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NOUVEAUX AGENTS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES,
COMPOSITIONS LES CONTENANT ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention se rapporte à de nouveaux agents de transfert, les
compositions les contenant et leurs utilisations pour le transfert in vitro,
in vivo ou ex
vivo d'acides nucléiques dans les cellules.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer
efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une technique
de
base avec de nombreuses applications biotechnologiques. I1 peut s'agir du
transfert
d'acides nucléiques dans des cellules in vitro , par exemple pour la
production de
protéines recombinantes, ou au laboratoire pour l'étude de la régulation de
l'expression des gènes, le clonage de gènes ou tout autre manipulation
impliquant
l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des
cellules in
vivo, par exemple pour la réalisation de vaccins, des études de marquage ou
égaiement des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert de
gènes
dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration
ultérieure,
par exemple pour la création d'animaux transgéniques.
Actuellement, le moyen le plus répandu pour transférer des génes dans des
cellules est l'utilisation de vecteurs viraux. Mais ceux-ci n'étant pas
complètement
dénués de risques, plusieurs autres méthodes basées sur l'emploi de vecteurs
synthétiques ont été proposées. Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions
principales : complexer et compacter l'acide nucléique à transfecter, et
promouvoir
son passage à travers la membrane plasmique et éventuellement à travers les
deux
membranes nucléaires.
Plusieurs familles de vecteurs synthétiques ont été développées, comme par
exemple les polymères ou encore les vecteurs biochimiques (constitués d'une
protéine
cationique associée à un récepteur cellulaire), mais un progrès important a
surtout été
accompli en transfection non-virale avec le développement des Iipofectants, et
plus
particulièrement des lipides cationiques. Il a ainsi été mis en évidence que
les lipides
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cationiques, du fait de leur charge globale positive, interféraient
spontanément avec
l'ADN globalement négatif, formant des complexes nucléolipidiques capables de
fusionner avec les membranes cellulaires, et permettaient ainsi la libération
intracellulaire de l'ADN.
S Différentes sortes de lipides cationiques ont ainsi été synthétisés : des
lipides
comportant un groupement ammonium quaternaire (par exemple le DOTMA,
DOTAP, DMRIE, DLRIE...), des lipopolyamines comme par exemple Ie DOGS, le
DC-Chol ou encore les lipopolyamines divulguées dans la demande de brevet
WO 97/18185, des lipides associant à la fois un groupement ammonium
quaternaire
et une polyamine comme le DOSPA, ou encore des lipides comportant diverses
autres
entités cationiques, notamment des groupes amidinium (par exemple l'ADPDE,
ADODE ou les lipides de la demande de brevet WO 97/31935). En fait, la
diversité
structurelle des lipides cationiques reflète en partie l'observation de la
relation
structure-activité.
Toutefois, l'emploi de ces vecteurs synthétiques pose encore de nombreuses
difficultés, et leur efficacitë reste à améliorer. Notamment, il serait
souhaitable de
pouvoir disposer de vecteurs non-cationiques ou moins cationiques , et ce poux
différentes raisons
- les complexes formés entre l'acide nucléique et les agents de transfert, du
fait de
leur charge globale positive, ont tendance à être captés par le système
réticuloendothélial ce qui induit leur élimination,
- du fait de la charge globale positive des complexes formés, les protéines du
plasma
ont tendance à s'adsorber à leur surface, et il en résulte une perte du
pouvoir de
transfection,
- dans un contexte d'injection locale, la présence d'une charge globale
positive
importante empèche la diffusion des complexes d'acides nucléiques en dehors du
site
d'administration , car les complexes s'adsorbent sur les matrices
extracellulaires. Les
complexes ne peuvent donc plus atteindre les cellules cibles, ce qui, par voie
de
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conséquence, entraîne une diminution de l'efficacité de transfert par rapport
à la
quantité de complexes injectée,
- et enfin, de nombreux acteurs du domaine de la transfection non-virale de
gènes ont
signalés que les lipides ou polymères cationiques ont un effet inflammatoire.
Par ailleurs, la formulation stable des vecteurs synthétique développés
jusqu'à
aujourd'hui à de faibles rapports de charges est en général difficile, voire
impossible,
et il a été constaté en outre qu'à faible rapport de charges, l'efficacité de
transfert est
souvent faible (Pitard et ai., PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997). Dans
toute la
suite, "rapport de charge" signifie le rapport des charges positives de
l'agent de
transfert sur les charges négatives de l'ADN. Ce rapport est souvent exprimé
en
nmoles d'agent de transfert par pg d'ADN.
Ce sont ces problèmes que les nouveaux agents transfectants mis au point par
la demanderesse, et qui font l'objet de la présente invention, se proposent de
résoudre.
En effet, leur structure particulière forme une ancre hydrophobe liée d'une
part à un
polycation qui permet la formation de complexes avec les acides nucléiques et
d'autre
part à au moins une tëte hydrophile qui permet de diminuer la densité de
charge
globale apparente de ces agents transfectants par rapport aux lipides ou aux
polymères
cationiques classiquement utilisés en transfection non-virale. La présence
d'au moins
une tête hydrophile crée une sorte d'« écran de charges » par diminution du
potentiel
zéta des complexes formés avec l'acide nucléique. Ainsi, lesdits complexes
apparaissent moins cationiques à l'organisme, avec les conséquences bénéfiques
qui
en découlent. De plus, il a été montré que les agents transfectants selon la
présente
invention sont particulièrement avantageux d'un point de vue physico-chimique
car ils
sont particulièrement stables lorsqu'ils sont mis en contact avec des acides
nucléiques
à de faibles rapports de charge.
Ainsi, un premier objet de l'invention concerne de nouveaux agents de
transfert d'acides nucléiques qui comprennent un espaceur hydrophobe lié
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chimiquement d'une part à un polycation et d'autre part à au moins un
substituant
hydrophi le.
Le polycation permet de former des complexes avec les acides nucléiques par
interractions avec les charges anioniques des acides nucléiques. L'espaceur
hydrophobe a une double fonction. Il permet d'une part le passage à travers
les
membranes cellulaires, et d'autre part, il rend les complexes formés avec les
acides
nucléiques viables en milieu biologique. En effet, l'espaceur hydrophobe crée
une
contrainte physique sur les complexes qui permet de protéger les acides
nucléiques du
milieu extérieur. L'hydrophobicité nécessaire pour que les complexes soient
viables
peut être aisément déterminée par l'homme du métier, par application des
méthodes
de recherche ordinaires ou par la méthode habituelle des tâtonnements. Enfin,
la
présence du ou des substituants hydrophiles permet de diminuer le potentiel
zéta des
complexes formés, ce qui fait apparaître lesdits complexes moins cationiques
au
milieu extérieur.
Au sens de l'invention, le polycation est une molécule linéaire ou ramifiée
polycationique susceptible de s'associer avec les acides nucléiques. On entend
au sens
de l'invention par association avec l'acide nucléique, tout type de liaisons
comme par
exemple les liaisons covalentes, les inteiractions électrostatiques, ioniques,
les ponts
hydrogène etc... De préférence, le polycation est une polyamine linéaire ou
ramifiée,
chaque groupe amino étant séparé par un ou plusieurs groupes méthylène.
Éventuellement, la polyamine peut en outre être substituée par d'autres
fonctions
cationiques, par exemple des groupes amidinium ou guanidinium, des guanidines
cycliques etc... Il peut s'agir notamment d'un polycation tel que défini dans
les
demandes de brevet WO 96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935, WO 98/54130 ou
encore WO 99/51581, et plus généralement dans toute la littérature concernant
des
structures de lipides cationiques connue de (homme du métier. Selon un aspect
préféré de l'invention, le polycation représente une polyamine de formule
générale (II)
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R3
~N /Ri
~CH,)P ~ \(CH,)m , nN\ (II)
R,
dans laquelle
- R" R, et Rj représentent indépendamment les uns des autres un atome
d'hydrogène
ou un groupement (CHZ)qNR'R" avec q un nombre entier pouvant varier de 1 à 6,
ceci
5 de manière indépendante entre les différents groupements R,, R~ et R3, étant
entendu
que l'un au moins de R" R, et R3 est différent d'un atome d'hydrogène,
- R' et R" représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou
un
groupement (CH~)qNH, avec q défini comme précédemment,
- m représente un nombre entier compris entre 1 et 6, et
- n et p représentent indépendamment l'un de l'autre des nombres entiers
compris
entre 0 et 6, avec lorsque n est supérieur ou égal à 2, m pouvant prendre des
valeurs
différentes et R, des significations différentes au sein de la formule
générale (II), et
iorsque n est égal à 0, l'un au moins des substituants R, et R~ est différent
d'un atome
d'hydrogène.
D'autres polycations possibles peuvent être également choisis parmi la
spermine, la
spermidine, la cadavérine, la putrescine, l'hexamethylènetétramine (hexamine),
le
chlorure de méthacrylamidopropyl-triméthylammonium (AMBTAC), le chlorure de
3-acrylamido-3-méthylbutyltriméthylammonium (AMBTAC), les polyvinylamines,
les polyéthylèneimines, ou encore les ionènes. (références : Barton et al.,
Comprehensive Organic Chernistry, Vol. 2, Ed. Pergamon Press, p. 90 ;
Encyclopedia
of Polvmer Science and Engineering, 2"° Édition, Ed. Wiley
Interscience, Vol. 1 l, p.
489 ; Mahler and Cordes, Biological Chemistr~.~, Harper International Édition,
p. 124.)
L'espaceur hydrophobe peut prendre des structures très variées du moment
qu' il apporte une hydrophobicité suffisante pour permettre la protection des
acides
nucléiques et le passage à travers les membranes. Cette hydrophobicité
suffisante peut
être déterminée par l'homme du métier en appliquant des méthodes de recherche
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ordinaires. Selon une variante préférée de l'invention, l'espaceur hydrophobe
est
constitué de 2 ou 3 chaînes grasses linéaires hydrocarbonées (c'est-à-dire
entre 10 et
20 atomes de carbone par chaïne, et de préférence 12, 14, 15, 16, I 7, ou 18
atomes de
carbone par chaîne, chaque chaîne pouvant être de longueur différente). Selon
une
autre variante, l'espaceur hydrophobe est constitué d'une très longue chaïne
grasse
linéaire hydrocarbonée, c'est-à-dire comprenant entre 20 et 50 atomes de
carbone, et
de préférence entre 40 et SO atomes de carbone et encore plus
préférentiellement entre
44 et 50 atomes de carbone).
Des substituants hydrophiles convenables sont par exemple choisis parmi les
substituants hydroxy, amino, les polyols, les sucres, ou encore les peptides
hydrophiles. On entend par polyol toute molécules hydrocarbonée linéaire,
ramifiée
ou cyclique comprenant au moins deux fonctions hydroxy. On peut citer à titre
d'exemple le glycérol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, les tétritols,
les
pentitols, les pentitols cycliques {ou quercitols), les hexitols comme le
mannitol, le
sorbitol, les dulcitols, les hexitols cycliques ou inositols etc...(Stanek et
al., The
Monosaccharidess Academic Press, pp. 621-655 et pp. 778-855).
Selon une variante avantageuse, les agents de transfert selon l'invention
comprennent au moins un substituant hydrophile qui est un sucre. On entend au
sens
de l'invention par "sucre", toute molécule constituée d'un ou plusieurs
saccharides.
On peut citer à titre d'exemple des sucres tels que les pyranoses et les
furanôses, par
exemple Ie glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose, Ie fructose, ou
encore le
maltose, le lactose, le saccharose, le sucrose, le fucose, le cellobiose,
fallose, le
Iaminarabiose, le gentiobiose, le sophorose, le mélibiose etc... De
préférence, Ie ou les
sucres sont choisis parmi le glucose, le mannose, le rhamnose, le galactose,
le
fructose, le lactose, le saccharose et le cellobiose. De plus, il peut
également s'agir de
sucres dits "complexes", c'est-à-dire de plusieurs sucres couplés covalemment
les uns
aux autres, chaque sucre étant de préférence choisi dans la liste citée
précédemment.
A titre de polysaccharides convenables, on peut citer le dextran, l'a-amylose,
l'amylopectine, les fructans, les mannans, les xylans et les arabinans.
Certains sucres
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préférés peuvent en outre interagir avec des récepteurs cellulaires, comme par
exemple certains types de lectines.
Plus particulièrement, les agents de transfert selon l'invention peuvent être
représentés par la formule générale (I)
0
/(CZZ)X X
R N (I)
~(CZ,)~ Y
pour laquelle
- R représente un polycation,
- Z représente un atome d'hydrogène ou un atome de fluor, les différents Z
étant
indépendant Ies uns des autres, et
- soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers
compris
entre 10 et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent
un
atome d'hydrogène, un groupement -OAIk où Alk représente un alkyle droit ou
ramifié contenant 1 à 4 atomes de carbone, un groupe hydroxy, un groupement
amino,
un polyol, un sucre, un peptide hydrophile ou non-hydrophile, ou un
oligonucléotide,
étant entendu que l'un au moins des substituants X et Y représente un groupe
hydrophile choisi parmi les hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou
les peptides
hydrophiles,
- soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et S0, X est soit
un atome
d'hydrogène soit un groupement -OAIk où Alk représente un alkyle droit ou
ramifié
contenant 1 à 4 atomes de carbone, et Y est un groupe hydrophile choisi parmi
les
hydroxy, les amino, les polyols, les sucres, ou les peptides hydrophiles.
Au sens de l'invention, le polycation, les polyols et les sucres de la formule
générale (I) sont tels que définis précédemment.
Les termes x et y sont définis dans la formule générale (I) de façon à prendre
toute valeur comprise entre 10 et 22 inclus ou entre 20 et SO inclus selon les
cas. De
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préférence, x et y, indépendamment l'un de l'autre, sont compris entre 12 et
18 inclus.
Plus préférentiellement, x et y valent, indépendamment l'un de l'autre, 14,
15, 16, 17
ou 18. Lorsque x est égal à 0 ou l, alors y est compris de préférence entre 30
et 50, ou
entre 40 et 50. Plus préférentiellement, y est compris entre 44 et 50.
On entend au sens de l'invention par "oligonucléotide" des chaînes contenant
un ou plusieurs nucléotides, désoxynucléotides, ribonucléotides et/ou
désoxyribonucléotides qui sont des unités monomériques se différenciant les
unes des
autres par la présence de bases qui peuvent ëtre choisies parmi l'adénine, la
guanïne,
la cytosine, la thymidine ou furacile [voir Lehninger Biochimie, Flammarion
Medecine Sciences, 2nde édition, p. 305-329]. Du fait de leur propriété à
former des
paires de base, les oligonucléotides sont largement utilisés en biologie
moléculaire,
par exemple comme linkers (molécule de liaison) ou comme sondes.
Par ailleurs, les oligonucléotides peuvent aussi être utilisés sous forme de
conjugués,
c'est-à-dire couplés à une ou plusieurs autres molécules ayant des propriétés
distinctes. A titre d'exemple, on peut citer le couplage d'un oligonucléotide
avec un
groupe chimique réactif, avec des groupes fluorescents ou chimioluminescents,
ou
encore avec des groupes susceptibles de favoriser les interractions
intermoléculaires
de façon à promouvoir l'entrée dans les cellules. De tels conjugués, décrits
dans
Bioconjugate Chemistry [John Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and
Modified Oligonucleotides : a IZeview of their Synthesis and properties, Vol.
I, N°3,
1990, pp. 165-187], possèdent de nombreuses utilisations et avantages comme
par
exemple la capacité d'améliorer l'entrée de complexes dans les cellules, de
diminuer le
taux de dégradation par les nucléases, d'augmenter la stabilité du complexe
concerné,
de suivre le devenir des oligonucléotides dans un organisme etc... Ainsi, le
ou les
oligonucléotides, lorsqu'ils sont greffés sur les agents de transfert selon la
présente
invention, permettent d'apporter une propriété supplémentaire aux dits agents
de
transfert (par exemple des propriétés de ciblage, de marquage etc...).
Les oligonucléotides peuvent être obtenus selon les méthodes classiques
connues de
(homme du métier, et il est également possible de synthétiser des
oligonucléotides
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modifiés selon les méthodes décrites dans Bioconjugate Chemistry, John
Goodchild,
Conjugales of Oligonucleotides and Modifred Oligonarcleotides : a Review of
their-
Synthesis and properties, Vol. l, N°3, 1990, pp. 165-187 ou dans
Tetrahedron,
Beaucage et al., The Svnthesis of Modified Oligontrcleotides bv the
Phosphoramiditeb
Approach and Their Application, Vol. 49, N° 28, pp. 6I23-6194,
1993.
On entend au sens de l'invention par "peptide" des chaînes contenant un ou
plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons de nature peptidique
[Lehninger
Biochimie, Flammarion Medecine Sciences, 2nde édition]. Il peut s'agir des 20
acides
aminés "classiques", c'est-à-dire ceux trouvés couramment dans la composition
des
protéines (Alamine, Valine, Leucine, Isoleucine, Proline, Phenylalamine,
Tryptophane, Méthionine, Acide Aspartique, Glutamine, Lysine, Arginine,
Histidine,
Glycine, Sérine, Thréonine, Cystéine, Tyrosine, Asparagine, Acide Glutamique),
ou
bien il peut aussi s'agir des acides aminés dits "rares" comme par exemple la
4-
hydroxyproline, la desmosine, la 5-hydroxylysine, la N-méthyllysine, la 3-
méthylhistidine, fisodesmosine etc... Enfin, il peut également s'agir des
acides aminés
apparaissant dans différentes cellules ou divers tissus sous forme libre ou
combinée et
qui dérivent en général des acides a-aminés (par exemple la (3-alamine,
l'acide y-
aminobutyrique, fhornocystéine, fornithine, la canavanine, l'acide
djenkalique, la ~i-
cyanoa(amine etc...). De tels peptides peuvent par exemple permettre le
ciblage de
certains types celiulaires. Dans ce contexte, on peut par exemple citer les
peptides
RGD ou NLS. II peut également s'agir séquences peptidiques ayant des
propriétés de
marquage, c'est-à-dire permettant l'identification, par exemple par des
techniques
d'analyse comme la spectrométrie de fluorescence, la spectrométrie infrarouge,
la
résonance magnétique nucléaire (RMN) etc... On peut par exemple citer à ce
titre les
séquences peptidiques ou pseudopeptidiques linaires ou cycliques comportant
fépitope Arg-Gly-Asp (Arginine-Glycine-Acide Aspartique) de reconnaissance des
récepteurs primaires et/ou secondaires des protéines d'adhésion du type
intégrines.
Les peptides selon l'invention peuvent en outre ëtre substitués au niveau de
un ou
plusieurs de leurs groupes fonctionnels, par exemple au niveau du carboxyle en
a, de
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la fonction amine en a et/ou au niveau des groupes fonctionnels de la chaîne
latérale
de chacun des acides aminés. A titre d'exemple, on peut citer les
substitutions par des
groupements aliphatiques saturés ou insaturés, linéaires, ramifiés ou
cycliques
contenant 1 à 24 atomes de carbone, tels que par exemple des radicaux
cholestéryle,
5 arachidonyle ou rétinoyle, ou encore des groupements mono- ou
polyaromatiques tels
que par exemple des dérivés benzyloxycarbonyle, benzylester ou rhodaminyle
substitués ou non. L'intérêt de telles substitutions s'inscrit dans le cadre
de
modification des propriétés chimiques et éventuellement biologiques desdits
peptides,
par exemple afin de les marquer.
10 Lorsque lesdits peptides sont utilisés à titre de substituant hydrophile,
ceux-ci sont
choisis parmi les peptides hydrophiles, c'est-à-dire les peptides constitués
uniquement
d'acides aminés hydrophiles ou encore ceux composés partiellement d'acides
aminés
hydrophiles et dont la composition les rend globalement hydrophiles.
Selon une variante préférée de l'invention, les groupes Z représentent tous
des
atomes d'hydrogène.
Selon un aspect plus particulièrement avantageux de l'invention, les agents de
transfert sont de formule générale (III)
O
R~ N/(CH~)X X
/ \ (III)
~(CH,)~ Y
pour laquelle
- R représente un polycation, et
- soit x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers
compris entre 10
et 22 inclus, et X et Y, indépendamment l'un de l'autre, représentent un atome
d'hydrogène ou un sucre, étant entendu que i'un au moins des substituants X et
Y
représente un sucre,
- soit x est égal à 0 ou 1, y est un entier compris entre 20 et 50, X est un
atome
d'hydrogène et Y est un sucre.
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Au sens de l'invention, le polycation, les sucres et x et y dans la formule
générale (III} sont tels que définis précédemment pour la formule générale
(I).
Des agents de transfert plus particulièrement préférés sont de formule
générale
(III) et x et y, indépendamment l'un de l'autre, représentent des entiers
compris entre
S 10 et 22 inclus, et l'un de X et Y représente un atome d'hydrogène et
l'autre un sucre.
Selon une autre variante avantageuse, les agents de transfert selon
l'invention sont de
formule générale (III) et x est égal à 0, y est un entier compris entre 40 et
50, X
représente un atome d'hydrogène, et Y est un sucre.
Il est entendu que la présente invention concerne également les isomères des
produits de formule générale (I) lorsqu'ils existent, ainsi que leurs
mélanges, ou leurs
sels.
Notamment, les composés de l'invention peuvent se présenter sous forme de
sels non toxiques et pharmaceutiquement acceptables. Ces sels non toxiques
comprennent les sels avec les acides minéraux (par exemple l'acide
chlorhydrique,
sulfurique, bromhydrique, phosphorique, nitrique), avec les acides organiques
(acide
acétique, propionique, succinique, maléfique, hydroxymaléique, benzoïque,
fumarique, méthanesulfonique ou oxalique), avec les bases minérales (soude,
potasse,
lithine, chaux), ou avec les bases organiques (amines tertiaires comme la
triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine).
Selon l'invention, la préparation des produits de formule générale (I)
s'effectue
en mettant en oeuvre les étapes suivantes
I ) On prépare dans un premier temps une chaîne alkyle à x atomes de carbone
(x étant défini comme précédemment), comportant une fonction hydroxy et une
fonction ester, par ouverture d'une lactone correspondante. La réaction
s'effectue
généralement dans un alcool, à pH basique et à une température comprise entre -
10°C
et la température ambiante. A titre d'exemple, l'alcool peut être le méthanol
ou
féthanol.
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2) Puis, on fixe le groupe X sur la chaîne alkyle bifonctionnelle obtenue à
l'étape précédente. Lorsque X représente un sucre, on effectue une
condensation dans
un solvant chloré, comme par exemple le dichlorométhane ou le chloroforme, et
en
présence d'un acide de Lewis, à température comprise entre -S°C et
10°C. L'acide de
Lewis peut par exemple être choisi parmi le chlorure d'étain, le chlorure de
fer, l'acide
p-toluène sulfonique (tsOH), le triméthylsillyltrifluorométhane sulfonique
(TMStf), le
trifluorure de bore étherate etc...[Kazunobu Toshima et al., Recent Progress
in O-
glcosilation Methods and its Application to Natural Products Svnthesis~ Chem.
Rev.
1993, Vol. 93, pp. 1503-1531].
Lorsque X représente un groupe peptidique hydrophile ou non, on effectue un
couplage peptidique selon les méthodes classiques (Bodanski M., Principles and
Practices of Peptides Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode
analogue
connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en
présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables,
à
température comprise entre 0 et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et
11. A titre
d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone,
l'acétonitrile,
le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme
solvant. Les
bases non-nucléophiles employées sont préférentiellement des amines
tertiaires, du
carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus
préférentiellement,
les bases utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la
triéthylamine
(TEA) ou le N-éthyldüsopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique
est
effectué entre 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C.
Lorsque l'on souhaite que X représente un groupe hydroxy, cette étape n'est
pas
effectuée.
Lorsque X représente un groupe amino, la réaction est effectuée par
substitution
nucléophile selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier qui
permettent d'obtenir une amine à partir d'un alcool.
Lorsque X représente un groupe -OAIk, on effectue une alkylation de la
fonction
alcool selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier ou selon des
méthodes analogues. Par exemple, on peut faire réagir un composé diazo de
formule
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générale Alk-N, éventuellement en présence d'un catalyseur tel que HBF~ ou du
gel
de silice. On peu également opérer dans les conditions de la Réaction de
Williamson
qui consiste à faire réagir en milieu basique un composé de formule générale
Alk-HaI
où Hal représente un atome d'halogène tel que le chlore, le brome ou l'iode,
sur ia
chaîne portant une fonction alcool.
La même réaction de type Williamson peut également être mise en oeuvre
lorsqu'on
souhaite que X représente un polyol.
Enfin, lorsque X représente un oligonucléotide, celui-ci est couplé à la
chaîne
bifonctionnelle selon les méthodes classiques connues pour greffer covaiemment
un
oligonucléotide. Par exemple, ledit oligonucléotide peut être greffé par
l'intermédiaire
d'un linker (molécule de liaison) convenable.
3) Dans un troisième temps, la fonction ester présente sur la chaîne
bifonctionnelle est hydrolysée en fonction acide selon les méthodes connues.
Par
exemple, on peut opérer en milieu basique dans un alcool à haut point
d'ébullition, à
température comprise entre 50°C et la température de reflux du mélange
réactionnel.
4) Puis, une chaîne alkylamine substituée ou non de formule générale (IV)
H,N-(CH,)y-Y (IV)
dans laquelle y et Y sont définis comme précédemment, est couplée au composé
obtenu à l'étape précédente, seion les méthodes de couplage peptidique
classiques
(Bodanski M., Pninciples and Practices of Peptides Svnthesis, Ed. Springe-
Verlag) ou
par toute méthode analogue connue de l'homme du métier.
Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non-
nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise
entre 0
et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le
chloroforme, la
2~ diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, facétonitrile, le dichlorométhane,
le
toluëne ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non-
nucléophiles employées sont préférentiellement des amines tertiaires, du
carbonate de
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calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases
utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA)
ou le
N-éthyldüsopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué
entre
0 et 50°C, et de préférence entre I 0 et 30°C.
Le groupe de formule générale (IV) est soit disponible dans le commerce, soit
il peut
être obtenu par condensation de Y sur l'alkylamine non-substituée
correspondante
selon une méthode analogue à celle décrite précédemment en 2).
S) L'amide obtenue à l'étape précédente est ensuite réduite en amine. On opère
pour cela selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier. Par
exemple,
on opère dans un solvant organique anhydre comme le tétrahydrofuranne anhydre,
par
action d'hydrure de lithium aluminium LiAlH4. D'autres agents réducteurs
pouvant
être utilisés sont par exemple le borane, le borane dans le diméthylsulfure
(BH3-
SMe2), le borohydrure de sodium/tétrachlorure de titane (NaBH4, TiCl4), le
chlorure
d'oxyde de phosphore sur Zinc (POCI,/Zn), le pentasulfure de phosphore (P4S,o)
sur
1 S nickel de Raney, etc... [Richard C. Larock, Comprehensive Organic
Transformations,
VCH Publishers Inc., 19$9]. On peut également opérer par hydrogénation
catalytique.
Avantageusement, la réduction est effectuée par action d'hydrure de lithium
aluminium LiAIHa, dans du tétrahydrofuranne anhydre, à température de reflux
du
mélange.
On obtient ainsi un composé de formule générale (V)
/(CH~)X X
HN (V)
~ (CH,),-Y
pour laquelle X, Y, x et y sont définis comme précédemment.
6) Enfin, dans une dernière étape, le dérivé acide correspondant au polycation
R tel que défini précédemment, est couplé au composé de formule générale (IV)
2S obtenu à l'étape précédente, selon les méthodes de couplage peptidique
classiques
(Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Svnthesis, Ed. Springe-
Verlag) ou
par toute méthode analogue connue de l'homme du métier.
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WO 00/32803 PCT/FR99/02995
Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non-
nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise
entre 0
et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le
chloroforme, la
diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, facétonitrile, le dichlorométhane, le
5 toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non-
nucléophiles employées sont préférentiellement des amines tertiaires, du
carbonate de
calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases
utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la triéthyiamine (TEA)
ou le
N-éthyldüsopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué
entre
10 0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C.
Les dérivés acides correspondant au polycation sont disponibles
commercialement.
Selon une autre variante, les agents transfectants selon la présente invention
peuvent être préparés en opérant de la façon suivante
1 ) On prépare dans un premier temps une chaïne alkyle à x atomes de carbone
1 S (x étant défini comme précédemment), comportant une fonction hydroxy et
une
fonction ester, par ouverture d'une lactone correspondante. La réaction
s'effectue
généralement dans un alcool, à pH basique et à une température comprise entre -
10°C
et la température ambiante. A titre d'exemple, l'alcool peut être le méthanol
ou
l'éthanol.
2} Puis, on effectue sur cette chaîne alkyle bifonctionnelle le couplage d'une
chaîne alkylamine substituée ou non de formule générale (IV)
H,N-(CHZ)~ Y (IV)
dans laquelle y et Y sont définis comme précédemment dans la formule générale
(I).
La réaction s'effectue à une température supérieure au point de fusion de
chaque
produit, avec ou sans vide. La réaction peut également être mise en oeuvre à
la
température de reflux en présence d'un solvant alcoolique. A titre d'exemple,
le
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solvant peut être le méthanol ou l'éthanol. On opère par exemple à température
comprise entre 45°C et 60°C.
La réaction peut également être menée à température de reflux du mélange en
présence d'un alcool tel que le méthanol à titre de solvant. Une autre
alternative
consiste à effectuer le couplage du composé de formule générale (IV)
directement
avec la lactone (dans ce cas, la première étape d'ouverture de la lactone
n'est pas
effectuée).
Le groupe de formule générale (IV) est soit disponible dans le commerce, soit
il peut
être obtenu par condensation de Y sur l'alkylamine non-substituée
correspondante
selon une méthode analogue à celle décrite ci-avant.
3) l'amide bicaténaire bifonctionnelle obtenue est ensuite réduite en amine.
On
opère pour cela selon des méthodes classiques. Par exemple, on opère dans un
solvant
organique anhydre comme le tétrahydrofuranne anhydre, par action d'hydrure de
lithium et d'aluminium (LiAIH~). D'autre agents réducteurs qui peuvent être
utilisés
sont par exempte le borane, le diméthyle de sulfure d'hydrure de bore (BH~-
SMe,), le
borohydrure de sodium/tétrachlorure de titane (NaBH4, TiCI~), le chlorure
d'oxyde de
phosphore sur Zinc (POC13/Zn), le pentasulfure de phosphore (P~S,o) sur nickel
de
Raney, etc... [Richard C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH
Publishers Inc., 1989]. On peut également opérer par hydrogénation
catalytique.
Avantageusement, la réduction est effectuée par action d'hydrure de lithium
aluminium LiAlH4, dans du tétrahydrofuranne anhydre, à température de reflux
du
mélange.
On obtient ainsi un composé de formule générale (VI)
/(CH,)~ OH
HN (VI)
~ (CH,)~ Y
pour laquelle Y, x et y sont définis comme précédemment.
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4) Puis, on condense le groupe X sur l'amine de formule générale (VI)
obtenue à l'étape précédente. La condensation est effectuée selon des méthodes
analogues à celles décrites précédemment pour la première voie de synthèse.
5) Enfin, dans une dernière étape, le dérivé acide correspondant au polycation
R tel que défini précédemment, est couplé au composé de formule générale (VI)
obtenu à l'étape précédente, selon les méthodes de couplage peptidique
classiques
(Bodanski M., Principles and Practices of Peptides Svnthesis, Ed. Springe-
Verlag) ou
par toute méthode analogue connue de l'homme du métier.
Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non
nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise
entre 0
et 100°C, le pH étant ajusté entre 9 et 11. A titre d'exemple, le
chloroforme, la
diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, facétonitrile, le dichlorométhane, le
toluëne ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant. Les bases non
nucléophiles employées sont préférentiellement des amines tertiaires, du
carbonate de
calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases
utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA)
ou le
N-éthyldüsopropylamine. Avantageusement, le couplage peptidique est effectué
entre
0 et 50°C, et de préférence entre 10 et 30°C.
Les dérivés acides correspondant au polycation sont disponibles
commercialement.
Naturellement, lorsque les substituants de X, Y et/ou du polycation peuvent
interférer avec la réaction, il est préférable de les protéger préalablement
avec des
radicaux compatibles et pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au
reste de
la molécule. On opère pour cela selon les méthodes classiques connues de
l'homme
du métier, et notamment selon les méthodes décrites dans T.W. GREENE,
Protective
Groups in Organic Svnthesis, 2nd Edition, Wiley-Interscience, dans McOMIE,
Protective Groa~ps in Organic Chemistry, Plenum Press (1973), ou dans Philip J
Kocienski, Protecting Groi~ps, Thieme.
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Par ailleurs, chaque étape du procédé de préparation peut être suivie, le cas
échéant, des étapes de séparation et de purification du composé obtenu selon
les
méthodes connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple illustratif d'agents de transfert d'acides nucléiques
avantageux selon l'invention, on peut citer les composés suivants
i (CisH3o) ~.~ H
HO O ,O / N~N~~N~NH,
~CiaHs~) O H H
Ho~~~~ oH Composé 1
OH
i (ysH~o)~ H
~, O O C, H /N~N~N~N~NH,
( i8 37) (Oj H H
HO OH
ôH Composé 2
CiaH~y
H
O O ~N~N''~N~N~NH,_
\ (CisHso~ O H H
~~ ~~" OH
Hp composé 3
OH
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un agent
de transfert d'acides nucléiques tel que défini ci-avant, et un acide
nucléique. Les
quantités respectives de chaque composant peut être ajusté aisément par (homme
du
métier en fonction de (agent de transfert utilisé, de l'acide nucléique, et
des
applications recherchées (notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide
désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences
naturelles
ou artificielles, et notamment d'ADN génomique {ADNg), d'ADN complémentaire
(ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique
(ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-
synthétiques,
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d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être
d'origine
humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc... Ils peuvent être
obtenus par
toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de
banques,
par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la
modification
chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils
peuvent
ëtre modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils
peuvent être simple ou double brin de même que des oligonuléotides courts ou
des
séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont
avantageusement
constitués par des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes
d'expression,
etc... Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de
réplication
fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs,
des
séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des génes
d'intérêt
thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison
à
1 S d'autres composants cellulaires, etc...
De préférence, l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt
thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou
plusieurs
promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment
tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le
produit
protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce
produit
protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule
cible,
c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible
lorsque
celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une
protéine
permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou
l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raïson d'une
modification,
ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut
aussi
coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue,
une activité
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WO OOI32803 PCTiFR99/02995
modifiée, etc... Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-
vis de la
cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter
ou
apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter
contre une
pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
S Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut
citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones,
les
lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc... (FR 92/03120), les
facteurs de
croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de
synthèse, les
facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS,
10 HARP/pléiotrophine, etc...) les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE,
etc..., FR
93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine
CFTR
associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb, Rap 1
A,
DCC, k-rev, etc..., FR 93/04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués
dans
la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la
réparation de
1 S l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les
gènes de
l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du
métabolisme,
catabolisme etc...
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une
séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler
20 l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles
séquences
peuvent, par exemple, être transcrites dans ia cellule cible en ARN
complémentaires
d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la
technique
décrite dans le brevet EP I40 308. Les gènes thérapeutiques comprennent
également
les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire
sélectivement
des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, (acide nucléique peut également comporter un ou
plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez
l'homme
ou l'animai une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en
oeuvre,
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l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements
immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des
micro-organismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de
peptides
antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de
l'hépatite
B (EP I85 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus",
d'autres virus
ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences
permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant
pour le
peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des
séquences qui
sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces
séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut
également
s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression
d'autres
protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences
promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de
séquences
promotrices issues du génome de la cellule que fon désire infecter. De même,
il peut
s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on
peut
citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV, etc... En
outre,
ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences
d'activation, de régulation, etc... II peut aussi s'agir de promoteur,
inductible ou
répressible.
Par ailleurs, (acide nucléique peut également comporter, en particulier en
amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le
produit
thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de ia cellule cible.
Cette séquence
signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais
il peut
également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une
séquence
signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence
signal
dirigeant Ie produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier
de la
cellule.
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Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou
plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes agent de
transfert/acide
nucléique et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de
mise en
oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un
acide
nucléique, un agent de transfert d'acides nucléiques tel que défini ci-avant
et au moins
un adjuvant capable de s'associer aux complexes agent de transfert/acide
nucléique et
d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant
(lipides,
peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter
ie
pouvoir transfectant des composés. Dans cette optique, les compositions de
l'invention peuvent comprendre à titre d'adjuvant, un ou plusieurs lipides
neutres.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la
présente invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière
particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques,
zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions
physiologiques. Il
peuvent être choisis plus particulièrement parmi la
dioléoylphosphatidyléthanolamine
(DOPE), l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl, -
palmitoyl, -mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-
méthylés 1
à 3 fois, les phosphatidylgiycérols, les diacylglycérols, les
glycosyldiacylglycérols,
les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les
sphingolipides (tels
que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides {tels que
notamment les asialoGMl et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par
extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des
techniques
classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des
lipides
naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également
Lehninger, Biochemistry).
Plus récemment, la demanderesse a démontré qu'il était également
particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé
intervenant
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WO 00/32803 PCT/FR99I02995
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ou non directement au niveau de la condensation dudit acide nucléique, tels
que ceux
décrits dans la demande de brevet WO 96/2SS08. La présence d'un tel composé,
au
sein d'une composition selon l'invention, permet de diminuer la quantité
d'agent
transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan
S toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité
transfectante. Par
composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on
entend
définir un composé compactant, directement ou non, l'acide nucléique. Plus
précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'acide
nucléique à
transfecter soit intervenir au niveau d'un composé annexe qui lui est
directement
impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit
directement au niveau de l'acide nucléique. Notamment, l'agent précompactant
peut
être tout polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation
préféré,
l'agent intervenant au niveau de ia condensation de l'acide nucléique dérive
en tout ou
partie d'une protamine, d'une histone, ou d'une nucléoline et/ou de l'un de
leurs
I S dérivés. Un tel agent peut égaiement être constitué, en tout ou partie, de
motifs
peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant
varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces
motifs
peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent
être
séparés par des liens de nature biochimique, par exemple par un ou plusieurs
acides
aminés, ou de nature chimique.
Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20
équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acide nucléique en mol/mol et,
plus
préférentiellement, de O,S à S.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions
selon la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage
permettant
d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être
un élément
de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'ADN vers
certains,
types cellulaires ou certains tissus souhaités (cellules tumorales, cellules
hépatiques,
cellules hématopoiétiques...). II peut également s'agir d'un élément de
ciblage
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intracellulaire permettant d'orienter le transfert de l'acide nucléique vers
certains
compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries, noyau etc...}. L'élément
de
ciblage peut ëtre lié à l'agent de transfert d'acides nucléiques selon
l'invention, ou
également à l'acide nucléique comme cela a été précisé précédemment. Lorsque
l'élément de ciblage est lié à l'agent de transfert d'acides nucléiques de
formule
générale (I), celui-ci constitue de préférence l'un des substituants X ou Y.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on
peut
citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les
lipides, les
neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés.
Préférentiellement, il
IO s'agit de sucres, de peptides ou de protéines tels que des anticorps ou des
fragments
d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires ou des fragments de ceux-
ci, des
récepteurs ou des fragments de récepteurs, etc... En particulier, il peut
s'agir de
ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de récepteurs de cytokines,
de
récepteurs de type lectines cellulaires, ou de ligands à séquence RGD avec une
affinité pour les récepteurs de protéines d'adhésion comme les intégrines. On
peut
également citer les récepteurs de la transferrine, des HDL et des LDL, ou Ie
transporteur du folate. L'élément de ciblage peut également être un sucre
permettant
de cibler des lectines tels que les récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux
syalydés
tel que le sialyl Lewis X, ou encore un fragment Fab d'anticorps, ou un
anticorps
simple chaîne (ScFv).
L'association des éléments de ciblage aux complexes nucléolipidiques peut
être effectuée par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple
par
couplage à une partie hydrophobe ou à une partie qui interagit avec l'acide
nucléique
de (agent de transfert selon l'invention, ou encore à un groupement qui
interagit avec
l'agent de transfert selon l'invention ou avec l'acide nucléique. Les
interactions en
question peuvent être, selon un mode préféré, de nature ionique ou covalente.
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés tels que définis
ci-avant pour le transfert de polynucléotides (et plus généralement de
polyanions}
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dans les cellules in vitro, in vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente
invention a
pour objet l'utilisation des composés tels que définis ci-avant pour la
préparation d'un
médicament destiné à traiter les maladies, en particulier les maladies qui
résultent
d'une déficience en un produit protéique ou nucléique. Le polynucléotide
contenu
S dans ledit médicament code ledit produit protéique ou nucléique, ou
constitue ledit
produit nucléique, apte à corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo.
Pour des utilisations in vivô, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la
régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les
compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations
par
10 voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale,
intraveineuse,
intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale,
intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions de l'invention
contiennent un
véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable,
notamment
pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une
administration par
15 voie topique (sur peau et/ou muqueuse). II peut s'agir en particulier de
solutions
stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui,
par
addition selon Ie cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent
Ia
constitution de solutés injectables. Les doses d'acides nucléiques utilisées
pour
l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en
fonction de
20 différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration
utilisé, de
la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du
traitement
recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration,
il peut
s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des
tumeurs,
ou dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture
suivi de leur
25 réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans
le cadre de la
présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les
poumons, le
foie, la rate, ia moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les
os, les
cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les
testicules, les
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ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux; les glandes, les tissus
conjonctifs,
etc...
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement du
corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes
( 1 ) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel
que défini ci-
avant, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec le complexe
formé
en (1).
L'invention concerne en outre une méthode de transfert d'acides nucléiques
dans les cellules comprenant les étapes suivantes
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un agent de transfert tel que
défini ci-
avant, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en ( 1 ).
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par
1 S incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in
vitro ou ex vivo),
ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in
vivo).
L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à
1000 üg
d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des
doses d'acide
nucléique allant de 0,01 à 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou
plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont
préalablement mélangés à l'agent de transfert selon l'invention et/ou à
l'acide
nucléique.
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement
avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques in vivo, notamment pour le
traitement de maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un
acide
nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide
nucléique
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apte à corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à un
composé de
formule générale (I) dans les conditions définies ci-avant.
Les agents de transfert d'acides nucléiques de (invention sont
particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des
cellules primaires
ou dans des lignées établies. II peut s'agir de cellules fibroblastiques,
musculaires,
nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques,
hématopoiétiques
(lymphocytes, CD34, dendritiques, étc...), épitheliales etc..., sous forme
différenciées
ou pluripotentes (précurseurs).
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend
également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples
et
figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant
l'invention sans en
limiter la portée. Notamment, la demanderesse propose à titre non-limitatif
divers
protocoles opératoires ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles
d'être mis
en oeuvre pour préparer les agents de transfert de formule générale (I). Bien
entendu, il
est à la portée de l'homme du métier de s'inspirer de ces protocoles ou
produits
intermédiaires pour mettre au point des procédés analogues en vue de conduire
à ces
mêmes composés. Il appartient également à l'homme du métier de s'inspirer des
procédés de synthèse décrits dans tes différentes demandes de brevet
précédemment
citée pour la synthèse du polycation R compris dans la formule générale (I)
(WO
96/17823, WO 97/18185, WO 97/31935 etc...).
FIGURES
Figure 1 - Représentation schématique du plasmide pXL2774 utilisé dans les
expériences de transfert d'ADN dans les cellules.
Fi-gure 2 : Activité de transfert de gène in vitro dans des cellules HeLa des
complexes
formés à partir du composé 2 selon l'invention sans co-lipide, ou bien en
présence de
cholestérol et en présence de DOPE comme co-lipides. L'axe des ordonnées
représente
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l'expression de la luciférase en pg/puit. L'axe des absisses indique le
rapport agent
transfectant/ADN en nmole/~g d'ADN.
Figure 3 : Activité de transfert de gène in vivo après injection directe dans
le muscle
antérieur du tibias de souris de complexes formés à partir du composé 2 selon
la
présente invention en présence de DOPE ( 1 : 1 ). L'axe des ordonnées indique
l'expression de la luciférase en pg/muscle. L'axe des absisses indique le
rapport
composé 2/ADN en nmoles/ug d'ADN.
FYFMP1 FC
A \ MATÉRIEL ET MÉTHODES
a Matériel
~ Les polyamines de départ, comme la spermidine, la spermine, le tris-(2-
aminoéthyle)amine, la phénylènediamine, les diaminoalcane etc..., sont
disponibles
commercialement ou elles peuvent être synthétisée par des méthodes classiques
(par
exemple par cyanoéthylation d'amines disponibles dans le commerce pour obtenir
des amines branchées)
~ de nombreux composés comme par exemple la triéthylamine,
l'hexafluorophosphate
de benzotriazol-1-yloxytris(diméthylamino)phosphonium (BOP), le chloroformate
de benzyle, le 11-bromoundécanol, etc... sont également des produits
commerciaux.
~ L'amberlite IR 120 est une résine échangeuse d'ions commerciale (catalogue
BDH).
~ Le diméthylsulfoxyde (DMSO), traité préalablement à l'hydroxyde de
potassium, a
été distillé sur hydrure de calcium puis stocké sur tamis moléculaire 4 ~.
~ Le dichlorométhane a été distillé sur le pentoxyde de phosphore puis stocké
sur
tamis moléculaire 4 t~.
~ Le tétrahydrofuranne (THF) a été distillé sur sodium en présence de
benzophénone.
~ Pour les réactions nécessitant des conditions anhydre, toute la verrerie est
séchée à
la flamme sous courant d'azote.
b) Méthodes
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- Analyses spectroscopiques
Les spectres de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur
un
spectromètre Brucker MSL 30 à la fréquence de 300 MHz pour le proton et 75 MHz
pour le carbone. Tous les déplacements chimiques sont reportés en ppm soit par
rapport à la fréquence du tétraméthylsilane (TMS), soit par rapport au
solvant. Les
spectres ont été enregistrés en utilisant soit le TMS soit le signal résiduel
du solvant
comme référence interne. La multiplicité des signaux est désignée par les
abréviations
suivantes : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet) et m
(multiplet).
- Techniques de chromato-graphie
~ La cinétique des réactions a été suivie par chromatographie sur couche mince
(CCM) avec un gel de silice contenant un indicateur fluorescent (Merck
Slilicagel
60 F254) comme support. Les chromatogrammes ont été révélés par pulvérisation
d'une solution alcoolique d'anisaldéhyde.
~ Toutes les chromatographies sur colonne ont été réalisées sous pression
d'air
comprimé avec du silicagel 60 comme phase stationnaire (0,05-0,02 mm). La
phase
mobile employée diffère selon le type de synthèse (chromatographie moyenne
pression).
~ Les analyses CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance) sont réalisées
sur un appareil Waters LC 4000 équipé d'une colonne analytique de type C4
commercialisée par Applied Biosystem ("Brownlee Columns" en acier inoxydable
de 3 cm de longueur et 0,46 cm de diamètre) et d'un détecteur "Waters 486" à
220
nm. La phase stationnaire est de l'aquapore butyl 7 microns, et les phases
mobiles
sont l'eau déminéralisée (2500 cmi) ou l'acétonitrile (2500 cm') additionné
d'acide
trifluoroacétique (2,5 cm'). Le débit est de 1 ml par minute.
B \ SYNTH~SE DES AGENTS nE TRANSFFrTrnN
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Exemple 1 . synthèse de l'a-D-mannopyrannoside de (3-[4-(3-amïno-propyl-
amino)-butyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-I6-octadécyle
(Composé 1)
a) Synthèse de l'acide 3-~4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino propyl tert-
5 butoxycarbonyl amïno)-butyl-tert-butoxycarbonyl aminoJ acétique (FRM37S)
A une solution de spermine {S g ; 24,96 mmoles) dans du méthanol {125 ml), on
ajoute du cyanoborohydrure de sbdium NaBH,CN (0,548 g ; 8,74 mmoles). La
solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une
ampoule
isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (2,34 g ;
25,46
10 mmoles) dans du méthanol (80 ml). Après une nuit, on ajoute au mélange de
la
triéthylamine (3,86 ml ; 27,71 mmoles) et du di-tert-butyl dicarbonate (27,67
g ;
129,79 mmoles) solubilisé dans du tétrahydrofuranne (55 ml). Après une nuit,
on
concentre à l'évaporateur rotatif puis on reprend par de l'acétate d'éthyle
(63 ml) et on
effectue un lavage à l'hydrogénosulfate de potassium et à la saumure. Puis on
sèche
1 S sur sulfate de magnésium et on concentre. Le produit obtenu est purifiée
par
chromatographie (CH,C1,/MeOH 9 : 1 ). Le rendement est de 30%.
IH RMN (CDC13) : b (ppm) 1,42 (s, 36H, C(CH3)3), 1,45 (m, 4H, CH2), 1,60 (m,
4H, CH2), , 3,04-3,33 (m, 12H, CH2), 3,91 (s, 2H, NCH2C00).
b) Synthèse du 1 S-hydroxypentadécanoate de méthyle
20 A 10 g de pentadécalactone (41,b0 mmol) dans 41,60 cm' de méthanol, on
ajoute
6,66 cm' de méthylate de sodium 2N ( 13,31 mmol) à 0°C.
Après 9 heures, on ajoute 9,24 cm3 d'acide acétique et on laisse agir pendant
15 minutes. Puis on évapore la solution sous vide à sec, on reprend ensuite
par du
dichlorométhane, et on effectue un lavage au bicarbonate de sodium. On sèche
la
25 phase organique obtenue par du sulfate de magnésium et on évapore le
solvant à
l'évaporateur rotatif. La purification se fait dans un mélange hexane/acétate
d'éthyle
6:4. On obtient le 1-ol-pentadécanoate de méthyle avec un rendement de 80 %.
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1H RMN (CDCI,) : 8 {ppm) 1,26 (m, 12H, (CH2)10), 1,S-1,6 (m, 4H, H-2 et H-13),
2,30 (t, ZH, J= 7,60 Hz, H-14), 3,64 (t, 1H, J= 5,84 Hz, H-1), 3,67 (s, 3H, H-
16).
c) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-acétyl-a-D-mannopyranoside de pentadécanoate de
méthyle
S A 0°C, on ajoute 5,26 cm' de chlorure d'étain (44,94 mmol) à 8,72 g
de mannose
pentaacétylé (22,47 mmol) dans S6 cm' de dichlorométhane pendant 30 minutes.
Puis
on ajoute 7,34 g de 1-0l pentadécanoate de méthyle précédemment obtenu en a)
(26,96 mmol). Après 2 heures, le mélange réactionnel est dilué par de l'éther
éthylique et on verse dans une solution d'hydrogénophosphate de sodium
(NaHP04).
Les phases aqueuses sont extraites avec du diéthyléther et les phases
organiques sont
successivement lavées par une solution de carbonate de sodium, de la saumure,
puis
séchëes sur sulfate de magnésium. Le produit obtenu après évaporation sous
vide à
sec est purifié par chromatographie moyenne pression dans un mélange
heptane/acétate d'éthyle 7:3. Le rendement est de S3 %.
1S 1H RMN (CDCh) : 8 (ppm) 1,26 (m, 20H, (CH2)10), 1,59 (m, 4H, OCH2CH2 et H-
13), 2,01, 2,OS, 2,12 et 2,17 (s, 3H, OCOCH3), 2,29 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-
14), 3,40
(m, 1H, J-- 7,89 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, 1H, J-- 7.89 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s,
3H,
COOCH3), 4,OS (ddd, 1 H, J-- 9,56 Hz et S, S7 Hz, H-S), 4,1 (dd, 1 H, J= S, S7
Hz et
I2, 32 Hz, H-6a), 4,29 (dd, 1 H, J= S, S7 Hz et 12, 32 Hz, H-6b), 4, 8 (d, 1
H, J= 1, 8S
Hz, H-1 ), 5,23 (dd, 1 H, J= I , 8S Hz et 3, 23 Hz, H-2), 5,27 (dd, 1 H, J= 9,
97 Hz et 9, S6
Hz, H-4), S,3S (dd, 1H, J= 9,97 Hz et 3,23 Hz, H-3).
d) Synthèse de l'a-D-mannopyranoside de pentadécanoate de méthyle
On traite 3,63 g de produit obtenu à l'étape précédente (6,01 mmol) en
solution dans
12 cm3 de méthanol par 3 cm3 de méthylate de sodium 2N (6,01 mmol). Lorsque la
2S réaction terminée, on neutralise cette dernière avec de l'Amberlite IRI20
( 1 équivalent poids/volume), on filtre et on évapore à sec sous vide.
iH RMN (CDC13) : 8 (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,59 (m, 4H, OCH2CH2 et H-
13), 2,34 (t, 2H, J-- 7, 62 Hz, H-14), 3,41 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHaCH2),
3,74 {m,
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1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH30C0), 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3,
H-
4, H-5 et H-6), 4, 75 (d, 1 H, J-- l , 82 Hz, H-1 ).
e) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl-a-D-mannopyranoside de pentadécanoate de
méthyle
A 2 g (4,56 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente d) en solution dans
20 cm'
de diméthylformamide (DMF) anhydre, on ajoute successivement 4,54 g d'iodure
de
potassium (27,36 mmol), 1,09 g d'hydrure de sodium 60% (27,36 mmol) et 3,25
cm'
de bromure de benzyle {27,36 mmol). Après 12 heures, on ajoute 18,24 cm' d'une
solution saturée de chlorure d'ammonium, et on laisse agir pendant 10 minutes.
Puis,
on dilue avec de l'eau et on extrait la phase organique par de l'acétate
d'éthyle. Celle-
ci est ensuite lavée avec de l'eau et de la saumure, et est finalement séchée
par du
sulfate de magnésium. On effectue par ailleurs un lavage supplémentaire par
une
solution saturée de thiosulfate de sodium afin d'éliminer les ions iodures. On
évapore
sous vide et on purifie l'huile résultante dans un mélange heptane/acétate
d'éthyle
9:1. Le produit est obtenu avec un rendement de 60 %.
1H RMN (CDC13) : d (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,49 (m, 2H, OCH2CH2), 1,59
(m, 2H, H-13), 2,31 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-14), 3,34 (m, 1H, J-- 6,71 Hz,
OCHaCH2),
3,63 (m, 1H, J-- 6,71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH3OC0), 3,75 (m, 1H, J--
8,97
Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,78 (s, 2H, CH2Phe), 3,90 (dd, 1H, J-- 6,21 Hz et J--
11,82 Hz,
H-6a), 3,97 {dd, 1H, J-- 6,21 Hz et J 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CHzPhe),
4,52
(dd, J-- 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, ~Phe), 4,63 (s, 2H, ~Phe),
4,69
(dd, 1H, J-- 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2), 4,74 (1H, J-- 2,52 Hz, H-1), 4,85 (dd,
1H, J--
7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H, Phe).
Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl-a-D-mannopyranoside de l'acide
pentadécanoigue
A 0,50 g (0,73 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente e) en solution
dans 7 cm~
de méthanol, on ajoute 4,68 cm' d'une solution de soude 25 %. Le mélange
réactionnel est chauffé à reflux pendant 30 minutes. Puis, on neutralise le
mélange à
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froid avec une solution d'acide chlorhydrique S %. On extrait la phase
organique par
de l'acétate d'éthyle, et on évapore à sec sous vide. La purification se fait
dans un
mélange heptane/acétate d'éthyle 4:6. Le produit est obtenu avec un rendement
de 62
%.
S iH RMN (CDC13) : d (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,49 (m, 2H, OCH2ÇH2), 1,59
(m, 2H, H-13}, 2,34 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-14), 3,34 (m, 1H, J-- 6,71 Hz,
OCHaCH2),
3,63 (m, 1H, J-- 6,71 Hz, OCHbCH2), 3,75 (m, 1H, J-- 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-S),
3,78
(s, 2H, CH2Phe), 3,90 (dd, IH, J-- 6,21 Hz et J-- 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd,
1H, J--
6,21 Hz et J-- 11,82 Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH2Phe), 4,52 (dd, J-- 2,91 Hz et
7,83
Hz, H-3), 4,57 (s, 2H, CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH~Phe), 4,69 (dd, 1H, J-- 2,52
Hz et
2,91 Hz, H-2), 4,74 (1H, J-- 2,52 Hz, H-1), 4,85 (dd, 1H, J-- 7,83 Hz et 8,97
Hz, H-4),
7,35 (m, 20H, Phe).
g) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benzyl a-D-mannopyranoside de N octadécyl IS-
carbamoyl pentadécanyle
1 S A 0,29 g (0,37 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente
f), en
solution dans S cm' de chloroforme, on ajoute successivement du 0,23 g de BOP
(0,52 mmol), 0,21 cm' de düsopropyléthylamine (1,48 mmol) et 0,12 g
d'octadécylamine (0,44 mmol). Lorsque la réaction est achevée, on dilue par du
dichlorométhane et on effectue un lavage par de l'eau. Puis, on sèche par du
sulfate de
magnésium et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par
chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4.
Le
produit est obtenu avec un rendement de 98 %.
iH RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,88 {t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, SOH,
(CH2)2S)~
1,47 (m, 4H, OCH2ÇH2 et H-17), 1,58 (m, 2H, H-13), 2,13 (t, 2H, J-- 7,92 Hz, H
2S 14), 3,23 (m, 2H, H-16), 3,34 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, 1
H, ,l--- 6, 71
Hz, OCHbCH2), 3,75 (m, IH, J-- 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-S), 3,78 (s, 2H, ÇHZPhe),
3,90 (dd, 1H, J-- 6,21 Hz et J-- 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, 1H, J-- 6,21 Hz et
J-- 11,82
Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CHzPhe), 4,52 (dd, J-- 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57
(s, 2H,
CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH2Phe), 4,69 (dd, 1H, J-- Z,S2 Hz et 2,91 Hz, H-2),
4,74 (1H,
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J-- 2,52 Hz, H-1), 4,85 (dd, 1H, J-- 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 5,37 (bande,
1H,
HNCO), 7,35 (m, 20H, Phe).
l:) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-D-ben4yl-a D-mannopyranoside de IS-
octadécylamino pentadécanyle
A 0,77 g (0,75 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente g), dans 1 S cm'
de
tétrahydrofuranne (THF) anhydre, on ajoute O,OS6 g d'hydrure de lithium
aluminium
AILiHa (1,50 mmol). On chauffe à reflux pendant 10 heures. Puis, le mélange
réactionnel est refroidi dans un bain de glace et on ajoute S6 p.l d'eau, puis
112 ~l de
soude 2N après 10 minutes, et enfin encore 56 pl d'eau 10 minutes plus tard.
On filtre
et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié dans un mélange
de
dichlorométhane/méthanol/ammoniac 28 % 9:2:O,S. Le produit est obtenu avec un
rendement de 86 %.
1H RMN (CDCI,) : 8 (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,2? (m, SOH,
(CH2)2S)~
1,4-1,6 (m, 9H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-l7et NH), 2,57 (t, 4H, J-- 7,92 Hz, H-
1S
I S et H- I 6), 3,34 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, 1 H, J-- 6, 71
Hz,
OCHbCH2), 3,75 (m, 1H, J-- 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-S), 3,78 (s, 2H, ~Phe), 3,90
(dd, 1 H, J-- 6,21 Hz et J-- 11,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, I H, J-- 6,21 Hz et J--
I 1,82 Hz,
H-6b), 4,07 (s, 2H, CH2Phe), 4,52 (dd, J= 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57 (s,
2H,
CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH2Phe), 4,69 (dd, 1H, J-- 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2),
4,74 (IH,
J-- 2,52 Hz, H-I), 4,85 (dd, IH, J-- 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 20H,
Phe).
i) Synthèse du 2,3,4,6-tétra-O-benTyl-a. D-mannopyranoside de (3 ~4-(3-tert
butoxycarbonyl-amino propyl-sert-butoxyearbonyl-amino)-buiyl-tert-
birtoxycarbanyl-aminoJ-méthylène-carbamoyl)-IS pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,63 g (0,61 mmol) d'une solution de produit obtenu précédemment à l'étape
h),
2S dans 10 cm' de chloroforme, on ajoute successivement 0,38 g de BOP (0,85
mmol),
0,425 cm~ de düsopropyléthylamine (2,44 mmol) et 0,48 g d'acide 3-[4-(3-tert-
butoxycarbonyl-amino-propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-
butoxycarbonyl-
aminoJ-acétique (FRM 37S) (0,73 mmol) obtenu à l'étape a). Au bout de 4
heures, on
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dilue par du dichlorométhane et on effectue un lavage à l'eau. On sèche par du
sulfate
de magnésium et on évapore à sec sous vide. Le produit obtenu est purifié par
chromatographie moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4.
Le
produit est obtenu avec un rendement de 80 %.
5 1H RMN (CDCI,) : 8 (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, SOH,
(CH2)25),
1,4-I,6 (m, 17H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-I7, H-37, H-40, H-41 et H-44),1,46 (m,
36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-I5, H-16 et H-35), 3,09-3 ,33 (m, 12H, H-36, H-
38, H-
39, H-42, H-43 et H-45), 3,34 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,63 (m, 1 H, J-
- 6, 71
Hz, OÇHbCH2), 3,75 (m, 1H, J-- 8,97 Hz et 6,21 Hz, H-S), 3,78 (s, 2H, ÇH~Phe),
10 3,90 (dd, IH, J-- 6,21 Hz et.l-- 1 I,82 Hz, H-6a), 3,97 (dd, 1H, J-- 6,21
Hz et J-- I 1,82
Hz, H-6b), 4,07 (s, 2H, CH~Phe), 4,52 (dd, J-- 2,91 Hz et 7,83 Hz, H-3), 4,57
(s, 2H,
CH2Phe), 4,63 (s, 2H, CH~Phe), 4,69 (dd, 1H, J-- 2,52 Hz et 2,91 Hz, H-2),
4,74 (I H,
J 2,52 Hz, H-1), 4,85 (dd, 1H, J-- 7,83 Hz et 8,97 Hz, H-4), 7,35 (m, 18H,
Phe).
j) Synthèse de l'a-D-mannopyranoside de (3-~4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino-
15 propyl-tert-butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl-aminoJ-
méthylène-
carbamoyl)-I S pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,63 g (0,38 mmoI) de produit obtenu à l'étape précédente i), dans 5 cm' de
méthanol, on ajoute 10 % de palladium sur charbon (0,027 g). La solution est
agitée
sous pression d'hydrogène a température ambiante. Au bout de 6 heures, on
filtre puis
20 on évapore à sec sous vide. La réaction est quantitative.
IH RMN (CD30D) : b (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, SOH,
(CH2)25)~ I,4-1,6 (m, 17H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-4I et H-
44),1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 3,09-3 ,33 (m,
12H, H-
36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,34 (m, 1H, J 6,71 Hz, OCHaCH2), 3,5-
3,82
25 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5 et H-6), 3,63 (m, 1 H, J-- b, 71 Hz, OCHbCH2),
4,72 ( I H,
J-- 2,52 Hz, H-1).
k) Synthèse de l'a-D-mannopyranoside de (3%4-(3-amino propyl-amino)-butyl-
an:inoJ-méthylène-carbamoyl)-IS pentadécanyl 16-octadécyle(composé 1)
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36
A 0,37 g (0,28 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente j), on ajoute
21,50 cm'
de tétrahydrofuranne (TFA) distillé. Après 1 heure, le mélange réactionnel est
concentré à froid et lyophilisé. On vérifie le degré de pureté du produit en
solution
dans du méthanol par CLHP comme décrit dans la partie "Matériel et Méthodes".
iH RMN (CD30D) : 0,88 (t, 3H, J 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 14H, (CH2)25), 1,4-
1,6 (m, 17H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-17, H-37, H-40, H-41 et H-44), 2,8-2,9 (m,
6H, H-15, H-16 et H-35), 2,92 (m, 2H, H-45), 2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-
39,
H-42, H-43), 3,34 (m, 1H, J-- 6,71 Hz, OCHaCH2), 3,5-3,82 (m, 6H, H-2, H-3, H-
4,
H-5 et H-6), 3,63 (m, 1H, J-- 6,71 Hz, OCHbCH2), 4,72 (1H, J-- 2,02 Hz, H-1).
Exemple 2 : synthèse du 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3-~(4-(3-amino-
propyl-amino)-butyl-amino]-méthylène-carbamoyl)-15-pentadécanyl-16-
octadécyle (composé 2)
a) Synthèse de l'acide 3-(4-(3-tert-butoxycarbonyl-amino propyl tert-
butoxycarbonyl amino)-brrtyl tert butoxycarbonyl aminoJ acétique (FRM375)
A une solution de spermine (5 g ; 24,96 mmoles) dans du méthanol (125 ml), on
ajoute du cyanoborohydrure de sodium NaBH,CN (0,548 g ; 8,74 rnmoles). La
solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une
ampoule
isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (2,34 g ;
25,46
mmoles) dans du méthanol (80 ml). Après une nuit, on ajoute au mélange de la
triéthylamine (3,86 ml ; 27,71 mmoles) et du di-tert-butyl dicarbonate (27,67
g ;
129,79 mmoles) solubilisé dans du tétrahydrofuranne (55 ml). Après une nuit,
on
concentre à l'évaporateur rotatif puis on reprend par de l'acétate d'éthyle
(63 ml) et on
effectue un lavage à l'hydrogénosulfate de potassium et à la saumure. Puis on
sèche
sur sulfate de magnésium et on concentre. Le produit obtenu est purifiée par
chromatographie (CH,CI,/MeOH 9 : 1). Le rendement est de 30%.
tH RMN (CDC13) : 8 (ppm) 1,42 (s, 36H, C(CH3)3), 1,45 (m, 4H, CH2), 1,60 (m,
4H, CH2), , 3,04-3,33 (m, 12H, CH2), 3,91 (s, 2H, NCH2C00).
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b) Synthèse du 15-hydroxy pentadécanoate de méthyle
A 10 g de pentadécalactone (41,60 mmol) dans 41,60 cm' de méthanol, on ajoute
6,66 cm' de méthylate de sodium 2N (13,31 mmol) à 0°C. Après 9 heures,
on ajoute
9,24 cm' d'acide acétique et on laisse agir pendant 1 S minutes. Puis on
évapore à sec
sous vide la solution qui est ensuite reprise par du dichlorométhane, et on
effectue un
lavage au bicarbonate de sodium. On sèche la phase organique obtenue par du
sulfate
de magnésium et on évapore Ie solvant à l'évaporateur rotatif. La purification
se fait
dans un mélange hexane/acétate d'éthyle 6:4. On obtient le I-ol-pentadécanoate
de
méthyle avec un rendement de 80 %.
IH RMN (CDC13) : 8 (ppm) I,26 (m, 12H, (CH2)10), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H-13),
2,30 (t, 2H, J= 7.60 Hz, H-14), 3,64 (t, 1H, J= 5,84 Hz, H-1), 3,67 (s, 3H, H-
16).
c) Synthèse du 2,3,4-tri-O-acétyl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de
pentadécanoate de méthyle
A O°C, on ajoute 2,49 cm' de chlorure d'étain (21,30 mrnol) à 3,55 g de
rhamnose
tétraacétylé ( 10,65 mmol) dans 27 cm' de dichlorométhane pendant 30 minutes.
Puis
on additionne 3,48 g de 1-0l pentadécanoate de méthyle précédemment obtenu
(12,78
mmol). Après 2 heures, le mélange réactionnel est dilué par de l'éther
éthylique et on
verse dans une solution de phosphate de sodium (Na,P04). Les phases aqueuses
sont
extraites avec du diéthyléther et les phases organiques sont successivement
lavées par
une solution de carbonate de sodium, de la saumure, puis séchées par du
sulfate de
magnésium. Après évaporation à sec sous vide, on purifie par chromatographie
moyenne pression dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 7:3. Le produit est
obtenu avec un rendement de 60 %.
iH RMN (CDCl3) : 8 (ppm) 1,20 (d, 3H, J-- 6,45 Hz, H-6), 1,26 (m, 20H,
(CH2)10),
1,59 (m, 4H, OCH2CH2 et H-13), 1,98, 2,04 et 2,16 (s, 3H, OCOCH3), 2,29 (t,
2H,
J-- 7, 62 Hz, H-14), 3,40 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,66 (m, 1 H, J--
6, 71 Hz,
OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, COOCH3), 3,88 (m, IH, J-- 6,45 Hz et 9,97 Hz, H-5),
4,70
(d, 1 H, J-- I , 72 Hz, H-1 ), 5,06 (dd, 1 H, J-- 9, 97 Hz et 9. 97 Hz, H-4),
5,22 (dd, 1 H, J--
1,72 Hz et 3,52 Hz, H-2), 5,30 (dd, 1H, J-- 3.52 Hz et 9,97 Hz, H-3).
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d) Synthèse de l'a-désoxy L-6-n:annopyranoside de pentadécar:oate de méthyle
On traite 5,08 g de produit obtenu à l'étape c) (9,34 mmol) en solution dans
20 cm' de
méthanol par 9,34 ml de méthylate de sodium 2N (18,68 mmol). Lorsque la
réaction
est achevée, on neutralise le mélange réactionnel avec de l'Amberlite IR120,
on filtre
et on évapore à sec sous vide.
1H RMN (CDC13) : 8 (pprn) 1,20 (d, 3H, J-- 6,45 Hz, H-6), 1,26 (m, 20H,
(CH2)10)~
1,59 (m, 4H, OCH2CH? et H-13), 2,29 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-14), 3,40 {m, 1H, J-
-
b, 71 Hz, OCHbCH2), 3,66 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H,
CH30C0),
3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4 et H-5), 4,70 (d, 1H, J 1,72 Hz, H-1).
e) Synthèse du 2,3,4-tri-O-ben ;y! 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de
pentadécanoate de méthyle
A 2,09 g (5,00 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente d), dans 30 cm' de
diméthylformamide (DMF) anhydre, on ajoute successivement 3,32 g d'iodure de
potassium (20,00 mmol), 0,80 g d'hydrure de sodium 60 % (20,00 mmol) et 2,38
cm;
du bromure de benzyle (20,00 mmol). Après 12 heures, on ajoute 20 cm' d'une
solution saturée de chlorure d'ammonium et on laisse agir pendant 10 minutes.
Puis,
on dilue avec de l'eau et on extrait la phase organique par de l'acétate
d'éthyle. Celle-
ci est ensuite lavée avec de l'eau et de la saumure, avant d'être finalement
séchée par
du sulfate de magnésium.
Par ailleurs, un lavage supplémentaire par une solution saturée de thiosulfate
de
sodium est effectué afin d'éliminer les ions iodures. On évapore à sec sous
vide et on
purifie l'huile résultante dans un mélange heptane/acétate d'éthyle 9:1. Le
produit est
obtenu avec un rendement de 60 %.
'H RMN (CDCl3) : 8 (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,33 (d, 3H, J= 6,21 Hz, H-
6),
1,59 (m, 4H, OCH2~ et H-13), 2,31 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-14), 3,40 (m, IH, J--
6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 {dd, 1 H, J-- 8, 96 Hz et 9, 5 Hz, H-4), 3,66 (m, 1
H, J-- 6, 71
Hz, OCHbCH2), 3,67 (s, 3H, CH30C0), 3,68 (m, IH, J= 9,5 Hz et 6,11 Hz, H-S),
3.75 (dd, IH, J-- 2,01 Hz et 3.02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-
3), 4.64
(s, 6H, CH2Phe), 4,73 ( I H, J-- 2.01 Hz, H- l ), 7,35 (m, I SH, Phe).
CA 02353576 2001-06-O1
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39
,~ Synthèse du 2,3,4-tri-O-ben4yl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de l'acide
pentadécanoïque
A 0,50 g (0,73 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente e),
dans
7 cm' de méthanol, on ajoute 4,68 ml de soude 25 %. Le mélange réactionnel est
chauffé à reflux pendant 30 minutes. Puis, on neutralise le mélange à froid
avec une
solution d'acide chlorhydrique 5 %. On extrait la phase organique par de
l'acétate
d'éthyle et on évapore à sec sous vide. La purification se fait dans un
mélange
heptane/acétate d'éthyle 4:6. Le produit est obtenu avec un rendement de 72 %.
'H RMN {CDC13) : ~ (ppm) 1,28 (m, 20H, (CH2)10), 1,33 (d, 3H, J-- 6,21 Hz, H-
6),
IO I,59 (m, 4H, OCH2ÇH~ et H-I3), 2,34 (t, 2H, J-- 7,62 Hz, H-I4), 3,40 (m,
1H, J--
6, 71 Hz, OCHaCH2), 3,61 (dd, 1 H, J 8, 96 Hz et 9, 5 Hz, H-4), 3,66 (m, I H,
J-- 6, 71
Hz, OCHbCH2), 3,68 (m, 1H, J= 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, 1H, J 2,01 Hz
et 3,02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J 3.02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, ÇH2Phe),
4,73
( 1 H, J-- 2, 01 Hz, H-1 ), 7,35 (m, 20H, Phe).
1 S g) Synthëse du 2,3,4-tri-O-ben; yl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de N
octadécyl-
I S-carbamoyl pentadécanyle
A 0,70 g (1,04 mmol) d'une solution de produit précédemment obtenu à l'étape
fj,
dans 13 cm' de chloroforme, on ajoute successivement 0,69 g de BOP (1,56
mmol),
0,72 cm' de düsopropyléthylamine (4, I 6 mmol) et 0,34 g d'octadécylamine
20 (1,25 mmol). Lorsque la réaction est terminée, on dilue par du
dichlorométhane, on
effectue un lavage à l'eau, on sèche sur sulfate de magnésium, et on évapore à
sec
sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie moyenne pression
dans
un mélange heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un
rendement de
84 %.
25 'H RMN (CDC13) : b (ppm 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, SOH,
(CH2)25)~
1,33 (d, 3H, J-- 6,21 Hz, H-6), I,47 (m, 4H, OCH2~ et H-17), 1,58 (m, 2H, H-
13),
2,13 (t, 2H, J-- 7,92 Hz, H-14), 3,23 (m, 2H, H-16), 3,40 (m, 1H, J-- 6,71 Hz,
OCHaCH2), 3,61 (dd, 1 H, J-- 8, 96 Hz et 9,5 Hz, H-4), 3,66 (m, 1 H, J-- 6, 71
Hz,
OCHbCH2), 3,68 (m, 1 H, J-- 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, 1 H, J-- 2, 01
Hz et
CA 02353576 2001-06-O1
WO 00/32803 PCT/FR99/02995
3.02 Hz, H-2), 3,88 (dd, J-- 3.02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH~Phe),
4,73
( 1 H, J-- 2,01 Hz, H-1 ), 5,37 (bande, 1 H, HNCO), 7,35 (m, I SH, Phe).
1:) Synthèse du 2,3,4-tri-O-benT,yl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de 1 S-
octadécyl
amino pentadécanyle
5 A 0,81 g (0,86 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente g), dans 15 cm3
de
tétrahydrofuranne (THF) anhydre, on ajoute 0,065 g d'hydrure de lithium;
aluminium
AlLiH4 (1,72 mmo!), et on chauffe à reflux pendant 10 heures. Puis, le mélange
réactionnel est refroidi dans de un bain de glace et on ajoute 65 ~I d'eau,
puis 130 ~l
de soude ZN au bout de 10 minutes, et enfin à nouveau 65 pl d'eau après 10
minutes.
10 On filtre et on évapore à sec sous vide. La purification se fait dans un
mélange
dichlorométhane/méthanol/ammoniac 28% 9:2:0,5. Le produit est obtenu avec un
rendement de 93 %.
'H RMN (CDCI,) : 8 (ppm) 0,$8 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, SOH,
(CH2)25)~
1,33 (d, 3H, J-- 6,21 Hz, H-6), 1,4-1,6 (m, 9H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-l7et
NH),
15 2,57 (t, 4H, J-- 7,92 Hz, H-15 et H-16), 3,40 (m, 1H, J-- 6,71 Hz,
OCHaCH2), 3,61
(dd, 1 H, J-- 8, 96 Hz et 9, 5 Hz, H-4), 3,66 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHbCH2),
3,68 (m,
I H, J-- 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3.75 (dd, 1 H, J-- 2, Ol Hz et 3, 02 Hz, H-
2), 3,88 {dd,
J-- 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 4.64 (s, 6H, CH2Phe), 4,73 {IH, J-- 2,OI Hz, H-
1), 7,35
(m, I SH, Phe).
20 i) Synthèse du 2,3,4-tri-O-ben;yl-6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3-%4-(3-
tert-
butoxycarbonyl-amino propyl-tert butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-
butoxycarbonyl-aminoJ-méthylène-carbamoyl)-1 S pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,78 g (0,86 mmol) d'une solution de produit obtenu à l'étape précédente h),
en
solution dans 7 cm' de chloroforme, on ajoute successivement 0,53 g de BOP
25 (1,20 mmol), 0,30 cm' de düsopropyléthylamine (1,72 mmol) et 0,62 g de FRM
375
obtenu à l'étape a) (0,95 mmol). Après 4 heures, on dilue avec du
dichlorométhane,
on effectue un lavage à l'eau, on sèche sur sulfate de magnésium, et on
évapore à sec
CA 02353576 2001-06-O1
WO 00/32$03 PCT/E'R99/02995
41
sous vide. Le produit obtenu est purifié par chromatographie "flash" dans un
mélange
heptane/acétate d'éthyle 6:4. Le produit est obtenu avec un rendement de 72 %.
'H RMN (CDCl,) : 8 (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,27 (m, 50H,
(CH2)25),
1,33 (d, 3H, J-- 6,21 Hz, H-6), 1,4-1,6 {m, 17H, OCH2ÇH2, H-17, H-14, H-17, H-
37,
H-40, H-41 et H-44),1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35),
3,09-
3 ,33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,40 (m, 1H, J-- 6,71
Hz,
OCHaCH2), 3,65 (s, 2H, CH2Phe), 3,66 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,68 (m,
1 H, J-- 9,5 Hz et 6,21 Hz, H-5), 3,99 (s, 2H, ÇH2Phe), 4,02 {dd, 1 H, J--
$,96 Hz et 9,5
Hz, H-4), 4.32 (s, 2H, ÇH~Phe), 4.57 (dd, 1H, J-- 2,01 Hz et 3,02 Hz, H-2),
4,73 (1H,
J-- 2,01 Hz, H-1), 4,82 (dd, J-- 3,02 Hz et 8,96 Hz, H-3), 7,35 (m, 18H, Phe).
j) Synthèse du 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3 ~4-(3-tert butoxycarbonyl-
amino propyl-tert butoxycarbonyl-amino)-butyl-tert-butoxycarbonyl-aminoJ-
méthylène-carbamoyl)-IS pentadécanyl-16-octadécyle
A 0,74 g (0,48 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente i), en solution
dans
10 cm~ de méthanol, on ajoute 10 % (0,034 g) de palladium sur charbon. La
solution
est agité sous pression d'hydrogène a température ambiante. Après 4 heures, on
filtre
puis on évapore à sec sous vide. La réaction est quantitative.
'H RMN (CD30D) : S (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J--
6,45 Hz,
H-6), 1,27 (m, 14H, (CH2)25), 1,4-1,6 (m, 17H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-17, H-
37,
H-40, H-41 et H-44),1,46 (m, 36H, Boc), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35),
3,09-
3 ,33 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43 et H-45), 3,40 (m, 1H, J 6,71 Hz,
OCHaCH2), 3,66 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz, OCHbCH2), 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4
et
H-5), 4,73 ( 1 H, J-- 2,01 Hz, H-1 ).
k) Synthèse du 6-désoxy-a-L-mannopyranoside de (3 ~4-(3-amino propyl amino)-
butyl-aminoJ-méthylene-carbamoyl)-IS pentadécanyl-16-octadécyle (composé 2)
A 0,40 g (0,31 mmol) de produit obtenu à l'étape précédente j), on ajoute 24
cm' de
tétrahydrofuranne (TFA) distillé. Après 1 heure, le mélange réactionnel est
évaporé
sous vide à froid et à sec, puis est lyophilisé. On vérifie le degré de pureté
du produit
en solution dans du méthanol par CLHP.
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'H RMN (CD30D) : b (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,36 Hz, H-33), 1,20 (d, 3H, J--
6,45 Hz,
H-6'), 1,27 (m, 14H, (CH2)2~), 1,4-1,6 (m, I7H, OCH2CH2, H-17, H-14, H-17, H-
37, H-40, H-41 et H-44), 2,8-2,9 (m, 6H, H-15, H-16 et H-35), 2.92 (m, 2H, H-
45),
2,92-3,17 (m, 12H, H-36, H-38, H-39, H-42, H-43), 3,40 (m, 1 H, J-- 6, 71 Hz,
S OCHaCH2), 3,66 (m, 1H, J-- b,71 Hz, OCHbCH2), 3,6-3,9 (m, 4H, H-2, H-3, H-4
et
H-S), 4,73 (1H, J-- 2,01 Hz, H-1).
Exemple 3 Synthèse du 6-désoxy-[i-L-galactopyrannoside du 1-(-(3-[4-(3-
amino-propyl-amino)-butyl-amino-propyl-aminoLméthylène-carbamoyl)-1S-
pentadécanyl-16-octadécanyle (composé 3)
a) Synthèse de l'acide ~3-J4-(3-benzyloxycarbonyl-amino propyl
6enzyloxycarbonyl amino)-butyl ben~yloxycarbonyl aminoJ propylamino) acétique
A une solution de spermine ( 10 g ; 49,9I mmoles) dans du méthanol (200 ml),
on
ajoute du cyanoborohydrure de sodium NaBH~CN (1,10 g; 17,47 mmoles). La
solution est ensuite soumise à une vive agitation. Par l'intermédiaire d'une
ampoule
1 S isobare, on ajoute en 100 minutes une solution d'acide glyoxylique (4,59 g
; 49,91
mmoles) dans du méthanol (120 ml). Après une nuit, on place le mélange
réactionnel
dans un bain de glace et on ajoute successivement de la soude 2N (34 ml) et du
chloroformate de benzyle ( 14,25 ml ; 99,82 mmoles) en 10 portions. On mélange
vigoureusement en maintenant le bain entre 5°C et 10°C. Au bout
de 2 heures à
température ambiante, le méiange est extrait avec de l'éther et neutralisé par
une
solution d'acide chlorhydrique SN. La phase organique est ensuite séchée sur
sulfate
de magnésium, et on concentre à l'évaporateur rotatif. Le produit obtenu est
purifié
par chromatographie (100 % CH~CI~ puis CH~Ch/MeOH 9 : 1). Le rendement est de
sz°i°.
2S 1H RMN (CDC13) : b (ppm) 1,28 (t, 4H, CH2), 1,60 (m, 4H, CH2), , 3,04-3,33
(m,
I2H, CH2), 3,49 (s, 2H, NCH2C00), 5,07 (s, 8H, CH2), 7,27 (m, 20H, Phe).
b) Synthèse du 1 S-hydroxypentadécanoate de méthyle
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La pentadécalactone (10 g ; 41,6 mmol) en solution dans du méthanol (41,6 ml)
est
traïtée par du méthylate de sodium 2N (6,656 ml ; 13,31 mmol) à 0°C.
Après 9
heures, on ajoute 9,24 ml d'acide acétique et on laisse agir pendant 15
minutes. Puis
on concentre la solution et l'huile résultante est dissoute dans du
dichlorométhane et
lavée par du bicarbonate de sodium. Après décantation, la phase organique est
séchée
sur sulfate de magnésium et on évapore. La purification se fait dans un
mélange 6 : 4
hexane/acétate d'éthyle (AcOEt) pour donner 1e 15-hydroxypentadécanoate de
méthyle avec un rendement de 80%.
1H RMN (CDCl3) : 8 (ppm) 1,29 (m, 20H, (CH2)10), 1,5-1,6 (m, 4H, H-2 et H-13),
2,30 (t, 2H, J-- 7.60 Hz, H-I4), 3,64 (t, IH, J-- 5,84 Hz, H-1), 3,67 (s, 3H,
H-16).
c) Syntèse de la N octadécyl-IS-hydroxypentadécanamide
On fond lOg de 15-hydroxypentadécanoate de méthyle obtenu à l'étape précédente
b)
(36,85 mmol) et 19,86 g d'octadécylamine (73,70 mmol) à 150°C sous
vide. Au bout
de 24 heures, le mélange est refroidi et dilué par du dichlorométhane. On
obtient un
précipité qui est filtré sur Büchner. Le solide obtenu est ensuite
recristallisé dans le
méthanol pour donner la N-octadécyl-15-hydroxypentadécanamide avec un
rendement de 100 %.
1H RMN (CDC13) : b (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6.96 Hz, H-33), 1,26 (m, 54H,
(CH2)27), 1,4-1,6 {m, 6H, H-2, H-13 et H-17), 2,30 (t, 2H, J-- 7.60 Hz, H-14),
3,25
(m, 2H, H-16), 3,64 (t, 2H, J-- 5.84 Hz, H-I), 5,39 (bande NHCO).
13C ~N (CDC13) : 8 (ppm) 14,48 (C-33), 25,3 et 26,3 (C-2 et C-13), 29,72
((CH2)27)), 36,7 et 34,8 (C-I4 et C-16), 63,6 (C-1), 174,31 (CO).
d) Synthèse du 15-octadécylamino pentadécanol
A une solution de 20 g de N-octadécyl-15-hydroxypentadécanamide obtenu à
l'étape
précédente c) (39,22 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (250 ml), on
ajoute
2,98 g d'hydrure de lithium aluminium LiAIH; (78,44 mmol). La réaction se fait
à
reflux pendant 10 heures. Après avoir refroidi le mélange réactionnel, on
ajoute
successivement de l'eau (2,98 ml) et de la soude 2N (2,98 ml}. Après 10
minutes, on
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rajoute de l'eau {2,98 ml). Le précipité formé est filtré sur Büchner et le
filtrat est
concentré à l'évaporateur rotatif pour donner le 1 S-octadécyiamino-
pentadécanol.
1H RMN (CDCI,) : 8 (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m, S4H,
(CH2)27), 1,43-I,59 (m, 7H, H-2, H-14, H-17 et bande NH), 1,S-1,6 (m, 4H, H-2
et
S H-13), 2,60 (t, 4H, J-- 6,50 Hz, H-1S et H-16), 3,64 (t, 2H, J-- 5,84 Hz, H-
I).
13C ~N (CDC13) : 8 {ppm) 14,48 (C-33), 25,3 et 26,3 (C-2 et C-14), 29,72
{(CH2)27)), 51,7 (C-1S et C-16), 63,6 (C-1).
e) Synthèse du N ~benzyloxycarbonylJ-15-octadécylamino pentadécanol
On ajoute goutte à goutte 7,$9 ml de chloroformate de benzyle {SS,26 mmol) à
une
solution refroidie à 0°C de 1 S-octadécylamino-pentadécanol obtenu à
l'étape
précédente d) (13,71 g ; 27,63 mmol) et de triéthylamine (7,7 ml ; SS,26 mmol)
dans
du dichlorométhane sec ( 1 SO ml). Après 10 minutes, on vérifie le pH du
mélange. Le
mélange réactionnel est ensuite laissé à température ambiante pendant une
nuit. Puis,
la solution est lavée par de l'eau, séchée sur sulfate de magnésium (MgSO~) et
1 S concentrée. Le mélange réactionnel est purifié par chromatographie
(heptane/AcOEt
6 : 4). On obtient le N-[benzyloxycarbonyl]-1S-octadécylamino-pentadécanoi
avec un
rendement de 70%.
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,88 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,26 (m, S4H,
(CH2)27), 1,43-1,59 {m, 6H, H-2, H-14, H-17), 3,20-3,22 (m, 4H, H-1S et H-16),
3,64 (t, 2H, J-- 5,84 Hz, H-1), 5,12 (s, 2H, OCH2Phe), 7,34 (m, SH, Phe).
13C ~N (CDCl3) : S (ppm) 14,48 (C-33), 25,8, 26,9 et 31,94 (C-2, C-14 et C-
17),
29,72 ((CH2}27)), 47,26-48,04 (C-1S et C-16), 63,08 (C-1), 66,79 (OCH2),
128,40
(Phe).
fj Synthèse du 2,3,4-tri-O-acétyl6-désoxy-j3-L-galactopyrannoside du IS-~N
2S (benzSyloxycarbonyl)-octadécylaminoJ pentadécanyle
I,S g de fucose tétraacétylé (4,52 mmol) sont mis à réagir avec 0,634 ml de
tétrachlorure d'étain (5,42 mmol) dans de l'acétonitrile séché (SO ml) pendant
30
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4S
minutes. Puis on ajoute 3,132 g de N-[benzyloxycarbonyl]-1 S-octadécylamino-
pentadécanol obtenus à l'étape précédente e) (4,97 mmol). Aprés S heures, la
réaction
est extraite et le produit obtenu est alors purifié par chromatographie
(heptane/acétate
d'éthyle 6 : 4). Le rendement est de 69 %.
S 1H RMN : 8 (ppm) 0,87 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J-- 6,51 Hz, H-
6), 1,25
(m, S4H, (CHZ)27), 1,52 (m, 6H, OCH2CH2, H-14 et H-17), 1,95, 2,OS et 2,15 (s,
3H, OCOCH3), 3,14-3.25 (m, 4H, H-1 S et H-16), 3,44 (m, 1 H, OCHaCH2), 3,63
(m,
1 H, OCHbCH2), 3, 79 (m, 1 H, H-S), 4,41 (d, 1 H, J 7, 98 Hz, H-1 ), 4,99 (dd,
1 H, J--
3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), 5,09 (s, 2H, OCHzPhe), 5,16 (dd, 1H, J-- 7,98 Hz et
10,46
Hz, H-2), 5,23 (dd, J-- 3, 52 Hz et 3, 31 Hz, H-4), 7.32 (m, SH, Phe).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 14,68 (C-33), 17,31 (C-2), 20,75 (CH3C00), 27,29
(C-6), 29,72 ((CH2)27)), 25,89-31,98 (OCH2CH~, C-14, C-17), 47.25-48.04 (C-1S
et
C-16), 66.91 (CH2Phe), 69,63 (OCH2CH2), 69,45 (C-2), 70,57 (C-S), 70,85 (C-4),
71,44 (C-3), 96,25 (C-I), 128.43 (Phe), 156.21 et 171,30 (CO).
1 S g) Synthèse du 2,3,4-tri-O-acéty! 6-désoxy-[i-L galactopyrannoside du 15-
octadécylamino pentadécanyle
A une solution de 2,3,4-tri-D-acétyl-6-désoxy-~i-L-galactopyrannoside du 1 S-
[N-
(benzyloxycarbonyl)-octadécylamino]-pentadécanyle obtenu à l'étape précédente
f)
(2,72 g ; 4,23 mmol) dans du méthanol ( 100 ml), on ajoute du palladium sur
charbon
actif à 10% (O,S g) sous pression d'hydrogène. La réaction est quantitative.
1H RMN : 8 (ppm) 0,87 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J-- 6,51 Hz, H-
6), 1,25
(m, S4H, (CH2)27), 1,52 (m, 6H, OCH2CH2, H-14 et H-17), 1.88-1.93 (bande
NH),1,95, 2,OS et 2,15 (s, 3H, OCOCH3), 2,64 (m, 4H, H-1S et H-16), 3,46 (m,
1H,
OCHaCH2), 3,63 (m, 1H, OCHbCH2), 3,79 (m, 1H, H-S), 4,41 (d, IH, J-- 7,98 Hz,
2S H-I), 4,99 (dd, 1H, J-- 3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), 5,16 (dd, 1H, J-- 7,98
Hz et 10,46
Hz, H-2), 5,23 (dd, J-- 3, 52 Hz et 3, 31 Hz, H-4).
13C RMN (CDCh) : 8 (ppm) 14,68 (C-33), 17,31 (C-2), 20,75 (CH3C00), 27,29
(C-6), 29,72 ((CH2}27)), 25,89-31,98 (OCH2CH2, C-I4, C-17), 47.75-48.04 (C-IS
et
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C-I6), 69,63 (OCH2CH2), 69,45 (C-2), 70,57 (C-S), 70,85 (C-4), 71,44 (C-3),
96,25
(C-1), 171,30 (CO).
I:) Synthèse du 2,3,4-tri-O-acétyl-6-désoxy-(3-L galactopyrannoside du (3-~4-
(3-
amino propyl amino)-butyl amine propyl ben~yloxycarbonyl-aminoJ-métliylene -
S carbamoyl)-1 S pentadécanyl-16-octadécanyle
A une solution de 0,60 g du composé obtenu à l'étape précédente g) (0,94 mmol)
dans
du chloroforme ( 1 S ml), on ajoute successivement de la düsopropyléthylamine
(0,491
ml ; 2,82 mmol), du BOP (0,457 g ; 1,03 mmo() et devl'acide {3-[4-(3-
benzyloxycarbonyl-amino-propyl-benzyloxycarbonyl-amino)-butyl-
benzyloxycarbonyl-amino)-propylamino}-acétique obtenu à l'étape a) (0,748 g ;
0,94
mmoi). L'huile résultante est purifé par chromatographie (heptane/acétate
d'éthyle 4
6). On obtient le 2,3,4-tri-O-acétyl-6-désoxy-~3-L-galactopyrannoside du (3-[4-
(3-
amino-propyl-amino)-butyl-amino-propyl-benzyloxycarbonyl-amino)-méthylene-
carbamoyl}- I S-pentadécanyl- I 6-octadécanyle avec un rendement de 45 % .
1H RMN : 8 (ppm) 0,87 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 3H, J-- 6,51 Hz, H-
6), 1,24
(m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 1SH, OCH2CH~, H-14, H-17, NH, CH2), 1,95,
2,OS et 2,1 S (s, 3H, OCOCH3), 3,OS-3,35 (m, 18H, H-1 S, H-16 et CH2N), 3,43
(m,
1 H. OCHaCH2), 3,67 {m, 1 H, J-- 6. 74 Hz, OCHbCH2), 3,79 (m, I H, H-S), 4,41
(d,
IH. J-- 7,98 Hz, H-1), 4,99 (dd, 1H, J--~ 3,52 Hz et 10,46 Hz, H-3), S,OS (s,
8H,
CH~Phe), 5,16 (dd, IH, J-- 7,98 Hz et 10,46 Hz, H-2), 5,23 (dd, J-- 3,52 Hz et
3,3IHz, H-4), 5,47 (bande CONH, 1H), 7.32 (m, 20H, Phe).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 14,84 (C-33), 20,75 (CH3C00), 27,29 (C-6'), 29,72
((CHZ)27)), 25,89-31,98 (OCH2ÇH2, C-14, C-17 et CH2), 37.87-46.87 (C-1S, C-16
et C-N), 66,84 (CH~Phe), 68,63 (OÇH2CH2), 69,45 (C-2), 70,57 (C-S), 70,85 (C-
4),
2S 71,44 (C-3), 96,25 (C-1), 128,31 (Phe), IS7,01 et 171,30 (CO).
i) Synthèse du 6-désoxy-j3-L galaetopyrannoside du 1-~ (3-~4-(3-amino propyl
amïno)-butyl amino propyl-benTyloxycarbonyl aminoJ-méthylène -carbamoyl)-15-
pentadécanyl 16-octadécanyle
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A une solution méthanolique (3 ml) contenant le produit obtenu à l'étape
précédente
h) (0,60 g ; 0,94 mmol) on ajoute une solution méthanolique (1 ml) saturée
d'ammoniac. Après une heure, on concentre.
iH RMN : 8 (ppm) 0,87 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 2H, J-- 6,51 Hz, H-
6), 1,24
(m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 15H, OCH2CH2, H-14, H-17, NH, CH2), 3,05-
3,35 (m, 18H, H-I5, H-16 et ÇHzN), 3,4-3,7 {m, 6H, OCH2CH2, H-3, H-4, H-5, H-
2), 4,73 (d, 1H, J-- 7,98 Hz, H-1), 5.,05 (s, 8H, CH2Phe), 5,47 (bande CONH,
IH),
7.32 (m, 20H, Phe).
j) Synthèse du 6-désoxy-(3 L galactopyrannoside du 1-~ (3-J4-(3-amino propyl-
amino)-butyl-amino propyl-aminoJ-méthylène-carbamoyl)-IS pentadécany! 16-
octadécanyle (composé 3)
A une solution du produit obtenu à l'étape précédente i) (0,072 g ; 0,05
mmol), on
ajoute du palladium sur charbon à 10% (0,032 g) dans du méthanol. Après une
nuit,
on filtre sur papier en verre et on concentre à l'évaporateur rotatif. Le
produit est
ensuite purifié par CLHP sur une colonne préparative de type C-4.
iH RMN : 8 (ppm) 0,87 (t, 3H, J-- 6,96 Hz, H-33), 1,2 (d, 2H, J 6,S1 Hz, H-6),
1,24
(m, 54H, (CH2)27), 1,39-1,67 (m, 15H, OCH2ÇH2, H-14, H-17, CH2), 2,92-3,19 (m,
18H, H-I5, H-16 et ÇH2N), 3,4-3,7 (m, 6H, OCH2CH2, H-3, H-4, H-5, H-2), 4,73
(d, 1 H, J 7, 98 Hz, H-1 ).
C \ UTILISATION DES AGENTS DE TRANSFERT SELON L'INVENTION
Exemple 4 : préparation de complexes agent de transfert/acide nucléique avec
le
composé 2 et mesure de leur taille
Cet exemple illustre la préparation de complexes entre un agent de transfert
selon
l'invention et un acide nucléique, leur taille ayant ensuite été mesurée.
Le glycolipide utilisé dans cet exemple et dans les exemples qui suivent est
le
composé 2 , en solution dans du chloroforme, à une concentration de 10 mg/ml.
Dans
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48
certains cas, un co-lipide neutre, cholestérol ou DOPE, a été préalablement
mélangé
au composé 2.
La solution lipidique est préparée de la façon suivante : un échantillon de
quantité
désirée est prélevé, le solvant est évaporé sous flux d'argon et on laisse
sécher pendant
1 heure. Puis, le lipide est réhydraté avec une solution contenant du dextrose
S% et
mM de chlorure de sodium pendant toute une nuit à 4°C. Le jour suivant,
les
solutions lipidiques sont chauffées à 60°C pendant 5 minutes puis
passées aux
ultrasons pendant 1 minute. L'opération est répétée jusqu'à ce que Ia taille
des
particules lipidiques soit stable.
10 L'ADN utilisé est le plasmide pXL3031 (figure 1) en solution dans un
mélange de
dextrose 6% et de chlorure de sodium 10 mM à une concentration de 0,5 mg/ml ou
de
1,0 mg/mI. Ce plasmide contient le gène luc codant pour la luciférase sous
contrôle
du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus. Sa taille est de 3671 bp. Le schéma
de
ce plasmide est représentée à la figure 1. Le plasmide pXL3031 a été purifié
selon les
méthodes décrites dans la demande de brevet WO 97/35002.
Les complexes composé 2/ADN sont préparés en mélangeant rapidement des volumes
appropriés de solution d'ADN plasmidique et de composé 2 (selon le rapport de
charges désiré), à température ambiante. La quantité d'agent transfectant
varie entre
0,26 nmoles/pg d'ADN et 12 nmoles/pg d'ADN.
La taille des complexes a été analysée en mesurant le diamëtre hydrodynamique
par
diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Laser Light Scattering) à l'aide
d'un
appareil Coulter N4Plus. Les échantillons sont dilués 20 fois dans une
solution
contenant 6% de dextrose et 20 mM de chlorure de sodium pour éviter les
diffusions
multiples.
A un rapport de 3 nmoles de lipide/pg d'ADN, les résultats suivants ont été
obtenus
Taille en nm
Micelles 130 nm
formulation avec du Cholestrol153 nm
Formulation avec de la 137 nm
DOPE
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Le terme "micelles" indique que le composé 2 a été utilisé seul, c'est-à-dire
sans ajout
de co-lipide neutre, et il forme donc une solution micellaire.
Ce tableau montre que les complexes obtenus ont une taille comprise entre 130
nm et
150 nm environ, ce qui est compatible avec une utilisation pharmaceutique,
notamment en injection.
Exemple 5 : Comportement des complexes formés à partir du composé 2 à
différents rapports de charge
Cet exemple illustre le comportement des complexes agent de transfert selon
finvention/acide nucléique lorsqu'on fait varier !e rapport de charge.
L'impact de
l'ajout d'un co-lipide (cholestérol ou DOPE) est également illustré.
De façon classique, on distingue 3 phases physico-chimiques lorsqu'on augmente
le
rapport de charges agents de transfertJADN (B. Pitard et al., Virus-sized self-
assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles
promote
gene transfer, PNAS, Vol. 94, pp. 14412-14417, 1997). Ces trois phases
déterminent
I 5 le potentiel thérapeutique de l'agent de transfert.
A faible rapport de charge, l'ADN n'est pas saturé par l'agent de transfert.
Il
reste encore de l'ADN non-complexé, et les complexes sont globalement chargés
négativement et de petite taille. Cette phase, stable, est appelée "Phase A".
Le fait que l'ADN ne soit pas complètement saturé par l'agent de transfert
signifie que
l'ADN n'est pas complètement protégé. L'ADN peut donc être soumis aux
dégradations par les nucléases. Par ailleurs, les complexes étant globalement
négatifs,
le passage de la membrane cellulaires est difficile. Pour ces raisons, les
complexes
nucléolipidiques de la phase A sont relativement inactifs.
A rapport de charge intermédiaire, l'ADN est complëtement saturé par l'agent
de transfert, et les complexes sont globalement neutres ou légèrement
positifs. Cette
phase est instable car les répulsions ioniques sont minimales et un phénomène
de
d'agrégation peut se produire. La taille des particules est bien au dessus de
la limite
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WO 00/32803 PCT/FR99/02995
de détection par diffusion dynamique de la lumière (très supérieure à 3 um).
Cette
phase instable est appelée "phase B". Une telle taille de complexes n'est pas
adaptée
pour des utilisations en injection, bien que cela ne signifie pas que les
complexes
soient inactifs dans la phase B : ils sont seulement sous une formulation qui
n'est pas
5 appropriée pour leur injection dans un but pharmaceutique.
A rapport de charge plus élevé, l'ADN est sursaturé par l'agent de transfert,
et
les complexes sont globalement positifs. Du fait des fortes répulsions entre
les
charges positives, cette phase est stable. Elle est désignée sous le nom de
"phase C".
Contrairement à la phase A, les complexes obtenus sont sous une forme telle
que
10 l'ADN est très bien protégé vis-à-vis des nucléases, et la charge
globalement positive
de ces complexes facilite la fixation sur la membrane cellulaire de nature
anionique et
le passage de cette membrane. Les complexes de la phase C sont donc
particulièrement adaptés à une utilisation pour le transfert d'acides
nucléiques dans les
cellules.
I S Ces 3 zones A, B et C ont été également mises à jour avec le composé 2
selon
l'invention comme agent de transfert
Rapport 025 0,50,75 1 1,5 2 3 4 6 8 10 I2
de
charges
Micelles A A B B B B C C C C C C
+ CholestrolA A B B B C C C C C C C
+ DOPE A A B B B C C C C C C C
Comme le montre le tableau ci-dessus, la zone B, qui est la zone
d'instabilité, est
particulièrement petite et se situe à des rapports de charge très faibles. La
zone C
commence dès 2 nmoles de lipide/pg d'ADN lorsque le composé 2 est utilisé
20 conjointement à un co-lipide {Cholestérol ou DOPE), et à partir de 3 nmoles
de
lipide/pg d'ADN lorsque le composé est utilisé seul. Comme cela a été précisé
précédemment, c'est dans cette zone qu'il est particulièrement avantageux de
se placer
pour une utilisation pharmaceutique.
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SI
A titre de comparaison, il a été montré avec un des lipides cationiques
divulgué dans
la demande WO 97/18185 que la zone C commençait à se former à des rapports de
charge au moins égal à 2 selon la concentration en chlorure de sodium de la
solution
(voir figure 3A dans B. Pitard et al., PNAS USA, 94, pp. 14412-14417, 1997).
Ainsi, le composé 2 est un agent de transfert particulièrement avantageux car
il est
stable à de faibles rapports de charge, ce qui permet de former des complexes
stables
avec de faibles quantités de glycoli~pides, avec les conséquences bénéfiques
qui en
découle sur le plan de la toxicité.
Exemple 6 : utilisation du composé 2 pour le transfert in vitro d'ADN
I O Cet exemple illustre la capacité des agents de transfert selon l'invention
à transfecter
l'ADN dans les cellules in vitro, à différents rapports de charge, en
l'absence et en
présence d'un co-lipide neutre (cholestérol ou DOPE).
Des microplaques de 24 puits sont ensemencées avec 60000 cellules HeLa par
puit, et sont mises en croissance une nuit. Le nombre de cellules après une
nuit, et
donc au moment de la transfection, est de 100000 cellules par puit.
Chaque puit est mis en contact avec les complexes formés avec le composé 2 et
contenant 1 pg d'ADN plasmidique dans 0,5 ml de milieu de culture DMEM
(Gibco/BRL sans sérum.. Les cellules sont incubées à 37°C pendant 5
heures. Le
milieu contenant les complexes est ensuite enlevé et remplacé par un milieu de
culture DMEM et 10% de sérum de veau foetal. Puis, les cellules sont à nouveau
mises en culture pendant 24 heures. Enfin, les cellules sont lysées et testées
en
utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex MLX.
Les résultats obtenus sont indiqués sur l'histogramme de la figure 2.
L'efficacité du
transfert est représentée par l'expression de la luciférase en pg/puit. On
constate que la
transfection maximale est de 500 pg/puit environ.
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En conclusion, cet exemple montre clairement qu'il est possible d'utiliser le
composé
2 selon l'invention pour former des complexes susceptible de promouvoir le
transfert
de l'ADN dans les cellules in vitro.
Exemple 7 : utilisation du composé 2 pour le transfert in vivo d'ADN
Cet exemple illustre la capacité des agents de transfert selon l'invention à
transfecter
l'ADN dans les cellules in vivo.
Le transfert de gène in vivo a été effectué sur des souris Balb/C par
administration
intratrachéale, intraveineuse et intramusculaire.
Dans le cas des injections intramusculaires, chaque souris a reçu 30 pl de
formulation
contenant 15 p.g d'ADN plasmidique dans le muscle antérieur du tibia. Les
tissus sont
récupérés 7 jours après l'injection, ils sont congelés et stockés à -
80°C en attendant
d'effectuer les tests d'activité luciférase.
Dans le cas des injections par voie intraveineuse, chaque souris a reçu 200 pl
de
formulation contenant 50 pg d'ADN plasmidique. Les tissus sont récupérés 24
heures
après l'injection, puis sont congelés et stockés de la même façon que
précédemment.
La figure 3 illustre l'activité des complexes formés avec le composé 2 pour le
transfert
de gène in vivo en intramusculaire. Ces résultats montrent clairement que la
formation
de complexes avec le composé 2 selon l'invention et de l'ADN permet de
promouvoir
le transfert dudit ADN dans les cellules in vivo.
De la même façon, on peut utiliser tout agent de transfert tel que défini dans
la
présente invention pour promouvoir le transfert d'ADN dans les cellules de
tout type
de tissus.
