Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02339436 2001-03-15
1
PRODUCTION D'ANTICORPS CONTRE LES FACTEURS DE VIRULENCE
ASSOCIÉS AUX SOUCHES D'ESCHERICHIA COLI AEEC, ET LEUR
UTILISATION
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte en général aux facteurs de virulence de
microorganismes, et plus spécifiquement aux facteurs de virulence associés aux
E.
1 o coli associés aux maladies entériques et plus particulièrement aux souches
d'Escherichia coli attachantes-effaçantes AEEC incluant les E. coli
entérohémorragiques EHEC (VTEC, STEC...) et les E. coli entéropathogènes EPEC
(REPEC, DEPEC, PEPEC,....) et aux souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
INTRODUCTION
La présente invention propose le développement de stratégies thérapeutiques et
diagnostiques contre les souches E. coli associés aux maladies entériques et
plus
particulièrement les souches de Escherichia coli attachant-effaçant (AEEC)
incluant les
EHEC 0157:H7 et autres E. coli entérohémorragiques (non-0157), les E. coli
entéropathogènes (EPEC) et les souches d'E. coli entérotoxinogènes ETEC.
La présente invention consiste aussi en l'étude des aspects cellulaires et
moléculaires de
la pathogenèse et de la réponse de l'hôte durant les infections dues aux
souches AEEC
2 5 avec des applications potentielles comme l'immunothérapie, différentes
stratégies vaccinales
(tel que l'élaboration de vaccins ADN capables d'induire une réponse
immunitaire cellulaire
et humorale spécifiquement dirigées contre les souches AEEC) et de
développement de
tests diagnostiques sensibles et spécifiques.
3 0 La présente invention a également pour but d'évaluer le rôle des animaux
comme réservoirs
de souches E. coli pathogènes pour l'homme incluant les E. coli 0157:H7 de
plus en plus
fréquents au Canada et dans le monde entier.
CA 02339436 2001-03-15
2
Problématigue.
Les AEEC incluent les EHEC (sérogroupes 0157:H7 et non-0157) et d'autres E.
coli
entéropathogènes (EPEC) de nombreuses espèces animales comme le lapin (REDEC),
le
chien (DEPEC), le porc (PEPEC),.... qui sont hétérogènes dans leur structure
antigénique
(antigène O- et H-). Bien qu'il n'existe pas de marqueur phénotypique commun à
tous les
AEEC, les déterminants de virulence codés par le locus d'effacement des
entérocytes LEE
(intimine Eae, protéines sécrétées EspA, EspB, EspD, récepteur de l'intimine
Tir...) sont
1 o cependant des marqueurs communs aux différentes souches. Ces marqueurs
peuvent donc
être utilisés pour le développement de tests diagnostiques, d'immunothérapie
et de
stratégies vaccinales contre les différentes souches AEEC.
Les bovins sont un important réservoir d'infection pour les EHEC 0157:H7 et
d'autres
souches AEEC responsables de dysenteries et de syndromes urémiques
hémolytiques
(NUS) chez l'homme. De nombreux cas de maladies ont été attribuées aux EHEC de
sérogroupe 0157 mais d'autres sérogroupes sont responsables de cas sporadiques
de
maladies humaines. Les infections humaines aux EHEC 0157 sont sous
surveillance
nationale dans beaucoup de pays mais la détection des infections EHEC non-0157
est
2 o souvent limitée à un petit groupe de laboratoires spécialisés. Cependant,
les humains sont
beaucoup plus souvent exposés aux EHEC non 0157 car ces souches sont
prévalentes
chez les animaux et comme contaminants de nourriture.
II est donc important d'éliminer les souches EHEC pathogènes de la microflore
intestinale
des veaux pour éviter une propagation chez l'homme. Une thérapie curative
n'est pas
encore disponible. Des techniques rapides de détection existent pour certaines
souches
AEEC comme celles appartenant à 0157 mais ne sont pas efficaces pour détecter
un grand
nombre d'autres souches EHEC et AEEC. De nouvelles techniques de détection,
basées
sur les marqueurs de virulence communs à toutes les souches AEEC, doivent donc
étre
3 o mises en place.
Les diarrhées dues aux AEEC sont aussi observées de plus en plus fréquemment
dans de
CA 02339436 2001-03-15
3
nombreuses espèces animales comme les lapins, les chiens, les chevaux, les
moutons, les
chats et les porcs. Ces diarrhées restent une importante cause de pertes
économiques
dans l'industrie animale. Les AEEC dont les E. coli entérohémorragiques (EHEC)
exercent
leurs effets pathogènes par l'intermédiaire de nombreux facteurs de virulence
codés par le
LEE dont certaines ont été caractérisées par la Demanderesse. Cette dernière a
également
démontré qu'une autre protéine appelée Paa est aussi impliquée dans l'adhésion
des AEEC
aux cellules hôtes et qu'elle se retrouve dans toutes les souches EHEC 0157:H7
et est
aussi fortement associée aux ETEC ( au moins dans les souches d'origine
porcine). Ces
résultats ont fait l'objet d'une publication dans Mechanisms in the
pathogenesis of enteric
1o diseases 2 Vol. 473, An H. et al., p179-184, ed. Paul P.S. et Francis D.H.,
Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York, 1999.
La vaccination maternelle est couramment pratiquée chez le porc et contrôle
les diarrhées
chez les animaux nouveau-nés mais pas chez les porcelets en période de post-
sevrage.
Une approche pour contrôler et traiter les diarrhées dues aux AEEC est
l'utilisation
d'antibiotiques qui devient de moins en moins recommandée à cause des
problèmes de
résistance bactérienne et de sa non efficacité. Une vaccination préventive
et/ou une
thérapie efficaces doivent donc être développées, à partir des facteurs de
virulence
communs aux différentes souches AEEC.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a donc pour objet de proposer des outils de diagnostic
pour détecter
les AEEC chez les animaux (préférablement chez les veaux et les porcs) et
l'homme.
La présente invention a également pour objet de développer des méthodes de
prévention
et de thérapie efficaces contre les AEEC.
Plus particulièrement, la présente invention propose la production d'anticorps
contre les
protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, et Tir, et préférentiellement contre la
Paa.
CA 02339436 2001-03-15
4
La présente invention propose aussi l'utilisation de ces anticorps, de
préférence ceux contre
la Paa, pour le développement de kits de diagnostics pour la détection des
AEEC.
La présente invention propose également l'utilisation de ces anticorps, de
préférence ceux
contre la Paa, pour le développement de méthodes de prévention et
d'immunothérapie, par
exemple, contre les maladies telles que la diarrhée, les colites hémorragiques
et le
syndrome urémique hémolytique (SUH) causés par les AEEC.
Préférentiellement, les anticorps produits contre les protéines Eae, EspA,
EspB, EspD, Paa,
et Tir sont des anticorps de poulet (de type IgY).
La présente invention a également pour objet l'usage les protéines Eae, EspA,
EspB, EspD,
Paa, et Tir, et tout fragment dérivant de ces protéines et ayant les
caractéristiques
immunologiques pour le développement de vaccin.
La présente invention a donc comme avantage l'utilisation d'anticorps de
poulet pour le
développement de kits de diagnostics pour la détection des AEEC et pour le
développement
de méthodes de prévention et d'immunothérapie contre les AEEC. Plus
particulièrement,
la production d'anticorps chez le poulet offre l'avantage d'être facilement
réalisable et
2 0 d'obtenir de meilleur rendement en terme de quantité par rapport aux
méthodes
traditionnelles. De plus, cette technique est non invasive.
Une immunothérapie à base d'anticorps de poulet présente aussi les avantages
suivants
- elle offre une alternative très intéressante à l'usage d'antibiotiques
contre les AEEC ;
- elle offre la possibilité d'être administrés par voie orale lors de
l'immunothérapie en
administrant les jaunes d'oeufs dans la nourriture, par exemple.
L'usage de la protéine Paa comme substrat pour la production d'IgY de poulet
offre
plusieurs avantages. En effet, paa est un nouveau gène impliqué dans
l'adhérence des
bactéries AEEC qui a été découvert dans notre laboratoire. La protéine Paa (28
kDa) n'est
pas encore exploitée entièrement, ni très bien caractérisée et toutes les
utilisations
possibles de Paa ne sont donc pas encore connues. Paa est par conséquent une
protéine
CA 02339436 2001-03-15
prometteuse pour lutter contre les souches d'AEEC. Paa est retrouvée dans 70%
des
souches AEEC et existe chez toutes les souches EHEC 0157 :H7.Paa est également
retrouvée dans les souches ETEC (voir Tableau N 2 publication An et al.) mais
est
rarement associé aux souches d' E. coli de la flore normale.
5 De plus, un mutant Paa::TnphoA n'adhère pas aux expiants intestinaux mais
cette
adhérence est restaurée par complémentation en trans de la souche mutante avec
le gène
paa sauvage ce qui confirme le rôle de cette protéine dans l'adhérence des
souches AEEC
(Figure 1 ).
Des anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer
l'adhésion de la
souche 1390 aux expiants intestinaux et inhibent donc le développement des
lésions A/E
(Figure 2). Ces anticorps pourraient également bloquer l'adhésion de
différentes souches
AEEC aux cellules intestinales.
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
a) Production des protéines recombinantes
Les gènes correspondant aux protéines Eae, EspA, EspB, EspD, Paa, Tir ont été
amplifiés
par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche de E. coli entéropathogène
porcine 1390
et clonés dans un vecteur d'expression (pQE30; Qiagen) permettant la fusion en
phase d'une
queue polyhistidine (His6) à l'extrémité N-terminale des protéines.
Une protéine de fusion utilisant seulement l'extrémité C-terminale de
l'intimine Eae (Eae
carboxy) qui est impliquée dans la reconnaissance au récepteur Tir ainsi
qu'une autre fusion
impliquant l'extrémité C-terminale stable de la protéine Paa ont été
réalisées.
Les protéines recombinantes produites ont pu être détectées par Western blot à
l'aide
d'anticorps anti-His et d'anticorps dirigés spécifiquement contre chacun des
facteurs de
virulence.
CA 02339436 2001-03-15
6
Toutes ces protéines de fusion ont ensuite été produites en grande quantité et
purifiées sur
colonne d'affinité en quantité suffisante pour réaliser les immunisations des
poules et
permettre les dosages ELISA.
b) Production, purification et spécificité des anticorps
Cinquante microgrammes de chacune des protéines purifiées sont inoculés en
présence
d'adjuvant incomplet de Freund dans le muscle pectoral de poules aux jours 1,
14, 28 et 42.
1 o Les neufs sont récoltés à partir du jour 28 et conservés à +4C jusqu'à
purification des
anticorps. Le jaune d'oeufs est mélangé avec du PBS (vol/vol), un volume de
chloroforme
est ajouté et l'ensemble est vortexé. Après centrifugation, la phase aqueuse
contenant les
IgY est conservée. L'analyse en SDS-PAGE permet de montrer qu'il y a
production d'IgY dès
le 28ème jour après la première immunisation. Des résultats préliminaires
obtenus par
analyse en Western blot font apparaître que les IgY purifiés reconnaissent
spécifiquement
les protéines de fusion homologues (voir, Figure 3).
Le titre de chacun des anticorps est alors mesuré par ELISA en utilisant les
protéines
purifiées homologues comme antigènes. Les conditions du test ELISA ont été
déterminées
2o pour chaque anticorps et les résultats montrent un titre élevé variant de
1/4000 à 1/32000
suivant la protéine (Titre de 1/12800 pour Eae carboxy ; 1/4800 pour Eae,
1/4000 pour
EspA ; 1/5600 pour EspB ; 1/12800 pour EspD ; 1/12800 pour Paa ; 1/25600 pour
Paa
carboxy ; 1/32000 pour Tir) 42 jours après l'immunisation initiale. Par la
suite, leur capacité
à détecter les antigènes correspondants dans la souche homologue 1390 et dans
des
souches EHEC et EPEC d'origines variées seront analysés.
c) Capacité des anticops spécifigues à prévenir le développement des lésions
A/E in vüro
dans le modèle des expiants d'iléon de porcelets.
- Mise au point du modèle
La première étape de ce travail a nécessité la mise au point des conditions de
culture
des expiants d'intestin de porcelets nouveau-nés permettant la meilleure
adhérence des
CA 02339436 2001-03-15
7
bactéries EHEC et EPEC aux cellules épithéliales d'iléon de porcelets sevrés.
Ces résultats
ont été exposés sous forme de communication affichée au ter Colloque
International de
Bactériologie Vétérinaire de langue française, 17-19 Mai 2000, Saint-
Hyacinthe, Québec.
- Rôle de Paa, nouveau facteur de virulence des EHEC et EPEC.
Un mutant non polaire de la souche porcine 1390 par insertion d'une cassette
kanamycine dans le gène paa et par échange allélique a été réalisé et sous
forme de
communication affichée au 1 er Colloque International de Bactériologie
Vétérinaire de langue
française, 17-19 Mai 2000, Saint-Hyacinthe, QUEBEC. Ce mutant et son
complément
1 o pourront être utilisés respectivement comme témoins négatif et positif
d'adhérence et de
formation des lésions A/E dans les expériences d'expiants d'intestin de
porcelets.
- Blocage des lésions A/E
La capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions
de type
A/E in vitro dans le modèle d'expiants d'intestin est actuellement testée dans
un premier
temps avec la souche homologue 1390 puis ensuite avec différentes souches EHEC
et
EPEC hétérologues. Cela permettra d'étudier la cinétique d'apparition des
différents facteurs
de virulence au cours de l'infection et le développement des lésions A/E.
Jusqu'à présent,
la Demanderesse a démontré que l'adhérence des bactéries 1390 est fortement
diminuée
2 0 en présence des anticorps anti-Eae, anti-Eae carboxy, anti-Tir, et à un
degré moindre avec
les anticorps anti-Paa (Figure 2). De plus, des études préliminaires ont
montré que les
anticorps anti-Eae et anti-Tir étaient aussi capables de diminuer fortement
l'adhérence d'une
souche hétérologue AEEC d'origine bovine (Figure 4)
2 5 - Capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des
lésions A/E in
vwo
Grâce aux résultats obtenus dans les expériences in vitro, nous pourrons
tester la
capacité des anticorps spécifiques à prévenir le développement des lésions A/E
in vivo dans
les modèles de porcelets nouveau-nés et sevrés infectés expérimentalement
ainsi que la
30 capacité d'un test ELISA à détecter les EHEC et EPEC homologues et
hétérologues dans
les fèces de ces porcs. Un modèle d'infection des porcelets sevrés est
actuellement à l'étude
au laboratoire. Les expériences préliminaires ont été présentées au congrès
organisé par
CA 02339436 2001-03-15
8
l'Association des Microbiologistes du Québec (Novembre 1999, Montréal) sous
forme de
communication affichée (voir résumé).
d) Développement de kits de diagnostic pour la détection d'AEEC
ELISA sandwich : les anticorps IgY de poules (ou IgG de lapins) spécifiques
d'une protéines
donnée seront adhérés (coating) sur une plaque ELISA 96 puits. L'échantillon
ou des
dilutions de cet échantillon à tester sera alors déposé dans les puits puis un
anticorps
secondaire IgG de lapins (ou IgY de poules) spécifiques de cette même protéine
sera ajouté.
La révélation sera effectuée avec un anticorps anti-IgG de lapin (ou anti-IgY
de poule) couplé
1 o à la péroxydase.
ELISA compétitif : les protéines purifiées correspondant à chacun des facteurs
de virulence
sont utilisées comme antigènes et sont adhérés (coating) sur la plaque ELISA.
Des anticorps
spécifiques marqués de ces différentes protéines sont alors ajoutés en même
temps que
l'échantillon à tester. Si l'échantillon contient la protéine recherchée,
cette dernière va
reconnaître l'anticorps qui ne pourra alors plus se fixer sur la plaque. II
n'y aura alors pas
d'immunoréponse. Inversement, si l'échantillon ne contient pas la protéine
recherchée,
l'anticorps pourra alors reconnaître la protéine fixée sur la plaque ELISA et
une forte réponse
sera observée après révélation.
e) Développement d'immunothérapies contre les AEEC
Exemple de protocole d'immunothérapie au niveau du champs : Des porcelets
nouveau-nés
ou en période de post-sevrage sont séparés en différents groupes. Un groupe
est nourri avec
une diète conventionnelle commerciale. Un autre groupe est nourri avec une
diète
supplémentée avec des neufs (ou de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) ne
contenant
pas d'anticorps dirigés contre les facteurs de virulence des AEEC (Eae, EspA,
EspB, EspD,
Tir, Paa). Un troisième groupe est nourri avec une diète supplémentée avec des
neufs (ou
de la poudre de jaune d'oeufs lyophylisés) contenant des anticorps dirigés
contre les facteurs
de virulence des AEEC (Eae, EspA, EspB, EspD, Tir, Paa). L'apparition des
signes cliniques
et la présence de souches AEEC après écouvillons rectaux permet de montrer
l'efficacité des
anticorps dirigés contre les souches AEEC.
Après validation de l'efficacité des anticorps dirigés contre les différents
facteurs de virulence
CA 02339436 2001-03-15
9
des souches AEEC, ces anticorps pourront être incorporés, de routine, à la
nourriture à des
fins préventives.
L'analyse bio-informatique du gène paa et de la protéine Paa a permis de
caractériser Paa
du point de vue de son pourcentage en G+C (annexe 1 ), de sa localisation
potentielle
(annexe 2), de son hydrophobicité (annexe 3), de la présence potentielle d'un
peptide signal
(annexe 4), de son caractère instable (annexe 5) et de ses homologies avec
d'autres
protéines (annexe 6).
1 o paa est situé à 35,4 min sur le chromosome de E. coli K12 entre les loci
rem et rel.
La mesure de l'activité phosphatase alcaline d'un mutant TnphoA ::Paa montre
que Paa
serait située au niveau du culot bactérien (annexe 7). L'étude plus précise de
la localisation
de Paa est en cours de réalisation.
L'analyse par électrophorèse en champs pulsés (PFGE) avec une sonde paa a
montré la
présence d'une seule copie du gène paa dans le chromosome de la souche porcine
1390
(annexe 8).
Des fusions du promoteur de paa avec le gène rapporteur de la GFP (green
fluorescent
protein) vont permettre d'étudier l'activité du promoteur Paa et d'analyser la
cinétique
d'expression de Paa au cours de l'infection et du développement des lésions
A/E . Ces
2 0 expériences sont actuellement en cours de réalisation.
Le mutant TnphoA ::Paa n'adhère pas aux expiants intestinaux de porcelets
(adhésion
comparable à celle observée avec une souche témoin négatif) mais la
complémentation en
trans de Paa restaure l'adhésion qui redevient sensiblement identique à la
souche sauvage
1390 (Figure 1 ).
2 5 Les anticorps anti-Paa obtenus chez la poule sont capables de bloquer
l'adhésion de la
souche 1390 aux expiants intestinaux de porcelets (Figure 2).
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en
détails
ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée
à ces
30 seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications
peuvent y être
effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de
l'invention.
