NH-(CH2)3-N-Boc-(CH2)3-N-Boc-CHi-COOH (b)
On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient un
solide blanc qui est utilisé sans autres purifications après une analyse CCM.
CCM : R f = 0,14 (CHCI3/MeOH, 6:4)
Le produit obtenu est utilisé de la même façon que précédemment afin de
20 protéger l'amine terminale par un groupement benzyloxycarbonyle. Le produit
(b) est ainsi obtenu avec un rendement de 32 % par rapport au produit (d).
CCM : Rf= 0,63 (CHCh/MeOH, 9:1)
MH+ : 523
III) SYNTH~SE DU 2-méthylsulfanyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine (f)
25 On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient
ainsi
1,5 g (0,0041 mol) de produit (f), soit un rendement de 40 %.
CCM : Rf= 0,25 (CHCl3/MeOH, 9:1)
MH+ : 131
IV) SYNTH~SE DE Z-NH(CH2)3-N-Boc(CH2)~-N-Boc-CHZ-COGIyN[(CH2),~-CH3]z
30 (g)
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On opère de la même façon que précédemment dans l'exemple 5. On obtient ainsi
le
produit (a) dont les groupements Boc ont été clivés.
CLHP : Rt = 19,44 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[o/loo]).
Ce produit obtenu est utilisé de ta même façon avec !e produit (b) que
précédemment
dans l'exemple S. Après purification sur colonne de silice
(dichlorométhane/méthanol,
8:2), on obtient le produit (g) avec un rendement de 84 %.
ÇCM : Rf= 0,9 (CHCl3/MeOH, 9:1)
CLHP : Rt = 23,95 min., (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
V) SYNTH~SE DE NH2(CH2);J2-N-Boc-(CHZ)3-NH-Boc-CH2-COGfyN[(CH2),~-
(h)
CH3J2
On opère de la même façon que précédemment avec l'exemple 5. Le produit (h)
est
obtenu avec un rendements de 73 % par rapport au produit (g).
CCM : Rf= 0,28 (CHCl3/MeOH, 6:4)
CLHP : Rt = 20,59 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
MH+ : 83 8
VI) SYNTH~SE DU COMPOSÉ (6)
On opère de la même façon que précédemment à l'exemple 5. Le composé (6) est
ainsi
obtenu avec un rendement de 68 %.
CLHP : Rt = 15,83 min, (H20/MeCN : 3 min [40/60], 3-20 min [0/100], 35 min
[0/100]).
Spectre de R M N 1H (500 MHz, (CD3)2S0 d6, b en ppm) : 0,88 (t, J = 7 Hz, 6H
CH, des chaînes grasses) ; de 1,15 à 1,35 (mt, 60H : (CH2),5 centraux des
chaînes
grasses) ; 1,46 et 1,54 (2 mts, 2H chacun : 1 CHZ de chaque chaîne grasse) ;
de 1,80 à
2,00 (mt, 6H : CHZ central des propyles et CH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-
pyrimidine) ;
de 2,85 à 3,05 (mt, IOH : NCHZ des propyles et NCH2 de la 1,4,5,6-tetrahydro-
pyrimidine) ; de 3,15 à 3,45 (mt : les 6H correspondant au =NCH2 de la 1,4,5,6-
tetrahydro-pyrimidine et aux NCH2 des chaînes grasses) ; 3,81 (mf, 2H
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NCH2CON) ; 4,04 (d, J = 5 Hz, 2H : CONCH2CON du glycyle) ; 7,88 - 8,61 - 8,74
et
8,99 (4 mfs, 8H en totalité : les échangeables et OH des CF3COOH).
MH~ : 832
B\ UTILISATION DES AGENTS DE TRANSFECTION SELON L'INVENTION
S Exemple 7 : préuaration de complexes nucléolinidiaues
Cet exemple illustre la préparation de complexes nucléolipidiques seion
l' invention.
Le composé utilisé dans cet exemple est le composé (1) en solution dans du
chloroforme. Des quantités de 10 nmoles de composé (1) (soit 11,8 ug) par pg
d'ADN
ont été utilisées. Dans certains cas, un co-lipide neutre, Cholestérol ou
DOPE, est
préalablement mélangé au composé. Un film lipidique fin se forme lorsqu'on
évapore le
chloroforme à l'aide d'un flux léger d'argon, puis il est réhydraté dans un
mélange de
dextrose 5% et de chlorure de sodium 20 mM, pendant toute une nuit, à
4°C. Les
échantillons sont ensuite traités aux ultrasons pendant 5 minutes, chauffés à
65°C
pendant 30 minutes, et enfin traités à nouveau aux ultrasons pendant 5
minutes. On
obtient ainsi des suspensions lipidiques qui sont stockées à 4°C
jusqu'à leur utilisation.
L'ADN utilisé est le plasmide pXL2774 (figure 2) en solution dans un mélange
de dextrose 5% et de chlorure de sodium 20 mM à une concentration de 0,5 mg/ml
ou
1,0 mg/ml. Le plasmide pXL,2774 possède les caractéristiques suivantes
- niveau d'endotoxines inférieur à 50 EU/mg,
- Taux d'ADN superenroulé supérieur à 60%,
- contenu d'ARN, c'est-à-dire d'AIZNm, d'ARNt et d'ARN ribosomique,
(déterminé par HPLC) inférieur à S%,
- taux d'ADN chromosomal inférieur à 1%,
- contenu protéique inférieur à 1%,
- osmolarité inférieure à I S mosmoles/kg.
On prépare les complexes nucléolipidiques selon l'invention en mélangeant
rapidement des volumes égaux de solution d'ADN et de suspension lipidique
telles que
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décrites ci-dessus. La quantité de composé complexé à l'ADN varie de 0,5
nmoles/pg
d'ADN à 12 nmoles/pg d'ADN.
Exemale 8 : comuortement des complexes formés à différent ranuort de charge
Cet exemple illustre le comportement des complexes nucléolipidiques selon
l'invention à différents rapport de charge . L'impact de l'ajout d'un co-
lipide neutre est
également illustré.
La taille des complexes a tout d'abord été analysée en mesurant le diamètre
hydrodynamique par diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Laser Light
Scattering) à l'aide d'un appareil Coulter N4plus. les échantillons sont
dilués 20 fois
dans une solution contenant 5% de dextrose et 20 mM de chlorure de sodium pour
éviter les diffusions multiples. L'effet du groupement cycloamidine, de la
composition
lipidique, et du rapport de charge sur la taille des complexes
nucléolipidiques selon
l'invention a ainsi été étudié.
On distingue trois phases possibles lorsqu'on augmente le rapport de charge
entre le composé (1) selon l'invention et l'ADN. Ces trois phases déterminent
le
potentiel thérapeutique du composé (1). La figure 3 illustre ces 3 phases pour
le
composé (1). On peut observer le même comportement pour d'autres composés
selon
l' invention.
A faible rapport de charge, l'ADN n'est pas saturé par le composé (1). Il
reste
encore de l'ADN nu, et les complexes sont globalement chargés négativement.
Les
particules sont de petite taille (entre 100 et 300 nm). Cette phase est
appelée « Phase
A ».
Le fait que fADN ne soit pas complètement saturë par le composé ( 1 ) signifie
que
l'ADN n'est pas complètement protégé par lui. L'ADN peut donc être soumis aux
dégradations par les enrymes (DNAases). Par ailleurs, les complexes étant
globalement négatifs, le passage de la membrane cellulaires est difficile.
Pour ces
raisons, les complexes nucléolipidiques de la phase A sont d'une efficacité
beaucoup
moins grande en transfection.
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A rapport de charge intermédiaire, l'ADN est complètement saturé par le
composé (1), et les complexes sont globalement neutres ou légèrement positifs.
Cette
phase est instable car les répulsions ioniques sont minimales et un phénomène
de
crosslinking » peut se produire. La taille des particules est bien au dessus
de la limite
de détection par diffusion dynamique de la lumière (très supérieure à 3 pm).
Cette
phase instable est appelée « phase B ».
Une telle taille de complexes n'est pas adaptée pour des utilisations en
injection.
Cependant,cela ne signifie pas pour autant que les complexes soient inactifs
dans la
phase B, mais ils sont seulement sous une formulation qui n'est pas appropriée
pour
leur injection dans un but pharmaceutique.
A rapport de charge relativement élevé, l'ADN est sur-saturé par le composé
(1), et les complexes sont globalement positifs. Du fait des fortes répulsions
entre les
charges positives, cette phase est stable. Elle est désignée sous le nom de «
phase C ».
Contrairement à la phase A, les complexes nucléolipidiques sont sous une forme
telle
que l'ADN est très bien protégé vis-à-vis des enzymes, et leur charge
globalement
positive facilite le passage de la membrane cellulaire de nature anionique.
Les
complexes de la phase C sont donc particulièrement adaptés à une utilisation
pour le
transfert d'acides nucléiques dans les cellules.
En plus du groupement cycloamidine du composé selon l'invention, l'utilisation
d'un co-lipide neutre a un fort impact sur la stabilité des complexes, comme
cela est
illustré figure 3. Les co-lipides ajoutés sont soit du DOPE (lipide
cationique/DOPE =
3/2), soit du cholestérol (lipide cationique /cholestérol = 3/1). En général,
l'ajout du
co-lipide neutre augmente l'instabilité des complexes, ce qui entraîne
l'augmentation de
la quantité de composé requise pour atteindre la phase C. Ceci est très
clairement
illustré à la figure 3 lorsqu'on compare le rapport de charge auquel la phase
C est
atteinte en présence et en l'absence de co-lipide.
Il faut noter que les valeurs du rapport de charge qui délimitent les trois
phases
A, B et C dépendent du composé utilisé. Ainsi, ces valeurs peuvent varier très
fortement d'un composé à l'autre.
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Enfin, l'affinité du composé vis-à-vis de (ADN en fonction du rapport de
charge a été étudiée. Pour cela, la réduction de fluorescence après ajout de 3
ug de
bromure d'éthidium (EtBr) a été mesurée. En effet, la substitution du bromure
d'éthidium de l'ADN par le composé est une indication de liaison à (ADN.
5 La formulation utilisée est diluées 20 fois jusqu'à une concentration finale
de 25
ug d'ADN/ml. La fluorescence relative mesurée pour l'ADN nu est définie comme
étant 100%. Le taux de liaison avec le composé ( 1 ) est représenté par la
réduction de
la fluorescence relative de (échantillon. La figure 3 montre que la
fluorescence diminue
quand le rapport de charge augmente, ce qui signifie qu'une plus grande
quantité de
10 composé ( 1 ) est disponible pour se lier à l'ADN (plus la fluorescence
décroît, plus une
grande quantité de composé se lie à l'ADN jusqu'à atteindre la saturation).
De cette façon, il a été ainsi montré que l'affinité du composé (1) selon
l'invention pour l'ADN est déterminée par le groupement cycloamidine, mais pas
par
l'addition d'un co-lipide.
15 Exemple 9 : transfection in vitro avec le composé (1)
Cet exemple illustre la capacité du composé ( 1 ) selon l'invention à
transfecter
(ADN dans les cellules in vitro, comparativement à l'ADN non-formulé.
Des microplaques de 24 puits sont ensemencées avec 60000 cellules HeLa
(ATCC) par puit, et transfectées 24 heures plus tard. Des complexes contenant
1 ~tg
20 d'ADN sont dilués dans 0,5 ml de milieu de culture DMEM (Gibco/BRL) en
l'absence
de sérum, puis ajoutés dans chaque puit. Les cellules sont incubées à
37°C pendant 4
heures. Le milieu contenant les complexes est ensuite enlevé et remplacé par
un
mélange de DMEM et de 10% de sérum de veau foetal. Puis, les cellules sont à
nouveau mises en culture pendant 24 heures. Enfin, les cellules sont lysées et
testées
25 en utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex
MLX.
Les résultats indiqués à la figure 4 soulignent la différence entre les
performances de l'ADN nu par rapport aux complexes composé ( 1 )/ADN de
l'invention totalement saturés : aucune activité luciférase n'a pu être
détectée
(sensibilité de l'appareil inférieure à 1 pg par puit) après transfection in
vitro d'ADN
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nu, alors que l'activité de transfert de gène des complexes selon l'invention
varie de
200 pglpuit à 8000 pg/puit.
Cet exemple montre donc clairement l'utilisation avantageuse du composé (1)
selon (invention pour la transfection des cellules irr vitro.
Exemple 10 : transfection in vitro avec les composés (3), (5) et (6)
Cet exemple illustre la capacité des composés (3), (5) et (6) selon
l'invention à
transfecter l'ADN dans les cellules in vitro, comparativement à l'ADN non-
formulé.
La transfection est effectuée selon le protocole de l'exemple 9 précédent,
dans
des cellules HeLa. Les résultats sont illustrés aux figures 5, 6 et 7. On
observe ainsi
que ces 3 composés présentent un bon niveau de transfection in vitro.
Exemple 11 : transfection in vivo du composé (1)
Cet exemple illustre la capacité du composé ( 1 ) selon l'invention à
transfecter
l'ADN dans les cellules iu vivo, comparativement à l'ADN non-formulé et au
lipide A
de formule condensée NHz(CH2)3NH(CHZ).,NH(CHZ);NHCH2COArgN[(CHZ)"CH3]2
décrit dans la demande WO 97/18185 et dont la structure est représentée
représenté à
la figure 1.
Le transfert de gène in vivo a été effectué sur des souris Balb/C par
administration intramusculaire et intraveineuse. Les formulations qui ont été
comparées sont des formulations d'ADN nu, des formulations contenant le lipide
A, ou
des formulations contenant le composé (1) selon l'invention.
Dans le cas des injections intramusculaires, chaque souris a reçu 30 pl de
formulation
contenant 15 ug d'ADN dans le muscle antérieur du tibia. Les tissus sont
récupérés 7
jours après l'injection, ils sont congelés et stockés à -80°C en
attendant d'effectuer les
tests d'activité luciférase. Les mesures d'activité luciférase se font comme
dans
l'exemple 8.
Dans le cas des injections par voie intraveineuse, chaque souris a reçu 200 pl
de
formulation contenant SO pg d'ADN. Les tissus sont récupérés dans ce cas 24
heures
après l'injection, puis congelés et stockés de la même façon que précédemment.
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Les résultats de transfert de gène in vivo sont présentés figure 8 et figure
9. Le
rapport entre le composé ( 1 ) et (ADN est de 10 nmoles/pg d'ADN. Le rapport
entre le
lipide A et l'ADN est de 4 nmoles/pg d'ADN.
La figure 8 illustre l'activité ij~ vivo dans le muscle du composé ( 1 ) selon
(invention comparativement à l'ADN nu et au lipide A. On constate que les
niveaux
d'activité luciférase sont équivalents entre l'ADN nu et le composé (1), ce
dernier
présentant en outre une activité très améliorée par rapport au lipide A. Les
mécanismes de transfert impliqués semblent différents entre (ADN nu et
(utilisation du
composé (1) selon la présente invention. En effet, les complexes selon
l'invention
utilisés ne contiennent pas d'ADN libre (phase C) et de plus, leurs résultats
in vitro
sont très supérieurs à ceux de l'ADN nu.
La figure 9 compare les activité du composé ( 1 ) selon Yinvention, de l'ADN
nu
et du lipide A, par voie intraveineuse et par voie intramusculaire.
On constate que l'efficacité de transfection est à peu près équivalente par
voie
intraveineuse pour le lipide A et pour le composé ( I ). Par contre, par voie
intramusculaire, l'efficacité de transfection du composé ( 1 ) selon
l'invention est très
nettement supérieure à celle du Timide A.
Par rapport à f ADN nu, le composé ( 1 ) présente une transfection par voie
intraveineuse, en plus de la transfection au moins équivalente par voie
intramusculaire.
Il apparaît donc que l'efficacité de transfert de (acide nucléique in vivo
avec le
composé (1) selon l'invention est globalement supérieure à celle avec le
lipide A qui est
un lipide cationique connu et celle de l'ADN non-formulé.
Enfin, il apparait que les complexes selon l'invention possèdent l'avantage,
par
rapport à la transfection d'ADN nu, de protéger l'ADN des dégradations par les
nucléases, contribuant ainsi à une amélioration significative de la stabilité
des
formulations. Les composés de la présente invention peuvent être également
utilisés
pour protéger l'ADN des détériorations au cours de la lyophilisation,
améliorant là
encore la stabilité des formulations.
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Exemale 12 : transfection in vivo des comaosés (5) et (6)
Cet exemple illustre la capacité des composés (5) et (6) à transfecter de
l'acide
nucléique in vivo de façon efficace.
Le même protocole qu'à l'exemple précédent est mis en oeuvre. La figure 10
montre que le composé (5) et le composé (6), formulés dans un rapport de
charges
0,25:1 avec l'ADN sans co-lipide, présentent un niveau de transfection in vivo
supérieur ou égal à l'ADN nu 48 heures après injection en i.m.
Le tableau suivant donne les résultats obtenus avec les composés (S) et (6)
dans différentes formulations
Rapport
Compos de Co-lipidep~mon pg/Poumondadm tration
charges
com os/ADN
Compos (5) 6/1 DOPE (1:1)254,9 1611,3 i.v.
Compos (5) 8/1 DOPE (l:I)535,2 3558,1 i.v.
Compos (5) 0,5/1 Chol. 209,6 1330,5 i.m.
(3:1)
Compos (5) 0,5/1 DOPE (1:1)155,8 974,6 i.m.
Compos (6) 6/1 - 175,1 1098,7 i.v.
Compos (6) 5/1 DOPE (1:1)407,7 2700,8 i.v.
Compos (6) 0,5/1 DOPE (1:1)1768 ,7 13005,4 i.m.
