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CA 02364562 2001-09-18
WO 00/61726 PCT/FR00/00879
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COMPOSITION DESTINEE A LA CONSERVATION D'ADENOVIRUS
RECOMBINANTS INFECTIEUX
La présente invention concerne la conservation d'adénovirus sous une forme
stabilisée
et stockable et les compositions liquides ou congelées destinées à cette
conservation.
s La conservation d'adénovirus dans des compositions stables est un problème
connu,
qui a fait l'objet de nombreuses études, sans pour autant donner des résultats
véritablement satisfaisants jusqu'à présent. Les virus recombinants ne sont en
effet
utilisables que si l'on parvient à les stocker sans dégradation et sans perte
de leur
pouvoir infectieux.
lo L'état physique des particules adénovirales, en solution, subit deux types
d'altérations
simultanément et rapidement au cours du temps : d'une part une agrégation
(coagulation) des particules sous forme d'amas ou de filaments, qui est un
phénomène
extrêmement grave car il est irréversible, et d'autre part une désintégration
de la
structure icosahédrale des capsides elles-mêmes (par une lyse des capsides et
libération
15 des capsomères dans le milieu).
Dans la demande internationale WO 98/02522 a été décrit un procédé de
conservation
de virus recombinants infectieux sous forme de suspension dans une solution
aqueuse
comprenant du saccharose. Les compositions préconisées ne contiennent pas de
glycérol et contiennent selon un aspect préféré au moins un sel de cation
divalent ou
2 o de cation alcalin monovalent.
Cependant il peut être montré que le saccharose n'apporte pas systématiquement
une
stabilisation à +4°C, et selon les cas la stabilisation à cette
température ne dépasse
jamais une période de 2 semaines, ou au mieux inférieure à 2 mois.
Dans J. Virology, 70( 11 ), 7498-7509 ( 1996) ont été décrites des
conservations
2 s d'adénovirus sous forme de solutions tampon à base de tampon Tris et de
glycérol,
mais contenant systématiquement du chlorure de magnésium. Ces préparations
nécessitent une conservation à des températures très basses, de l'ordre de -
70°C pour
éviter une réduction de leur pouvoir infectieux.
Dans Human Gene Therapy, 7, 1693-99 ( 1996) est également utilisée une
formulation
3 o de stockage à base de tampon Tris et de glycérol, et comprenant du
chlorure de
magnésium. Cette formulation est conservée à -80°C.
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Plus généralement, les formulations à base de Tris décrites dans la
littérature à ce jour
contiennent de façon systématique du chlorure de magnésium ( 1 mM en général)
ou/et
un sel à concentration physiologique ( généralement NaCI à 150 mM). On peut
citer
par exemple à titre illustratif [Cell, 68, 143-155 (1992) ; Nature Genetics,
3, 229-234
s (1993) ; Human Gene Therapy, 6, 5-11 (1995) ; Human Gene Therapy, 6, 145-153
(1995) ; Human Gene Therapy, 6, 277-287 (1995) ; Human Gene Therapy, 6, 643-
666 (1995) ; Human Gene Therapy, 6, 1039-1044 (1995) ; Human Gene Therapy, 6,
1317-1322 (1995) ; Human Gene Therapy, 6, 1587-1593 (1995) ; Human Gene
Therapy, 7, 2177-2184 (1996) ; J. Virology, 73, 1601-1608 (1999)]. Lorsque les
s o auteurs le précisent, la conservation du virus est effectuée
systématiquement à -70°C /
-80°C.
Il a été montré depuis, que l'évolution de la structure virale (agrégation et
lyse) est un
phénomène très dépendant de facteurs tels que la concentration de certains
contre-ions
cationiques ajoutés à la solution et aussi tels que la concentration
d'adénovirus. Au
15 dessus de concentrations de 1E12 pv/ml environ, l'agrégation et la
désintégration des
capsides (donc la perte de pouvoir infectieux) sont observées en quelques
heures à
quelques jours, selon les compositions pharmaceutiques utilisées, alors que
ces
phénomènes deviennent plus lents à faible concentration. De ce fait il est
particulièrement difficile de conserver pendant un temps prolongé des
compositions
2 o fortement concentrées en particules virales.
Il a été ainsi trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention,
que les
adénovirus recombinants infectieux pouvaient ëtre conservés en milieu aqueux,
à des
températures comprises entre +4 et +20°C, sous forme de suspension dans
une
solution tampon capable de fixer le pH du milieu à des valeurs légèrement
alcalines,
2 s additionnée de glycérol et sans adjonction de cations métalliques
divalents ou de
cations alcalins.
Plus spécifiquement le pH du milieu est fixé entre 8,0 et 9,6.
Les compositions liquides ou congelées contenant les particules adénovirales
dans une
solution tampon additionnée de glycérol entrent dans le cadre de la présente
invention.
3 o Ces compositions présentent l'avantage considérable d'une bonne stabilité,
mais aussi
d'être particulièrement adaptées à la conservation pendant un temps prolongé
de
concentrations élevées en particules virales.
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Selon l'invention, la solution tampon capable de fixer le pH du milieu entre
8,0 et 9,6
est constituée soit d'un système acide/base comprenant le Tris [tris(hydroxymé-
thyl)aminométhane], ou la lysine et un acide choisi parmi un acide fort (acide
chlorhy-
drique par exemple) ou un acide faible (acide maléfique, acide malique, ou
acide
acétique par exemple), soit d'un système acide/base comprenant l'Hepes [acide
2-(4-
(2-hydroxyéthyl pipérazin)-1-yl)éthanesulfonique] et une base forte (soude par
exemple).
De préférence le pH est fixé entre 8,4 et 8,8 et encore plus particulièrement
à 8,4
(valeur mesurée à 25°C).
1o La concentration de la solution tampon est déterminée de manière à exercer
l'effet
tampon dans une limite et un volume ou la valeur du pH ne soit pas affectée.
La
concentration molaire en acide + base peut varier de 10 à 500 mM, de
préférence de
20 à 100 mM, et plus particulièrement elle est fixée à 20 mM. Parmi les
systèmes
tampons selon l'invention, la solution tampon Tris/HCl à une concentration de
20 mM
donne des résultats particulièrement satisfaisants.
Selon l'invention, la composition contient 10 à 50 % de glycérol, et de
préférence
entre 20 et 25 % (volumes à volumes).
Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir optionnellement
d'autres
adjuvants. Ces derniers peuvent être choisis parmi des polymères (polyéthylène
2 o glycols, par exemple PEG 400, PEG 8000), les pluronics (Pluronic F68 par
exemple)
notamment à raison d'environ 1 à 20 % en poids, les polysorbates (notamment le
Tween-20, par exemple à 0,01 à 1 % en poids), ou choisi parmi des sucres comme
par
exemple le saccharose, le mannitol, ou le dextrose (notamment à raison
d'environ 5 à
10 %) ou encore parmi les alcools (notamment l'éthanol) à raison de 1 à 10 %
en
2 s volume.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement adaptées à la
conservation
des préparations adénovirales de forte concentration. En effet les
compositions ainsi
stabilisées permettent de maintenir les particules virales en suspension
aqueuse liquide
(notamment entre +4 et +20°C) tout en préservant le pouvoir infectieux
du virus et
3 o ceci même à des concentrations virales très élevées (depuis des valeurs de
1 E8 pv/ml
jusqu'à 1 E 12 pv/ml ou jusqu'à 1 E 13 pv/ml et pouvant même aller jusqu'à SE
13
pv/ml).
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Selon une autre alternative de l'invention le virus peut aussi être congelé à -
20°C,
conservé ainsi plusieurs mois ou plus longtemps, puis décongelé dans cette
formulation
sans dommage ni pour sa structure ni pour son pouvoir infectieux.
Selon l'invention, les compositions peuvent être préparées par mise en
suspension dans
s la solution tampon, de particules adénovirales initialement obtenues en
solution
aqueuse, puis purifiées, suivie de l'addition de glycérol et éventuellement de
l'addition
d'un adjuvant tel que cité précédemment.
L'adénovirus recombinant infectieux peut être obtenu suivant les méthodes
habituelles
de production dans des cellules de lignées transcomplémentantes
d'encapsidation, par
i o exemple les cellules de la lignée 293 ou de la lignée PER-C6. Les
particules virales
peuvent être ensuite purifiées par centrifugation en gradient de chlorure de
césium
comme décrit par exemple dans Journal of General Virology, 34, 19-35 (1977).
Plus
préférentiellement les particules virales sont purifiées par chromatographie
liquide en
mode d'échange d'anion, de filtration sur gel, en mode hydrophobe ou par
chélation de
i5 métal. La purification par échange d'anion est particulièrement avantageuse
puisqu'elle
permet d'obtenir en une seule étape de chromatographie une préparation virale
pure,
débarrassée des protéines, des acides nucléiques, et autres impuretés et
métabolites
provenant de la cellule productrice, et débarrassée des composés apportés par
le milieu
de culture. Des modes préférés de purification par chromatographie sont
décrits dans
20 la demande internationale WO 98/00524 ou comme ci-après dans les exemples.
Les
particules adénovirales sont ensuite formulées dans le tampon de conservation
sélectionné en utilisant notamment des méthodes de dialyse, de diafiltration,
ou de
chromatographie de filtration sur gel.
La composition ainsi obtenue peut être éventuellement congelée et conservée à
une
25 température de stockage souhaitée (par exemple -20°C), mais cette
opération n'est
cependant pas indispensable à la conservation sur une longue durée, les
compositions
étant stables à l'état liquide entre +4 et +20°C.
Les compositions selon l'invention sont stables, sans dégradation notable
[stabilité
physique et biologique (pouvoir infectieux)] pendant une durée d'au moins 12
mois à
30 +4°C ou d'au moins 5 mois à +20°C. On entend plus
particulièrement par solution
stable physiquement, une solution ne présentant pas d'apparition de
coagulation, de
sédimentation de particules ou de précipité (par estimation visuelle, par
mesure de la
densité optique, par l'analyse en microscopie électronique, ou par l'analyse
de
distribution de taille des particules) après la période de conservation
considérée.
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La présente invention concerne plus particulièrement la conservation
d'adénovirus
infectieux sous une forme stabilisée et les compositions liquides ou congelées
destinées
à cette conservation.
La formulation selon l'invention présente l'intérêt d'être la première
composition
s réalisée permettant la conservation des adénovirus sous forme liquide à des
températures de +4 à +20°C tout en ayant la possibilité d'avoir une
concentration
virale élevée. L'invention est particulièrement intéressante dans son
application aux
adénovirus recombinants, mais elle peut être appliquée d'une manière générale
à tous
les adénovirus (sauvages ou recombinants).
Zo A titre d'exemple peuvent être cités notamment les adénovirus ci-après qui
peuvent
être avantageusement conservés dans une composition selon l'invention :
l'ensemble
des adénovirus sauvages humains, appartenant aux six sous-groupes connus
dénommés A, B, C, D, E, et F, et plus particulièrement l'ensemble des 49
sérotypes
différents d'adénovirus humains composant ces six sous-groupes. De même,
l'invention pourra s'appliquer aux virus sauvages simiens, bovins, équins,
porcins,
ovins, ou canins appartenant à la famille des Adenoviridae. De plus,
l'invention pourra
s'appliquer aux virus mutants provenant des virus sauvages appartenant à la
famille
des Adenoviridae.
Parmi les vecteurs adénovirus recombinants auxquels la présente invention peut
2 o s'appliquer, on peut citer tous les adénovirus modifiés comportant une ou
plusieurs
délétion dans la région du génome appelée E 1, ou dans la région E2, ou dans
la région
E3 ou dans la région E4, ainsi que les virus recombinants comportant plusieurs
délétions combinées dans les régions ci-dessus, ainsi qu'aux virus
recombinants
complètement délétés (appelés gutless) [FASEB, 11, 615 (1997)].
2 s De même, la présente invention s'applique aussi aux vecteurs adénoviraux
recombinants comportant en outre un acide nucléique d'intérêt. L'acide
nucléique
d'intérêt peut être inséré en différents sites du génome de l'adénovirus.
Avantageusement, il est inséré au niveau de la région El, E3, ou E4.
Cependant, il est
clair que d'autres sites peuvent être utilisés. En particulier, l'accès à la
séquence
3 o nucléotidique du génome permet à l'homme du métier d'identifier des
régions
permettant d'insérer l'acide nucléique d'intérêt. L'acide nucléique d'intérêt
peut être
toute séquence d'ADN introduite, en particulier toute séquence dont le
transfert et/ou
l'expression dans la cellule cible est recherchée.
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En particulier, il peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques et/ou
un ou
plusieurs gènes codant pour des protéines antigéniques. Les gènes
thérapeutiques qui
peuvent ainsi être transférés sont tous les gènes dont la transcription et
éventuellement
la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet
thérapeutique.
s Parmi les produits thérapeutiques, on peut citer plus particulièrement les
enzymes, les
dérivés sanguins, les hormones, les limphokines : interleukines, interférons,
TNF, etc
(W093/19191), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs
précurseurs
ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF,
aFGF, bFGF, NT3, NTS, etc., les apolipoprotéines : ApoAl, ApoIV, ApoE, etc.
Zo (W094/25073), la dystrophine ou une minidystrophine (W093/06223), les gènes
permettant de contrôler la resténose : GAX, NOS, etc., les gènes suppresseurs
de
tumeurs : p53, Rb, Rap 1 A, DCC, k-rev, etc (W094/24297), les gènes codant
pour des
facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, les gènes
suicides
TK, etc., les immunoglobulines naturelles ou artificielles : Fab, ScFv
(W094/29446),
15 les gènes anti-apoptotiques : AKT, etc.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens,
dont
l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes
ou la
transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être
transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires
et
2 o bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans
la demande de
brevet EP 140 308.
De même, la présente invention s'applique aux vecteurs adénoviraux
recombinants
permettant la production de rétrovirus [Tumor Targetting, 3, 59 ( 1998)], aux
adénovirus comportant une ou plusieurs modifications dans une ou plusieurs
protéines
2 s constitutives de la capside virale, en particulier la fibre (protéine IV)
et la protéine
hexon (protéine II), ou aux adénovirus dépourvus de fibre [Journal of
Virology, 73,
1601 ( 1999)], chacune de ces modifications ayant été introduite dans le but
de
modifier le tropisme naturel de l'adénovirus [Current Opinion in
Biotechnology, 8,
583 (1997)].
3 o Par ailleurs, les compositions selon l'invention sont particulièrement
intéressantes du
fait qu'elles peuvent être utilisées pour la préparation d'un médicament
destiné à un
traitement thérapeutique ou prophylactique par thérapie génique.
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Les virus infectieux ont de nombreuses applications parmi lesquelles on peut
citer leur
utilisation dans le domaine de la vaccination et dans le domaine de la
thérapie génique.
Dans ces applications, après transfert de leur matériel génétique (ARN ou ADN)
dans
la cellule hôte, les virus utilisent la machinerie cellulaire de la cellule
infectée pour
réaliser la synthèse de protéines codées par leur propre génome, et induire
ainsi l'effet
biologique spécifique recherché. Dans des applications de thérapie génique,
des virus
recombinants infectieux portant un gène d'intérêt thérapeutique sont utilisés
pour
transférer ce gène dans des cellules spécifiques de l'organe du patient à
traiter. Une
grande variété de protocoles thérapeutiques ont été décrits et sont
actuellement en
z o cours d'évaluation clinique pour transférer et exprimer des gènes
thérapeutiques à
l'aide de vecteurs viraux. Parmi ces vecteurs, les vecteurs adénoviraux non
réplicatifs
ont été largement développés durant ces dernières années pour le transfert de
gènes
codant pour des protéines thérapeutiques. Parmi ces gènes, on peut citer le
gène
suppresseur de tumeur p53, qui est impliqué dans le contrôle de la
prolifération
s5 cellulaire. Divers protocoles d'essais cliniques de transfert du gène p53 à
l'aide
d'adénovirus chez l'homme sont actuellement développés dans des indications
anticancéreuses. Parmi les autres applications en développement, on peut citer
le cas
du traitement de la mucoviscidose.
L'utilisation de vecteurs adénoviraux comme agents thérapeutiques n'est
envisageable
2 o que si l'on dispose de méthodes permettant de conserver et stocker les
préparations
durant des périodes suffisantes longues sans perte significative du pouvoir
infectieux
des virus en question. C'est pourquoi la présente invention est
particulièrement
intéressante.
Les exemples suivants donnés à titre non limitatif, montrent comment
l'invention peut
2 s être mise en pratique, ainsi que la stabilité des compositions et le
pouvoir infectieux
des particules ainsi formulées.
Exemple 1
Préparation d'une composition selon l'invention
Une suspension virale est préparée de la manière suivante : les cellules 293
sont
cultivées dans un CellCube (Costar) dans un milieu DMEM supplémenté avec 10 %
de
sérum de veau foetal. Lorsqu'elles atteignent la confluence, les cellules sont
infectées à
une multiplicité d'infection de 2 avec une aliquote de la banque de travail de
l'adénovirus :-exprimant le gène p53. Cinq jours après l'infection, le
surnageant de
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production est récolté par drainage et clarifié par passage à travers un train
de filtres
de porosité décroissante 10/1/0,8-0,2 gym. Ce surnageant est ensuite concentré
20 fois
en volume par ultrafiltration tangentielle sur une membrane Millipore ayant un
seuil de
coupure de 300 kDa. Le virus est ensuite purifié par chromatographie sur une
colonne
s de Source 15Q équilibrée et éluée avec un gradient de chlorure de sodium
dans du
tampon 20 mM Tris/HCI, pH 8,0. Le pic de virus est collecté, et le virus est
concentré
par ultrafiltration tangentielle sur une membrane Millipore ayant un seuil de
coupure
de 300 kDa. Les préparations virales ainsi obtenues sont de très grande pureté
et
contiennent < 50 ng d'albumine bovine sérique et < 10 ng d'ADN de la cellule
hôte
s o pour 1 E 12 particules virales. Le virus est ensuite formulé dans les
divers tampons
sélectionnés. Pour ei~ectuer cette opération, le changement de tampon est
effectué par
chromatographie sur colonne PD-10 (Amersham-Pharmacia Biotech) remplie de
Sephadex G-25 équilibrée et éluée avec le tampon sélectionné en suivant les
instructions du fournisseur. Après dosage par chromatographie, la
concentration du
15 virus est ajustée si nécessaire à la valeur cible par dilution dans le
tampon de
formulation sélectionné. La stabilité virale dans les diverses formulations
est ensuite
étudiée en plaçant pour chacune des formulations sélectionnées, 2 ml de
suspension
virale dans un tube en polypropylène à la température étudiée (-20°C,
+4°C, ou
+20°C). Les échantillons sont ensuite conservés à cette température
durant une
2 o période déterminée pour chacune des expériences en question (voir exemples
ci-
après).
Les analyses par microscopie électronique sont effectuées par dépôt de la
solution à
analyser sur une grille carbonée qui est ensuite traitée en coloration
négative par
l'acétate d'uranyle à 1,5 %. L'appareil utilisé pour ces analyse est un
microscope
25 électronique Jeol 1010 opérant à une tension de 50 kV à 100 kV.
Les analyses de distribution de taille des particules virales sont effectuées
par
spectroscopie de corrélation de photons (PCS) à l'aide d'un appareil Coulter
N4+
(Coultronics).
Les analyses CLHP (chromatographie liquide hautes performances) permettant de
3 o quantifier les particules virales sont effectuées comme décrit ci-après
Une colonne de chromatographie remplie avec environ 1 ml de Q Sepharose~ XL
(45-
165 gym; Amersham-Pharmacia Biotech) est préparée dans une colonne de type HR
5/5 (Amersham-Pharmacia Biotech). Cette colonne, montée sur un système CLHP
équipé d'un système de détection UV/visible opérant dans la plage d'absorbance
200-
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300 nm, est utilisée pour la séparation et la quantification des particules
virales. Avant
chaque analyse, la colonne est équilibrée à 30°C dans un tampon 20 mM
Tris/HCI, pH
7,5 à un débit de 1,5 ml/min. L'échantillon à analyser contenant les
particules virales
est injecté sur la colonne. Après l'injection, la colonne est lavée avec 5
volumes du
même tampon, et les espèces fixées sont éluées avec un gradient linéaire de 0
à l M de
chlorure de sodium dans le tampon 20 mM Tris/HCI, pH 7,5 sur 30 volumes de
colonne. En fin de gradient, la colonne est lavée avec 2 volumes de colonne de
soude
0,5 N avant ré-équilibration en vue de l'analyse suivante.
Une courbe étalon à 260 nm est construite avec une préparation de particules
i o d'adénovirus purifiée par chromatographie. Cette préparation étalon a été
titrée au
préalable en particules par son absorbance à 2 ô0 nm dans une solution de SDS
à 0,1
en utilisant le facteur de conversion de 1 x 10 particules par unité
d'absorbance à 260
nm). Les échantillons sont filtrés au travers d'un filtre (0,22 gym) avant
l'analyse par
chromatographie.
La technique de titration des adénovirus est décrite par F. L. Graham et al.,
Molecular
Biotechnology, 3, 207 (1995). La technique de mesure de l'expression de la
protéine
penton par immunotitration suivie d'une quantification par cytométrie de flux
est
décrite dans Boyle et al., « Determination of adenoviral vector activity using
an
2 o immunotitration method », poster présenté au « 5'" annual meeting of viral
vector and
vaccines, (1998) ».
Exemple 2
Conservation à +4°C de compositions selon l'invention ; stabilité
physique des
particules virales
2 5 Le tableau ci-après montre les résultats obtenus en fonction de la nature
de la solution
tampon et la stabilité physique des particules virales déterminée par
l'analyse
chromatographique des préparations
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Concentration
virale
au
temps
considr
(en
jours)
Formulation Concentration(x10'2
pv/ml)
initiale
(x10'Zpv/ml)10 15 20 35 60 90
*Tris/HCl + glycrol8,9 9,8 9,7 10,1 10,2
10%
*Tris/HCl + glycrol8,3 9,0 8,4 9,0 8,9
10% +
pluronic F68 10%
*Tris/HCl + glycrol6,6 7,2 7,2 6,9
10% +
PEG 400 10%
*Tris/HCl + glycrol7,5 8,0 8,2 8,6 8,0
10% +
PEG 8000 10%
*Tris/HCl + glycrol7,4 7,7 8,5 7,9 8,5
10% +
saccharose 5%
L-Lysine [20 mM, 8,7 10,3 9,2
pH = 8,4]
+ glycrol 10%
Comparaison
*Tris/HCl + saccharose6,3 5,7 1,9 0,015
5%
*Tris/HCl + saccharose10,5 8,4 0,7
10%
*Tris/HCl : 20 mM ; pH = 8,4 - % glycérol : vol/vol - % saccharose : vol/vol
Exemple 3
Conservation à +4°C de compositions selon l'invention ; effet de la
concentration
s en glycérol
Le tableau ci-après montre les résultats obtenus en fonction de la
concentration en
glycérol dans la formulation et donne la stabilité physique des particules
virales
déterminée par l'analyse chromatographique des préparations
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Formulation Concentration
virale
(
x
10'Z
pv/ml)
au
temps
considr
0 15 1 2 3 4,5 6 9 12
jour mois mois moismois mois moismois
*Tris/HCl + 6,7 7,9 8,2 7,8 8,4 7,5 6,0 0,3 -
glycrol 10%
(vovvol)
*Tris/HCl + 5,8 6,7 6,8 6,9 6,8 6,3 5,8 6,4 5,9
glycrol 15
vol/vol)
*Tris/HCl + 5,4 6,3 6,5 6,4 7,1 6,0 5,8 6.0 5,9
glycrol 20
% (vol/vol)
*Tris/HCl + 5,7 6,5 6,6 6,6 7,1 6,5 6,2 6,4 6,4
glycrol 25
(vol/vol)
Comparaison
Tris/HCl 10 11,810,4 0,9 - - - - - -
mM + MgClz
1 mM + glycrol
10%
(vol/vol)
Tris/HCl 10 10,35,0 0,8 - - - - - -
mM + MgClz
1 mM + NaCI
150 mM +
glycrol 10%
(vol/vol)
Tris/HCI 10 6,9 7,7 7,6 5,9 0,580,47 0,15 0,25-
mM + MgClz
1 mM + saccharose
1 M
*Tris/HCl : 20 mM, pH = 8,4.
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessus confirment clairement qu'une
teneur
de 10 % (vol/vol) est efficace pour la stabilisation physique des particules
sur une
s période de 6 mois. L'efficacité est également confirmée sur une periode de 1
an au
moins pour les formulations incluant plus de 10 % de glycérol. Aucune des
formulations antérieurement connues n'apportait une stabilisation sur une
durée aussi
prolongée : notamment la formulation comprenant Tris/HCl 10 mM + MgCl2 1mM +
saccharose 1M ne s'avère pas appropriée pour stabiliser les particules
adénovirales à
Zo concentration élevée (6,9 x 10'z pv/ml), la concentration virale chute
rapidement à
partir du 2eme mois.
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WO 00/61726 PCT/FR00/00879
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Exemple 4
Pouvoir infectieux des adénovirus conservés selon l'invention à +4 ou
+20°C
Le pouvoir infectieux des particules virales est mesuré par la capacité des
particules à
exprimer le transgène qu'elles comportent et à conduire à l'expression de la
protéine
s correspondante. La protéine est ici la protéine penton (protéine III) qui
est détectée
par immunotitration en utilisant une méthode de marquage avec un anticorps
(anti-
penton) suivie d'une analyse en cytométrie de flux. Le résultat obtenu est
exprimé en
unités d'infection par ml de solution (UI/ml). Le calcul du ratio pv/IU
représente une
seconde façon d'exprimer l'évolution du titre infectieux au cours du temps.
Dans les
i o conditions expérimentales utilisées, ce ratio a une valeur de 20 ~ 10
environ pour une
préparation virale fraîchement obtenue avant mise en conservation.
Le tableau ci-après montre le pouvoir infectieux des particules formulées en
glycérol
ou en saccharose après 6 ou 12 mois de conservation à +4°C ou après 1
mois de
conservation à +4°C puis 3,5 mois de conservation à +20°C.
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Cette étude montre que l'activité virale est particulièrement bien préservée à
+4°C
pour toutes les concentrations en glycérol égales ou supérieures à 10 %, et
plus
spécialement encore pour toutes les concentrations en glycérol égales ou
supérieures à
15%. De même, les préparations conservées 1 mois à +4°C puis 3,5 mois à
+20°C et
s contenant au moins 10 % de glycérol ont conservé leur capacité d'infection.
La
possibilité de conserver à long terme et à température ambiante, des
préparations
adénovirales très concentrées est démontrée pour la première fois. La
formulation de
comparaison contenant du saccharose et du chlorure de magnésium ne permet pas
la
conservation du virus concentré (6,9 x 10'' pv/ml) ni à +4°C ni à
+20°C. La
Zo formulation à faible concentration (0,36 x 10'2 pv/ml) voit son titre
décroître après une
conservation d'un mois à +4°C suivie d'une conservation de 3,5 mois à
+20°C. Les
formulations contenant du saccharose sont totalement inadaptées lorsque l'on
augmente la concentration.
Après trois mois de conservation, les différentes préparations ont été
analysées par
i s microscopie électronique. Ces analyses montrent que
A une concentration de 20 % en glycérol les particules apparaissent natives,
pleines,
entières, et symétriques. Pratiquement aucune sous-unité libre n'est
détectable dans le
milieu. En revanche, dans la formulation de comparaison à concentration virale
élevée,
les particules sont pour la plupart agrégées soit en massifs contenant environ
50
2 o particules, soit en structures filamenteuses. Certaines particules ont
perdu une partie
de leurs capsomères et ont une structure plus arrondie ou ovoïde. Les
capsomères et
les fibres libérés dans le milieu restent totalement dispersés et sont très
facilement
observables. Ceci est observé aussi bien à +4°C qu'à +20°C.
Après 12 mois à 4°C, les particules conservées dans 20% de glycérol
apparaissent
2 s inchangées (pleines, entières et symétriques).
Exemple 5
Pouvoir infectieux d'une préparation adénovirale formulée dans le Tris/HCl +
glycérol et conservée à -20°C
Dans cet exemple, le pouvoir infectieux des particules est déterminée par la
titration
3 o en pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond à la
détermination du
pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus. Cette détermination est
effectuée par
infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après
15 jours
d'incubation, du nombre de plages de cellules infectées. Ces dosages reposent
sur des
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méthodes biologiques et les valeurs obtenues sont dans une certaine mesure
fonction
des conditions opératoires utilisées [J. Virol., 70, 7498 (1996)].
Le tableau ci-après montre le titre infectieux, mesuré dans un test pfu, d'une
préparation virale conservé 2 mois à -20°C.
Formulation Titre Titre Titre Ratio
initial J60 J60 pv/pfu
pv/ml pv/ml pfu/ml J 60
(x 10'Z)(x 10'2)(x 10")
mM Tris/HCl (pH 8,4) 7,7 7,7 3,0 26
+ 10 % glycrol
s La valeur de la mesure du titre infectieux, et plus particulièrement le
ratio pv/pfu
indiquent que les particules virales n'ont pas été altérées par l'étape de
congélation-
décongélation, ni par la conservation durant 2 mois à -20°C. (Ce ratio
a une valeur de
20 à 30 environ pour la préparation virale initiale).
Exemple 6
Zo Conservation à +4°C de compositions selon l'invention ; stabilité
physique des
particules virales
Le tableau ci-après montre les résultats obtenus en fonction de la nature de
la solution
tampon et la stabilité physique des particules virales déterminée par
l'analyse
chromatographique des préparations
ConcentrationConcentration
Formulation initiale virale
au
temps
considr
(en
jours)
(x10'2
pv/ml)
(x 10'Z 30 60 90
pv/ml)
20 mM Tris/HCl (pH 8,4) + glycrol 29,2 31,4 32,1 33,7
20 %
100 mM Tris/HCl (pH 8,4) + glycrol 7,7 8,4 6,0 8,3
20 %
20 mM Tris/HCl (pH 8,4) + glycrol 13,9 14,8 14,7 15,0
20 % + thanol 10 %
20 mM Lysine/HCl (pH 8,4) + glycrol7,8 8,4 6,8 7,7
20 %
20 mM Hepes/Na (pH 8,4) + glycrol 7,9 8,4 7,0 8,6
20 %
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Exemule 7
Conservation à +4°C de compositions selon l'invention ; effet du
pH des
solutions tampon
Le tableau ci-après montre l'effet du pH de la solution tampon sur le pouvoir
infectieux
s des particules formulées dans le Tris 20mM, glycérol 10%, après 3 mois de
conservation
Titre Titre
Formulation Tris/HCl 20 mM initial aprs
+ glycrol 10 3 mois
osa +4C
(x 10'' pv/ml UI/ml pv/UI
pv/ml) (x 10' (x 10"
Z)
pH = 7,5 3,1 2,5 0,18 136
pH = 8,0 6,7 6,1 1,1 56
pH = 8,5 7,2 7,0 1,6 44
pH = 9,0 6,4 5,8 1,2 48
pH = 9,5 6,0 5,5 2,0 28
Cette étude montre que l'activité virale est particulièrement bien préservée à
+4°C dans
les formulations Tris/HCl 20 mM contenant 10 % de glycérol à des pH allant de
8,0 à
9,5.
s o Au dessous de pH = 8,0, la stabilité n'est plus assurée à +4°C.
