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UTILISATION DE PROMOTEURS SPECIFIQUES HYBRIDES
POUR CON'TROLER L'EXPRESSION TISSULAIRE
La présente invention concerne le domaine de la biologie, et en particuler le
domaine de la régulation de l'expression de gènes. Elle décrit notamment de
nouvelles constructions et de nouveaux vecteurs permettant une expression
ciblée et
forte de gènes. La présente invention est utilisable dans de nombreux
domaines, et en
particulier pour la production de protéines recombinantes, pour la création de
modèles animaux transgéniques, pour la création de lignées cellulaires, pour
la mise
au point de tests de criblage, ou encore en thérapie génique et cellulaire.
La possibilité de .contrôler et de diriger l'expression de gènes constitue un
enjeu très important dans le développement des biotechnologies. In vitro, elle
peut
permettre d'améliorer les conditions de production de protéines recombinantes,
en
utilisant des populations particulières de cellules. Toujours in vitro, elle
peut
permettre la détection o~u la mise en évidence de la présence de populations
spécifiques de cellules dans un échantillon, ou également de tester les
propriétés d'un
produit ou la régulation d'un gène dans une population spécifique de cellules.
Le
contrôle de l'expression de gènes est également très important pour des
approches
thérapeutiques ex vivo ou in vivo, dans lesquelles la possibilité de contrôler
sélectivement la production d'une molécule thérapeutique est essentielle. En
effet,
selon les applications, selon le gène à transférer, il est important de
pouvoir cibler
certains tissus ou certaines parties seulement d'un organisme afin de
concentrer l'effet
thérapeutique et de limiter la dissémination et les effets secondaires.
Le ciblage de l'expression d'un acide nucléique donné peut être réalisé selon
différentes approches. Une première approche consiste par exemple à utiliser
des
vecteurs ou des agents de transfert présentant une spécificité cellulaire
donnée.
Cependant, la spécificité conférée par ce type de vecteurs est généralement
assez
grossière et ne permet pas un ciblage de populations précises de cellules. Une
autre
approche consiste à utiliser des signaux d'expression spécifiques de certains
types
cellulaires. A cet égard, des promoteurs dits "spécifiques" ont été décrits
dans la
littérature, tels que le promoteur des gènes codant pour la pyruvate kinase,
la villine,
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la GFAP, le promoteur de la protéine intestinale de liaison des acides gras,
le
promoteur de factine a des cellules du muscle lisse, le promoteur SM22 ou
encore le
promoteur du gène de l'albumine humaine par exemple. Cependant, si ces
promoteurs
présentent une spécificité tissulaire, ils présentent également, en
contrepartie, une
puissance relativement faible. Ainsi, la grande majorité de ces promoteurs
possède
des niveaux d'activité qui sont bien en deça de ceux de promoteurs dits
"forts",
généralement d'un facteur compris entre 10 et 100 au moins. En outre, il est
généralement considéré que la spécificité d'un promoteur est inversement
proportionnelle à sa force et que, plus la force est augmentée, plus le niveau
d'activité
non-spécifique est important.
Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir disposer de promoteurs
qui soient à la fois spécifiques de certains tissus et forts. L'objet de la
présente
invention est précisément de fournir de nouvelles constructions permettant
l'expression forte et ciblée de gènes.
L'invention décrit en particulier de nouveaux promoteurs chimériques
permettant une expression de gènes forte et spécifique des cellules
musculaires lisses.
L'invention décrit également des vecteurs contenant de tels promoteurs et leur
utilisation pour le transfert; de gènes dans les cellules in vitro, ex vivo et
in vivo. Les
constructions de (invention permettent pour la première fois de combiner des
propriétés opposées, à savoir un grande selectivité et une activité
transcriptionnelle
élevée. La présente invention offre ainsi un moyen particulièrement performant
pour
le ciblage de l'expression de gènes dans des cellules du muscle lisse, in vivo
ou in
vitro, et pour la régulation de cette expression.
L'invention repose plus particulièrement sur la construction de promoteurs
chimériques (ou hybrides), comprenant des régions d'origine et de fonction
différentes. Plus particulièrement, un premier objet de (invention réside dans
un
promoteur hybride comprenant
- tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et
ubiquitaire, et
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- une région promoteur permettant l'expression spécifique dans les cellules
musculaires lisses.
L'association de régions enhanceur et de promoteurs a déjà été décrite dans
l'art antérieur. Ainsi, il est connu par exemple de coupler la région
enhanceur du
CMV avec des promoteurs non spécifiques tels que le promoteur du gène de
l'actine-
~3 de poulet (W096/135!~7) afin d'augmenter leur force. Néanmoins, de telles
constructions n'ont pas été décrites ou suggérées dans le but de tenter
d'obtenir une
expression forte et spécifique des cellules du muscle lisse. L'invention
repose en
partie sur la sélection et la combinaison d'éléments "enhancers" particuliers
et
d'éléments "promoteurs" particuliers. L'invention repose également sur la mise
en
évidence que cette combinaison d'éléments permet d'obtenir une expression à
des
niveaux élevés, sans affecter la sélectivité du promoteur pour les cellules
cibles du
muscle lisse. L'invention fournit donc des constructions particuliérement
avantageuses puisqu'elles permettent la production ciblée et avec des niveaux
importants de molécules dans les cellules du muscle lisse. En outre, la
présente
demande montre également que ces constructions peuvent être utilisées aussi
bien in
vitro que in vivo.
Dans ïes promoteurs hybrides selon l'invention, la région enhancer et la
région promoteur sont associées de manière fonctionnelle, c'est-à-dire de
sorte que la
région enhancer exerce une activité stimulante sur l'activité de la région
promoteur.
Généralement, ces deux régions sont donc liées génétiquement et sont
suffisamment
proches l'une de l'autxe pour permettre à la région enhancer d'activer la
région
promoteur. Préférentiellement, la distance séparant la région enhancer et la
région
promoteur est inférieure à 1 kb, plus préférentiellement inférieure à 500 pb.
Dans les
constructions particulièrement préférées selon l'invention, ces deux régions
sont
espacées de moins de 400 pb, plus préférentiellement de moins de 200 pb. En
outre,
comme le montrent les exemples, l'orientation respective des deux régions n'a
pas
d'influence significative sur l'activité des promoteurs hybrides de
l'invention. De ce
fait, la région enhancer peut être positionnée dans la même orientation ou
dans
l'orientation inverse par rapport au sens de la transcription de la région
promoteur.
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Dans un mode préféré de mise en oeuvre, la région enhancer est choisie parmi
la région enhancer du géne précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), la
région enhancer du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV), la région
enhancer
du virus SV40, et la région enhancer du gène EF 1 a. Plus préférentiellement,
dans les
promoteurs hybrides de l'invention, la région enhancer est la région enhancer
du gène
précoce immédiat du cytomégalovirus (CMV-IE), de préférence du cytomégalovirus
humain (hCMV-IE). Une région enhanceur particulière est constituée par exemple
du
fragment -522 à -b3 du Irène hCMV-IE, ou de tout fragment comprenant au moins
une partie de celui-ci et présentant une activité enhancer.
S'agissant de la région promoteur, on utilise avantageusement pour la mise en
oeuvre de l'invention une région comprenant tout ou partie du promoteur du
gène
codant pour l'actine-a de cellules musculaires lisses (SMact) ou du gène SM22.
Le
promoteur de ces gènes a été décrit pour son caractère spécifique des cellules
du
muscle lisse (voir notamment Ueyama H. et coll., Mol. Cell. Biol., 4 (1984)
1073-
1078 ; Solway J. et coll., J: Biol. Chem., 270 ( 1995) 13460-13469).
Une première variante particulièrement avantageuse de la présente invention
est constituée par un promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du
cytomégalovirus humain (hCMV-IE), et
- tout ou partie d.u promoteur du gène codant pour l'actine-a de cellules
musculaires lisses (SMact), de préférence du gène Smact humain.
Une deuxième variante particulièrement avantageuse de la présente invention
est constituée par un promoteur hybride comprenant:
- tout ou partie de la région enhancer du gène précoce immédiat du
cytomégalovirus humain (:hCMV-IE), et
- tout ou partie du promoteur du gène SM22, de préférence du gène SM22
alpha de souris.
Par ailleurs, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la
région
promoteur utilisée est une région chimère comprenant un promoteur basal et une
séquence conférant la spécificité tissulaire, ladite séquence étant dérivée du
promoteur SMact ou du promoteur SM22, ou d'une combinaison des deux. Dans ce
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mode de réalisation, le promoteur basal peut être un promoteur "minimal",
c'est-à-dire
comprenant uniquement les séquences essentielles à l'activité de promoteur
transcriptionnel (par exemple une boîte TATA). Ce promoteur basal peut être le
propre promoteur basal .du gène SMact ou SM22, ou d'origine hétérologue ((3-
globine, HSV-TK, SV4(1 ou EF1-a par exemple ). La séquence conférant la
spécificité tissulaire comprend avantageusement une partie de la séquence du
promoteur SMact (R. T. Shimizu et al. J. Biol. Chem. 270 (1995) 7634-7643)
et/ou
du promoteur SM22 ( L.I,i et al. J. Cell. Biol. 132 ( 1996) 849-859; S. Kim et
al. J.
Clin. Invest. 100 (1997) 1006-1014; Kemp et al. Biochem. J. 310 (1995) 1037-
1043).
Un type particulier de promoteur hybride selon l'invention comprend donc
tout ou partie de la région enhancer d'un promoteur/enhancer fort et
ubiquitaire,
- un promoteur basal et,
- une séquence conférant la spécificité tissulaire comprenant tout ou partie
du
promoteur SMact et/ou du promoteur SM22.
Pour la construction des promoteurs hybrides de l'invention, les techniques de
biologie moléculaire conrmes de l'homme du métier peuvent être mises en
oeuvre.
Ainsi, la région enhancer et la région promoteur (y compris le promoteur basal
et la
séquence conférant la spécificité tissulaire) peuvent être isolées par les
techniques
classiques à partir de banques d'acides nucléiques ou à partir de l'ADN
cellulaire
total, par exemple par amvplification au moyen de sondes spécifiques. Ces
fragments
peuvent également ëtre synthétisés artificiellement en utilisant les
informations de
séquences disponibles dans i'art antérieur. Lorsque ces fragments sont
obtenus, ils
peuvent être aisément combinés entre eux au moyen de ligases et autres enzymes
de
restriction, pour générer des promoteurs hybrides de l'invention. En outre,
ces
fragments peuvent être modifiés par digestion, mutation, insertion ou addition
de
paires de bases, soit dans le but de faciliter leur clonage, soit dans le but
de modifier
leurs propriétés fonctionnelles. Par ailleurs, comme indiqué ci-avant, les
fragments
peuvent être associés directement l'un à l'autre ou au contraire espacés par
des paires
de bases n'ayant pas d'influence significative sur l'activité du promoteur
hybride.
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Les promoteurs hybrides de l'invention possèdent ainsi la capacité d'exprimer
un acide nucléique d'intérêt de manière spécifique dans ies cellules
musculaires
lisses. Le caractère « spécifique » de l'expression signifie que l'activité du
promoteur
est significativement très supérieure dans les cellules du muscle lisse. Bien
qu'une
expression non-spécifique puissse exister dans d'autres cellules, le niveau
d'activité
correspondant reste généralement très faible (négligeable) par rapport à celui
observé
dans les cellules du muscle lisse, généralement inférieur d'un facteur 10 au
moins.
Les résultats présentés dans les exemples montrent à cet égard un différentiel
d'expression pouvant atteindre un facteur 140, ce qui témoigne de la
sélectivité
importante des promoteurs de l'invention. A cet égard, les résultats présentés
montrent également une forte spécificité à l'égard des cellules musculaires
lisses
puisque aucune expression n'a été détectée dans les cellules endothéliales qui
se
trouvent au voisinage, dans le vaisseau sanguin, notamment l'artère. Les
résultats
présentés dans les exemples montrent également que la force des promoteurs de
l'invention est bien supérieure à celle des promoteurs spécifiques non-
hybrides, le
différentiel pouvant dépasser un facteur 100. Ces éléments illustrent donc les
propriétés avantageuses et inattendues des promoteurs hybrides de l'invention,
en
terme de force et de spécificité, pour l'expression d'acides nucléiques
d'intérêt dans
les cellules du muscle lisse.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne une cassette d'expression
comprenant un acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt,
placé sous le contrôle d'un promoteur hybride tel que défini ci-avant.
Avantageusement, la cassette de l'invention comprend en outre un signal de
terminaison de la transcription, placé en 3' de l'acide nucléique.
Compte tenu des populations cellulaires ciblées par les cassettes de
l'invention, l'acide nucléique peut coder par exemple pour une protéine
choisie
parmi
- les protéines impliquées dans le cycle cellulaire, telles
que par exemple p21 ou toute autre protéine inhibitrice des kinases
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dépendantes des cyclines {cdk), le produit du gène du rétinoblastome (Rb),
GAX, GAS-l, GAS-3, GAS-6, Gadd 45, Gadd 153, les cyclines A, B et D.
- les protéines induisant fapoptose, telles que par
exemple p53, les membres de la famille des inducteurs d'apoptose tel que
Bas, Bcl-XS, Bad ou tout autre antagoniste de Bcl2 et de Bcl-X~.
- les protéines capables de modifier la prolifération des
cellules musculaires lisses, telles que par exemple un anticorps
intracellulaire ou un ScFv inhibant l'activité de protéines impliquées dans
la prolifération cellulaire, comme par exemple la protéine Ras, la map-
kinase, ou des récepteurs à la tyrosine-kinase ou aux facteurs de
croissance.
- des protéines de marquage (LacZ, GFP, Luc,
Phosphatase alcaline sécrétée (SeAP), hormone de croissance (GH) etc)
dans le but dc; réaliser des études de prolifération ou des études de
diagnostic,
- les protéines induisant l'angiogénèse, telles que par
exemple les membres de la famille du VEGF, les membres de la famille
du FGF et plus particulièrement FGF1, FGF2, FGF4, FGFS,1'angiogénine,
fEGF, le TGFa, le TGF(3, le TNFa, le Scatter Factor/HGF, les membres
de la famille des angiopoëtines, les cytokines et en particulier les
interleukines dont II,-l, IL-2, IL-8, l'angiotensine-2, l'activateur du
plasminogène (TPA), l'urokinase (uPA), les molécules impliquées dans la
synthèse de lipides actifs (prostaglandines, Cox-1 ).
- les facteurs de transcription, tels que par exemple les
récepteurs nucléaires naturels ou chimériques, comprenant un domaine de
liaison à l'ADN, un domaine de liaison au ligand et un domaine activateur
ou inhibiteur de la transcription, tels que par exemple les protéines de
fusion tetR-NLS-VP16, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux
oestrogènes, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux hormones
stéroîdiennes, les protéines de fusion dérivées des récepteurs aux
progestérones, les protéines du système CID {Chemical Inducer of
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Dimer~ization) décrit par Rivera et col. (Rivera et al. (1996), A humanized
system for pharmacologie control of gene expression, Nature Medecine, 2
1028-1032).
Il est entendu que la présente invention n'est pas limitée à des exemples
particuliers de protéines ou ARN, mais qu'elle peut ëtre utilisée par l'homme
du
métier pour l'expression de tout acide nucléique dans les cellules du muscle
lisse, par
de simples opérations d'expérimentation habituelles.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant un
promoteur hybride ou une cassette tels que définis ci-avant. Le vecteur de
l'invention
peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un
virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant, etc. Il
s'agit de
préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
Parmi les vecteurs de type plasmidique, on peut citer tous les plasmides de
clonage et/ou d'expression connus de l'homme du métier et qui comportent
généralement une origine de réplication. On peut citer également des plasmides
de
nouvelles génération portant des origines de réplication et/ou des marqueurs
perfectionnés tels que décrits par exemple dans les demandes W096/26270 et
PCT/FR96/01414.
Parmi les vecteurs de type virus recombinant, on peut citer préférentiellement
les virus adénovirus, rétrovirus, virus de l'herpès ou virus adéno-associés
recombinants. La construction de ce type de virus recombinants défectifs pour
la
réplication a été largement décrite dans la littérature, ainsi que les
propriétés
d'infection de ces vecteurs (voir notamment S. Baeck et K.L. March (1998),
Circul.
Research vol. 82, pp 295-305), T. Shenk, B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley
et al
(1996), Adenoviridae : the viruses and their replication (in virology). Pp 211-
2148,
EDS - Ravenspublishers/Philadelphia, P. Yeh et M. Perricaudet (1997), FASEB
Vol.
1 l, pp 615-623.
Un virus recombinant particulièrement préféré pour la mise en oeuvre de
l'invention est un adénovirus recombinant défectif.
Les adénovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36
(kilobases) kb environ. Il en existe différents sérotypes, dont la structure
et les
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propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique
comparable. Plus particulièrement, les adénovirus recombinants peuvent être
d'origine humaine ou animale. Concernant les adénovirus d'origine humaine, on
peut
citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les
adénovirus
de type 2 (Ad2), S (Ad5), 7 (Ad7) ou 12 (Adl2). Parmi les différents
adénovirus
d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adénovirus d'origine
canine, et
notamment toutes les souches des adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61
(ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adénovirus d'origine animale sont cités
notamment dans la demande W094/26914 incorporée à la présente par référence.
Le génome des adénovirus comprend notamment une séquence inversée
répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des
gènes
précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus
dans les
régions E1, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région E1
notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes
tardifs sont
contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été
entièrement
séquencé et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank
M73260).
De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7,
Adl2, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation comme vecteurs recombinants, différentes constructions
dérivées des adénovirus ont été préparées, incorporant différents gènes
thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié
de
manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi,
les
constructions décrites dans l'art antérieur sont des adénovirus délétés de la
région El,
essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les
séquences
d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gene ï 01 ( 1991 ) 195 ; Gosh-Choudhury et
al.,
Gene 50 ( 1986) 161 ). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur,
il a été
proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de
I'adénovirus.
Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant
ts 125,
permettant d'inactiver la protéine de 72kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der
Vliet
et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une déletion d'une autre région
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essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La
région E4 est
en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans
la stabilité
des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de
la
cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des
vecteurs
adénoviraux dans lesquel s les régions E 1 et E4 sont délétées possèdent donc
un bruit
de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De
tels
vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, W095/02697,
W096/22378). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène
IVa2 ont également été d~;crits (W096/10088).
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, fadénovirus
recombinant est un adénovirus humain du groupe C. De manière plus
préférentielle, il
s'agit d'un adénovirus Ad?. ou AdS.
Avantageusement, l'adénovirus recombinant utilisé dans le cadre de
l'invention comprend une; délétion dans la région EI de son génome. Encore
plus
particulièrement, il comprend une délétion des régions E 1 a et E 1 b. A titre
d'exemple
précis, on peut citer des délétions affectant les nucléotides 454-3328; 382-
3446 ou
357-4020 (par référence au génome de l'Ad5).
Selon une variante préférentielle, l'adénovirus recombinant utilisé dans le
cadre de l'invention comprend en outre une délétion dans la région E4 de son
génome. Plus particulièrement, la délétion dans la région E4 affecte
l'ensemble des
phases ouvertes. On peut citer à titre d'exemple précis les délétions 33466-
35535 ou
33093-35535. D'autres types de délétions dans la région E4 sont décrites dans
les
demandes W095/02697 et W096/22378, incorporées à la présente par référence.
La cassette d'expression peut être insérée en différents sites du génome
recombinant. Elle peut être insérée au niveau de la région El, E3 ou E4, en
remplacement des séquences délétées ou en surplus. Elle peut égelement être
insérée
en tout autre site, en dehors des séquences nécessaires en cis à la production
des virus
(séquences ITR et séquence d'encapsidation).
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Les adénovirus recombinants sont produits dans une lignée d'encapsidation,
c'est-à-dire une lignée de cellules capables de complémenter en trans une ou
plusieurs
des fonctions déficientes dans le génome adénoviral recombinant. Parmi les
lignées
d'encapsidation connues par l'homme du métier, on peut citer par exemple la
lignée
293 dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus
précisément, la lignée 293 est une lignée de cellules embryonnaires humaines
de rein
contenant l'extrémité gauche (environ 11-12 %) du génome de l'adénovirus
sérotype 5
(Ad5), comprenant fITR gauche, la région d'encapsidation, la région E 1,
incluant E 1 a
et E 1 b, la région codant pour la protéine pIX et une partie de la région
codant pour la
protéine pIVa2. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adénovirus
recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou
partie de
la région E 1, et de produire des stocks viraux ayant des titres élevés. Cette
lignée est
également capable de produire, à température permissive (32°C), des
stocks de virus
comportant en outre la mutation E2 thermosensible. D'autres lignées
cellulaires
capables de complémentc;r la région E 1 ont été décrites, basées notamment sur
des
cellules de carcinome de poumon humain A549 (W094/28152) ou sur des
rétinoblastes humains (Hum. Gen. Ther. (1996) 215). Par ailleurs, des lignées
capables de trans-complémenter plusieurs fonctions de l'adénovirus ont
également été
décrites. En particulier, on peut citer des lignées complémentant les régions
E 1 et E4
(Yeh et al., J. Virol. Vol" 70 (1996) pp 559-565; Cancer Gen. Ther. 2 (1995)
322 ;
Krougliak et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575) et des lignées complémentant
les
régions E1 et E2 (W094/28152, W095/02697, W095/27071).
Les adénovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de
l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules
après
environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36
heures). Pour
la mise en oeuvre du procédé, l'ADN viral introduit peut être le génome viral
recombinant complet, eventuellement construit dans une bacterie (W096/25506)
ou
dans une levure (W095/03400), transfecté dans les cellules. Il peut également
s'agir
d'un virus recombinant utilisé pour infecter la lignée d'encapsidation. L'ADN
viral
peut aussi être introduit sous forme de fragments portant chacun une partie du
génome viral recombinant et une zone d'homologie permettant, après
introduction
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dans la cellule d'encapsidation, de reconstituer le génome viral recombinant
par
recombinaison homologue entre les différents fragments.
Après la lyse des cellules, les particules virales recombinantes sont isolées
par
centrifugation en gradient de chlorure de césium. Une méthode alternative a
été
décrite dans la demande FR96:4$164 incorporée à la présente par référence.
L'invention concerne également une composition comprenant un vecteur tel
que défini ci-avant et un agent de transfert chimique ou biochimique. On
entend par
le terme "agent de transfert chimique ou biochimique" tout composé (i.e.,
autre qu'un
virus recombinant) facilitant la pénétration d'un acide nucléique dans une
cellule. Il
peut s'agir d'agents non viraux cationiques comme des lipides cationiques, des
peptides, des polymères (Polyéthylène Imine, Polylysine), des nanoparticules ;
ou
d'agents non viraux non cationiques comme des liposomes non cationiques, des
polymères ou des nanoparticules non cationiques. De tels agents sont bien
connus de
l'homme du métier.
L'invention concerne également une composition comprenant un virus
recombinant tel que défini précédemment et un véhicule physiologiquement
acceptable.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant
un vecteur tel que décrit ci-avant. Les compositions pharmaceutiques de
l'invention
peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale,
parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée,
intraoculaire,
transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules
pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable, en particuïier
pour
une injection intravasculaire ou dans les tissus du muscle lisse. II peut
s'agir en
particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure
de
sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels),
stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui,
par
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addition selon le cas d"eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent
la
constitution de solutés injectables. D'autres excipients peuvent être utilisés
tels que
par exemple un hydrogel. Cet hydrogel peut être préparé à partir de tout
polymère
(homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polyméres ont par
exemple été décrits dans la demande W093/08845. Certains d'entre eux, comme
notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont
commerciaux. L'utilisation d'un hydrogel est particulièrement avantageuse pour
le
transfert d'acides nucléiques dans les parois vasculaires, et notamment dans
les
cellules musculaires lisses des parois vasculaires. Les doses utilisées pour
l'injection
peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en
fonction
du mode d'administration utilisé, du but poursuivi (marquage, pathologie,
dépistage,
etc), du gène à exprimer, ou encore de la durée de 1 'expression recherchée.
D'une
manière générale, les virus recombinants selon l'invention sont formulés et
administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de
préférence
106 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir
infectieux d'une solution virale, et est déterminé par infection d'une culture
cellulaire
appropriée, et mesure du nombre de plages de cellules infectées. Les
techniques de
détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la
littérature. Pour une utilisation in vitro ou ex vivo, les cassettes, vecteurs
ou
compositions de l'invention peuvent être incubés à des doses classiques en
présence
des populations de cellules choisies. Ces incubations peuvent être réalisées
sur des
boites de culture, des flasques, des fermenteurs, ou tout autres dispositif
choisi.
Par ailleurs, l'invention concerne également toute cellule modifiée par une
cassette ou un vecteur (notamment un adénovirus) tels que décrits ci-avant. On
entend par cellule « modifiée » toute cellule contenant une construction selon
i'invention. Ces cellules peuvent être utilisées pour la production de
protéines
recombinantes in vitro. Elles peuvent également être destinées à une
implantation
dans un organisme, selon la méthodologie décrite dans la demande W095/14785.
Ces
cellules sont préférentiellement des cellules musculaires lisses humaines.
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L'invention concerne également l'utilisation d'un promoteur hybride tel que
défini ci-avant pour l'expression spécifique d'un acide nucléique dans les
cellules
musculaires lisses, in vitro, ex vivo ou in vivo.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un promoteur hybride tel que défini
ci-avant pour la préparation d'une composition destinée à l'expression d'un
acide
nucléique dans les cellules musculaires lisses in vivo et pas dans les
cellules
endothéliales qui se trouvent au voisinage dans l'artère.
En raison de leur caractère spécifique des cellules du muscle lisse, les
constructions selon l'invention sont également utilisables pour la création de
modèles
animaux de pathologies vasculaires ou pour la réalisation d'études de marquage
ou
dans des méthodes de détection ou de dépistage de la présence de cellules
musculaires lisses dans des échantillons.
La présente invention a encore pour objet un procédé de production de
protéines recombinantes comprenant l'introduction dans une population
cellulaire
d'un vecteur tel que défini ci-avant, la culture de ladite population
cellulaire
recombinante, et la récupération de ladite protéine produite. Avantageusement,
pour
la mise en oeuvre du procédé de l'invention, on utilise des cellules
musculaires lisses.
Il peut s'agir de lignées établies ou de cultures primaires.
La présente demande sera décrite plus en détails à l'aide des exemples qui
suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Tableau I : Activités relatives des promoteurs hybrides (hSMa-actine)
évaluées en transfections transitoires in vitro dans des cellules musculaires
lisses de
lapin en culture primaire (SMC lapin), dans des cellules ECV304, dans des
myoblastes C2C 12, dans des cellules HeLa, dans des cellules NIH 3T3, dans des
cellules de carcinome TIJ182, ainsi que dans les cellules rénales 293.
L'activité
relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité
luciférase
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obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE
est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. HnE-X : la
séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon
l'orientation opposée.
Tableau II : Activités relatives des promoteurs hybrides (mSM22) évaluées
en transfections transitoires in vitro dans des celluies musculaires lisses de
lapin en
culture primaire (SMC lapin), dans des cellules ECV304, dans des myoblastes
C2C12, dans des cellules HeLa, dans des cellules NIH 3T3, dans des celiules de
carcinome TU182, ainsi que dans les cellules rénales 293. L'activité relative
de
chaque promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue
avec
le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en
amont du promoteur X selon son orientation normale. HnE-X : la séquence
enhancer
de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée.
Figure 1 : Représentations schématiques des plasmides dont la cassette
d'expression contient le promoteur hybride hSMa-actine.
Figure 2 : Reprësentations schématiques des plasmides dont la cassette
d'expression contient le promoteur hybride mSM22a.
Figure 3 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfections
transitoires in vitro dans des cellules musculaires lisses de lapin en culture
primaire
(SMC de lapin), dans des cellules endothéliales issues d'un carcinome de
cordon
ombilical humain (ECV304), dans des myoblastes de souris (C2C12) ainsi que
dans
des cellules épithéliales issues d'un carcinome du col de l'utérus humain
(HeLa).
L'activité relative de chaque promoteur est exprimée en pourcentage de
l'activité
luciférase obtenue avec le plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer
de
hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon son orientation normale. hnE-
X
la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon
l'orientation opposée.
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Figure 4 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfections
transitoires in vitro dans des fibroblastes embryonnaires de souris (NIH 3T3),
dans
des cellules issues d'un carcinome ORL humain (TU182), ainsi que dans des
cellules
rénales embryonnaires humaines transformées (293). L'activité relative de
chaque
promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le
plasmide pCMV-leadTK. Enh-X : la séquence enhancer de hCMV-IE est clonée en
amont du promoteur X selon son orientation normale. hnE-X : la séquence
enhancer
de hCMV-IE est clonée en amont du promoteur X selon l'orientation opposée.
Figure 5 : Activités des promoteurs hybrides évaluées en transfert de gène in
vivo dans le muscle tibial cranial de souris C57BL6. L'activité relative de
chaque
promoteur est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase obtenue avec le
plasmide pCMV-leadTK.
MATERIELS ET METHODES
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les
extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN
piasmidique en
gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose, la
purification de
fragments d'ADN par électroélution, la précipitation d'ADN plasmidique en
milieu
salin par féthanol ou fisopropanol, la transformation dans Escherichia coli
sont bien
connues de l'homme de; l'art et sont abondamment décrites dans le littérature
(Sambrook et colt. "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring
Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
Le plasmide pGL3-Basic, utilisé pour les clonages des différentes régions
promotrices, est d'origine commerciale (Promega Corporation). Les plasmides
pCMV(3 (Clontech Laboratories Inc.) et pUCl8 (Boehringer Mannheim) sont
également d'origine commerciale.
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L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique d'ACP
(Amplification en Chaine par la Polymerase) peut être effectuée en utilisant
un DNA
thermal cyclerT~ (Perkin Filmer Cetus) selon les recommandations du fabricant.
L'électroporation d'ADN plasmidique dans des cellules d'Escherichia coli peut
être réalisée à l'aide d'un électroporateur (Bio-Rad) selon les
recommandations du
fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut ëtre effectuée par le
méthode développée par Sanger et coll. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 ( 1977)
5463-
5467) en utilisant le kit distribué par Applied Biosystems selon les
recommandations
du fabricant.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Construction de promoteurs hybrides et de plasmides
d'expression les contenant.
1.1. Promoteurs hSMa-active hybrides.
. Plasmide phSMact. L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été
préparé selon la méthode décrite par Sambrook et colt. ("Molecular Cloning, a
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989) à partir d'une culture primaire de cellules musculaire lisses aortiques
humaines
(Clonetics).
Cet ADN a été utilisé comme matrice pour une première amplification par
ACP utilisant les amorces suivantes
- Amorce 6417 (5' GATGGTCCCTACTTATGCTGCTA 3') (SEQ ID 1)
commençant à la position -1034 (région promotrice) du gène de l'a-active de
muscle
lisse spécifique humain ((Jeyama H. et coll., Mol. Cell. Biol., 4 (1984) 1073-
1078.
Accès Genbank D00618).
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- Amorce 6418 (S' CTTCCATCATACCAAACTACATA 3') (SEQ ID 2) en
position 1974 de la séquence D00618 se situant à l'interieur du premier intron
du
gène hSMact. Le mélange réactionnel comprend 1 mg d'ADN génomique, 10 pmoles
de chacune des deux amorces (6417 et 6418), 100 mM de chaque
désoxyribonucléotide (dA'CP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl2 et 5 unités de Taq
ADN polymérase (PerkinE;lmer). Le volume réactionnel est complété à 50 ml
ajusté à
la concentration optimale du tampon ACP recommandée par Perkin Elmer.
L'amplification ACP est réalisée dans des tubes MicoampTM (Perkin Elmer) à
laide d'un thermocycleur PTC-100TM (MJ Research, Inc.). Cette amplification
consiste en une étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min suivie de 30
cycles
comprenant une étape de dénaturation de 15 sec à 95°C, une étape
d'hybridation de 30
sec à 60°C et une étape d'extension de 1 min à 72°C. Ces trentes
cycles sont suivis
d'une extension supplémentaire de 5 min puis les réations ACP sont conservées
à
10°C.
Un microlitre de cette réaction a été prélevé de cette première réaction puis
dilué dans 10 ml d'eau. Ensuite 1 ml de cette dilution a été utilisé pour
réaliser une
seconde ACP dans les mèmes conditions que la première (ci-dessus) mais avec un
couple d'amorces différent
-Amorce 6453 (:S' CTGCTAAATTGctc~agGACAAATTAGACAAA 3')
(SEQ ID 3), cette amorce introduit un site XhoI (minuscules soulignées) en
amont du
promoteur hSMact (position -680).
- Amorce 6456 (5' CCCTGACAaagcttGGCTGGGCTGCTCCACTGG 3')
(SEQ ID 4), cette amorce introduit un site HindIiI en position +30 de hSMact.
Après analyse sur un gel d'agarose puis purification, le fragment d'ADN
amplifié par ACP est digéré pendant 3 heures à 37°C par Xhol et HindIII
puis cloné
dans le vecteur pGL3-Basic (Proméga) préalablement digéré par ces mëme enzymes
de restriction, pour générer le plasmide phSMact (Figure 1 ).
. Plasmides pXL3130 et pXL3131. Un fragment d'ADN correspondant à la
région enhancer du promoteur du gène IE du cytomégalovirus humain (hCMV-IE)
comprise entre les positions -522 et -b3 par rapport au site d'initiation de
la
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transcription, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide pCMV(3 comme
matrice
et les oligonucléotides 8557 (5' ATC GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA
CGG 3') (SEQ ID 5) et 8558 (5' ATC GAC GCG TCC GCT CGA GCG TCA ATG
GGG CGG AGT TG 3') (SEQ ID 6) comme amorces. Ce fragment a été digéré par
MIuI puis a été cloné dans le plasmide phSMact préalablement digéré par MIuI
et
traité par la phosphatase alcaline. Selon le sens d'insertion du fragment deux
plasmides différents ont été obtenus : nXL3130 et nXT.~ t ~ t t .PC
rPmrPePntatinnc
schématiques de ces plasmides sont rassemblées dans la figure (figure 1 ). Ces
plasmides comportent, sous forme d'un fragment MIuI-NcoI, un promoteur hybride
constitué de fenhancer du promoteur du gène hCMV-IE et du promoteur du gène
hSMa-actine.
1.2. Promoteurs mSM22 hybrides.
Plasmide pmSM22. L'ADN génomique de haut poids moléculaire a été
préparé selon la méthode décrite par Sambrook et colt. {"Molecular Cloning, a
Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1989) à partir d'un foie de souris Balbc.
Cet ADN a été utilisé comme matrice pour une amplification par ACP
utilisant les amorces suivantes
- Amorce 6517
(5' CCAGGCTGCAct, Çg~ACTAGTTCCCACCAACTCGA 3') (SEQ ID 7),
cette amorce introduit un site XhoI (minuscules soulignées) en position -436
du
promoteur du gène SM22 alpha de souris (Solway J. et coll., J. Biol. Chem.,
270
( 1995) 13460-13469 ; Accès Genbank L41161 ).
- Amorce 6518
(5' TCGTTTGaa~cttGGAAGGAGAGTAGCTTCGGTGTC 3') (SEQ ID 8),
cette amorce introduit un site HindIII en position +43 de mSM22 alpha.
Un mélange réactionnel comprenant 1 mg d'ADN génomique de souris, et 10
pmoles de chacune des deux amorces (6517 et 6518) a été préparé avec les mêmes
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réactifs que pour hSMact et aux mêmes concentrations, suivi d'une
amplification
ACP réalisée dans les mêmes conditions (voir exemple 1.1.).
Après analyse sur un gel d'agarose puis purification, le fragment d'ADN
amplifié par ACP est digéré pendant 3 heures à 37°C par XhoI et HindIII
puis cloné
dans le vecteur pGL3-Basic (Proméga) préalablement digéré par ces même enzymes
de restriction. Le plasmide résultant a été désigné pmSM22 (Figure 2).
. Plasmide pXL3I52 et pXL3153. Un fragment d'ADN correspondant à la
région enhancer du promoteur du gène hCMV-IE comprise entre les positions -522
et
-63 par rapport au site d"initiation de la transcription, a été amplifié par
ACP en
utilisant le plasmide pCM:V~i comme matrice et les oligonucléotides 8557 (5'
ATC
GAC GCG TGC CCG TTA CAT AAC TTA CGG 3') (SEQ ID 5) et 8558 (5' ATC
GAC GCG TCC GCT CCïA GCG TCA ATG GGG CGG AGT TG 3') (SEQ ID 6)
comme amorces. Ce fragment a été digéré par MIuI puis a été cloné dans le
plasmide
pmSM22 préalablement digéré par MIuI et traité par la phosphatase alcaline.
Selon le
sens d'insertion du fragment deux plasmides différents ont été obtenus :
pXL3152 et
pXL3153. Les représentations schématiques de ces plasmides sont rassemblées
dans
la figure 2. Ces plasmides comportent, sous forme d'un fragment MIuI-NcoI, un
promoteur hybride constitué de l'enhancer du promoteur du gène hCMV-IE et du
promoteur du gène mSM22.
1.3. Plasmide de contrôle pCMV-leadTK.
Le vecteur d'expression pCGN précedemment décrit par Tanaka et coll.(Cell ,
b0 (1990) 375-386) contient le promoteur CMV (-522/+72) fusionné au "leader"
du
gène tk de HSV (+51/+101) en amont d'une séquence codant pour fépitope de
fhémagglutinine. Le plasmide pCGN ( 10 ng) a été utilisé comme matrice pour
une
amplification ACP. La réaction ACP ainsi que l'amplification ont été réalisées
dans
les mêmes conditions que celles utilisées pour hSMact et mSM22 (exemples 1.1
et
1.2). Les amorces qui ont été utilisées sont les suivantes
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- Amorce 6718 (S' CCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCG 3')
(SEQ ID 9), cette amorce s'hybride avec le promoteur CMV en position -522 (8
nucléotides en aval du site EçoRI de pCGN).
- Amorce 6719 (5' gGGACGCGCTTCTACAAGGCGCTGGCCGAA 3')
(SEQ ID 10), cette amorce s'hybride jusqu'en position 101 du "leader" tk. Le
premier
nucléotides G en gras est destiné à restaurer le site NcoI de pGL3-Basic comme
sera
explicité ci dessous.
Le fragment d' ACP ainsi obtenu est purifié puis phosphorylé à l'aide de la
polynucléotide kinase du phage T4 (New England Biolabs). Parallèlement, le
vecteur
pGL3-Basic (Proméga) a été linéarisé par NcoI, purifié puis traité par la
Klenow
ADN polymérase (Boehringer Manheim) afin de remplir le site NcoI. Ce vecteur
est
ensuite déphosphorylé à l'aide de la phosphatase alcaline (Boehringer Manheim)
puis
utilisé pour l'insertion du fragment d' ACP phosphorylé. Ainsi, la guanosine
(G) de
l'amorce 6719 permet de restaurer le site NcoI uniquement lorsque le fragment
CMV-
leader tk est orienté avec la partie 5' (amorce 6718, position -522 du CMV) en
aval
du site HindIII de pGL3-Basic et son extrémité 3' (amorce 6719, leader tk) est
ligaturée au site NcoI de pGL3-Basic (premier ATG de la luciférase). Le
plasmide
ainsi obtenu est désigné pC;MV-leadTK.
EXEMPLE 2 : Spécificité des promoteurs hybrides in vitro.
Cet exemple illustre les propriétés de spécificité tissulaire des promoteurs
hybrides de l'invention in vitro.
2.1. Cultures cellulaires.
Les cellules musculaires lisses (SMC) de lapin sont cultivées en milieu
DMEMTM (Life Technologies Inc.) supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal
(SVF). Les cellules ECV304 sont cultivées en milieu 199TM (Life Technologies
Inc.)
supplémenté avec 10% de SVF. Les myoblastes C2C12, les cellules HeLa, les
cellules NIH 3T3 ainsi que les cellules TU 182 sont cultivées en milieu DMEMTM
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supplémenté avec 10% de SVF. Les cellules 293 sont cultivées en milieu MEMTM
(Life Technologies Inc.) supplémenté avec du pyruvate, des acides aminés non
essentiels et 10% de SVF. 'Toutes les cultures sont réalisées dans une étuve à
37°C, en
atmosphère humide et sous une pression partielle en COZ de 5%.
2.2. Transfections in vitro.
Les transfections sont réalisées en plaques 24 puits et chaque transfection
est
effectuée trois fois. Vingt quatre heures avant la transfection, les cellules
sont
ensemencées : (i) à 5x104 cellules par puits pour les cellules musculaires
lisses de
lapin, les cellules ECV304, NIH 3T3 et HeLa, (ü) à 105 cellules par puits pour
les
cellules TU182, (iii) à 3x104 cellules par puits pour les cellules C2C12, et
(iv) à
2x 1 OS cellules par puits pour les cellules 293.
Pour chaque puits, 500 ng d'ADN plasmidique (250 ng de plasmide d'intérêt et
250 ng de pUCl8) sont mélangés au lipide cationique RPR120535 B (WO 97/18185)
à raison de 6 nmoles de lipide par p.g d'ADN dans du milieu DMEMTM (20 pl
final)
comprenant 150 mM de NaCI et SO mM de bicarbonate. Après 20 minutes à
température ambiante, les 20 pl du mélange ADN/lipide sont mis en contact avec
les
cellules, en absence de SVF, durant 2 heures. Le milieu de culture est alors
supplémenté en SVF de manière à obtenir le pourcentage de SVF requis pour la
culture de chaque type cellulaire.
Quarante huit heures après la transfection, le milieu de culture est retiré et
les
cellules sont rincées deux fois avec du PBS (Life Technologies Inc.).
L'activité
luciférase est alors déterminée à l'aide du kit Luciferase Assay SystemTM
(Promega
Corporation) selon les recommandations du fournisseur.
2.3. Activités spécifiques des promoteurs hybrides.
Les activités luciférases relatives des promoteurs hybrides (par rapport au
promoteur pCMV-lead TIC) mesurées in vitro dans sept types cellulaires
différents,
sont rassemblées dans les figures 3 et 4, ainsi que dans les tableaux I et II.
Les
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résultats montrent que pour les promoteurs hSMact (Tableau I) et mSM22
(Tableau
II), l'activité relative est une valeur qui rend bien compte de la spécificité
de ces
promoteurs pour les cellules musculaires lisses ; spécificité qui a déjà été
décrite dans
la littérature (Skalli et coll,, J. Histochem. Cytochem., 37 {1989) 315-321 ;
Shimizu et
coll., J. Biol. Chem., 270 ( 1995) 7631-7643 ; Li et coll., J. Cell Biol., 132
( 1996) 849-
859). En effet, l'activité relative dans les SMC de lapin est au moins 5 fois
supérieure
à celles observées dans les autres types cellulaires : (i) de 5 à 20 fois
supérieure pour
le promoteur hSMact (Tableau I), et (ü) de 5 à 25 fois supérieure pour le
promoteur
mSM22 (Tableau II).
Les résultats présentés dans les tableaux I et II montrent clairement que,
dans
les cellules musculaires lisses, l'activité des quatre promoteurs hybrides
selon
l'invention (Enh-hSMact, hnE-hSMact, Enh-mSM22, et hnE-mSM22) est
comparable, en terme de force, à celle du promoteur CMV. D'autre part,
l'activité
relative de chacun de ces promoteurs, dans un autre type cellulaire, est au
moins 10
fois inférieure pour les promoteurs hybrides hSMact, et au moins 4 fois
inférieure
pour les promoteurs hybrides mSM22, que celle observée dans les cellules
musculaires lisses : (i) de 10 à 140 fois pour les promoteurs hybrides hSMact,
et (ü)
de 4 à 55 fois pour les promoteurs hybrides mSM22. Ces promoteurs hybrides
conservent donc la même spécificité tissulaire que celle observée pour les
promoteurs
spécifiques hSMact et mSM22.
Ces résultats montrent en outre que l'orientation de la région enhancer dans
les
promoteurs hybrides de l'invention n'a pas d'influence significative sur leur
activité.
Les quatre promoteurs hybrides possèdent donc, in vitro, une activité dans les
cellules musculaires lisses aussi importante que celle du promoteur CMV (qui
est
réputé pour être un promoteur fort), tout en conservant une spécificité
tissulaire
comparable, voire supérieure, à celle des promoteurs hSMact et mSM22.
EXEMPLE 3 : Spécificité des promoteurs hybrides in vivo.
Cet exemple illustre les propriétés de spécificité tissulaire des promoteurs
hybrides de l'invention in vivo.
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3.1. Transfert de gène dans le muscle squelettique.
Les différents plasmides ont été injectés, en intramusculaire, dans le muscle
tibial cranial de souris C57BL6 femelles agées de 5 semaines. Chaque plasmide,
dilué
dans une solution de Na(:1 à 150 mM final, est injecté à raison de 10 pg par
muscle.
Trois jours après injection, les muscles sont prélevés dans 2 ml de tampon
Cell
Culture Lysis ReagentrM (Promega Corporation), et broyés à l'aide d'un
homogénéiseur Diax (Heidolph). Le broyât est ensuite centrifugé durant 15
minutes à
4000 g, puis l'activité luciférase est évaluée à l'aide du kit Luciferase
Assay SystemTM
(Promega Corporation) selon les recommandations du fournisseur.
3.2. Activités des promoteurs hybrides dans le muscle squelettique in vivo.
Les activités relatives des deux promoteurs spécifiques (hSMact et mSM22)
ainsi que celles de deux des promoteurs hybrides de l'invention (Enh-hSMact et
Enh-
mSM22) ont également été évaluées in vivo après transfert d'ADN nu dans le
muscle
tibial cranial de souris. Les résultats rassemblés dans la figure 5 montrent
que
l'activité du promoteur Enh-hSMact est 100 fois inférieure à celle du
promoteur
CMV. De même, l'activité du promoteur Enh-mSM22 est 17 fois inférieure à celle
du promoteur CMV. Ainsi, la spécificité tissulaire observée in vitro, et
notamment
dans les cellules C2C 12 qui constituent le modèle le plus proche de celui
utilisé in
vivo, est donc conservée in vivo.
EXEMPLE 4 : Construction d'adénovirus recombinants exprimant la
protéine GAX sous contrôle de promoteurs hybrides spécifiques.
Cet exemple à pour but de décrire un vecteur adénoviral portant le gène
codant pour la protéine GAX opérationellement lié au promoteur hybride de
l'invention composé de l'enhancer CMV et du promoteur SMa-actine (enh-hSMact).
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Le gène gax humain comporte 912 paires de bases et code pour un facteur de
transcription de 303 acides aminés impliqué dans l'arrêt de la croissance
cellulaire
(growth-arrest-specific homeobox) et ayant un rôle sur la prolifération des
cellules
musculaires lisses humaines. Ce gène à homeodomaine a été initialement isolé
de
l'aorte et est exprimé en particulier dans les tissus cardiovasculaires
adultes (Gorski et
al. 1993).
La séquence du gène humain de gax a été cloner à partir d'une banque de
cDNA de muscle squelettique par PCR (Polymerase Chain Reaction) en utilisant
comme amorce une séquence dérivée du gène gax humain et publiée par Walsh et
al.
(Genomics (1994), 24, p535). La séquence a ensuite été clonée dans le vecteur
d'expression pXL3297. Ce plasmide est dérivé du plasmide Bluescript
(Stratagene)
contenant fenhancer/promoteur IE CMV humain (-522/+72) (Cell (1985), 41, p521)
et le poly A de SV 40 (2538-2759)(GenBank locus SV4CG).
La construction utilise le plasmide pXL3130 décrit dans l'exemple 1 (figure 1
)
dans lequel le promoteur SMa-actine avait été préalablement introduit. Le
plasmide
pXL3297 est un vecteur d'expression contenant le gène gax humain. Il a été
digéré
par les enzymes HindIII et AvrII afin d'introduire le gène gax humain dans le
plasmide précédent pXL3282 également digéré par les enzymes HindIII et AvrII
pour
donner le plasmide pXL 3300. Comme l'indique la figure 6, dans laquelle les
différentes étapes de la construction des plasmides décrites ci-dessus sont
détaillées,
le plasmide final, pXL3310 comporte une cassette d'expression consituée de
l'enhancer CMV-IE, le promoteur SMa-actine (pSMA), associés selon l'invention
et
opérationellement liés au gène codant pour la protéine GAX humaine ainsi que
le
signal de terminaison poly A de SV40.
La cassette d'expression du gène gax humain est ensuite introduite dans un
adénovirus humain recombinant de sérotype 5 (Ad5) délété des régions E1 et E3
par
co-transfection et recombinaison homologue entre le plasmide porteur de la
cassette
d'expression du gène gax et fadénovirus, en cellules d'encapsidation. Ces
cellules
sont de préférence la lignée 293. La production d'un stock d'adénovirus
contenant la
cassette d'expression du gène gax humain, résulte de la lyse des cellules
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d'encapsidation 2 ou 3 jours après l'infection et l'isolation des particules
virales
recombinantes par centrifugation en gradient de chlorure de césium.
Les particules virales sont ensuite utilisées pour étudier l'expression du
gène
gax humain sous le contrôle du promoteur de l'invention dans des cellules
musculaires lisses
L'expression de la protéine GAX est vérifiée 24 heures après l'infection des
cellules primaires musculaires lisses par immunofluorescence ou par western
blot en
utilisant les anticorps polyclonaux anti-gax de lapin.
L'expression des ARN messagers est analysée 24 heures après l'infection des
cellules musculaires lisses par dot blot et northern blot en utilisant un
oligonucléotide
dont la séquence est présente dans le gène gax.
L' analyse de l'activité biologique de fadénovirus codant pour le gène gax est
réalisée de la façon suivante
Des cellules musculaires lisses en phase de croissance exponentielle sont
infectées avec un adénovirus contenant le gène codant pour la protéine GAX
sous le
contrôle du promoteur enh-hSMact en l'absence et en présence de 125 ng de
lipofectine (plaques 48 puits) . Les adénovirus (dans des dilutions variables)
et la
lipofectamine sont incubés pendant 30 minutes à température ambiante dans un
milieu privé de sérum. Le mélange ou le virus seul est mis en contact avec les
cellules
pendant une heure à 37°C. A la fin de la période d'infection, le milieu
contenant le
virus est retiré et les cellules sont incubées en milieu DMEM contenant 0,5 %
de
SVF. Dans les 24 heures suivants (infection le milieu de culture est remplacé
par un
milieu de croissance pour la moitié des cultures et (incubation est poursuivie
48
heures pour permettre aux cellules d'entrer en phase S. Pour l'autre moitié
des
cultures, un milieu faiblement mitogène est ajouté pour maintenir les cellules
en
quiescence. Les cellules viables sont comptées 72 heures après l'infection en
utilisant
le protocole Alamar.
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LISTE DE SEQUENCES
<110> RHONE-POULENC RORER
<120> Utilisation de promoteurs spécifiques hybrides pour
controler l'expression tissulaire.
<130> Listage de séquences demande PCT
<140>
<141 >
<150> FR9812000
<151> 1998-09-25
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<21 1 > 23
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucléotide
<220>
<221> mise feature
<222> (1)..(23)
<400> 1
gatggtccct acttatgctg cta 23
<210> 2
<211> 23
<21 2> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonuc:léotide
<220>
<221> mise feature
<222> (1)..(23)
1
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<400> 2
cttccatcat accaaactac ata 23
<210> 3
<21 1 > 32
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonuc:Léotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (32)
<400> 3
ctgctaaatt gctcgaggac aaattagaca aa 32
<210> 4
<211> 33
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucl.éotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<400> 4
ccctgacaaa gcttggctgg gctgctccac tgg 33
<210> 5
<21 1 > 30
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la sêquence
artificielle:oligonucléotide
2
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<220>
<221> misc feature
<222> (1)__(30)
<900> 5
atcgacgcgt gcccgttaca taacttacgg 30
<210> 6
<211> 38
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucléotide
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(38)
<400> 6
atcgacgcgt ccgctcgagc gtcaatgggg cggagttg 3g
<210> 7
<211> 36
<21 2> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la sëquence
artificielle:oligonucl_êotide
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(36)
<400> 7
ccaggctgca ctcgagacta gttcccacca actcga 36
<210> 8
<21 1 > 36
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
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<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucléotide
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(36)
<400> 8
tcgtttgaag cttggaagga gagtagcttc ggtgtc
36
<210> 9
<211> 30
<21 2> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucléotide
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(30)
<400> 9
cccgttacat aacttacggt aaatç~gcccg 30
<210> 10
<211> 30
<21 2> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<221> mise feature
<222> (1)..(23)
<220>
<223> Description de la séquence
artificielle:oligonucléotide
<220>
<221> mise feature
<222> ( 1 ) . . ( 30)
<400> 10
gggacgcgct tctacaaggc gctggccgaa
4
