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WO 00!01724 PCTIF1t99101630
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PROTEINES DE TUBE POLA=CRE DE MTCROSPORIDIE,
ACIDES NUCLEIQUES CODANT POUR CES PROTEINES ET LEURS
APPLICATIONS.
L'invention a pour objet des protéines
complètes purifiées de tube polaire (PTPs) de microsporidie
ainsi que les gènes codant ces protéines, et leur
utilisation dans les domaines du diagnostic.
E. cuniculi est une m_Lcrosporidie, parasite
intracellulaire obligatoire, fréquente chez de nombreux
mammifères et impliquée dans divE:rses infections che z
l'homme principalement chez les sujeta immunodéprimés. Deux
autres espèces du genre Encephal.itozoon (E. ~.ntestinalis et
E. h ellem) sont aussi impliquées dans différentes
infections opportunistes. De manière générale, les
microsporidies sont responsables chez les patients sidéens
de pathologies digestives, mais aussi d'atteintes
oculaires, musculaires, hépatiques, de rhinosinusites et
d'infections s~stémiques (1). Des tests sérologiques ont
également montré la présence importante des microsporidies
chez les patients immunocompétents , puisque atteignant 8~
de la population (2). 4 genres de: microsporidie sont
responsables de maladies humaines . Enterocytozoon,
Encephalitozoon, Vittaforma et TrachipZeistophôra.
L'émergence de ces parasites en pathologie humaine suscite
de 1a part des chercheurs un intérêt grandissant dans les
domaines systématique, épidémiologique, clinique, du
diagnostic et de la thérapeutique.
Actuellement, le diagnostic repose su.r des
tests PCR à partir d'oligonucléotides déterminés d'après
les séquences d'ADN ribosomal, seules séquences connues
chez la plupart des microsporidies. La thérapeutique, quant
à elle, est limitée à l'utilisation de certaines molécules
telles que l'albendazole ou la fumagilline.
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- Ces eucaryotes unicellulaires présentent un
mécanisme d'invasion unique. La spore, stade infectieux,
renferme en effet un appareil d'extrusion constitué d'un
tube polaire inséré à son extrémité antérieure dans un
disque d'ancrage. Sous l'effet de certains stimuli, pouvant
être liés in vitro à une variation du pH, à l'osmolarité, à
la présence de cations ou d'anions, le tube polaire est
extrudé de la spore microsporidienne et traverse la
membrane plasmique d'une cellule-hôte. Le sporoplasme,
expulsé à travers ce tube, est ainsi inoculé dans la
cellule réceptrice. Cet appareil invasif, spécifique des
microsporidies et unique dans le monde vivant, suscite donc
un intérêt à la fois d'un point dE~ vue fondamental mais
aussi appliqué pour le diagnostic et la thérapeutique.
A ce jour, aucune séquence complète de
protéines constituant ce tube polaire n'a été obtenue.
Selon Weidner (3) le tube polaire serait constitué d'une
seule protéine de 23 kDa chez Am~eson rn.ichaelis. Plus
récemment, chez une microsporidie parasite de poisson,
Glugea americanus, une extraction différentielle des
protéines en présence d'un agent réducteur (DTT) a permis
de mettre en évidence qu'une protéine de 43 kDa est
constitutive du tube polaire, mais seule une partie de la
séquence N-terminale de 16 acides aminés a été déterminée
(4) .
La production d'anticorps palyclonaux et
monoclonaux a également été réalisée contre le tube polaire
de différentes espèces (5, 6, 7), montrant une passible
hétérogénéité protéique de cette structure.
Les travaux de recherche, ayant conduit à. la
présente invention, ont tout d'abord consisté à produire
des anticorps polyclonaux et monoclonaux contre le tube
polaire d'E. cuniculi. I1 a ainsi obtenu 2 anticorps
polycïonaux (anti-55 kDa et anti-35 kDa) et un anticorps
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monoclonal (anti-55 kDa) réagissant spécifiquement avec le
tube polaire en immunofluorescenc:e et en microscopie
électronique (6). Après séparation des protéines sparales
par électrophorèse en 2 dimensions et transfert sur
membrane PVDF une protéine ayant une masse moléculaire
apparente proche de 55 kDa et un point isoélectrique de 5
était reconnue par ces trois types d'anticorps. Sur ces
gels de 2 dimensions, une autrs=_ protéine de masse
moléculaire apparente proche de 35 kDa et avec un point
isoélectrique de 9 était également reconnue par 2 anticorps
anti-tube polaire, l'anticorps polyclonal anti-35 kDa et
l'anticorps monoclonal.
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre
de la présente invention ont donc permis, pour la première
fois, d'obtenir des protéines complètes de tube polaire de
microsporidie. Les travaux présenté:> par les Inventeurs à
l'occasion d'un congrès (Fifth International Workshops on
Opportunitic Protists and Fifth Gs~neral Meeting af the
European Concertecl Action on Pneurno~~yst.zs Research, Lille
3-7 septembre 1997) sur l'obtention d'une protéine de tube
polaire de 55 kDa sont insuffisants pour effectivement
permettre l'obtention de cette protéine complète et
purifiée et pour identifier, cloner et séquencer le gène
correspondant. En effet, aucune donnée de séquence
nucléique ou protéique n'apparaît dans le document relatant
ce congrès (8). Le protocole expérimental qui y figure
comprend des étapes classiques et bien connues de l'homme
du métier (9), telles que l'extraction des protéines
sporales, les électrophorèses (SDS-PAGE), la production
d'anticorps polyclonaux et: monoclonaux, ie microséquençage
de peptides ainsi que la déterminatic>n d'amorces dégénérées
et leur amplification par PCR. Comp te-tenu du caractère
synthétique du document relatant ce congrèsP son
enseignement est insuffisant pour permettre à l'homme du
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métier de reproduire les travaux des Inventeurs et de
mettre en évidence la Séquence complète d'une protéine
complète de tube polaire de microsporidie.
L'invention a donc pour' objet des protéines
complètes purifiées de tube polaire de microsporidie et
plus particulièrement de 3 espèces microsporidiennes du
genre Encephali.tozoon . E. cuniculi, E. intestinalis et E.
hellem.
Plus particulièrement l'invention concerne .
- une protéine de masse moléculaire apparente
d'environ 55 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 5,
de E. cunicu2i et E. intestinalis,
- une protéine de masse moléculaire apparente
d'environ 35 kDa et un point isoélectrique de l'ordre de 9,
de E. cuniculi, E. intestinalis et E. hellem.
Dans un second temps, le:~ travaux réalisés sur
les deux protéines purifiées d'E. cuniculi {55 et 35 kDa)
ont consisté à les soumettre à un mi.croséquençage interne
après digestion par l'Endolysine C. Deux peptides ont ainsi
été séquencés (P1 . ATALCSNAYGI~TPGQQGMAQ et P2 .
SATQYAMEACATPTP) pour la protéine de 55 kDa et un peptide
{P3 . AVQGTDRCILAGIïD) pour la protéine de 35 kDa, et ont
permis à partir d'amorces dégénérées d'amplifier une partie
des gènes correspondants.
En l'absence de banque génomique, les
Inventeurs ont réussi à déterminer les séquences des gènes
et leurs régions flanquantes par une technique de SSP-PCR
(10). Ces différentes étapes ont permis de définir la
structure complète des gènes, leurs particularités ainsi
que les similitudes éventuelles avec d'autres gènes. Les
structures primaires des protéines de 55 et 35 kDa ont
également été déterminées.
L'invention concerne donc les protéines de tube
polaire de microsporidie dont la séquence en acides aminés
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est représentée dans la liste de séquences en annexe sous
les numéros SEQ ID No : 1 , SEQ ID No : 2 , SEQ ID No : 3 , SEQ
ID No :4 et SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé
fonctionnellement équivalent de celles-ci.
5 On entend par dérivé fonctionnellement
équivalent, les protéines dont la :séquence comprend une
modification et/ou une suppression et:/ou une addition d'un
ou plusieurs résidus d'acides aminéa, dès lors que cette
modification et/ou suppression et/ou addition ne modifie
pas la fonction de ces protéines. De tels dérivés peuvent
être analysés par L'homme du métier selon les techniques .
- de criblage de banques d'expression à L'aide
d'anticorps dirigés contre les protéïnes du tube polaire,
ou
- de criblage de banques génomiques à l'aide de
sondes nucléiques capable de s'hybri.der à un gène codant
pour une protéine du tube polaire.
La protéine de 395 acides aminés, ci-après
désignée PTP55, représentée dans la liste de séquences en
annexe sous le numéro SEQ ID No :1 correspond à la protéine
de 55 kDa d'E cuniculi. Elle présente une masse moléculaire
déduite de 39 609 Da et de 37 230 Da sans le peptide
signal, qui est inférieure à celle de 55 OOO observée sur
gels de polyacrylamide. Cette protéine est synthétisée. par
E. cuniculi sous la forme d'un plus grand précurseur dont
la séquence signal de 22 acides aminé: est éliminée lors du
ciblage vers des vésicules impliquées dans la formâyion du
tube polaire. La séquence d'une protéine mature du tube
polaire de l'invention correspond donc à la séquence
comprisé entre les acides aminés en :position 23 et 395 de
SEQ ID Na :1. Plusieurs caractéristiques de peptide signal
sont en effet observées .
- structure secondaire prédite comme formant
une hélice tx,
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- - présence d'acides aminés hydrophobes ainsi
que de résidus basiques proches de la partie N-terminale,
- absence d'un résidu lysine en position 22, et
- prédiction de peptide :signal par l'algorithme
de von Heijne (11).
De plus, le séquençage N-terminal de la.
protéine a montré une séquence ident~_que à celle du peptide
P1, confirmant que le peptide de 22 acides aminés était
clivé lors de la maturation.
On observe en outre que la PTP55 ne contient
pas de résidus tryptophane, phénylalanine, ni arginine.
Elle présente un point isoélectrique déduit de 4,7 en
accord avec celui observé sur gels <ie polyacrylamide en 2
dimensions qui était de l'ordre c~e 5. L'étude d.e ces
séquences de 395 acides aminés et de 373 acides aminés dans
la protéine mature, montre qu'elle ne présente aucune
homologie significative avec d'autres protéines déjà
décrites dans les banques de données.
Une protéine homologue des PTP55 a été également
identifiée chez l'espèce E. intestinalis. Cette protéine de
371 acides aminés est représentée dans la liste de
séquences en annexe sous le numéro SEQ ID No :3. La
séquence présente notamment de fortes homologies avec les
régions N- et C- terminales de la PTP55 d'E. cun.iculi.
La protéine de 277 acides aminés, désignée ci-
après PTP35, représentée dans la liste de séquences en
annexe sous le numéro SEQ ID No :2 correspond à la pratéine
de 35 kDa d'E. cuniculi. Elle présente une masse
moléculaire déduite de 30 075 Da' inférieure donc à celle
de 35 000 observée sur gels de polyacrylamide. L'extrémité
N-terminale de la PTP35 préseante également des
caractéristiques de peptide signal .
- structure secondaire prédite comme farmant
une hélice oc,
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- présence d'acides aminÉa hydrophobes ainsi
que de résidus basiques,
- prédiction de peptide signal par l'algorithme
de von Heijne (11).
~ De la même maniére que pour 1a PTP55, la PTP35
d'E. cun,iculi présenterait un peptide signal. Des sites
potentiels de clivage protéolytiques ;peuvent être prédits
entre les résidus 12 et 13, 13 et 14 ou 22 et 23. Cependant
un tel clivage ne pourrait être confirmé que par le
séquençage de la partie N-terminale de~ la protéine. Sur la
base des données disponibles, 1a séquence d'une protéine de
tube polaire selon l'invention est comprise entre les
acides aminés 1 et 277 de la séquence donnée en annexe sous
le numéro SEQ ID No :2.
La PTP35 ne contient pas de résidus
tryptophane. Elle présente un point isoélectrique déduit de
8,6 en accord avec celui observé sur gels de polyacrylamide
en 2 dimensions qui était de l'ordre de 9. L'étude de cette
séquence de 277 acides aminés montre qu'elle ne présente
aucune homologie significative avec d'<~.utres protéines dêjà
décrites dans les banques de données.
Les inventeurs ont éga:Lement obtenus des
protéines homologues de PTP35 chez les, 2 autres espèces du
genre Encephalitozoon, E. intestina.I~is et E. hellem. Les
séquences correspondantes sont en annexe sous les numéros
SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5. Les PTP35 d'E. intestina..~is
et d'E. hellem sont respectivement constituées de 275 et
272 acides aminés et présentent environ 80~ d'identité.
La séquence d'une protéine PT35 du tube polaire
de l'invention correspond plus pari~iculièrement à une
séquence constituée par ou comprenant .
- la séquence comprises eni:re les acides aminés
en position 1 et 275 de la séquence représentëe dans la
liste de séquences en annexe sous le niunéro SEQ TD No:4..
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- - la séquence comprises entre les acides aminés
en position 1 et 272 de la séquence' représentée dans la
liste de séquences en annexe sous le :numéro SEQ ID No:5.
Des anticorps poly ou monoclonaux dirigés
contre au moins une protéine de l'invention ou un fragment
de celles-ci peuvent être préparés par les méthodes
décrites dans la littérature. Les anticorps polyclonaux
sont formés selon les techniques classiques par injection
des protéines, extraites à partir des spores d'E. cunicu.Ii
ou produites par transformation d'un hôte, à des animaux,
puis récupération des antisérums et des anticorps à partir
des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
Les anticorps monoclonaux peuvent être produits en
fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de
rates d'animaux préalablement immunisés à l aide des
protéines de l'invention. Ces anticorps sont utiles pour
rechercher d'autres protéines de tubes polaires d'E.
cuniculi, d'E. hellem ou d'E. intest~inalis et pour étudier
la parenté entre les protéines de tubes polaires de
différentes espèces, voire de différents genres. En effet,
les anticorps formés contre le tube polaire d'E.
intestina3is ou d'E. hellem donnant lieu à des réactions
immunologiques cxoisées avec les protéines du tube polaire
d'E.cuniculi. Mais ils peuvent aussi trouver des
applications dans le domaine diagnostique.
L'invention concerne donc aussi un procédé de
diagnostic des infections provoquées par les microsporidies
du genre Encephalitozoon comprenant les étapes suivantes .
a) on immobilise une protéine recombinante de
tube polaire de microsporidie selon l'invention sur un
support d'analyse tel qu'une feuille de nitrocellulose ou
une plaque ELISA,
b) on sature les sites aspécifiques de
réaction, par exemple en présence de lait écrémé 5~,
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c) on incube le produit obtenu à l'étape (b)
avec les anticorps du sérum du sujet à tester, de manière à
ce que, si le sérum contient des anticorps dirigés contre
une protéine de tube polaire de microsporidie, ceux-ci se
complexent à ladite protéine,
d) on élimine par lavage .Les anticorps du sérum
qui ne sont pas complexés à l'étape (c,),
e) on incube le produit de l'ëtape (d) avec des
anticorps secondaires anti-humains couplés à une molécule
permettant leur révélation, comme par exemple un enzyme tel
que ia péroxydase ou à un fluorochrome,
f) on élimine par lavage les anticorps anti-
humains qui ne sont pas liés spécifiquement et,
g) on révèle par tout moyen approprié les
complexes anticorps anti-humains / anticorps du sérum /
protéine formés à l'étape (e).
Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un
tel procédé est constitué par .
- un support d'analyse sur lequel sont
immobilisées des protéines recombinant:es de tube polaire de
microsporidie,
- une solution contenant des anticorps anti-
humains couplés à une molécule permettant leur révélation,
et
- une notice comportant les étapes du procédé
de diagnostic décrit plus haut.
L'invention se rapporte également à une
molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une
séquence nucléique codant pour une protéine de tube polaire
de microsporidie. Plus particulièrement, l'inventian se
rapporte aux séquences nucléotidiques codant pour les
protéines de PTP55 et PTP35 correspondant respectivement
aux protéine de 55 et 35 kDa de=.s microsporidies E.
cuniculi, E. intestinalis et E. hellem.
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L'invention envisage à titre spécifique, une
molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée 'par une
séquence nucléique codant pour une ~>rotéine de tube ,polaire
de microsporidie dont la séquence en acides aminés est
5 représentée dans la liste de séquences en annexe sous le
numéro SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID
No :4 ou SEQ ID No :5, un fragment ou un dérivé
fonctionnellement équivalent de cette protéine.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence
10 codant pour la protéine PTP55 d'E, cuniculi est représentée
dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID
No :1 ou sa séquence complémentaire. Plus particulièrement,
une telle séquence d'acide nucléique comprend la séquence
comprise entre les nucléotides 411 et 1532 de SEQ ID No :1
ou sa séquence complémentaire. La séquence nucléique de SEQ
ID No :1 est composée de 1830 nucléotides et comprend un
cadre de lecture ouvert de 1188 paires de bases allant de
la position 345 tcodon d'initiation ATG) à la position 1532
(codon stop TAG). La région précédant la position 345 est
susceptible de comprendre des éléments utiles à la
transcription de la protéine PTP55 telle qu'une région
promotrice.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence
codant pour une protéine homologue de PTP55 identifiée chez
l'espèce E. intestinalis est représentée dans la liste de
séquences en annexe sous le numéro SEQ TD No :3.
Une molécule d'ADN comprenant la séquence
codant pour la protéine PTP35 est représentée dans la liste
de séquences en annexe sous le nums;ro SEQ ID No :2 ou sa
séquence complémentaire. Plus particulièrement, une telle
séquence d'acides nucléiques comprend la séquence comprise
entre les nucléotides 458 et 1291 de SEQ ID No :2 ou sa
séquence complémentaire. La séquence nucléique II de
l'invention est composée de 1740 nucléotides et comprend un
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cadre de lecture ouvert de 834 paire~~ de bases allant de la
position 458 (codon d'initiation ATG) à la position 1291
(codon stop TAA). La région précédant la position 458 est
susceptible de comprendre des éléments utiles à la
transcription de la protéine PTP35 telle qu'une région
promotrice.
Deux molécules d'ADN comprenant chacune une
séquence codant pour une protéine homologue de PTP35 chez
deux autres espèces du genre Encephalitozoon, E.
intestinales et E. hellem sont représentées dans la liste
de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID No :4 et SEQ
ID No :5.
L'invention concerne donc tout particulièrement
les molécules d'acide nucléique dont les séquences
nucléotidiques sont représentées dans la liste de séquence
en annexe sous les numéros SEQ ID No :1, SEQ ID No :2, SEQ
ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID No :5 ainsi que toutes
séquences nucléotidiques capables de s'hybrider avec
celles-ci. En effet, l'invention concerne bien entendu
aussi les séquences nucléotidiques dérivées de SED ID
No :1, SEQ ID No :2, SEQ ID No :3, SEQ ID No :4 et SEQ ID
No :5 par exemple du fait de la dégénérescence du code
génétique, et qui code pour des protéines prësentant des
caractéristïques de tube polaire de m.icrosporidie.
L'invention concerne également un vecteur
comprenant au moins urne molécule d'acide nucl.éigue
précédente, avantageusement associée à des séquences de
contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou
d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine de tube
polaire de microsporidie de l'invention ou d'un fragment de
celle-ci. La préparation de ces vecteurs ainsi que la
production ou l'expression dans un hôte des protéines de
l'invention peuvent être réalisées épar les techniques de
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biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de
l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé de production
d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon
l'invention consiste .
- à transférer une molécule d' acide nucléique
de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans
un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte' cellulaire dans des
conditions permettant la production de la protéine de tube
polaire de microsporidie,
- à isoler, par tous moyens appropriés les
dites protéines.
A titre d'exemple, un procédé d'expression
d'une protéine de tube polaire de microsporidie selon
l'invention consiste .
- à transférer une molécule d' acide nucléique
de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans
un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des
conditions permettant l'expression desdites protéines.
L'hôte cellulaire mis en aeuvre dans les
procédés précédents peut être choisi parmi. les procaryotes
ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les
levures, les cellules de mammif~~res, de plantes ou
d'insectes.
Le vecteur utilisé est choisi en fonction de
l'hôte dans lequel il sera transféré ; il peut s'agir de
tout vecteur comme un plasmide.
L'invention concerne donc aussi les hôtes
cellulaires et plus particulièrement les bac~:éries
transformées comme E. coZi, exprimant. des protéines de tube
polaire de microsporidie obtenues conformément aux procédés
précédents.
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L'invention concerne également les sondes
nucléiques et oligonucléotides préparés à partir des
molécules d'acide nucléique de l'invention.
Ces sondes, avantageux>ement marquées, sont
utiles pour la détection par hybridation de séquences
similaires chez d'autres microsporidies. Selon les
techniques classiques, ces sondes sont mises en contact
avec un échantillon biologique. Différentes techniques
d'hybridation peuvent être mises en oeuvre telles que
l'hybridation sur taches (Dot-blot) ou l'hybridation sur
répliques (technique de Southern) ou autres techniques (DNA
chips). De telles sondes constituent: des outils permettant
de détecter rapidement des séquences similaires dans les
gènes codant pour les protéines de tube polaire de
microsporidie ce qui permettrait d'étudier l'origine et la
conservation de ces protéines constituant le tube polaire.
Les oligonucléotides sont utiles pour des
expériences de PCR par exemple pour rechercher des gènes
dans d'autres microsporidies ou dans un but de diagnostic.
L'invention concerne donc aussi un procédé de
diagnostic des infections provoquées par des
microsporidies, comprenant les étape: suivantes .
a) on extrait de l'ADN de spores
microsporidiennes prélevées dans des échantillons
biologiques provenant des urines, des selles, ou d'une
biopsie,
b) on amplifie l'ADN extrait par tout moyen
approprié teï qu'une PCR à l'aide d'oligonucléotides
spécifiques déduits des séquences de:~ gènes codant pour les
protéines de tube polaire de microsporidie,
c} on immobilise les produits d'amplification
sur un support d'analyse,
d) on détermine l'origine microsporidienne des
produits d'amplification par hybridation à l'aide d'une
sonde nucléotidique marquée spécifique d'une microsporidie. '
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Il est possible de réaliser l'étape (cj par
fixation des produits d'amplific:ation sur un support
d'analyse, tel qu'une membrane ou une plaque ELISA.
~ Un kit de diagnostic pour la mise en oeuvre d'un
tel procédé est constitué par
- les moyens nécessaires à l'amplification des
séquences codant pour les protéines de tube polaire de
microsporidie, tels que des oligonucléotides spécifiques de
ces séquences, et tous les autres éléments nécessaires à la
réalisation d'une PCR,
- un support d'analyse ~aour fixer les produits
de l'amplification, et
- des sondes marquées spécifiques d'une
microsporidie.
L'invention se rapporte également à des
compositions vaccinales capables de prévenir les infections
provoquées par les mïc~osporidies du genre Encephal.~tozoon
comprenant à titre de principe, actif une protéine de
l'invention ou un fragment de celle-ci en association avec
un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
En effet, les anticorps formés contre le tube
polaire d'E. intestinalis ou d'E.. he~llem donnant lieu à des
réactions immunologiques croisées avec des protéines de
tube polaîre d'E. cuniculi, l'invention fournït
avantageusement un vaccin potentiel contre les infections
provoquées par les mïcrosporidies du genre Encephalitozoon.
D'autres caractéristig;ues et avantages de
l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui
suivent concernant la production d'anticorps contre le tube
polaire, le clonage et le séquençage des gènes codant pour
des protéines de tube polaire chez E. cuniculi, et qui se
rapportent aux dessins en annexe dans lesquels .
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- la figure 1 montre .
~ A . la séparation électrophorétique des
protéines sporales par SDS-PAGE avec sur la piste l la
fraction soluble dans SDS 2%, 2-mercaptoéthanol 10%, et sur
la piste 2 la fraction résiduelle obtenue après incubation
dans du 2-mercaptoéthanol 50~ pendant 48 heures.
~ B . l'analyse pair immunofluorescence
indirecte à l'aide d'anticorps polyclonaux dirigés contre
la bande de 55 kDa séparée par SD~S-PAGE {dilution 1/50e)
sur des cellules MRC-5 infestées par Encephalitozoon
cuniculi. Les spores avec, leurs tubes polaires extrudés
sont fortement marquées.
~ C . l'immunoblot avec l'anticorps polyclonal
anti-55 kDa (dilution 1/5000e, piste 1) et l'anticorps
monoclonal Ec 102 (dilution 1/1~DOOOe, piste 2). Les
marqueurs de poids moléculaires {M) sont indiqués sur la
gauche et sont donnés en kDa. Les b:lots ont été révélés en
utilisant un kit ECL (Amersham).
- la figure 2 montre l'immunoréactivité de la
protéine de 55 kDa. L'électrophorèse sur gel deux
dimensions a été réalisée en utilisant
l'isoélectrofocalisation dans la première dimension et des
gels de 12~ dans la deuxième dimension. Les
protéines
séparées ont été soit colorées au nitrate d'argent (A) soit
transférées sur des membranes de PVI)F et incubées avec les
anticorps polyclonaux dirigés contre le spot acide de 55
kDa {dilution 1/5000e) isolé par élec:trophorèse 2D (~).
Les poids moléculaires sont indiqués en kDa et
les points isoélectriques numérotés de 4 à 8.
On observe en (C) le m<~rquage spécifique des
tubes polaires extrudés en immunofluorescence avec ce même
anticorps.
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WO 00/01724 PCTJFR99/OI630
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- la figure 3 illustre l'expression de la PTP55
chez Escherichia coli. On distingue en A, l'analyse sur
gels de polyacrylamide (SDS-PAGE) des protéines extraites
de bactéries transformées avec la construction plasmidique
pQE30-PTP55. La piste 1 montre la production sans
induction ; la piste 2 après induction à 1'IPTG et la piste
3 la PTP recombinante purifiée sur résine Ni~NTA.
On distingue en B un i.mmunoblotting avec les
sérums dirigés contre 1a PTP55 recombinante (dilution
1/1000e). Sur la piste 1, les protéines d'E. coli 4 heures
après induction IPTG ; sur la piste 2 les protéines
d'Encephalitozoon cuniculi.
On distingue en C un marquage en
immunofluorescence indirecte, avec les antisérums dirigés
contre la PTP55 recombinante de;s tubes polaires d'E.
cun3culi. Les tubes polaires extrude''=_s sont indiqués par des
flèches.
On distingue en D un immunomarquage à l'or
colloïdal en microscopie électronique à transmission des
sections de tube polaire.
- la figure 4 montre un immunomarquage réalisé
sur des gels d'électrophorèse ~en 2 dimensions avec
l'anticorps monoclonal dirigé contre' le tube polaïre.
L' electrophorèse sur ge:l de deux dimensions a
été réalisée en utilisant 1'isoélectrofocalisation dans la
première dimension et des gels des 12~ dans la deuxième
dimension. Les protéines séparées ont été soit colorées au
nitrate d'argent (A) soit transférées sur des membranes de
PVDF et incubées avec l'anticorps monoclonal (dilution
1/5000e) (B). Les spots de 55 et 35 kDa sont indiqués par
des flèches.
- la figure 5 illustre l'expression de 1a PTP35
chez Escherichia coli. La figure 5 montre .
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~ en A, l'analyse sur gels de polyacrylamide
(SDS-PAGE} des protéines extraites de bactéries
transformées avec la construction plasmidique pQE30-PTP35.
La piste 1 montre la production sans induction ; la piste 2
après induction à l'IPTG et la piste 3 la PTP recombinante
purifiée sur résine Ni-NTA.
Les marqueurs de poids moléculaires sont
indiqués en kDa.
en B, un immunoblot:ting avec les sérums
dirigés contre la PTP35 recombinante (dilution 1/1000e}.
Sur la piste 1 on distingue le profil
électrophorétique d'Encephalitozoon cunicu.Zi coloré au bleu
de Coomassie.
Sur la piste 2 est illustré le marquage d'une
protéine de 35 kDa d'E. cuniculi avec l'anticorps dirigé
contre la protéine recombinante de 35 kDa exprimée chez
Escherichia coli.
en C, le marquage en immunofluorescence
indirecte, avec les antisérums dirigés contre la PTP35
recombinante; des tubes polaires d'E. cunzculi. La flêche
indique un tube polaire extrudé.
1) Production d'anticorps contre le tube
polaire d'E. cuniculi, analyses immunocytochimictues.
La souche d'E. cuniculi utilisée est un isolat
de souris. Elle est entretenue sur culture cellulaire MDCK.
Les spores libérées dans le surnageant de culture sont
récupérées et stockées à 4°C dans du PBS. L'extraction des
protéines sporales est réalisée par broyage des spores avec
des billes de zirconium (0,1 mm de diamètre) dans un tampon
contenant 2.5~ de SDS et 10ô de 2-mercaptoéthanol en
présence d'inhibiteurs de protéases. Après dénaturation par
la chaleur 10 minutes à 100°C, les débris sporaux sont
éliminés par centrifugation à 18000 g pendant 5 minutes.
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Les protéines sont ensuite séparées par SDS-PAGE sur des
gels de polyacrylamide 12%.
Pour l'électrophorèse en 2 dimensions, les
échantillons protéiques sont solubilisés dans un tampon à
base d'urée 9 M, de 2-mercaptoéthanol 5% et de CHAPS 40 mM.
L'isoélectrofocalisation est réali:~ée dans les conditions
suivantes . 4 heures à 400 V, 30 minutes à 600 V puis 30
minutes à 800 V avec la combinaison d'ampholines
(Pharmacia) 40% pH 3-10, 60% pH 4-f.,5. Après équilibration
des gels de première dimension dans du SDS / 2-
mercaptoéthan:ol pendant 10 minutes, les protéines sont
séparées selon leur masse moléculaire par SDS-PACiE. Les
gels correspondants sont colorés soit à l'argent soit au
bleu de Coomassie, ou transférés sur membrane PVDF
(Immobilon P, Polylabo) en utilisant: un système semi-sec.
Les anticorps polyclonaux ont été produits
contre différentes protéines d~E. cuni.cu3i séparées par
électrophorèse. Des injections i:ntrapéritonéales sont
réalisées chez des souris BALB/c pour chaque échantillon
protéique. La bande protéique de 55 kDa a également été
utilisée pour produire des anticorps monoclonaux. Ainsi, 3
anticorps dirigés contre Ie tube polaire ont été obtenus .
2 anticorps polyclonaux anti-35 kDa et anti-55 kDa et un
anticorps monoclonal anti-55 kDa.
L'immunoblotting, l'ïmmunolocalisation en IFA
et en microscopie électronique à transmission sont réalisés
selon les techniques classiques.
2) Microséquença e c~e PTPs de masses
moléculaires apparentes 55 kDa et 35 kDa.
La séquence N-terminale ainsi que 2 peptides
internes (P1 et P2) ont été séquencés pour la PTP55 d'E.
cuniculi.
N-terminal . ATALCSNAYG
P1 . ATALCSNAYGLTPGQQGMAS)
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P2 SATQYAMEACATPTP
Un peptide interne (P3) a été séquencé pour la
PTP35.
P3 . AVQGTDRCILAGIID
Ces séquences ont été réalisées à partir des
protéines de 55 kDa et de 35 kDa isolées par électrophorèse
en 2 dimensions, par le laboratoire de microséquençage des
protéines, Institut Pasteur, Département des
biotechnologies.
Pour le séquençage interne des peptides P1, P2
et P3, les protéines ont été préalablement digérées par
l'Endolysine C, enzyme protéolytique coupant après un
résidu lysine.
3) Amplification PCR, clonage et séguença e des
gènes codant pour les PTPs.
a) Gènes codant our les PTP55 d'E. cuniculi et
d'E. intestinalis.
A partir d'amorces dégénérées déduites des
peptides P1 et P2, un fragment d'ADN d'environ 1 kpb a été
amplifié, cloné dans un vecteur plasmidique pCR2
(Invitrogen, TA cloning vector) et séquencé selon la
méthode dë Songer ( 12 ) . L' amplificai~ion des régions 5' et
3' du gène de la PTP a été réaliséE~ par une technique de
PCR (SSP-PCR). L'analyse des séquences est réalisée sur le
serveur de biologie moléculaire Infobiogen.
La séquence complète représentée dans la liste
de séquence en annexe sous Ie numéro SEQ ID No :1 comprend
1830 nucléotides et comporte un cadre de lecture de 1188
pb. Ce dernier contient 395 codons allant du site considéré
comme étant le site d'initiation de la traduction au codon
de terminaison TAG. Le codon considéré comme codon ATG de
départ est précédé par une région particulièrement riche en
A-T. La séquënce en acides aminés traduite est représentée
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dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID
No :1.
A l'aide d'amplifications par PCR et SSP-PCR,
le gène codant pour une protéine homologue de PTP55 a été
5 séquencé et est représenté dans la liste de séquence en
annexe sous le numéro SEQ ID No :3. Cette séquénce comporte
un cadre de lecture de 1113 pb. Ce dernier contient 371
codons allant du site considéré comme étant le site
d'initiation de la traduction au codon de terminaison TAG.
b) Gènes codant pour 1.=s PTP35 d'E. cuniculi,
d'E. intestinalis et d'E. hellem.
A partir d'amorces dégénérées déduites du
peptide P3, différents fragments ont été amplifiés par la
technique de SSP-PCR, clonés dans un vecteur piasmidique
pGEMT (Promega, TA cloning vectoi.°), séquencés selon la
méthode de Sanger et analysés comme décrit ci-dessus.
La séquence complète de la PTP35 d'E. cuniculi
représentée dans la liste de séquence en annexe sous le
numéro SEQ ID No :2 comprend 1740 nucléotides. Le cadre de
lecture comprend 834pb. Ce derniE:r contient 277 codons
allant du site considéré comme étant le site d'initiation
de la traduction au codon de terminaison TAA. Le codon
considéré comme codon ATG de départ est précédé par une
région particulièrement riche en A-'T, similaire à celle de
la PTP55. La séquence d'acides aminés traduite est
représentée dans la liste de séquences en annexe sous le
numéro SEQ ID No :2.
Les séquences des PTP35 d'E. intestinalis et
d'E. hellem représentées dans la liste de séquences en
annexe sous les numéros SEQ ID DJo :4 et SEQ ID No :5
contiennent respectivement 825 et: 816 nucléotides non
compris le codon stop. Les protéineas correspondantes sont
constituées de 277 et 272 acides aminés.
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4) Expression des PTPs chez Escherichia coli.
Une partie de la PTP55 d'E. cuniculi
correspondant à la région entre les peptides P1 et P2 a été
clonée dans un vecteur d'expres:~ion pQE30 (Qiagen) et
exprimée chez E. soli (souche M15). La protéine
recombinante a été purifiée par chromatographie d'affinité
sur colonnes de nickel et injectée à des souris. Les
anticorps correspondants testés en immunoblotting,
immunofluorescence et en microscopie électronique à
transmission ont permis de confirmer que cette protéine
était bien localisée au niveau du tube polaire d'E.
cuniculi.
Une partie de la PTP35 entre les résidus 27 et
277 a également été exprimée chez E. soli selon la même
technique. Les anticorps produits contre cette protéine
recombinante ont montré un marquage du tube polaire.
5) Analyse des séauence:~ primaires des PTP55 et
PTP35.
L'analyse Blast n'a montré aucune homologie
significative avec d'autres protéixnes connues, si ce n'est
avec le collagène, principalement dû au fait que la PTP55
est riche en résidus glycine et pro:Line.
a) Les PTP55 sont riches en résidus proline,
glycine, glutamine, sérine et thréonine qui représentent à
eux 5 plus de 55~ du contenu en acides aminés. Le site de
clivage (entre les résidus sérine et alanine de la PTP55
d'E. cuniculi) proposé est prédit comme tel par les
caractéristiques suivantes .
, - absence de résidu lysine en position 22
précédant le peptide P1 séquencé (23-42) après digestion de
la protéine par l'Endolysine C,
- séquençage N-terminal de la protéine
correspondant à celui du peptide P1,
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22
présence d'acides aminés hydrophobes dans
cette région N-terminale,
- algorithme de von Heijne,
- structure secondaire en hélice a.
La PTP est vraisemblablement synthétisée par E.
cuniculi (ou E. intestinalis) sous forme d'un plus grand
précurseur dont la séquence signal de 22 acides aminés est
éliminée lors de la maturation. La protéine mature aurait
donc une masse moléculaire de 37230 Da.
Des sites de N-glycosylation (NETS, NGTS et
NISG) sont présents dans la séquence. La présence de
nombreux résidus sérine et thréonine (21,6ô) laisse
également supposer des sites de O-glycosylation.
La région centrale de la protéine PTP55 d'E.
cunicu~i est caractériséé par 4 répétitions en tandem de 26
acides aminés chacune avec une conservation au niveau
nucléique. Cette région est partiE~llement encadrée par 2
autres répétitians de 9 acides aminés. Aucune répétition
n'est observée dans la séquence PrCP55 d'E. intestinalis,
mais les 2 PTP55 présentent de fortes homologies dans les
parties N- et C- terminales.
b) Les PTP35 sont particulièrement riches en
résidus lysine (11.50 et acide glutamique (9~). 3 sites de
clivages potentiels d'une séquence signal sont représentés
entre les résidus 12 et 13, 13 et: 14, et 22 et 23. Une
séquence RGD est présente dans la PTP35 d'E. cuniculi et
d'E. intestinalis, séquence que l'on retrouve dans des
protéines telles que la fibronectine~ et qui intervient dans
des phénomènes d'attachement cellulaire. Un site potentiel
de N-glycosylation (NSTS) est également présent dans la
séquence PTP35 d'E. cuniculi.
6) Localisation chromosomique et estimation du
nombre de co ies.
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23
L'hybridation d'une sonde, correspondant à une
partie du gène codant pour la PTP55, sur les chromosomes
d'E, cuniculi séparés par électrophorèse en champs pulsé a
montré une localisation unique de ce gène sur le chromosome
VI.
La même sonde a été app:Liquée sur des Southern
après digestion de l'ADN génomique d'E. cuniculi par
différentes enzymes de restriction . une seule bande est
marquée sur chaque profil de digestion, ce qui permet
d'affirmer que le gène existe en une seule copie.
Le gène codant pour la PTP35 d'E. cuniculi est
également localisé sur le chromosome VI.
i:i'
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24
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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WO 00!01724 PCT/FR99/01630
1
LISTE DE SÉQUENCES
(1)INFORMATION GÉNÉRALES:
(iii)NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(2)INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:1 .,
(i) CARCTRERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRIN: doube
(D) CONFIGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE:
(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ ID N0:1 .
GAATTCAGAT GCCTCATACC TTGGGATTAA AAAATTGATG TTCATTTGTT ATATATCCTG60
GGCGGACAGG CCGGCTCGTA TTCTTCAGGG GTGTCGCCTA CCCAGTGCAC AGGAGGTTC'C120
GGAGGTGTCT TGGATGGAAA GTAAGGCCAT TTGTGGGTTC TCATCCATGT CATCGTCCC'T1$0
2 TTCGGCTGTT TCACCAAGAT CCAATTATTC CTCCAGGACT TTCAACCCTC AGAATGGAAA240
O
CAGAGATGAA ACTCTCTGTG CAAATCGTAG ATATCGATTG GAGACATTGA AACCACGGAG300
TTTGAAATAA AAGTATAAAT ACCTCCGAAA ACGCAGAGTT TAAG ATG AAA 356
GGT ATT
Met Lys Gly Ile
1
2 TCT AAG ATC CTC TCT GCC TCT ATT GCC CTG ATG AAG TTG GAG 404
5 AAT GTC
Ser Lys Ile Leu Ser Ala Ser Ile Ala Leu Met Lys Leu Glu
Asn Val
5 10 15 20
TAT TCA GCA ACC GCA CTG TGC AGC AAT GCA TAT GGC CTA ACT 452
CCG GGA
Tyr Ser Ala Thr Ala Leu Cys Ser Asn Ala Tyr Gly Leu Thr
Pro Gly
30 25 30 35
CAA CAG GGT ATG GCT CAG CAG CCG TCG TAT GTG CTG ATC CCC 500
AGC ACC
Gln Gln Gly Met Ala Gln Gln Pro Ser Tyr Val Leu Ile Pro
Ser Thr
40 45 50
CCG GGA ACC ATA GCA AAC TGT GCA AGC GGT TCA CAG GAC ACA 548
TAT TCT
3 Pro Gly Thr Ile Ala Asn Cys Ala Ser Gly Ser ~Gln Asp Thr
5 Tyr Ser
55 60 65
CCT TCT CCC GCT GCA CCC ACA TCT CCA GTG ACT CCG GGG AAA 596
ACT AGC
Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Ser Pro Val Thr Pro Gly Lys
Thr Ser
70 75 g0
4O GAG AAT GAG ACA TCT CCA TCG GCT CCT GCA GAA GAT GTA GGA 644
ACA TGC
Glu Asn Glu Thr Ser Pro Ser Ala Pro Ala Glu Asp Val Gly
Thr Cys
85 90 95 100
AAG ATT GCC GTA TTG AAG CAC TGC GAC GCA CCA c,;GA ACA ACA 692
TCA GGG
Lys Tle Ala Val Leu Lys His Cys Asp Ala Pro Gly Thr Thr
Ser Gly
45 105 110 115
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RErGLE 26j
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2
ACG ACACCA TCA CAA 740
GGG GGG CAG
CCT CCT
TGT
GAA
ACC
CCA
GAG
CAG
Thr ThrProGlySer GIy GluThr GlnGln Pro
Pro Pro
Cys Glu
Gln
120 125 130
TTG TCAGTGATCTCC ACCACT GCCGTA GTGGAG TCT 788
CCT CCG
GTG
ACT
Leu SerValIleSer ThrThr AlaValProVal ThrValGlu Ser
Pro
135 240 145
GCA CAGTCTCCATCT GTTGTGCCA GTTGTTCCTGTC GTTGCTCAC CAC 836
Ala GlnSerProSer ValValPro ValValProVal ValAlaHis His
150 155 160
Z CAG GCAGTTCCAGGC TACTACAAC AATGGAACATCC GGTATTCCT GGA 884
O
Gln AlaValProGly TyrTyrAsn AsnGlyThrSer GlyIlePro Gly
165 170 . 175 180
CAG CAACAGATCCTT TCTGGCACT CTTCCCCCAGGA GCCACTTTG TGT 932
Gln GlnGlnIleLeu SerGlyThr LeuProProGly AlaThrLeu Cys
185 190 195
CAG GGACAGGCCATG CCTAGCACT CCTGGACAGCAA CAGATCCTT TCT 980
G1n GlyG1nAlaMet ProSerThr ProGlyGlnGln Gln21eLeu Ser
200 205 210
GGC ACTCTTCCCCCA GGGGTCACT TTGTGTCAGGGA CAGGCCACG CCT 1028
2 Gly ThrLeuProPro GlyValThr LeuCysGlnGly GlnAlaThr Pro
0
215 220 225
AGC ACTCCTGGGCAG CAACAGGTC CTTTCTGGCACT CTTCCCCCA GGA 1076
Ser ThrProGlyGln GlnGlnVal LeuSerGlyThr LeuProPro Gly
230 235 240
2 GTC ACTTTGTGTCAG GGACAGGCC ACGCCTAGC.ACTCCTGGGCAG CAA 1124
5
Val ThrLeuCysGln GlyGlnAla ThrProSer'~hrProGlyGln Gln
245 250 255 260
CAG GTCCTTTCTGGC ACCCTTCTC CCAGGAGCCACT TTGTGfiCAG GAT 1172
Gln VaILeuSerGly ThrLeuLeu ProGlyAla'rhrLeuCysGln Asp
30 265 270 275
CAA GGTATGCCTGGA ACATCCGGA GTTCCTGGACAG CAGGGACAG TCT 1220
Gln GlyMetPro-Gly ThrSerGly ValProGlyGln GlnGlyGln Ser
280 285 290
AGT GGACAGTGTTGfiGCCCCTCAG ATTCCAAACCCT GTCATGCCG CCA 1268
3 Ser GlyGlnCysCys AlaProGln IleProAsnI?roValMetPro Pro
5
295 300 305
TCC ATGAACATTAGT GGAAATGGG TATCCTTCTTCT ACCGCATAC AGC 1316
Ser MetAsnIleSer GlyAsnGly TyrProSerSer ThrAlaTyr Ser
310 315 320
CCA CTCGGATCA CTGGGATCC TGTGTTGACATA CAG ACG GGG 1364
AAC AAG
Pro LeuGlySer LeuGlySer CysValAspTle Gln Thr Gly
Asn Lys
325 330 335 340
GGG TGCGAG CAAAAACCC GAGAAGTCCGCC ACG GCC 1412
ACA CAG
TCC TAT
Gly SerCysGlu LysPro LysSerF~laThr
Thr Gln Glu Gln
Tyr
Ala
45 345 350 355
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE13LE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00/01724 PCT/FR99/01630
3
ATG GAG GCC TGT GCA ACA CCA ACA CCA ACG GTT ATT ATA GGC 1460
AAC AGC
Met Glu Ala Cys Ala Thr Pro Thr Pro Thr Val Ile Ile Gly
Asn Ser
360 365 37p
GAG TAT CTT GTT GGA CCA GGA ATG TAC AAT GCA ATT AAC TCT 150$
CCA TGC
Glu Tyr Leu Val Gly Pro Gly Met Tyr Asn Ala Ile Asn Ser
Pro Cys
375 380 385
AAC ACT GCT GTC CAA TGC TGC TAG GCTAAAATAA AACGAGTTTA ATCTTCTTTT1562
Asn Thr Ala Val Gln Cys Cys
390 395
ZO TCTTCGGTCT TTTGGAACGT TGGATGGGGA TGGAGGAGTC TATGGGCTGA 1622
AGTGAAATGC
CAACACTTCT TCTGCCCAAG AACACATTCG GATGTTCTTC CTGTGGCCAG 1682
GAGTTTGGTA
ACAGGATTCC CCGAGGATTT AGCAGCCTTG GAGTACCATG .ATTGAATCAG 1742
TATTAAACTT
CTCAAATTAT TTTATTCTTT CTGTTTTATA TCCCGAGCCA .ATCTGAGAAG 1802
AATGCCTCGA
ATTCAAGCTC CCTTAGAAGT GTGGGATC 1$30
(2)INFORMATION POUR LA SEQ ID N0:2 .
(i) CARACTRERISTIQUES DE LA SQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFTGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLCULE: ADN
(ix) CARACTRISTIQUES
(A) NOM/CLE:
(xi)DESCRIPTION DE LA SQUENCES: SEQ ID N0,:2 .
AAGCTTCTGA ACAAGCGCTA ACCCTCTTTC AGAATATATA AAGCAATCCA 60
TACAACTTCT
CCATCCATCC CGGTGCTGTT TCTTTGGAGG CAAAACAGAG GAGGTGGCGA 120
TATCGATGGT
GCATCCATAA TATATACAAG ACACTCCAGG CTGCAACTGA ATCAACACAC 180
TCCATCCCCT
3 CAGGAAGTCG GTAAACTTGC CTTGAAAATA GCCAATGGAT GTCTCCAGGC 240
O TTTATACCAT
GCACAGCTAT ATCTTGGCCT GAAGTGCACT TTCAGGTCzGG GCTTTGTTAC 300
ATTGCGGTGT
TTTGGATTAC CTGATATAAT TTGTTACCCA-CTGAGTCAAG TCGAAACCAG "360
TAGTCCGCAG
ATTTCTAACA GAGAGGAAAG ACTGGAGGTA ATTTGTGGCT TTTGAAACAT 420
GCACAGCAAA
ATAAAATATA AAAGAAGCCT TTTGCACACT ACCAAAG ATG TTG TTA CTT 475
CTC GCC
3 Met Leu Leu Leu Leu Ala
5
1 5
ATA ACT GCT GTT GTT AGC GCC ACG ATG GTC CAT C'CT TCA GCT 523
GTT GTT
Ile Thr Ala Val Val Ser Ala Thr Met Val His F~ro Ser Ala
Val Val
10 15 20
4O CCA CAG CCC GCA GCA CCT CTC CAT GTC GTT CCC C.'CA CAG CAG 571
CAA ATG
Pro Gln Pro Ala Ala Pro Leu His Val Val Pro F~ro Gln Gln
Gln Met
25 30 35
GGC ATG GTT AAC GGA TGC ACC AGC AAG AAA CTA GAG CsGT~GCA 619
GAA ATA
Gly Met Val Asn Gly Cys Thr Ser Lys Lys Leu Glu Gly Ala
Glu Ile
45 40 45 50
FEUfLLE DE REMPLACEMENT (RECiLE 26)
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WO 00/01724 PCT/FR99/01630
4
ATG AGA AGG AAC ATGATT CAGAAA AGA TCG GAG GCA ACA 667
GAG .AGC
TGC
Met Arg Arg Asn MetIleGlu GlnLys Arg Ser Glu Ala Thr
Cys ,Ser
55 60 65 70
AAG GCG ATG ATT GAAAGGGCA GAAAAG GCT GAA TCA TTC AAC 715
AAT GTA
Lys Ala Met Ile GluArgAla GluLys Ala Gl.u Ser Phe
Asn 'Val Asn
75 80 85
AAG GAA GTT AGC AAAGGACCT CAAAAG GAT GGC CAG TGC ATA 763
AGC GGA
Lys Glu Val Ser LysGlyPro GlnLys Asp Gly Gln Cys Ile
Ser Gly
90 95 100
Z O GAA AAA GCT GTA CAAGGTACC AGGTGT ATT GCT GGA ATA ATC 811
GAT (~TC
Glu Lys Ala Val GlnGlyThr ArgCys Ile Ala Gly Tle Ile
Asp Leu
105 110 115
GAT AAG GCG GTG AACAAGCGC TACAGA ATC GAT GTG GAG AAC 859
AAG 'CCA
Asp Lys Ala Val AsnLysArg TyrArg Ile Asp Val Glu Asn
Lys Ser
120 125 _L30
AGC ACC TCG CTC TACAGAGGA AAGCTA ATT CTA ATT GTC AAT 907
GAC GCC
Ser Thr Ser Leu TyrArgGly LysLeu Ile Leu Ile al Asn
Asp Ala
135 140 145 150
GTC GAC TAT GGG CTGCAGCCG ACTAAG CCA AAG AAG AAG TCC 955
ATC AAG
Val Asp Tyr Gly LeuGlnPro ThrLys Pro Lys Lys Lys Ser
Ile Lys
155 160 165
AAG ATA ATG GCG AATCTCCCT CCGAAG AGA ATG TAT TTC AAC 1003
CAG GTAG
Lys Ile Met Ala AsnLeuPro ProLys Arg Met Tyr Phe Asn
Gln Glu
170 175 180
2 5 CAA ATC GGT CAG CTTGTTGGA AGAGGA ACG CCC CAG GA AAC 1051
GCA 'l'TC
Gln Ile Gly Gln LeuValGly ArgGy Thr Pro Gln Glu Asn
Ala Phe
185 190 195
AAG GAG GAC TGC AAGCCTTGT GGTCCC AAG ACT GTT GAA ACT 1099
GAG F,AG
Lys Glu Asp Cys LysProCys GlyPro Lys Thr Val Glu Thr
Glu Lys
30 200 205 210
ACT TCT GAG AAA TGTAATCTT TGCGAG CTT GGA ACA TCT GCT 1147
GGG A,AA
Thr Ser Glu Lys CysAsnLeu CysGlu Leu Gly Thr Ser Ala
Gly Lys
215 220 225 230
CTG ATA AGC AAG GCCATACAG AAGGAA GTC GAC ACG AAG GAA 1195
AAG AAG
3 5 Leu Tle Ser Lys AlaIleGln LysGlu Val Asp Thr Lys Glu
Lys Lys
235 240 245
GGG GAG AAA AGT GCAAGCCAG TCTGAT GGC GGC ACT GCT GAG 1243
GAC GAG
Gly Glu Lys Ser AlaSerGln SerAsp Gly Gly Thr Ala Glu
Asp Glu
250 255 260
4 O GAT GCG GAA GTA CAGCAACCT GCGGAC GGC GGT CTA GAG TAA 1291
TCT GAG
Asp Ala Glu Val GInGlnPro AIaAsp Gly Gly Leu Glu
Ser Glu
265 270 275 277
TTTTTAAATT AAAATCTCC C CTTCAAGTGC 1351
TGGATTGAAT TTTTGTGAAA
GACTTTGGGA
ACATTTCGTG AAGGCTAACA ATCTCAGGTC 1411
TAAATTGTTA ACTCGATGGA
ATAGTCAATT
4 5 CGTATTTCCT TTCCTTGGAT ACCAGCCTGT
1471
GGTCTGCCCC TCCTGGCAGT
TATCGCATCG
TCGACAGAGT CAAACTGAAC CCTTTGGACA 2531
GAATCCATAT T~CTTCTTGTA
TTGGTCGTAG
ACTATTACTA CCCGATAGTT CTGATCCTCT 1591
CAGTATCTCA CCTTGAGAAG
GTCTCTAACG
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE(3LE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00/01724 PCT/FR99/OIb30
TCGTCTTCGG TTATGTGTGC TCCCAGCCCA AATATCCCTA TCGCCCTGGA GGGAGACCCG 1651
TTTCTCTTTG CTTTAAGTGC ATATCTTTCG TTTTTATAGG AGCTTGGATC TGTTCCTTCG 1711
TATCCCCTTG TCGGGCGCTC CACCTCGAG 1740
5 {2}INFORMATION POUR SEQ .
LA TD
N0:3
{i) CARACTRERISTIQUES DE J~:
LA
SEQUENC
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATTON: lin aire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
{ix) CARACTERISTIQU ES
(A) NOM/CLE:
(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SEQ :3 .
ID
N0
1:5
ATG AAA GGT ATT TCT GTT CTC GCC TCTATTGTCCTA ATGAAG 48
AAG TCA
Met Lys Gly Ile Ser Val Leu Ala SerIleValLeu MetLys
Lys Ser
1 5 10 15
TTG AAG GGT GTC TAT ACA ACT CTG TGTGGAGATTCA ACACAA 96
TCT GTG
Leu Lys Gly Val Tyr Thr Thr Leu CysG1yAspSer ThrGln
Ser Val
20 25 30
GGA CTG CAG GGC ACA CAA CCG TAT GTGCTGGTTCCT AGTGCA 144
ACC TCA
Gly Leu Gln Gly Thr Gln Pro Tyr ValLeuValPro SerAla
Thr Ser
35 40 45
2 5 CCA GAG ACA ATA GCC TGT GGA AGT CCACAGAACATG TATGTC 192
AAC TAC
Pro Glu Thr Ile Ala Cys Gly Ser ProGlnAsnMet TyrVal
Asn Tyr
50 55 60
CCT TCT ACT CCT ACT ATG CCT ACA GTGCCAGGCACA ACTGGT 240
ACC TCC
Pro Ser Thr Pro Thr Met Pro Thr ValProGlyThr ThrGly
Thr Ser
65 70 75 g0
GAG AGC GAG ACA CCT TCT CCA TCA TCTCCTACAGAG GATGTG 288
ACT ACA
Glu Ser GIu Thr Pro Ser Pro Ser SerProThrGlu AspVal
Thr Thr
85 90 95
GGA ACA TGC AAG ATT GTT GTA CAT TGTGATGCACCA GGAACA 336
GCT AAG
3 5 Gly Thr Cys Lys I1e Va1 Va1 His CysAspAlaPro GlyThr
Ala Lys
100 105 110
TCA TCA ACA CCT TGC CCG GAA ACT TTGGCCCCCTCT CAGCCA 3$4
GAA CAG
Ser Ser Thr Pro Cys Pro Glu Thr LeuAlaProSer GlnPro
Glu Gln
115 120 125
4O GTA GCA GCT ACA ATT ACA CCA GTT GTTGCTTCTGTG CAGACG 432
GCC CTG
Val Ala Ala Thr Ile Thr Pro Val ValAlaSerVal GlnThr
Ala Leu
130 135 140
CCG CAA GCA GCT GTT ATC CTT CCA AAGGCCGTCTCT GCCCAG 480
ACC ACT
Pro Gln Ala Ala Val Ile Leu Pro LysAlaValSer AlaGln
Thr Thr
4 5 145 150 155 160
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00101724 PCT/F'R99I01630
6
CCG GCA ACC ATC ATT CCA CAG GCA TACTAC 528
TCT TTC CCA GGC AAT
AAC
Pro Ala Thr Ile IIe Pro Asn Gln A1a GlyTyrTyrAsn
Ser Phe Pro
165 170 175
AGT GCA ATT CCC GGG ATA ACA GGT AAT CTCTCTCCAAGT 576
CAA CTT GTT
Ser Ala Ile Pro Gly Ile Thr Gly Asn LeuSerProSer
Gln Leu Val
180 185 190
GCC TCT TCT TGC CAA GTG GGA ACA ACA AGCTCCACCCCC 624
GTG CCC GGA
Ala Ser Ser Cys Gln Val Gly Thr Thr SerSerThrPro
Val Pro Gly
195 200 205
CAG CAG CTA CCA GGC GTT TCT GGA ACC CCTTGCCAAATA 672
GCT TCA ATT
G1n Gln Leu Pro Gly Val Ser G1y Thr ProCysGlnIle
Ala Ser Ile
210 215 220
GTA CAG GGA ACT CAA AGC AAC ACC CCT CAGCAATTCTTG 720
AGT GGA GGA
Val Gln Gly Thr Gln Ser Asn Thr Pro GlnGlnPheLeu
Ser Gy Gly
225 230 235 240
CCG GGA ATC GTT CCT GGA CTC CAG CCG CAAGCTACTTCT 768
GTT AGC GAT
Pro Gly Ile Val Pro Gly Leu Gln Pro GlnAlaThrSer
Val Ser .Asp
245 250 255
GGA ACC CCT ACC CCT GTT CAA AGC CAA GGACAGCAATGC 816
TCT AGC 'rCT
2 0 Gly Thr Pro Thr Pro Val Gln Ser Gln GlyGlnGlnCys
Ser Ser Ser
260 265 270
TGC TGC ACT CCT CCA ACA CCT GTA ATG ACTCCTATGGGT 864
ATC AAC c~CA
Cys Cys Thr Pro Pro Thr Pro Val Met ThrProMetGIy
Ile Asn 1?ro
275 280 285
2 5 ATC AGC AGT AAT GGG CCC TCA ACT GCG GCCCCAACCCTT 912
TAT AGC TAC
Ile Ser Ser Asn Gly Pro Ser Thr Ala AlaProThrLeu
Tyr Ser ':L'yr
290 295 300
GGA CAA TTG GGA CCT ATC ACA CAG AAG ACATCATCCTGC 960
TGC GAC TCA
Gly Gln Leu Gly Pro Ile Thr Gln Lys ThrSerSerCys
Cys Asp Ser
3 0 305 310 315 320
GAA CCA AAA GAA AAG GTA CAG TAT GGA GAAGCATGCGCT 1008
CCT GCA AfiG
Glu Pro Lys Glu Lys Val Gln Tyr Gly GluAlaCysAla
Pro Ala Met
325 330 335
GCA CCA ACT CCA ACT GTT GGA AAT GCT TATCTCCTTAGC 1056
GCT CTA GAG
3 5 Ala Pro Thr Pro Thr Val Gly Asn Ala TyrLeuLeuSer
Ala Leu C3lu
340 345 350
CCG GGG ATG TAT AAT CTC TCT CCA TGC GCTTGCTGCCAA 1104
TCA AAC AAC
Pro Gly Met Tyr Asn Leu Ser Pro Cys CysCysGln
Ser Asn A,sn Ala
355 360 365
4 0 CAA CAA TGC TAG
1116
Gln Gln Cys
370 371
(2)INFORMATION LA ID N0:4 .
POUR SEQ
45 (i) CARACTRERISTTQUES
DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE(~LE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00101724 PCT/FR99101630
7
(D) CONFIGURATION:
linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE:
ADN
(ix) CARACTERISTIQUES
(A) NOM/CLE:
(xi)DESCRIPTION DE LA SEQUENCES: SE!
ID
N0:4
.
ATG TTG TTA CTT CTC TCA GCA GTT TTTGTTAGC GCT ACA GTC 48
GCT GCA
Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Val PheValSer Ala Thr Val
Ala Ala
1 5 10 15
ZO CAG TCA GGT GTT GTC TCC CAG CCT ACACCCATT CCG ATT CCT 96
ACA CTT
Gln Ser Gly Val Val Ser Gln Pro ThrProIle Pro Ile Pro
Thr Leu
20 25 30
GGA CAG CCG ATG GGG GGC ATG GCC GGGTGCACT AAC AAG CTA 144
AAC AAA
Gly Gln Pro Met Gly Gly Met Ala GlyCysThr Asn Lys Leu
Asn Lys
1.5 35 40 45
GAT GGT GTT GAA ATA ATG AGA AGG ATGGTGGAA TGC CAG AGA 192
AAC AAG
Asp Gly Val Glu Ile Met Arg Arg MetValGlu Cys Gln Arg
Asn Lys
50 55 60
AAT GCA GAG GCA ACA AAA GCA ATG GAAAGGGCT AAT GAA GCT 240
GTT AAG
2 Asn Ala Glu Ala Thr Lys Ala Met GluArgAla Asn Glu Ala
0 Va1 Lys
65 70 75 80
GTA GAA ACA TTC AAT AAG GAG GTC AAAGGACCT CAA AAG AGC 288
AGT GAA
Val Glu Thr Phe Asn Lys Glu Val LysGlyPro Gln Lys Ser
Ser Glu
85 90 95
2 GGC CAG TGC ATA GAA AAA GCT GTA GGCACCGAC AGA TGT CTT 336
5 CAG ATT
Gly Gln Cys Ile Glu Lys Ala Val GlyThrAsp Arg Cys Leu
Gln Ile
100 1.05 110
GCA GGA ATA ATT GAT AAG GCT GTG AAGCGT.AAG TAC AGA TCG 384
AAC ATC
Ala Gly Ile Ile Asp Lys Ala Val LysArgLys Tyr Arg Ser
Asn Ile
3 115 12 0 12 S
0
GAT GTG GAG AAT AGC ACC TCG CTC AGAGGCGAC AAA CTA GCT 432
TAT ATT
Asp Val Glu Asn Ser Thr Ser Leu ArgGly,Asp Lys Leu Ala
Tyr Ile
130 135 140
CTA ATT GTC AAT GTT GAC TAT GGA CAGCCAATT ATC AAA AAG 4$0
CTT CCA
3 Leu Ile Val Asn Val Asp Tyr Gly GlnProIle Ile Lys Lys
5 Leu Pro
145 150 155 160
AAG AAG AAA TCC AAG ATA ATG GCA CTTCCTCAA CCA AAG GAG 528
AAT AGA
Lys Lys Lys Ser Lys Ile Met Ala LeuProGln Pro Lys Glu
Asn Arg
165 170 175
40 ATG TAT TTC AAC CAG ATC GGA CAG GTTGGAGCA AAG GGA TTC 576
CTT ACA
Met Tyr Phe Asn Gln Ile Gly Gln ValGlyAla Lys Gly Phe
Leu Thr
180 185 290
CCT CAA GAC AAC AAG GAT GAA TGC CCATGCGAA CCT AAG ACT 624
AAG AAG
Pro Gln Asp Asn Lys Asp Gu Cys ProCysGlu Pro Lys Thr
Lys Lys
45 195 200 205
GTT GAA ACT GCT TCT GAA AGA TGT CTTGGGTGC GAG CTT GGA 672
AAT AAG
Val Glu Thr Ala Ser Glu Arg Cys LeuGlyCys Glu Leu Gly
Asn Lys
210 215 220
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~LE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00/01724 PCTIFR99/01630
8
ACC TCA GCC-CTG ATA AAG GCC ATA AAG GAG AAGGAG 720
AGT CAA AAG ATC
Thr Ser Ala Leu Ile Lys Ala Ile Lys GluIle LysGlu
Ser Gln Lys
225 230 235 240
AGC CCA AAG GAG GGG AGA AAC ACA CAG TATGAT GGTGAG 768
GAC ACC GAA
Ser Pro Lys Glu Gly Arg Asn Thr Gln TyrAsp GlyGlu
Asp Thr Glu
245 250 255
GGC TCT GCT GAA GAT GAA GGC CAA CCT GCAGAC GGCGAA 816
GCT CAA TC:T
Gly Ser Ala Glu Asp Glu Gly Gln Pro AlaAsp GlyGlu
Ala Gln Ser
260 265 270
GGT CTA GAG TAA 828
Gly Leu Glu
274 275
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID :5 .
N0
(i} CARACTRERISTIQUES
DE LA SEQUENCE:
l5 (A) LONGUEUR:
(B) TYPE: nuclotide
(C) NOMBRE DE BRIN: double
(D) CONFIGURATION:
linaire
(ii } TYPE DE MOLECULE:
ADN
20 (ix}
CARACTERISTTQUES
(A) NOM/CLE:
(xi}DESCRIPTION SEQ :5
DE ID .
LA N0
SEQUENCES:
ATG TTG TTA CTT TTC GTA GTT ACT GTT GCTGCA CAGGTG 48
ACC CTT AGC
25 Met Leu Leu Leu Phe Val Val Thr Val AlaAla GlnVal
Thr Leu Ser
1 5 10 15
GCA CCT GTA .ACT CCG GCA GCT GTA ACA TTCCTT CCTGGT 96
CAG CCT C.AA
Ala Pro Val Thr Pro Ala Ala Val Thr PheLeu ProGly
Gln Pro Gln
20 25 30
3 O GCC CAG CAA AAG ATT GGT GTG GAC AGA GCCAAC AAGCAA 144
GGC AAC TGT
Ala Gln Gln Lys Ile Gly Val Asp Arg AlaAsn LysGln
Gly Asn Cys
35 40 45
GTA GAA GGT GTT CAA TTT CAA GGA ATG GATTGC CCGAAA 192
ATA GAC GCC
Val Glu Gly Val Gln Phe Gln Gly Met AspCys ProLys
Ile Asp Ala
35 50 55 60
AGA AAC TCC GAG GCT AAT GCA ATG CAA GCCAAG CAAAAG 240
GCA GTT AGA
Arg Asn Ser Glu Ala Asn Ala Met Gln AlaLys GlnLys
Ala Val Arg
6S 70 75 80
GCT TTA GAA ATC TAC AAG GAG ATT AAG CCCACA CCAAAG 288
AAT AGC GGC
4O Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Glu Ile Lys ProThr ProLys
Asn Ser Gly
85 . 90 95
GAT AGC GGC CAG TGC GAA AGA GCT CAA ACTGAC AGGTGT 336
ATA GTA GGT
Asp Ser Gly Gln Cys Glu Arg Ala Gln ThrAsp ArgCys
Ile Val Gly
100 105 110
45 ATT CTT GCA AAA ATA GAC AAG GCT AAC CTTAAG TACAGA 384
ATC GTG ATG
Ile Leu Ala Lys Ile Asp Lys Ala Asn LeuLys TyrArg
Ile Val Met
115 120 125
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RE~GLE 26)
CA 02333919 2001-O1-05
WO 00/01724 PCT/FR99101630
9
ATC TCA AAG GTA GGA AAT ACA TTCAGA AAG CTA 432
GCT GCA GGA
CTC AAC
Ile Ser Lys Val Gly Asn Thr AlaLeuPheArgGly Lys Leu
Ala Asn
130 135 140
AT'T TCT CTA ATT CTT AAT GAT TATGGACTTAA.GCCA TTT ACT 480
GTT TTC
Ile Ser Leu Ile Leu Asn Asp TyrGlyLeuLysPro Phe Thr
Val Phe
145 150 155 160
GTT GTA AAG AAG AAA ACA AGA GTGTTCCCCCAAGGG GAG CTG 528
AAG GAT
Val Val Lys Lys Lys Thr Arg ValPheProGlnGly Glu Leu
Lys Asp
165 170 175
ZO AAC TTC AAT GGA ATT GGT CTT ATAGGAGTAAAAGGC TTC CCT 576
CAG ACA
Asn Phe Asn Gly Ile Gly Leu IleGlyVal:LysGly Phe Pro
Gln Thr
180 185 190
CAA GAC AAT AAT GAT GAA AAG CCGTGTGAC'rCTCCA AAG ACT 624
TGC AAG
Gln Asp Asn Asn~Asp Glu Lys ProCysAspSerPro Lys Thr
Cys Lys
195 200 205
GTT GAG ACT GTT GCT GAG TGT AATCTTGGGTGCCAG AAG GGG 672
GAA CTT
Val Glu Thr Val Ala Glu Cys AsnLeuGlyCysGln Lys Gly
Glu Leu
210 215 220
ACG CCT GGG TTG ATA AGC GCC ATACAAAAGAAGGAG AAG GAA 720
AGA GTC
2 0 Thr Pro Gly Leu Ile Ser Ala IleGlnLysLysGlu Lys Glu
Arg Val
225 230 235 240
AGC TCA AAG GAC GGA GAA AGC TCAACCCAGAACGGC GGC ACC 76$
AAA GAA
Ser Ser Lys Asp Gly Glu Ser SerThrGlnAsnGly Gly Thr
Lys Glu
245 250 255
2 5 ACC GAT GAT GAA GAT GGA CAA TCTCCGGACGGTAAT CCA GAG 816
CAG GGA
Thr Asp Asp Glu Asp Gly Gln SerProAspGlyAsn Pro Glu
Gln Gly
260 265 270 272
TAA 819
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
