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Composition destinêe à la mise ea oeuvre d'un traitement
cytotoxique, notamment antitumoral ou antiviral, chez un mammifére
La présente invention concerne une composition cytotoxique
comprenant une première séquence d'acide nucléique codant pour tout ou
partie d'une chimiokine MIP et une seconde séquence d'acide nucléique
codant pour tout ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité
cytotoxique, notamment antitumorale ou antivirale. La présente invention est
particulièrement utile dans le cadre de la mise en oeuvre d'un traitement par
thérapie génique de maladies prolifératives ou infectieuses.
A ce jour, les résultats les plus encourageants obtenus dans le cadre de
traitements antitumoraux concernent des traitements combinés associant un
traitement à base de composés chimiques (chimiothérapie) et un traitement
reposant sur l'utilisation de rayonnements (radiothérapie). Outre les
désagréments importants qu'occasionne chez le patient ce type de traitement,
on constate dans un grand nombre de cas que des cellules tumorales, de type
métastatique ou non, persistent chez le sujet traité, pouvant occasionner un
rechute et ne permettant donc pas de rémission complète.
De récents travaux conduits dans le domaine du cancer ont proposé
d'adapter les protocoles de thérapie génique à la thérapie antitumorale. A cet
égard, on peut par exemple citer les travaux de Meneguzzi et al., 1991,
Virology, 181, 61-69 relatifs à l'immunisation contre des cellules tumorales à
l'aide d'un vecteur recombinant de ia vaccine exprimant les gènes E6 et E7 du
virus du papillome humain de type 16. On peut également citer le contenu du
brevet français FR 92/03120 relatif à l'utilisation d'un adénovirus
recombinant exprimant une cytokine dans le cadre d'une thérapie génique
antitumorale.
Les cytokines sont des molécules naturellement produites à la suite
d'une stimulation antigénique ou d'une réaction inflammatoire (Gillis and
Williams, 1998, Curr. Opin. Immunol., 10, 501-503) dont l'utilité dans le
cadre du traitement de certains cancers a été montrée notamment par Oettger
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(Curr. Opin. Immunol., 1991, 3, 699-705). Ainsi , Leroy et al. (1998,
Res.Immunol. 149 (7-8) : 681-684) ont montrë que la production de cytokines
sur les sites de la tumeur après administration infra-tumorale de vecteurs
viraux recombinants permet l'induction d'une réponse immunitaire associée à
une inhibition de la croissance tumorale. Néanmoins, cette réponse
ar~titumorale bien qu'encourageante ne permet pas la disparition définitive
des
cellules tumorales, et par conséquent la mise en oeuvre d'un traitement
antitumoral satisfaisant.
Les chimiokines constituent pour leur part une sous classe de la famille
des cytokines. Elles se distinguent des autres cytokines par leur propriété
chimio-attractive, notamment lors des processus naturels de chimiotactisme,
et notamment d'attraction des cellules du système immunitaire vers les tissus
dans lesquels siège (inflammation ou (infection, ainsi que par leurs
propriétés
anti-angiogéniques.
Les chimiokines sont des protéines de faible poids moléculaire (entre 8
et 10 kd ), de petite taille (de 70 à 80 acides aminés) dont les séquences en
acides aminés présentent un faible taux d~omologie (variant de 10 à 70
selon les chimiokines considérées) permettant de définir à ce jour environ 50
chimiokines différentes. Ces chimiokines peuvent néanmoins étre subdivisées
en 4 grandes familles relatives à la position des résidus cystéines qu'elles
renferment. Les familles a dont l'extrémité N-terminale comprend 2 cystéines
séparées par un acide aminé unique (chimiokines de t3rpe IL-8, NAP-2, GCP-2)
et (3 dont l'extrémité N-terminale comprend 2 cystéines adjacentes
(chimiokines de type RANTES, MIP1, MCP1) sont les mieux caractérisées
(Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, pages 159-165 ; Murphy, P.M.,
1994, Annu. Rev. Immunol., 12, pages 593-633).
Par ailleurs, le groupe de Dilloo et al. (1996, Nature Medicine, vol. 2,
Number 10, 1090-1095) a montré que la co-expression, après administration
recombinants chez la souris de fibroblastes modifiês ex vivo à l'aide de
vecteurs rétroviraux, d'une chimiokine particulière, la lymphotactine (Lptn),
et
de finterleukine-2 (IL2), permet de stimuler la réponse ïmmune antitumorale
de l'animal traité. Toutefois, cet effet est limité dans le temps, et ne
permet
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qu'un contrôle transitoire du volume tumoral et aucune rémission che2 les
animaux traités.
Il est donc souhaitable de disposer de nouvelles compositions
permettant notamment la mise en oeuvre de traitements antitumoraux
efficaces, aisës à mettre en place, c'est à dire permettant un contrôle
prolongé
du volume tumoral et l'augmentation du taux de survie des patients traités.
Nous avons maintenant identifié de nouvelles compositions cytotoxiques
dont les différents constituants sont choisis de façon à obtenir un effet
synergique de leurs activités respectives et des propriétés améliorées desdits
lo constituants. Plus particulièrement, de telles compositions permettent
d'inhiber ou de retarder la prolifération cellulaire en induisant la mort
spécifique des cellules, notamment tumorales, une meilleure présentation des
antigènes et/ou une stimulation des cellules immunes de l'organisme hôte. La
présente invention offre une alternative avantageuse et efficace aux
techniques
i5 de i'art antérieur, notamment pour traiter le cancer de homme ou de
l'animal.
L'invention concerne en premier lieu une composition destinée à la mise
en oeuvre d'un traitement cytotoxique, par exemple antitumoral ou antiviral,
ou toute applications nécessitant la mort cellulaire, chez un maïnmifère
comprenant
20 (i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie
d'une chimiokine MIP,
(üj au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout
ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique,
lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des
25 éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte dudit
mammifère.
Dans le cadre de la présente invention, il est possible d'utiliser en (i)
l'intégralité de la séquence d'acide nucléique codant pour la chimiokine MIP
(pour Macrophage Inflammatory Protein, en anglais) ou une partie seulement
3o de ce polypeptide, ou un polypeptide dérivé ou muté, dans la mesure où la
fonction et les propriétés de ia chimiokine MIP sont conservées. Au sens de la
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présente invention, on entend par mutation, une délétion et / ou une
substitution et / ou une addition d'un ou plusieurs nucléotides. De méme, il
est envisageable d'utiliser une séquence codant pour une chimiokine hybride
provenant de la fusion de la séquences codant pour une chimiokine de type
MIP et de la séquence codant pour au moins une chimiokine d'un autre type
(MANTES, MCP 1, ...).
Dans le cadre de la présente invention, la chimiokine MIP préférée est la
chimiokine de type MIP 1, et plus particulièrement sélectionnée parmi le
groupe consistant en les chimiokines MIPla et MIP1(i dont les propriétés ont
été mises en évidence par Wolpe et al, 1988, J. Exp. Med, 167, 570-581.
MIPla , dont les séquences en acides nucléiques et peptidique sont
décrites dans Obaru et al. 1986, J. Biochem. 99, 885-894, dont le contenu est
incorporé par référence dans la présente demande, est produite par les
lymphocytes T et les monocytes. Elle permet la chimio-attraction des
éosinophiles et des lymphocytes T au cours des infections des voies
respiratoires ; des monocytes et des neutrophiles au cours d'arthrites
rhumatoidales, d'inflammations du système digestif ou de méningites d'origine
bactérienne. En outre, elle inhibe la prolifération des précurseurs
hématopoïétiques.
2o MIP1(i, dont les séquences en acides nucléiques et peptidique sont
décrites dans Brown et al. 1989, J. Immunol. 142, 679-68, dont le contenu est
incorporé par référence dans la présente demande, est également produite par
les lymphocytes T et les monocytes. Elle exerce ses propriétés chimio-
attractives sur les monocytes et les neutrophiles dans les cas arthrites
osseuses et les méningites bactériennes. Comme MIPla, elle inhibe la
prolifération des précurseurs hématopoiétiques.
Il existe des variants naturels desdites protéines MIPla et MIP1(3 qui
sont connus de l'homme de l'art et qui portent par exemple les noms GOS 19,
LD78, pAT464 , TY5 (de souris) ou SIS a (de souris) pour MIPla ou pAT744,
Act-2, G-26, H-400 (de souris) ou hSIS y (de souris) pour MIP1(3. Dans le cas
particulier de MIP1(3, on choisira par exemple la séquence correspondant à
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Act-2 (Lipes et al., 1988, PNAS, 85, 9704-9708, dont le contenu est incorporé
ici en référence).
par « polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique u, on entend
désigner toute substance peptidique susceptible d'induire ou d'activer une
5 réponse immune dirigée spécifiquement contre une cellule tumorale
(l'activité
cytotoxique est alors appelée activité antitumorale) ou une cellule infectée
par
un virus (l'activité cytotoxique est alors appelée activité antivirale) ou
d'inhiber
la croissance et / ou la division d'une telle cellule, notamment tumorale ou
infectée. Selon un cas préféré, ladite activité cytotoxique se traduit par la
mort
l0 de ladite cellule. Selon un cas particulier, il serait également possible
d'utiliser
des compositions selon la présente invention dans des cas pathoiagiques
associés à une prolifération cellulaire, telle que par exemple les phénomènes
de restenose.
L'activité de chimio-attraction d'un polypeptide donné, notamment
dérivé de la chimiokine MIP, sur des cellules impliquées dans les réactions
immunes (telles que par exemple des eosinophiles, des lymphocytes T, des
monocytes ou des neutrophiles peut étre évaluée par un test de
chimiotactisme (Maghazachi, 1993, Nature Immunity, 12, 57). De méme, ce
type de chimiokine inhibant la prolifération des précurseurs
2o hématopoïétiques, il est possible d'évaluer une telle propriété in vitro
selon
Graham et al., 1992, Growth Factors, 7, I51.
L'activité cytotoxique d'un polypeptide donné, notamment une activité
antitumorale, peut étre évaluée in vitro par la mesure de la survie cellulaire
soit par des tests de viabilité à court terme (tel que par exemple le test au
bleu
tryptan au MTT), soit par des tests de survie clonogénique (formation de
colonies) (Brown et Wouters, 1999, Cancer Research, 59, 1391-1399) ou in
vivo par la mesure de Ia croissance des tumeurs (taille et/ou volume) dans un
modèle animal (Ovejera et Houchens, 1981, Semin. Oncol., 8, 386-393).
Selon une première variante, l'invention concerne une composition
caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique est
choisi parmi les cytokines, les protéines codées par un gène appelé « gène
suicide ~ et les facteurs protéiques antiangiogéniques.
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Plus particulièrement, lorsque ledit polypeptide en (ü) est une cytokine,
il s'agit préférentiellement d'une cytokine choisie parmi les interférons a,
(3 et
y, les interleukines, et notamment fIL-2, l'IL-4 l'IL-6, l'IL-10 ou fIL-12,
les
facteurs nécrosant des tumeurs (TNF) et les facteurs stimulateurs de colonies
(GM-CSF, C-CSF, M-CSF...).
Selon un mode de réalisation préféré, ladite cytokine est sélectionnée
parmi l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFN-y). L'interleukine-2
est
notamment responsable de la prolifération des lymphocytes T activés, de la
multiplication et de l'activation des cellules du système immunitaire (pour la
séquence en acide nucléique voir notamment FR 85 09480). L'IFN-y active les
cellules phagocytaires et accroit l'expression des antigènes de surfaces de
classe I et II du complexe majeur d~istocompatibilité (pour la séquence en
acide nucléique voir notamment FR 85 09225). Lesdites séquences en acide
nucléique sont incorporées par référence dans la présente demande.
Selon un autre mode de réalisation, la composition selon l'invention est
caractérisée en ce qu'elle comprend en (ü) au moins deux séquences d'acide
nucléique codant pour tout ou partie de l' interleukine-2 (IL-2) et, tout ou
partie de l'interféron gamma (IFN-y).
Selon une seconde variante, l'invention concerne également une telle
composition caractérisée en ce que ledit polypeptide en (ü) présente au moins
une activité enzymatique sélectionnée parmi l'activité thymidine kinase,
l'activité purine nucleoside phosphorylase, l'activité guanine ou uracile ou
orotate phosphoribosyl transférase et l'activité cytosine désaminase.
Plusieurs études ont permis d'identifier des polypeptides qui ne sont pas
toxiques en tant que tels mais qui présentent des propriétés enzymatiques
catalytiques capables de transformer une substance inactive (prédrogue) , par
exemple un nucléoside ou un analogue de nucléoside, en substance
hautement toxique pour la cellule, par exemple un nucléoside modifié qui peut
ètre incorporé dans les chames d'ADN ou d'ARN en élongation, avec pour
conséquence, notamment, l'inhibition de la division cellulaire ou des
dysfonctionnements cellulaires conduisant à la mort de la cellule renfermant
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de tels polypeptides. Les 1 gènes codant pour de tels polypeptides sont dits
« gènes suicides N. De nombreux couples gène suicide/prédrogue sont
actuellement disponibles. On peut citer plus particulièrement, les couples
- la thymidine kinase du virus herpès simplex de type 1 (TK HSV-1) et
l' acyclovir ou le ganciclovir (GCV) (Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad.
Sci.
USA 90, 7024-7028 ; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552 ; Ram et al.,
1997, Nat. Med. 3, 1354-1361 ) ;
- le cytochrome p450 de rat et la cyclophosphophamide (Wei et al., 1994,
Human Gene Therapy 5, 969-978) ;
- la purine nucleoside phosphorylase d'Escherichia coli (E. Colt) et la 6-
methylpurine deoxyribonucleoside (Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1,
233-238) ;
- la guanine phosphoribosyl transférase d'E. coli et la 6- thioxanthine
(Mzoz et Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595) et
- la cytosine désaminase (CDase) et la 5-fluorocytosine (5FC).
Plus particulièrement, la CDase est un enzyme qui intervient dans la
voie métabolique des pyrimidines par laquelle la cytosine exogène est
transformée par le biais d'une désamination hydrolytique en uracile. Des
e
activités CDases ont été mises en évidence chez ~ les procaryotes et les
eucaryotes inférieurs (Jund et Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615 ;
Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219-228 ; De Haan et al., 1972, Antonie
van Leeuwenhoek 38, 257-263 ; Hoeprich et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-
118 ; Esders et Lynn, 1985, J. Biol. Chem. 260, 3915-3922) mais elles sont
absentes chez les mammifères (Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. I5,
435-446 ; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153). Les gènes FCYI de
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) et codA d'E. coli codant
respectivement pour la CDase de ces deux organismes sont connus et leurs
séquences publiées (EP 402 108 ; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6 ;
W093/01281).
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La CDase désamine également un analogue de la cytosine, la 5-
fluorocytosine (5-FC) en 5-fluorouracile (5-FU) qui est un composé hautement
cytotoxique notamment lorsqu' il est converti en 5-fluoro-UMP (5-FUMP). Les
cellules dépourvues d'activité CDase, en raison soit d'une mutation
inactivante
du gène codant pour l'enzyme, soit de leur déficience naturelle pour cette
enzyme (par exemple les cellules mammifères) sont résistantes au 5-FC (Jund
et Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615 ; Kilstrup et al., 1989, J.
Bacteriol. 1989 171, 2124-2127). Par contre, il a été montré qu'il est
possible
de transmettre la sensibilité au 5-FC à des cellules mammifères dans
lesquelles la séquence codant pour une activité CDase a été transférée (Huber
et al., 1993, Cancer Res. 53, 4619-4626 ; Mullen et al., 1992, Proc. Natl.
Acad.
Sci. USA 89, 33-37 ; WO 93/01281). De plus, dans ce cas, les cellules
avoisinantes non transformées deviennent également sensibles au 5-FC
(Huber et aL, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8302-8306). Ce phénomène,
appelé effet de voisinage (bystander en anglais), est dû à l'excrétion par les
cellules exprimant l'activité CDase, de 5-FU qui intoxique les cellules
voisines
par simple diffusion à travers la membrane cellulaire. Cette propriété de
diffusion passive du 5-FU constitue un avantage par rapport au système de
référence tk/GCV pour lequel l'effet de voisinage nécessite un contact avec
les
cellules qui expriment tk (Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,
1831-1835). Cet effet constitue par conséquent un atout supplémentaire de
l'utilisation de la CDase dans le cadre de la thérapie génique, notamment
anticancéreuse.
Cependant, la sensibilité au 5-FC varie beaucoup selon les lignées
cellulaires. Une faible sensibilité est observée par exemple dans des lignées
tumorales humaines PANC-1 (carcinome de pancréas) et SK-BR-3
(adénocarcinome du sein) transduites par un rétrovirus exprimant le gène
codA d'E. Coli (Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175). Ce phénomène
indésirable pourrait s'expliquer par l'absence ou la faible conversion
endogène
du 5-FU formé par l'action enzymatique de la CDase en 5-FUMP cytotoxique.
Cette étape, normalement assurée dans les cellules mammifères par l'orotate
phosphorybosyl transférase (Peters et al., 1991, Cancer 68, 1903-1909), peut
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ètre absente dans certaines tumeurs et rendre ainsi Ia thérapie génique, basée
sur la CDase, inopérànte.
Chez les procaryotes et eucaryotes inférieurs, l'uracile est transformée
en UMP par l'action de l'uracile phosphoribosyl transférase (présentant par
5 conséquent une activité UPRTase). Cette enzyme converkit également le 5-FU
en 5-FUMP. Ainsi des mutants furl de la levure S. cerevisiae sont résistants à
de fortes concentrations de 5-FU (10 mM) et de 5-FC (10 mM) car en absence
d'activité UPRTase, le 5-FU, provenant de la désamination du 5-FC par la
CDase, n'est pas transformé en 5-FUMP cytotoxique (Jund et Lacroute, 1970,
10 J. Bacteriol. 102, 607-615). Les gènes upp et FURI 'codant pour l'UPRTase
respectivement d'E. coli et de S. cerevisiae ont été clonés et séquencés
(Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56 ; Kern et al., 1990, Gene
88, 149-157).
Au sens de la présente invention, un polypeptide ayant une activité
15 UPRTase désigne un polypeptide capable de convertir l'uracile ou un de ses
dérivés en un analogue monophosphaté et, en particulier Ia 5-FU en 5-FUMP.
Par « mutation ~, il faut entendre l'addition, la délétion et/ou la
substitution
d'un ou plusieurs résidus à un endroit quelconque dudit polypeptide.
L'UPRTase native dont il est question dans la présente invention peut
20 ètre d'une origine quelconque, notamment procaryotique, fongique ou de
levure. A titre illustratif, les séquences d'acide nucléique codant pour les
UPRTases d'E. coli (Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56), de
La.ctococcus lactis (Martinussen et Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-
6463), de Mycobacterium bonis (Kim et al., 1997, Biochem Mol. Biol. Int 41,
25 1117-1124) et de Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol.
177,
271-274) peuvent étre utilisées dans le cadre de l'invention. Mais on préfère
tout particulièrement mettre en oeuvre une UPRTase de levure et notamment
celle codée par le gène FURl de S. cerevisiae dont la séquence divulguée dans
Kern et al. (1990, Gene 88, 149-157) est introduite ici par référence. A titre
30 indicatif, les sëquences des gènes et celles des UPRTases correspondantes
peuvent ètre trouvées dans la littérature et les banques de données
spécialisées (SWISSPROT, EMBL, Genbank, Medline...).
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Par ailleurs, la demande PCT/FR99/00904 décrit un gène FURI
dépourvu de 105 nucléotides en 5' de la partie codante permettant la synthèse
d'une UPRTase délétée des 35 premiers résidus en position N-terminale et
débutant à la méthionine en position 36 dans la protéine native. Le produit
5 d'expression du gène mutant, désigné FUR1d105, est capable de
complémenter un mutant furl de S. cerer~isiae. En outre, le mutant tronqué
présente une activité UPRTase supérieure à celle de l'enzyme native. Ainsi,
selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le polypeptide codé
selon l'invention est un mutant de délétion d'une UPRTase native. La délétion
10 est de préférence localisée dans la région N-terminale de l'UPRTase
d'origine.
Elle peut étre totale (concerner l'ensemble des résidus de ladite région N-
terminale) ou partielle (concerner un ou plusieurs résidus continus ou non
dans la structure primaire). D'une manière gënérale, un polypeptide est
constitué de parties N-terminale, centrale et C-terminale, chacune
représentant environ le tiers de la molécule. Par exemple, l'tJPRTase de S.
cerevisiae ayant 251 acides aminés, sa partie N-terminale est constituée des
83 premiers résidus débutant à la méthionine dite initiatrice située en
première position de la forme native. Quant à l'UPRTase d'E. coli, sa partie N-
terminale couvre les positions 1 à 69.
2o En outre, les demandes de brevet W096/ 16183 et PCT/FR99/00904
décrivent l'utilisation d'une protéine de fusion codant four une enzyme à deux
domaines ayant les activités CDase et UPRTase et démontrent que le transfert
d'un gène hybride codA::upp ou FCYl::FURl ou FCY1::FUR1d105 porté par un
plasmide d'expression augmente la sensibilité au 5-FC de cellules B 16
transfectées. Les séquences protéiques et nucléiques décrites dans ces deux
demandes sont incorporées dans la description de la présente demande. Selon
ce mode de réalisation, le polypeptide est un polypeptide fusionné en phase
avec au moins un second polypeptide. Bien que la fusion puisse avoir lieu à
un endroit quelconque du premier polypeptide, les extrémités N ou C-
terminales sont préférées et notamment l'extrémité N-terminale. Une fusion
des activités CDase et UPRTase permet d'améliorer la sensibilité des cellules
cibles à la 5-FC et à la 5-FU.
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L~omme de l'art est capable de cloner les séquences de CDase ou
UPRTase à partir des données publiées, de procéder à d'éventuelles mutations,
de tester les activités enzymatiques des formes mutantes dans un système
acellulaire ou cellulaire selon la technologie de l'art ou en suivant le
protocole
indiqué dans la demande PCT/FR99/00904 et de fusionner, notamment en
phase, les polypeptides d'activité CDase et UPRTase, et par conséquent tout
ou partie des gènes correspondants.
Par conséquent, selon un cas précis, la composition de l'invention est
caractérisée en ce que la séquence d'acide nucléique (ü) est sélectionnée
parmi
les séquences nucléiques des gènes CodA, upp, FUR1; FCY1 et FUR1.~105, ou
par une combinaison de tout ou partie desdites séquences.
L'invention concerne plus particulièrement une dite composition
caractérisée en ce que ledit polypeptide en (ü) présente au moins une activité
CDase et une activité UPRTase.
Par « combinaison de séquences d'acide nucléique » on entend désigner
aussi bien des séquences distinctes qui codent pour au moins deux
polypeptides distincts que des séquences fusionnées qui codent pour des
polypeptides de fusion, étant entendu que la production de tels polypeptides
peut étre réalisée sous le contrôle des mémes éléments de régulation (cassette
polycistronique) ou d'éléments indépendants, identiques ou différents,
homologues ou hétérologues vis à vis du vecteur les renfermant, constitutifs
ou inductibles.
Selon un mode particulier de réalisation, la composition de l'invention
comprend au moins une séquence d'acide nucléique (ü) codant pour un
polypeptide de fusion dans lequel un premier polypeptide présentant une
activité UPRTase ou CDase est fusionné en phase avec au moins un second
polypeptide, ledit second polypeptide présentant une activité CDase ou
UPRTase, respectivement. Plus particulièrement, un tel polypeptide est
caractérisé en ce que Ia fusion avec le second polypeptide est réalisée à
l'extrémité N-terminale dudit premier polypeptide.
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Selon un cas préféré, ladite composition est caractérisée en ce que la
séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide de fusion est une
séquence hybride comprenant
- une première séquence d'acide nucléique codant pour un
premier polypeptide présentant une activité UPRTase ou CDase,
- une seconde séquence d'acide nucléique codant pour un second
polypeptide présentant une activité Cdase ou UPRTase, respectivement.
Une telle séquence d'acide nucléique hybride codant pour ledit
polypeptide de fusion peut en outre renfermer une séquence de type IRES.
l0 L'invention concerne notamment une telle composition pour laquelle la
première séquence d'acide nucléique est sëlectionnée parmi upp, FUR1 et
FUR10105, et en ce que la seconde séquence d'acide nucléique est
sélectionnée parmi CodA et FCY1, et vice-versa. De manière tout à fait
préférée, une telle séquence d'acide nucléique hybride est choisie parmi les
séquences hybrides décrites dans les demandes de brevet W096/ 16183 et
PCT/FR99/00904.
Selon une troisième variante, la composition selon la présente invention
est caractérisée en ce que ledit polypeptide ayant une activité cytotoxique
(ü)
est un facteur protéique anti-angiogénique. L'angio~énèse est le processus
responsable de la formation de nouveaux capillaires à partir du réseau
vasculaire déjà existant. Ce processus complexe est finement régulé dans les
tissus sains par la balance des effets de nombreux facteurs angiogéniques et
anti-angiogéniques. Cependant, dans certaines pathologies, et notamment lors
de la formation d'une tumeur, ce processus est dérégulé : les facteurs
angiogéniques prennent le pas sur les facteurs anti-angiogéniques ce qui
permet une vascularisation importante des tumeurs et par voie de
conséquence leur développement rapide et / ou l'apparition de métastases.
C'est pourquoi, dans le cadre de la présente invention, un facteur anti-
angiogénique est considéré comme étant un agent cytotoxique, notamment
antitumoral. Parmi les différents facteurs anti-angiogéniques connus à l'heure
actuelle on peut notamment citer l'angiostatine, l'endostatine, le facteur
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plaquettaire PF4, la thrombospondine-1, le PRP (pour Proliferin Related
Protein), le VEGI (pour Vascular Endothelial Growth Inhibitor) les
metalloprotéases et l'urokinase.
Les séquences d'acide nucléique (i) ou (ü) ~ peuvent ètre aisément
obtenues par clonage, par PCR ou par synthèse chimique selon les techniques
cônventionnelles en usage. Il peut s'agir de gènes natifs ou dérivés de ces
derniers par mutation, délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs
nucléotides. Par ailleurs, leur séquences sont largement décrites dans la
littérature consultable par homme de l'art.
La présente invention a également trait à une composition telle que
présentée ci-dessus caractérisée en ce que lesdites séquences d'acide
nucléique (i) et (ü) sont insérées dans un vecteur recombinant d'origine
plasmidique ou virale, ainsi qu'à un tel vecteur recombinant portant de telles
séquences nucléotidiques placées sous le contrôle des éléments nécessaires à
leur expression dans une cellule hôte. Les séquences d'acide nucléique {i) et
(ü)
peuvent étre présentes en un ou plusieurs exemplaires sur un méme vecteur.
Plus particulièrement, les compositions de l'invention peuvent
comprendre lesdites séquences d'acide nucléique (i) et (ü) insérées dans un
mème vecteur recombinant ou dans des vecteurs recombinants distincts.
Par N vecteur recombinant » selon l'invention, bn entend désigner un
H vecteur d'origine plasmidique ou virale, et éventuellement un tel vecteur
associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efTicacité
transfectionnelle
et/ou la stabilité dudit vecteur et/ou la protection dudit vecteur in viUO â
l'égard du système immunitaire de l'organisme hôte. Ces substances sont
largement documentées dans la littérature accessible à homme de l'art (voir
par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121 ;
Hodgson et Solaiman , 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342 ; Remy et al.,
1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A titre illustratif mais non
limitatif,
il peut s'agir de polymëres, de lipides notamment cationiques, de liposomes,
de
protéines nucléaires ou virales ou encore de lipides neutres. Ces substances
peuvent étre utilisées seules ou en combinaison. Des exemples de tels
composés sont notamment disponibles dans les demandes de brevet WO
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98/08489, WO 98/ 17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP
890362 ou WO 99/05183. Une combinaison envisageable est un vecteur
recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL,
spermine-chol, spermidine-chol etc...) et des lipides neutres (DOPE).
Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente
invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression.
D'une manière générale, ils sont connus de homme de l'art et nombre d'entre
eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les
construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On
peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés dé pBR322 (Gibco BRL),
pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou
encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201). De préférence, un
plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une
origine de replication assurant l'initiation de la replication dans une
cellule
productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEl
pour un plasmide destiné à ëtre produit dans E. coli et le système oriP/EBNAl
si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère,
Lupton
et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 ; Yates et al., Nature 313, 812-
815). II peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de
sélectionner ou identifier les celiules transfectées (complémentation d'une
mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...).
Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant
son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui
favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984,
Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire).
S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant
d'un poxvirus (virus de la vaccine, notamment MVA, canaripox.., etc), d'un
adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un
foamyvirus ou d'un virus associé à l'adénovirus. On aura de préférence
recours à un vecteur non réplicatif et non intégratif. A cet égard, les
vecteurs
adénoviraux conviennent tout particulièrément à la mise en oeuvre de la
présente invention. Toutefois, il convient de noter ici que dans le cadre de
la
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mise en oeuvre de la présente invention, la nature du vecteur revêt peu
d'importance.
Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement
dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés
5 pour l'application cancer. Un rétrovirus recombinant selon l'nvention
cômporte généralement les séquences LTR, une rëgion d'encapsidation et la
séquence nucléotidique selon l'invention placée sous le contrôle du LTR
rétroviral ou d'un promoteur interne tels que ceux décrits ci-après. Il peut
dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, felin,
10 humain etc...) et en particulier du MoMuLV (Moloney ;purine leukemia
virus),
MVS (Mucine sarcoma virus) ou Friend mucine retrovirus (Fb29). Il est propagé
dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides
viraux gag, pol et/ ou env nécessaires à la constitution d'une particule
virale.
De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-
12
15 etc...). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des
modifications
notamment au niveau des LTR (remplacement de la région promotrice par un
promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une
région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type Vh30) (voir les
demandes françaises 94 08300 et 97 05203).
On pourra également avoir recours à un vecteur adénoviral défectif pour
la réplication c'est à dire dépourvu de tout ou partie d'au moins une région
essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions E1, E2, E4 et. Une
délétion de la région E1 est préférée. Mais elle peut étre combinée à d'autres
modification(s)/délétion(s) touchant notamment tout ou partie des régions E2,
E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont
complémentées en trans au moyen d'une lignée de complémentation et/ou
d'un virus auxilliaire afin d'assurer la production des particules virales
d'intérêt. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde
génération de l'état de la technique (voir par exemple les demandes
internationales W094/28152 et W097/04119). A titre illustratif, la délétion de
la majorité de la région E 1 et de l'unité de transcription E4 est tout
particulièrement avantageuse. Dans le but d'augmenter les capacités de
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clonage, le vecteur adénoviral peut en outre étre dépourvu de tout ou partie
de
la région E3 non esséntielle. Selon une autre alternative, on peut mettre en
oeuvre un vecteur adénoviral minimal retenant les séquences essentielles à
fencapsidation, à savoir les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la
région
d'encapsidation. Par ailleurs, l'origine du vecteur adénoviral selon
l'invention,
peut étre variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il
peut
dériver du génome d'un adénovirus d'origine humaine ou animale (canine,
aviaire, bovine, murine, ovine, porcine, simienne...) ou encore d'un hybride
comprenant des fragments de génome adénoviral d'au moins deux origines
l0 différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou
CAV-
2 d'originé canine, DAV d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine
bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176 ; Spibey et
Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gene, 198?, 60:
21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Virol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on
préférera
un vecteur adénoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un
adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5. Un vecteur adénoviral
selon la présente invention peut étre généré in vitro dans Escherichia coli
(E.
coli) par ligation ou recombinaison homologue (voir par exemple la demande
internationale W096/ 17070) ou encore par recombinaison dans une lignée de
complémentation. Les différents vecteurs adénoviraux ainsi que leurs
techniques de préparation sont connus (voir par exemple Graham et Prevect,
1991, in Methods in Molecular Biology, vol 7, p 109-128 ; Ed : E.J. Murey, The
Human Press Inc).
Les éléments nécessaires à l'expression sont constitués par l'ensemble des
éléments permettant la transcription de la séquence nucléoddique en ARN et
la traduction de l'ARNm en polypeptide, notamment les séquences promotrices
et/ou des séquences de régulation efficaces dans ladite cellule, et
éventuellement les séquences requises pour permettre l'excrétion ou
l'expression à la surface des cellules cibles dudit polypeptide. Ces éléments
3U peuvent étre régulables ou constitutifs. Bien entendu, le promoteur est
adapté
au vecteur retenu et à la cellule hôte On peut citer, à titre d'exemples, les
promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycérate Kinase), MT
(metallothioneine ; Mc Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), a-1
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antitrypsine, CFTR, les promoteurs du gène codant pour la créatine kinase
musculaire, pour l'actine, pour le surfactant pulmonaire, immunoglobuline, /3-
actine (Tabin et al., 1982, Mol. Cell Biol. 2, 426-436), SRa (Takebe et al.,
1988,
Mol. Cell. Biol. 8, 466-472), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian
Virus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur de MPSV, le
promoteur TK-HSV-1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus),
les promoteurs du virus de la vaccine p7.5K pHSR, pKl L, p28, p 11 et les
promoteurs adénoviraux EIA et MLP ou une combinaison desdits promoteurs.
Il peut également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une
cellule tumorale ou cancéreuse. On peut citer notamment les promoteurs des
gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et
al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic
antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol.
Cell.
Biol. 10, 2738-2748), tyrosinose surexprimé dans les mélanomes (Vile et al.,
1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du
sein et du pancréas (Harns et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-I75) et a-
fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 199?, Cancer
Res. 57, 461-465). Le promoteur précoce du Cytomégalovirus (CMV), ou celui
du RSV, est tout particulièrement préféré. Il est également possible
d'utiliser
une région promotrice tissu-spécifique, notamment lorsque la tumeur à traiter
est issue d'un type cellulaire particulier, ou activable dans des conditions
définies. La littérature procure un grand nombre d'informations relatives à de
telles séquences promotrices.
Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments
additionneis améliorant l'expression de la séquence nucléotidique selon
l'invention ou son maintien dans la cellule hôte. On peut citer notamment les
séquences introniques (WO 94/29471), séquences signal de sécrétion,
séquences de localisation nucléaire, sites internes de réinitiation de la
traduction de type IRES, séquences poly A de terminaison de la transcription .
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention concerne plus
particulièrement un vecteur recombinant, notamment un vecteur viral, et plus
spécifiquement un vecteur adénoviral defectif pour la réplication, comprenant
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(i) une séquence d'acide nucléique codant pour tout ou partie
d'une chimiokine MIP,
(ü) au moins une séquence d'acide nucléique codant pour tout
ou partie d'un polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique,
_ lesdites séquences d'acide nucléique étant placées sous le contrôle des
éléments nécessaires à leur expression dans une cellule hôte et étant définies
comme indiqué ci-dessus.
La présente invention a également pour objet une particule virale,
notamment adénovirale, comprenant un vecteur viral recombinant selon
l'invention. Une telle particule virale peut étre générée à partir d'un
vecteur
viral selon toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art. Sa
propagation est effectuée notamment dans une cellule de complémentation
adaptée aux déficiences dudit vecteur. S'agissant d'un vecteur adénoviral, on
aura par exemple recours à une lignée de complémentaion telle que décrite
dans la demande WO 94/28152, à la lignée 293 établie à partir de cellules de
rein embryonnaire humain, qui complémente efficacement la fonction E1
(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72), la lignée A549-El (Imler et
al.,
1996, Gene Therapy 3, 75-84) ou une lignée permettant une double
complémentation (Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565 ; Krougliak et
Graham, 1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586 ; ,Wang et al., 1995 Gene
Therapy 2, 775-783 ; demande internationale WO 97/04119). On peut
également employer des virus auxilliaires pour complémenter au moins en
partie les fonctions défectives. Par cellule de complémentation, on entend une
cellule capable de fournir en trans les facteurs précoces et/ou tardifs
nécessaires à l'encapsidation du génome viral dans une capside virale pour
générer une particule virale contenant le vecteur recombinant. Ladite cellule
peut ne pas complémenter à elle seule toutes les fonctions défectives du
vecteur et dans ce cas peut étre transfectée/transduite par un vecteur/virus
auxilliaire apportant les fonctions complémentaires.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une
particule virale, selon lequel
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(i) on introduit un vecteur recombinant selon l'invention dans une
cellule, notamment une cellule de complémentation capable de
complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une dite
cellule transfectée,
(ü) on cultive ladite cellule transfectée dans des conditions
appropriées pour permettre la production de ladite particule virale,
et
(iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
Bien entendu, la particule virale peut ètre récupérée du surnageant de
culture mais également à partir des cellules. Une des méthodes couramment
employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de
congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de
lyse. Ceux-ci peuvent étre amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art
(procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un
gradient de chlorure de césium...).
L'invention a également trait à une cellule hôte eucaryote comprenant
les fragments d'ADN présents dans la composition selon l'invention.' Ladite
cellule hôte est avantageusement une cellule de mammifère et, de préférence,
une cellule humaine. Il s'agira de préférence d'une cellule 293, LCA4 ou
PERC6. Une telle cellule est notamment utile pour' produire les particules
virales à haut titre, sans générer de particules compétentes pour la
réplication . L' invention concerne également une cellule hôte comprenant une
séquence nucléotidique, un vecteur recombinant selon l'invention ou infectée
par une particule virale selon l'invention. Aux fins de la présente invention,
une cellule hôte est constituée par toute cellule transfectable par un vecteur
recombinant ou infectable par une particule virale, tels que dëfinis ci-avant.
Une cellule de mammifère et notamment humaine convient tout
particulièrement. Elle peut comprendre ledit vecteur sous forme intégrée dans
le génome ou non (épisome). Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale
d'une origine quelconque, notamment hématopoïétique (cellule souche
totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire
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(cellule satellite, myocyte, myoblaste, muscle lisse...), cardiaque,
pulmonaire,
trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
L'invention concerne également une composition destinée à la mise en
oeuvre d'un traitement antitumoral ou antiviral, ou toute applications
5 nécessitant la mort cellulaire, chez un mammifère comprenant
(i) tout ou partie du polypeptide MIP,
(ü) tout ou partie d'un poiypeptide ayant au moins une
activité cytotoxique,
lesdits polypeptides étant définis comme indiqué précédemment.
10 Un autre objet selon l'invention consiste en une formulation destinée à
la mise en oeuvre d'un traitement cytotoxique, notamment antitumoral ou
antiviral, chez un mammifère caractérisée en ce qu'elle comporte une
composition (à base d'acides nucléiques ou de polypeptides telle que décrite
précédemment), un vecteur adénoviral ou une particule virale selon
15 l'invention, ainsi qu'un support acceptable d'un point de vue
pharmaceutique.
Un tel support est préférentiellement isotonique, hypotonique ou faiblement
hypertonique et présente une force ionique relativement faible, tel que par
exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, un tel support peut renfermer
tout solvant, ou liquide aqueux ou partiellement aqueux tel que de l'eau
stérile
20 non pyrogène. Le pH de la formulation est en outre ajusté et tamponné afin
de
repondre aux exigences d'utilisation in viao. La formulation peut également
inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue
pharmaceutique, de méme que des agents de solubilisation, de stabilisation,
de préservation. Pour une administration injectable, on préfère une
formulation en solution aqueuse, non-aqueuse ou isotonique. Elle peut ètre
présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche
(poudre, lyophilisat...) susceptible d'étre reconsituée de manière
extemporanée
par un diluant approprié.
Selon un mode particulier de l'invention, ladite formulation comporte en
outre des quantités acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une
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prodrogue capable d'étre transformée en molécule cytotoxique par un
polypeptide ayant au moins une activité cytotoxique.
Une telle prodrogue sera notamment sélectionnée dans le groupe
consistant en l'acyclovir ou le ganciclovir (GCV), la cyclophosphophamide, la
6-methylpurine deoxyribonucleoside, la 6-thioxanthine, la cytosine ou un de
ses dérivés ou l'uracile ou un de ses dérivés. De manière tout à fait
préférée,
ladite prodrogue est la 5-fluorocytosine (5FC) ou la 5-fluorouracile (5-FU ).
Par ailleurs, notamment dans le cadre de formulations renfermant une
composition selon la seconde variante évoquée ci-dessus, il convient de noter
que ladite formulation peut également comprendre une ou plusieurs
substances potentialisant l'effet cytotoxique du 5-FU. On peut citer en
particulier, les drogues inhibant les enzymes de la voie de biosynthèse de
novo
des pyrimidines (par exemple celles citées ci-après), les drogues telles que
la
Leucovorin (Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692) qui
en présence du produit du métabolisme du 5-FU (5-FdUMP) augmente
l'inhibition de la thymidylate synthase ce qui entraine une diminution du pool
de dTMP nécessaire à la réplication et enfin les drogues telles que le
méthotréxate (Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137) qui en inhibant
la dihydrofolate réductase et en élevant le pool d'incorporation de PRPP
(phosphoribosyipyrophosphate) provoque l'augmentation de 5-FU dans l'ARN
cellulaire.
Une formulation selon l'invention est plus particulièrement destinée au
traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie gënique et s'adresse
plus particulièrement aux maladies prolifératives (cancers, tumeurs,
resténose...etc) et aux maladies d'origine infectieuse, notamment virale pour
lesquelles il est nécessaire de limiter la prolifération des cellules
infectées
(induites par les virus de l'hépatite B ou C, le HIV, l'herpès, les
rétrovirus....etc).
Une formulation selon l'invention peut étre fabriquée de manière
conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou
digestive. Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut
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citer par exemple la voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque,
intramusculaire, intraveineuse, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale,
intrapulmonaire ou intratrachéale. Pour ces trois derniers modes de
réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs
fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le
dosage
appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de
l'individu, de la maladie à traiter ou encore du ou des gènes) d'intérêt à
transférer. Les préparations à base de particules virales selon l'invention
peuvent étre formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp
(unités formant des plages), avantageusement 105 et 1013 ufp et, de
préférence,
106 et 1012 ufp. Pour ce qui est du vecteur recombinant selon l'invention, des
doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de
manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg peuvent ètre envisagées. Une
composition à base de polypeptides comprend de préférence de 0,05 à 10 g et,
de manière tout à fait préférée, de 0,5 à 5 g dudit polypeptide. Bien entendu,
les doses peuvent étre adaptées par le clinicien.
La présente invention est également relative à l'utilisation thérapëutique
ou prophylactique d'une composition, d'un vecteur recombinant ou d'une
2o particule virale selon l'invention pour la préparation d'un médicament
destiné
au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique, notamment
pour la préparation d'un médicament cytotoxique, notamment antüumoral ou
antiviral, destiné à inhiber la croissance ou provoquer le rejet d'une tumeur
ou
la mort d'une cellule infectée. Selon une première possibilité, le médicament
peut étre administré directement in vivo (par exemple par injection
intraveineuse, dans une tumeur accessible ou à sa périphérie, dans les
poumons par aérosol, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde
appropriée...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à
prélever des cellules du patient (cellules souches de la moêlle osseuse,
lymphocytes du sang pér~iphér~ique, cellules musculaires...), de les
transfecter
ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadministrer au
patient. Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers,
tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée.
Parmi
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les applications envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus
(notamment ceux induits par les papillomas virus), de la prostate, du poumon,
de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du
larynx du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie etc...).
Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par
exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles
lisses
de la paroi vasculaire (resténose). Enfin pour ce qui est des maladies
infectieuses, l'application au SIDA peut étre envisagée.
Il est par ailleurs envisageable, le cas échéant et sans sortir du cadre de la
présente invention, de procéder à des administrations simultanées ou
successives par des voies différentes des différents composants compris dans
la composition ou la formulation pharmaceutique selon l'invention.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement des
maladies par thérapie génique, caractérisée en ce que l'on administre à un
organisme ou à une cellule hôte ayant besoin d'un tel traitement une séquence
nucléotidique, un vecteur recombinant, une particule virale ou une cellule
hôte selon l'invention.
Lorsque la méthode de traitement met en oeuvre une séquence
nucléotidique, un vecteur recombinant ou une particule virale permettant
l'expression d'un polypeptide selon l'invention ayant ~zne activité UPRTase,
il
peut ètre avantageux d'administrer en outre une seconde séquence
nucléotidique codant pour un second polypeptide présentant une activité
CDase, ladite seconde séquence nucléotidique étant portée par ledit vecteur
recombinant ou particule virale ou par un vecteur ou une particule virale
indépendante. Dans ce dernier cas, l'administration des séquences UPRTase et
CDase peut étre simultanée ou consécutive, l'ordre d'administration étant
sans importance.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'utilisation thérapeutique ou
la méthode de traitement comprend également une étape supplémentaire
selon laquelle on administre à l'organisme ou la cellule hôte des quantités
acceptables d'un point de vue pharmaceutique d'une prédrogue,
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avantageusement d'un analogue de cytosine et, en particulier de la 5-FC. A
titre illustratif, une dose de 50 à 500 mg/kg/jour peut étre employée avec une
préférence pour 200 mg/kg/jour. Dans le cadre de la présente invention, la
prédrogue est administrée selon les pratiques standards et ceci de manière
5 préalable, concomittante ou encore postérieure à celle de l'agent
thérapeutique
selon l'invention. La voie orale est préférée. On peut administrer une dose
unique de prédrogue ou des doses répétées pendant un temps suffisamment
long pour permettre la production du métabolite toxique au sein de
l'organisme ou de la cellule hôte.
l0 Selon une mode avantageux de l'invention, l'utilisation thérapeutique
ou la méthode de traitement est associée à un second traitement du patient
par chirurgie (notamment par ablation de la tumeur partiellement ou
totalement), par radiothérapie ou chimiothérapie. Dans ce cas particulier, le
traitement selon l'invention est appliqué de manière préalable, concomitante
15 ou fait suite audit second traitement. De manière préféré, ce traitement
sera
appliqué suite audit second traitement.
Les exemples qui suivent ont pour but d'illustrer les différents objets de
la présente invention et n'ont par conséquence aucun caractère limitatif.
La figure 1 représente l'évolution du volume tumoral chez des souris B6D2
2o implantées avec des cellules tumorales B 16F0.
La figure 2 représente le taux de survie de ces mêmes souris. Des
groupes de 15 souris sont traités à l'aides de compositions comprenant des
adénovirus exprimant les gènes suivants : huMIPa, huIL2, huMIPla +huIL2,
Ad vide.
25 La figure 3 représente l'évolution du volume tumoral chez des souris
B6D2 implantées avec des cellules tumorales RENCA.
La figure 4 représente le taux de survie de ces mèmes souris. Des
groupes de 15 souris sont traités à l'aides de compositions comprenant des
adénovirus exprimant les gènes suivants : huMIP(3, huIL2, huMIP(3 +huIL2,
30 Ad vide.
La figure 5 représente l'évolution du volume tumoral chez des souris
B6D2 implantées avec des cellules tumorales P815.
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La figure 6 représente le taux de survie de ces mémes souris. Des
groupes de 15 souris sont traités à l'aides de compositions comprenant des
adénovirus exprimant les gènes suivants : Tampon Tris, huMIPa +huIL2,
huMIPla + muIFNy, huIL2 + muIFNy.
5 La fgure 7 représente l'évolution du volume tumoral chez des souris
B6D2 implantées avec des cellules tumorales RENCA. Ces souris sont traitées
à l'aide de compositions comprenant des adénovirus exprimant le gène MIP1(i
humain (huMIP1(i) en combinaison avec des adénovirus exprimant le gène
murin IL12 (muILl2), ou des adénovirus exprimant le gène muILl2, ou des
10 adénovirus ne contenant aucun transgène (Ad vide).
EXEMPLES
Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les
techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées
15 dans Maniatis et aL, (19$9, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les recommandations du
fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de recombinaison
homologue sont de préférence réalisées dans la souche E. soli BJ 5183
(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des
20 sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des
extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I
d'E. coli (Klenow). Par ailleurs, les fragments de génome adénoviral employés
dans les difïérentes constructions décrites ci-après, sont indiqués
précisément
selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle
25 que divulguée dans la banque de données Genbank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, les cellules sont transfectées
ou transduites et cultivées selon ies techniques standards bien connues de
l'homme du métier.
Modèles tumoraux
Trois modèles de cellules tumorales ont été choisis afin d'évaluer
l'activité de la composition de l'invention : P815 (mastocytome H-2d, décrite
dans Dunn et al, 1957, J.Natl. Cancer Inst., 18, 587-590), B16F0 (mélanome
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H-2b, dëcrite dans Wu et al, 1996, Cancer Res., 56, 21-26) et RENCA
(carcinome rénal H-2d, décrite dans Murphy et al, 1973, J.Natl.Cancer Inst.,
50(4), 1023-1025). Les cellules (3E+5 pour chaque modèle de tumeur) sont
implantées à J-7 /J-11 en sous cutané dans le flanc droit de souris B6D2
àgées de 6 à 8 semaines.
Administration des compositions cytotoxiques de l'inventzon
Un volume de 100 Nl de vecteurs adénoviraux (5 x 108 unités
infectieuses) est injecté directement dans les tumeurs lorsque leur volume
avoisine 4 à 10 mm3 (JO). Cette injection est répétée dans les mémes
conditions à J 1 et J2.
L'efficacité de la composition de l'invention administrée est contrôlée
par la mesure de la taille des tumeurs ainsi que par la mesure du temps de
survie des souris traitées avec le cas échéant un contrôle du statut
immunologique de l'animal par ELISPOT, test CTL, ... Les animaux peuvent en
outre étre ensuite soumis à un challenge contra-latéral au cours duquel une
dose létale de cellules tumorales est administrée à l'animal pré-traité.
EXEMPLE 1
Construction de pTG13010 (huMIPla).
L'ADNc de MIPla humain (Numéro d'accession auprès de GenBank
X03754 ; séquence incorporée à la demande par référence) a été assemblé par
oligonucléotides synthétiques suivant la séquence décrite pas Obaru,K. & al.
1986, J. Biochem. 99 (3), 885-894. Cet ADNc a été introduit dans un vecteur
dérivé de pBluescript pour donner le vecteur pTG13006.
Le fragment NotI-Asp718 de pTG13006 renfermant le gène MIPla est
isolé et introduit dans le vecteur pTG$347 clivé par ces mèmes enzymes, pour
donner le vecteur de transfert pTG 13008. A titre indicatif, pTG8347 est un
vecteur p polyII (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) dans lequel sont
insérées les séquences Ad5 1 à 458, le promoteur RSV, les séquences
d'épissage de l'intron 2 de la béta-globine 1 de lapin, les séquences de
polyadénylation de la béta-globine 1 de lapin et les séquences Ad5 3328-5788.
Une telle construction est à la portée de l'homme de l'art, notamment sur la
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base de la demande francaise 97 06757. Le vecteur adénoviral pTG 13010 est
reconstitué par recombinaison dans la souche E. coLi BJ 5183 entre le
fragment PacI-BstEII de pTG 13008 et le vecteur pTG6624 (décrit dans la
demande française 97 06757) linéarisé par CIaI. A titre indicatif, pTG6624
correspond au plasmide p poly II portant le génome Ad5 délété des régions E1
(nt 459 à 3327) et E3 (nt 28592 à 30470) ia cassette d'expression de MIP
étant insérée à la place de E 1.
La construction finale pTG13010 contient le génome Ad5 délété de
l'essentiel des régions E1 (nt 459 â 3328) et E3 (nt 28249 à 30758) et en lieu
l0 et place de E1, une cassette pour l'expression du gène MIPIa placé sous le
contrôle du promoteur RSV et des séquences d'épissage de l'intron 2 de la
béta-globine 1 de lapin. Les particules adénovirales sont générées par
transfection dans une lignée de complémentation de la fonction E1, par
exemple la lignée 293 (ATCC CRL1573) selon les techniques de l'art (Graham
et Prevec, 1991, Methods in Molecular Biology Vol7, Gene Transfer and
Expression Protocols ; Ed E.J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ).
Construction de pTG13023 (huMIP1 ~i / variant Act2).
L'ADNc de MIP1 (3 humain (Numéro d'accession GenBank : J04130 ;
séquence incorporée à la demande par référence) a été assemblé par
oligonucléotides synthétiques suivant la séquence décrite par Lipes,M.A. et
al.
1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (24), 9704-9708. Cet ADNc a été
introduit dans un vecteur dérivé de M13TG130 (KIENY et al. 1983, Gene, 26,
91-99) pour donner le vecteur M 13TG 13013.
Le fragment NotI-Asp718 de M13TG13013 renfermant le gène MIP1 (3
est isolé et introduit dans le vecteur pTG8347 clivé par ces mémes enzymes,
pour donner le vecteur de transfert pTG13015. Une telle construction est à la
portée de homme de l'art, notamment sur la base de la demande française
97 06757. Le vecteur adénoviral pTG13023 est reconstitué par recombinaison
dans la souche E. coli BJ 5183 entre le fragment PacI-BstEII de pTG 13015 et
le vecteur pTG6624 (décrit dans la demande française 97 0675?) linéarisé par
CIaI.
La construction finale pTG13023 contient le génome Ad5 délété de
l'essentiel des régions E 1 (nt 459 à 3328) et E3 (nt 28249 à 30758) et en
lieu
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et place de E1, une cassette pour l'expression du gène MIP1 (i placé sous le
contrôle du promoteur RSV et des séquences d'épissage de l'intron 2 de la (3
globine 1 de lapin. Les particules adénovirales sont générées par transfection
dans une lignée de complémentation de la fonction EI, par exemple la lignée
293 (ATCC CRL1573) selon les techniques de l'art (Graham et Prevec, 1991,
Methods in Molecular Biology VoI7, Gene Transfer and Expression Protocols ;
Ed E.J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ).
EXEMPLE 2
Expériences in vivo.
Afin d'évaluer la capacité des compositions de l'invention à inhiber la
croissance des tumeurs in vivo, 3.105 cellules B 16F0, RENCA ou P815 sont
injectées à (J = -10/-?) dans des souris immunocompétentes B6D2. Dès que
les tumeurs deviennent palpables (J=0) différentes compositions (voir la
légende des figures 1 à 6) sont injectées à trois reprises (J0, J1, J2) par
voie
infra-tumorale à une dose de 5.108 unités infectieuses.
Les résultats obtenus mettent en évidence une augmentation des taux
de survie (figures 1, 3 et 5) associée à une baisse des volumes tumoraux
(figures 2, 4 et 6) chez les souris traitées avec les compositions comprenant
un
adénovirus exprimant MIPla ou MIP1(3 associé à l'IL2 ou l2FNy. Ces résultats
confirment bien l'intérèt des composition de l'invention dans la mise en
oeuvre
d'un traitement antitumoral.
Les souris ainsi traitées sont ensuite soumises à un challenge contra-
latéral consistant en une administration dans les conditions décrites
précédemment d'une dose létale (3.105 cellules) de cellules tumorales à
J80/J100. On a ainsi constaté que les résultats décrits ci-dessus sont en
outre assortis d'un état immunitaire de la souris tel qu'aucune tumeur n'est
capable de se développer après cette étape de challenge.
EXEMPLE 3
Expériences in vivo
Afin d'évaluer la capacité des compositions de l'invention à inhiber la
croissance des tumeurs in vivo, 4.105 cellules RENCA sont injectées à (J = 0)
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dans des souris immunocompétentes B6D2. Dès que les tumeurs deviennent
palpables (J - 6) différentes compositions renfermant soit 2.108 unités
infectieuses (ui) d'un adénovirus exprimant le gène MIPl(3 humain (huMIPl(3)
en combinaison avec 2.108 ui d'un adénovirus exprimant le gène mutin IL12
(muILl2), soit 2.108 ui d'un adénovirus exprimant le gène muILl2 en
combinaison avec 2.108 ui d'un adénovirus ne renfermant aucun transgène
(Ad vide), soit 4.108 ui d'un Ad vide, sont injectées à trois reprises (J6,
J7, J8)
par voie infra-tumorale. Pour toutes ces compositions, les adénovirus sont
dans une solution contenant 100 mM de Tris et 10 mM de MgCla. Il a été par
ailleurs vérifié que les souris traitées dans les mèmes conditions par une
composition comprenant seulement les adénovirus exprimant le gène MIP1(3
présentaient des tumeurs de volume identique ou méme supérieur à celles
observées chez des souris traitées par une composition comprenant des Ad
vides.
Les résultats obtenus selon cet exemple (figure 7) mettent en évidence
une baisse des volumes tumoraux chez les souris traitées avec les
compositions de l'invention comprenant un adénovirus exprimant MIP1(3
associé à un adénovirus exprimant l'IL12, tout particulièrement par
comparaison aux résultats observés lors du traitement des souris avec
muILl2 seul. Ces résultats confirment bien l'intérèt des compositions de
l'invention dans la mise en oeuvre d'un traitement antitumoral.
