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POLYNUCLÉOTIDE ET PROTÉINE IMPLIQUÉS DANS LA
SYNAPTOGEN~SE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention
La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant
pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est
associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies
psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et
thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
b) Brève descriution de l'art antérieur
L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et
principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les
critères
cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans
l'ouvrage DSM-IV-TRT"" (Diagnostic and statistical manual of mental disorders,
2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des
études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme.
Ä partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe ef al. (Human Molecular
Genetics, 1999, 8:805-812) décrit 11 régions chromosomiques susceptibles
d'être impliquées dans le développement de l'autisme parmi lesquelles une
région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genet., 1999,
104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des
patients atteints d'autisme et Milunsky et al. (Clin. Genet., 1999, 55:455-
460)
décrit des délétions en Xp22 chez des patients atteints de schizophrénie et
suggère plus précisément l'implication d'une délétion en Xp22.3 dans le
développemént de la cette maladie psychiatrique. Toutefois, ni le gène
impliqué
dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
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Les neuroligines (HNLs) sont des protéines d'adhésion cellulaire qui
peuvent déclencher à elles seules la synaptogenèse c'est-à-dire la formation
de
synapses (Scheiffele et al., Cell, 2000, 101:657-669). Une protéine HNL4
(Human Neuroligline-4) a été décrite par Bollinger et al. (Biochem. J. 2001,
356:581-588) sans description génomique ni fonction biologique associée.
D'autre part, la base de données LOCUSLINKT"" (htta://www.ncbi.nim.nih.giov)
du
13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951
des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en
outre inconnue.
Au vu de ce qui précède, il est clair que la connaissance des bases
moléculaires de l'autisme et tout particulièrement du gène impliqué dans la
maladie est fortement souhaitée afin de permettre de développer de nouvelles
approches thérapeutiques, de nouveaux médicaments et des tests
diagnostiques.
II existe également un besoin concernant l'identification de la fonction
biologique des neuroligines ainsi que l'identification de la séquence
nucléique et
protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL4.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme
cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la
présente description de l'invention.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant
pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est
associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies
psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également un gène codant pour une protéine
appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus
particulièrement la protéine HNL4 et son homologue fonctionnel HLNS codé par
un gène du chromosome Y, les applications diagnostiques et thérapeutiques
liées à l'identification du gène et de ses mutations, de même que des méthodes
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de tri de molécules interagissant avec les produits d'expression du gène selon
l'invention.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène
HLN4.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une
synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
La Figure 4 est un schéma qui montre la localisation chromosomique et
l'évolution des gènes HNL4 et HNLS.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes
Neuroligines humaines.
Les Figures 6a, 6b et 6c montrent le résultat de l'analyse par SSCP
(Single Strand Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène
codant pour la protéine HNL4 ainsi que la séquence de cette mutation.
La Figure 7 est un schéma qui montre la localisation de la protéine HNL4
et les effets de la mutation sur HNL4.
La Figure 8 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 1) du gène
humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 9 représente la séquence d'ADN complémentaire
(SEQ ID NO: 2) du gène humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3)
de la protéine humaine HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 11 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 4) du gène
humain HNLS.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc)
(SEQ ID NO : 5) du gène humain HNLS sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 6)
de la protéine humaine HNL5 sauvage.
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La Figure 14 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc)
(SEQ ID NO : 7) d'un transcrit alternatif du gène humain HNL5 sauvage.
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 8)
correspondant à la séquence alternative de la Figure 14.
' La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 9)
de la protéine humaine HNL4 mutée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la
séquence génomique du gène HLN4 localisé en Xp22.3 ainsi que l'identification
d'un homologue fonctionnel HNLS placé sur le chromosome Y localisé en
Yq 11.22.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication de la protéine
HNL4 dans la synaptogenèse c'est-à-dire la dernière étape du développement du
système nerveux central.
Selon un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide isolé
ou purifié, qui, dans sa forme sauvage, est impliqué dans la synaptogenèse,
dont
au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au
développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au
développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques et plus
particulièrement l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Préférablement, le
polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus
préférablement
en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore
plus préférablement polypeptide consiste en la protéine HNL4 ou la protéine
HLNS. Avantageusement, le polypeptide de l'invention comprend une séquence
choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la
SEQ ID N0:8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100
acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6
ou de la SEQ ID N0:8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les
polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage HNL4 ou HNLS.
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Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une
protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence
peptidique substantiellement identique, au moins en partie, à la séquence
peptidique de la protéine sauvage. II peut s'agir par exemple de polypeptides
5 modifiés chimiquement ayant une séquence peptidique 100% identique à une
portion de la protéine sauvage. II peut s'agir aussi de polypeptides hybrides
ayant
une première portion 100% identique à une première portion de la protéine
sauvage et une seconde portion aucunement/partiellement identique à une
seconde portion de la protéine sauvage. II peut s'agir encore de polypeptides
ayant une homologie totale/partielle avec une portion de la protéine sauvage.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage, on entend tous
les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine
sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution
de un
ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. II peut également
s'agir
d'une modification apportée par l'addition de chaînes carbonées fixées sur au
moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des
acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une
modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus
particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la
protéine humaine HNL4 ou HNLS. Selon un mode de réalisation privilégié, le
polypeptide muté selon la présent invention possède la SEQ ID N0:9 ou une
séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés
consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID N0:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui
sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus
particulièrement
un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la
synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est
associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une
prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies
psychiatriques.
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Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par
l'homme de leur état natif, c.-à-d., si une telle molécule existe dans la
nature, elle
a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un
polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme
vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucléotide ou polypeptide
lorsque
séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification
et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme
étant "isolé". D'ailleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est
introduit dans
un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe
quelle
autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit
organisme.
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN
possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant
pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules
d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci
inclut les
molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées
(ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. II va de
soi
que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux-
polynucléotides selon la présent invention
Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon
l'invention code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la
SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 ou pour un fragment de cette protéine.
Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe
constitué par: la SEQ ID N0:1, la SEQ ID N0:2, la SEQ ID N0:4, la
SEQ ID N0:5, la SEQ ID N0:7, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au
moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ
ID N0:1 ou la SEQ ID N0:2.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une
protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour
une protéine HLN4 mutée et il est muté de telle sorte que la mutation provoque
une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide
de l'invention comprend la SEQ ID N0:1 et la mutation consiste est une
insertion
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d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9
(ORF).
Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue
de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison
précoce de la protéine (D396stop).
Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent
être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus
par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie
biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures
cellulaires
appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon la présente
invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela
est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura
obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également
déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux
qui
ont une activité biologique adéquate.
Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage etlou
d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par
un
tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression
de
la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation
d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide
d'un
vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences
d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de
l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le
milieu
de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de
peptides
dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera
pas
décrite plus en détail.
Les polypeptides et polynucléotides de la présente invention peuvent aussi
être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables
de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un
polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise
donc
également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des
techniques
très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et
Milstein
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(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined
specificity,
Nature (1975), 262:495-4.97).
Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention
des pathologies biochimiques ou des maladies mentales tels que l'autisme ou le
Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation
d'un
polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la
synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion
cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des
Neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en
la protéine HNL4 ou la protéine HLNS. Des exemples de polynucléotides non
mutés sont donnés précédemment.
L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion
dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide
codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine
HNL4. Préférablement les cellules dans lequel le polynucléotide est inséré
sont
des cellules souches. Des exemples de polynucléotides satisfaisant sont
données précédemment.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de
cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour
une
protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant:
a) l'utilisation de cellules souches du patient;
b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide
codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse
tel que la protéine NHL4; et '
c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape
b).
Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de
traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs
facteurs, les polynucléotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer
dans
les cellules et le mode et la quantité de polynucléotides ou de cellules
devant être
administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la
nature du traitement, la séquence exacte des polynucléotides; le stade de la
maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
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Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter
des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, une
prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une
maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Le procédé
comprend au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour
une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un
fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce
gène;
- la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la
synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la
synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la
synaptogenèse
Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé comprend:
a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la
synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou
l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et
b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la
séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN
messager.
Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse)
pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des
synapses,
d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou
d'une
maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale. Selon un mode
de réalisation préféré, le kit comprend au moins un des éléments choisi dans
le
groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support
solide, ces
éléments permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour
une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un
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fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce
gène; et/ou
ü) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la
synaptogenèse.
5 Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le
kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus
préférablement pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines
humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL4 ou la protéine
HLNS.
10 Avantageusement, le gène code, dans sa forme sauvage, pour une
protéine comprenant la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8. Plus
préférablement, le gène comprend la SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:4.
La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au
développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger ouvre la porte à la
découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter
la
maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de
molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide
codé par le polynucléotide tel que défini précédemment, ou l'activité
biologique
du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation
privilégié, le procédé de tri comprend:
a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de
moduler son activité biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et
c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de
l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
L'exemple qui suit permettra de mettre en 'évidence d'autres
caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLE
L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4 et HNL5 sont
spécifiques des primates bien qu'absents chez les singes du nouveau monde.
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Alors que tous les gènes du chromosome Y ont commencé à diverger de leur
homologue sur le chromosome X il y a 40 millions d'années, le gène HNL5 est le
plus fortement conservé (Table 1 ).
Table 1: conservation
des gnes
HNL4 et HNL5
au cours
de l'volution.
Gene pair Ks KA ~~ Ks/KA DNA Protein SAquence
dlv~rgencedivergencecompared
_ (%) (%,~ (nucleotidesj
~ ,
Croup 4
GYG2/GYG2P' 0.11 0.06 1.8 7 1 2 . 525
ARSD/ARSDf'" 0.09 0.07 1.3 7 13 846
ARSFJARSEP' 0.05 0.04 1.2 4 9 615
PRKXIY 0,07 0.03 2.3 5 8 1020
HNL4/5 0.079 0.012 6.456 3 2 2451
STS/STSP' 0 .12 0 .10 1. 2 1 1 1 B 8 5 2
KAL1/KALP' 0.07 0.06 1.2 6 12 1302
AMELX/Y __0.07 0.07 1.0 7 12 576
Croup 3 ~ "'
T84X/Y 0.29 0.04 7.3 7 7 135
EIF1AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432
ZFX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394
DFFRX/Y 0 . 0 . 6 . 1 1 9 7 6'71
3 3 0 S 6
DBX/Y 0.36 0.04 9.0 12 9 1932
CASK/CASKP' 0.24 0.22 1.1 15 32 156
UTX/Y 0.26 0.08 3,3 12 16 4066
Croup 2
UBE1X/Y ' 0.5$ 0.07 8.3 16 13 693
.
SMCX/Y 0.52 0.08 6.5 17 15 4623
Croup r
RPS4X/Y 0.97 0.05 ~ 19 18 18 7g2
RBMX/Y 0.94 0.25 3.S 29 38 1188
SOX3lSRY 1.25 0.19 6.6 2B 29 264
PCDHX/Y 0_006 0.008 0.808 1 2 2850
Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes
(KA) de tous
les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y.
Le rapport
25 KS/KA est une indication de la conservation des gènes. KS est le taux de
substitution synonyme
par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la
séquence de la
protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme
qui représente les
modifications qui changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1
alors le gène n'est
pas conservé car il y a autant de modification synonymes et non-synonymes.
C'est le cas pour les
30 couples X/Y possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y
(par ex.
KAL1/KALP*). Si KS/KA >1, alors le gène varie au cours de l'évolution mais la
protéine est bien
conservée. C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la variation
génétique entre ces
gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences
protéiques de HNL4
et HNLS.
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Pour la détection de mutations sur le gène HNL4, les étapes suivantes ont
été utilisées:
Matériels et Méthodes
Identification de la séguence des Qènes HNL4 et HNL5
L'isolement des gènes HNL4 et HNL5 a été effectué par l'analyse
informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par
l'arnpli~cation
des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux.
Analyse informatique
Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du
microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du
génome humain (http://genome.usc.edu et http//www.ensembl.org/
genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le marqueur génétique qui montre
la liaison la plus significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et
al.
(1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était
localisé
dans un gène putatif KIAA1260 et qu'il y existait un homologue putatif
KIAA0951
localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant
pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de la séquence génomique.
Une analyse par alignement de séquence (BLAST) et un arbre phylogénétique
regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que
KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de . la famille des
neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4 et HNLS.
Analyse des transcrits HNL4 et HNL5
Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes
(n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux.
Les
ADNc complets des ARNm HNL4 et HNLS ont été retrotranscrits, amplifiés et
directement séquencés. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et
le
séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
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Séauencaae des gènes HNL4 et HNL5 chez les sujets autistes et Asperger
Chaque exon des gènes HNL4 et HNL5 a été amplifié et séquencé à partir
de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués
dans le Tableau 3.
Tableau 2. Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et
séquencer les ADNc de HNL4 et HNLS.
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXY4 GCTCTGAATGATGGCCTTCTG
Exons 4-6 HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces dégénérées, utilisation du code universel : M(AC), R(AG),
W(AT), S(CG),
Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT)
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Tableau 3. Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les
gnes HNL4 et HNLS.
Exons Amorces Squences
Exon 1 HNL4 HNLXE1 F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC
HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA
Exon 1 HNLS HNLYE1 F GGGGTGCTTCTTTTGGGAGGCT
HNLXYE1R CACGGGAAAGGGGTGCATGGA
Exon 2 HNL4/5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG
Exon 3 HNL4/5 HNLXYE3F TGTGTTTCCGTACTTGGCTTT
HNLXYE3R GCTTAGTCATTCACATGATGAA
Exon 4 HNL4 HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT
HNLXYE4R TTCTTGGTTCAGGGTATTTGC
Exon 4 HNLS HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT
HNLXYE4R TTCTTGGTTCAGGGTATTTGC
Exon 5 HNL4/5 HNLXYESdF TGTCCRCAATTTTGCACCTGC
HNLXYESdR AGGAYAGTGATACCCCAACA
Exon 6 HNL4/5 HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces code universel : M(AC), R(AG),
dgnres, utilisation W(AT), S(CG),
du
Y(CT), K(GT), V(ACG),
H(ACT), D(AGT),
B(CGT), N(ACGT)
Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique
des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont
été amplifiées.
Ainsi, 44 garçons et 22 filles autistes ont été testés pour la majorité de la
partie codante HNL4/5.
Chez une famille suédoise, une mutation insT1186 provoquant une
terminaison précoce D396stop de la protéine a été identifiée. Elle est
localisée
dans l'exon 5 de HLN4 et, par conséquent, engendre la production d'une
protéine
tronquée dépourvue de son domaine transmembranaire essentiel pour sa
fonction de protéine d'adhésion. Cette mutation coïncide parfaitement avec le
syndrome en ce qu'elle est présente chez la mère et les deux enfants atteints
alors qu'elle est absente chez le frère sain. Plus précisément, un des enfants
présente le syndrome d'Asperger (DSM-IV-TRT"", 2000, pages 80-84) alors que
CA 02364106 2001-11-30
le second est autiste. De plus, cette mutation est apparue de novo car elle
est
absente chez les grands parents maternels.
D'autre part, le ratio garçon/fille, lequel est de quatre pour l'autisme et de
neuf pour de Syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle
5 HLN4/5 influe sur la synaptogenèse et la mutation de HLN4/5 constitue un
facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le
Syndrome d'Asperger.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des
primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans
10 la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées
dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première
mutation
décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose
tuberculeuse, etc.).
