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SOUCHES AVIRULENTES DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS, PRODUISANT DU XANTHANE
L'invention a pour objet de nouvelles souches bactériennes,
notamment de Xanthomonas, en particulier Xanthomonas campestris ayant
perdu le caractère phytopathogène mais ayant sensiblement conservé la
capacité de production d'exopolysaccharide, notamment de gomme xanthane.
s Xanfhomonas campestris pv. campestris est une bactérie Gram-
négative phytopathogène des Crucifères utilisée pour la production
industrielle
de gomme xanthane (Martin, 1994, Res. Microbiol. 145 :9 93-97).
L'importance économique de cet exopolysaccharide a suscité de
nombreuses études sur les gènes impliqués dans cette synthèse (Martin,
io 1994, précité).
De nombreux déterminants de la pathogénicité ont été décrits
(Dow et Daniels, 1994, In Bacterial pathogenesis of plants and animais, JL
Dangl, ed. Springer Verlag, Heidelberg). Parmi eux, se trouvent des enzymes
extracellulaires à activité hydrolytique sur les tissus végétaux. Lorsque le
is système de sécrétion responsable de l'export de ces enzymes est inactivé,
les
souchès de X. campestris ont un phénotype non phytopathogène associé à
des symptômes des plantes très réduits (Dow et Daniels, 1994, précité). Parmi
les déterminants de la pathogénicité décrits se trouve l'exopolysaccharide,
qui
semble avoir un rôle dans la phase précoce de la maladie (Dow et Daniels,
20 1994, précité ; Katzen et al., 1998, J. Bacteriol. 180 : 1607-1617). De
même,
un gène hrpXc, décrit chez X. campestris pv. campestris (Kamoun et al., 1992,
Mol. Plant Microbe Interact. 5 : 22-33), est impliqué dans la suppression des
réponses de défense de la plante hôte compatible, puisque sa mutation
entraîne une réaction nécrotique caractéristique (réponse d'hypersensibilité,
2s HR). Les gènes d'avirulence décrits chez les différents pathovars de X.
campestris sont aussi impliqués dans la pathogénicité de la bactérie
puisqu'ils
sont reconnus par la plante possédant le gène de résistance correspondant et
conduisent à une réaction HR (Dow et Daniels, 1994, précité ; Yang et al.,
1995, Mol. Plant Microbe Interact. 8 : 627-631 ). Parmi les autres gènes
3o impliqués dans la pathogénicité des Xanthomonas (Dow et Daniels, 1994,
précité), ont été décrits deux gènes chez X. campestris pv campestris dont
des mutations conduisent à une pathogénicité réduite sans modifications des
niveaux d'accumulation d'enzymes extracellulaires et d'exopolysaccharides
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(Osbourn et ai., 1990, Mol. Plant Microbe Interact. 3 : 280-285). D'autres
déterminants de la pathogénicité sont constitués par différents jeux
indépendants de gènes régulateurs de la synthèse des enzymes
extracellulaires et de l'exopolysaccharide parmi lesquels on trouve : les
gènes
s rpfA à H, dont des mutations conduisent à une réduction de la production
d'exopolysaccharide ; rpfN, un represseur de la synthèse de ces enzymes et
de l'exopolysaccharide ; cip, dont des mutations conduisent à une
pathogénicité réduite et à une moindre production d'exopolysaccharides (Dow
et Daniels, 1994, précité). Enfin, d'autres déterminants de la pathogénicité
io sont constitué par les gènes hrp.
Les gène hrp (réaction d'hypersensibilité et pathogénicité) sont
essentiels pour la pathogénicité sur plante compatible et pour la réaction
d'hypersensibilité sur les hôtes résistants (Alfano et Collmer, 1997, J.
Bacteriol.
179 : 5655-5662 ). Ils ont été clonés et caractérisés à des degrés divers chez
is plusieurs bactéries phytopathogènes des genres Erwinia, Pseudomonas,
Ralstonia et Xanthomonas où ils sont relativement conservés (Zurek et
Bukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47 : 227-241 ; Alfano et
Collmer, précité), en particulier chez X. campestris pv. vesicatoria (Huguet
et
al., 1998, Molec. Microbiol 29 : 1379-1390 ; Fenselau et al., 1992, Molecular
2o Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396 ; Bonas, 1994, précité). Les plus
conservés d'entre eux ont d'ailleurs été renommés gènes hrc (Bogdanove et
al., 1996, Mol. Microbiol., 20 : 681-683). Parmi les fonctions des gènes hrp
décrites à ce jour se trouvent la régulation de leur expression, la production
de
protéines élicitrices de la réponse de l'hôte, la constitution d'un système de
2s sécrétion spécifique (dit de type III) et la synthèse de glucanes
periplasmiques
(Zurek et Bukowski, 1998, Acta Microbiologica Polonica, 47 : 227-241 ;
Mudgett et Staskawicz, 1998, Current Opinion in Microbiology 1 : 109-114 ;
Lindgren, 1997, Annu Rev. Phytopathol. 35 :129-152 ; Alfano et Collmer, 1997,
précité ; Bonas, 1994, précité). Un ensemble de gènes hrp a été cloné chez X.
3o campestris pv. campestris (Arlat et al., 1991, Mol. Plant Microbe Interact
4
593-601 ) mais non séquencé. II est aussi rapporté que les souches porteuses
de mutations dans ces gènes réalisées à l'aide d'un transposon auraient une
production normale d'exopolysaccharide d'après l'aspect des colonies sur
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boite. Aucune quantification plus précise de la productivité de xanthane de
ces
souches n'a toutefois été publiée.
En outre, les mutations réalisées chez ces souches ne possèdent
pas un caractère de stabilité suffisant pour une utilisation industrielle pour
la
s production de gomme xanthane. En effet, le transposon utilisé contient le
gène
codant pour la transposase (Simon et al., 1989, Gene 80 : 161-169) ce qui
n'exclue pas un événement d'excision du transposon à une fréquence pouvant
être estimée entre 10-6 et 10-3 par génération (Berg et al., 1989, In Berg and
Howe ed., Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
1o pp 879-926 ; Craig, In Escherichia coli and Salmonelle, Neidhardt ed., ASM
Press, Washington, D.C. pp 2339-2362). De plus, le transposon utilisé
contient un gène de résistance aux antibiotiques néomycine et kanamycine.
Enfin, le transposon inséré dans le génome de ces souches constitue un
élément d'ADN non homologue puisque celui-ci n'est pas un élément naturel
is du génome de la souche utilisée.
Bien qu'il n'existe pas de réglementation spécifique à l'heure
actuelle en Europe imposée par le caractère phytopathogène de Xanthomonas
campestris pv. campestris, il est hautement souhaitable, pour des raisons
liées
à l'environnement, d'utiliser des souches de Xanthomonas campestris non
2o phytopathogènes, afin de diminuer le risque éventuel de contamination de
cultures d'intérêt agronomique à proximité du site. La sélection d'une telle
souche par les techniques classiques de mutagenèse aléatoire de production
est un processus long et fastidieux puisqu'il doit faire intervenir un
criblage à
haute capacité permettant d'isoler une souche non phytopathogène mais ayant
2s conservé ses caractéristiques de productivité, c'est-à-dire sans mutations
secondaires.
Par ailleurs, l'utilisation d'une souche génétiquement modifiée
produisant une gomme xanthane modifiée (telle que décrite dans US
5,514,791 ) ou ayant une productivité améliorée est soumise à une
3o réglementation stricte (Theilleux 1998, Dictionnaire permanent Bioéthique
et
Biotechnologies, ed Législatives, pp 1595-1648). Celle-ci impose notamment
pour une construction réalisée dans une souche présentant un danger pour les
plantes, d'adopter des mesures de confinement sévères sur le site de
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production. Les investissements nécessaires auraient alors des conséquences
économiques négatives.
II existe par conséquent un besoin de disposer d'une souche
industrielle de X. campestris stablement dépourvue de caractère
s phytopathogène mais ayant retenu ses propriétés de productivité de gomme
xanthane. De plus, pour des raisons réglementaires et afin de simplifier le
traitement des déchets issus de la séparation de la gomme xanthane de la
biomasse, il est utile que la souche ne contienne pas de gène hétérologue
codant pour une résistance à un antibiotique. Enfin, au regard des
législations
1o française et européenne, il est préférable que la souche obtenue ait été
construite par autoclonage, ce qui signifie qu'elle ne contienne pas
d'éléments
d'ADN étranger à son patrimoine génétique naturel.
Les travaux des inventeurs ont permis la construction d'une
souche de X. campestris possédant les propriétés requises.
is De manière surprenante, il a été montré grâce à l'invention
qu'une bactérie devenue non phytopathogène de manière stable, par délétion
d'un fragment de taille importante affectant plusieurs kilobases de gènes
impliqués dans la virulence, était néanmoins capable de produire de la gomme
xanthane.
2o De manière plus surprenante encore, la souche modifiée de
l'invention produit de la gomme xanthane en une quantité et une qualité en
tous points comparables à celle produite par la souche sauvage à partir de
laquelle la construction a été réalisée.
L'invention a pour objet une souche bactérienne ayant perdu le
2s caractère phytopathogène par inactivation d'au moins un gène de virulence
et
ayant conservé la capacité de production d'exopolysaccharide.
La souche bactérienne selon l'invention est avantageusement
rendue stablement non phytopathogène par délétion d'au moins un gène,
avantageusement au moins deux gènes, de préférence au moins trois gènes
3o du groupe de gènes hrp ou hrc, et de préférence 5 à 9 gènes du groupe de
gènes hrp ou hrc.
Par "stablement dépourvue de caractère phytopathogène", on
entend que ce caractère est conservé après un nombre de cycles cellulaires
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d'au moins 20 générations, avantageusement d'au moins 30 générations, de
préférence d'au moins 40 générations.
Parmi les bactéries ayant perdu leur caractère phytopathogène et
avantageusement utilisables pour une production industrielle
s d'exopolysaccharide, on peut citer en particulier les genres suivants :
Erwinia,
Pseudomonas, Ralstonia et Xanthomonas.
L'invention a notamment pour objet une souche Xanthomonas
essentiellement dépourvue de caractère phytopathogène de manière stable et
io ayant conservé sensiblement la capacité de production d'exopolysaccharide.
Par "essentiellement non phytopathogène", on entend l'absence
de lésions et/ou flétrissures envahissantes sur des feuilles de plantes hôtes
crucifères, notamment le chou (Brassica oleracera), après au moins 15 jours
suivant l'inoculation de la feuille par blessure de la nervure centrale.
1s Avantageusement, la souche Xanthomonas est de l'espèce
campestris, en particulier pv campestris.
L'inactivation du(des)dit(s) gènes) est obtenue de préférence par
une délétion d'au moins 1 kb, de préférence au moins 3 kb, avantageusement
au moins 5 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc, de préférence 9 kb et
2o pouvant aller jusqu'à 40 kb dans le groupe de gènes hrp ou hrc.
Dans un mode de réalisation préféré, la souche de Xanthomonas,
notamment campestris essentiellement non phytopathogène selon l'invention
est obtenue par délétion des gènes hrpA1 à hrpC2 d'une souche sauvage
phytopathogène de Xanthomonas campestris pv campestris.
2s La gomme xanthane produit par les souches de Xanthomonas de
l'invention est une gomme xanthane sensiblement identique à celle produite
par l'espèce sauvage, à savoir qu'elle présente sensiblement la même
distribution de poids moléculaire, ainsi que le méme degré de modifications,
notamment des degrés d'acétylation et de pyruvylation.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation
d'une souche telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce qu'elle est
obtenue
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par recombinaison homologue avec un plasmide comprenant une délétion de
tout ou partie des gènes hrp ou hrc.
L'invention a en outre pour objet un procédé de préparation
s d'exopolysaccharide bactérien, notamment de gomme xanthane, caractérisé
en ce que l'on cultive une souche bactérienne, le cas échéant, du genre
Xanthomonas, de préférence de l'espèce Xanthomonas campestris telle que
définie ci-dessus, dans des conditions permettant la production
d'exopolysaccharide dans le milieu de fermentation.
io
Les exemples qui suivent illustrent la construction de souches de
Xanthomonas campestris répondant aux caractéristiques de l'invention.
is Dans ces exemples, la construction a été réalisée à partir d'une
souche de Xanthomonas campesfris pv campestris obtenue par criblage de
gomme xanthane.
II va de soi qui d'autres souches de Xanthomonas et également
de bactéries productrices d'exopolysaccharide appartenant à un genre différent
2o accessibles à l'homme du métier peuvent être utilisées comme matière
première de départ pour réaliser des souches non phytopathogènes,
conformément aux connaissances générales du domaine technique en
question et aux indications données ci-après, notamment en se référant aux
parties de séquences rapportées dans le cas où la souche appartient à
2s l'espèce Xanthomonas campestris.
Pour leur compréhension, on se reportera aux figures annexées
sur lesquelles
- la figure 1 schématise la stratégie de construction de dérivés de
30 la souche de X. campestris RPA-BIOCAT826 porteurs d'une délétion de gènes
hrp.
L'organisation des gènes hrp chez X. campestris pv vesicatoria
est décrite par Fenselau et Bonas (1995, Mol. Plant Microbe Interact. 8 (6),
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845-854 ) et par Fenselau et al., (1992, Mol. Plant Microbe Interact. 5, 390-
396) et est disponible en partie dans Genebank sous le numéro d'accès U
33548. Les régions homologues clonées à partir de la souche RPA-
BIOCAT826 sont représentées ainsi que le nom des plasmides dans lesquels
s elles ont été clonées. La carte de restriction de la région hrp de X,
campestris
pv campestris est publiée par Arlat et al., 1991, Mol. Plant Microbe Interact
4:593-601, et est complétée par les résultats présentés dans les exemples 1 à
4. La délétion dhrpA1-C2 portée par le plasmide pRPA-BCAT140 décrit dans
les exemples a été introduite dans le génome par double recombinaison
1o homologue ;
- la figure 2 représente les signaux d'hybridation obtenus en
Southern Blot avec la sonde HRPB5 décrite ci-dessous et les ADN génomique
de la souche RPA-BIOCAT826 et de deux dérivés de cette souche ayant
intégré la délétion dhrpA1-C2. La position des bandes du marqueur de taille a
is été rapportée par comparaison avec la distance de migration sur le gel
coloré
au bromure d'éthidium avant transfert. Ces tailles sont exprimées en
kilobases.
- la figure 3 représente les signaux d'hybridation obtenus en
Southern Blot avec la sonde HRPC2 décrite ci-dessous et tes ADN
génomiques de la souche RPA-BIOCAT826 et de 5 dérivés de cette souche
2o ayant intégré la délétion dhrpAl-C2. La position des bandes du marqueur de
taille a été rapportée par comparaison avec la distance de migration sur le
gel
coloré au bromure d'éthidium avant transfert. Ces tailles sont exprimées en
kilobases.
2s Matériels et méthodes
Sauf autres précisions, les techniques mises en oeuvre sont des
techniques classiques de biologie moléculaire et de microbiologie, connues de
l'homme de l'art telles que décrites par exemple par Ausubel et al., 1987
(Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York ;
3o Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning : a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Sring Harbor, New York), Coligan et al., 1997
(Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc)..
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1. Souche de départ
La souche RPA-BIOCAT826 est issue de la collection de Rhodia
Chimie (Usine de Melle, RTAM) et a été sélectionnée pour son aspect
morphologique blanc au lieu de l'habituel aspect jaune. Les souches RPA-
s BIOCAT1016, 1017, 1019 et 1021 ont été déposées à la CBS sous les
numéros respectifs CBS 101940, CBS 101941, CBS 101942, CBS 101943 et
CBS 101944.
2. Milieu de culture MSX
io
Le milieu MSX employé pour la culture des Xanthomonas
contient : 0,2 g/1 d'extrait de levure; 1,2 g/1 de NH4N03; 7,3 g/1 de KZHP04 ;
0,25
g/1 de MgS04, 7H20; 1 g/1 de glucose et 15 g/1 de Bacto-Agar pour le milieu
gélosé ; 10 g/1 de glucose pour le milieu liquide. Le sulfate de magnésium et
1s le glucose sont stérilisés à part et ajoutés extemporanément. Le pH du
milieu
est équilibré à pH 7,2 avant stérilisation avec de l'acide sulfurique dilué à
10 %.
Les préparation d'ADN génomique ont été réalisées à partir de
jeunes cultures liquides en MSX (0D660 inférieure à 0,4). Après centrifugation
2o de 40 ml de culture, le culot cellulaire est repris dans 11,9 ml de tampon
TE
(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York) et
630 p1 de SDS 10 % (Sodium Dodecyl Sulfate) puis 63 NI de Protéinase K à 20
mg/ml sont ajoutés. Après incubation de 1 h à 37°C, 2,1 ml de NaCI 5M
sont
ajoutés, suivis par 1,7 ml de 10% CTAB dans une solution de NaCI 0,7M et le
2s tout est incubé 10 min à 65°C. Après une première extraction avec un
volume
équivalent d'un mélange chloroforme/alcool isoamylique (24 :1 ) suivie d'une
deuxième extraction par un volume équivalent d'un mélange
phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 :24 :1 ), le surnageant est ajouté à
0,6 volume d'isopropanol. Après centrifugation (5 min à 10 000 tourslmin), le
3o culot obtenu est lavé dans de l'éthanol à 70% puis séché avant d'être
repris
dans au moins 2 ml de TE auxquels est ajouté 25 NI d'une solution de RNAse
à 5 mg/ml. Après une incubation de 1 h à 37°C, une extraction au
phénol/chloroforme/alcool isoamylique est réalisée et l'ADN du surnageant est
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précipité par ajout de 0,1 volume d'Acetate de sodium 3 M et de 2,5 volume
d'éthanol. Le culot obtenu après centrifugation de 5 minutes à 14 000
tours/min est lavé à l'éthanol 70%, séché, puis resuspendu dans au moins 0,5
ml de TE.
EXEMPLE 1
Clonage de la région hrpC2 de RPA-BIOCAT826
io La région visée a été amplifié par PCR à partir de l'ADN
génomique de la souche RPA-BIOCAT826 en utilisant les amorces XcC2.3
(SEQ ID N°1) et XcC2.4 (SEQ ID N°2). L'ADN génomique de la
souche RPA-
BIOCAT826 a été extrait et utilisé dans une réaction de PCR contenant 100 ng
d'ADN génomique, 40 pmole de chaque amorce, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de
is polymérase Pwo (Boehringer Mannheim) dans un volume final de 50 u1 du
tampon de cette enzyme. Après une incubation de 5 min à 95°C, le
mélange a
d'abord subi 30 cycles comprenant une incubation de 1 min à 94°C, puis
1 min
à une température allant de 63°C à 48°C (par pas de 0,5°C
par cycle) et 1 min
à 72°C, puis 15 cycles comprenant une incubation de 1 min à
94°C, suivie de 1
2o min à 48°C et d'une minute à 72°C, et enfin 10 min à
72°C. Le produit
d'amplification de taille voisine de 1,2 kb a été purifié par migration sur
gel
d'agarose puis à l'aide du kit Qiaex (Quiagen). II a ensuite été cloné dans le
vecteur pZERO-1 (Invitrogen BV) ouvert par EcoRV. Après transformation de
la souche E. coli JM110, un clone hébergeant un plasmide ayant intégré le
2s fragment de 1,2 kb a été retenu. Ce plasmide a été appelé pRPA-BCAT91 et
l'insert qu'il contenait a été séquencé (Genome Express, Grenoble, France).
La séquence obtenue (SEQ ID N°3) a été alignée avec la séquence du
gène
hrpC2 de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-
Microbe Interactions, 5 : 390-396). Une identité de 87% a été trouvée sur les
30 1188 bp représentant 61 % du gène hrpC2. La séquence en acides aminés
déduite de la séquence nucléotidique montre un pourcentage d'identité de
92% par rapport à la portion équivalente de la séquence de la protéine HrpC2
de X. campestris pv vesicatoria.
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EXEMPLE 2
Clonage de la région HrpA de RPA-BIOCAT826
s
Cette région a été clonée en criblant une banque partielle
génomique de la souche RPA-BIOCAT826 à l'aide d'une sonde nucléotidique
correspondant à la région équivalente de la souche X. campestris pv
vesicatoria. Cette région est disponible dans un plasmide dénommé pL3o qui
1o contient un insert de 6,6 kb EcoRV englobant les gènes hrpB8 et hrpA1 de X.
campesfris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-Microbe
Interactions, 5 : 390-396).
La sonde HRPA1 a été préparée par PCR en utilisant les
amorces XcvA15 (SEQ ID N°4) et XcvA18 (SEQ ID N°5) à raison de
40 pmole
is chacune, la matrice plasmidique pL3o (40 ng), 0,2 mM dNTP, 1,25 U de
polymérase Pwo (Boehringer Mannheim) dans un volume final de 50 NI du
tampon de cette enzyme. Après une incubation de 5 min à 95°C, le
mélange a
subi 30 cycles comprenant une séquence de 30 secondes à 94°C, 1 min à
55°C et 1,5 min à 72°C. Après une dernière incubation de 10 min
à 72°C, le
2o produit d'amplification de 664 bp a été purifié sur gel d'agarose puis par
le kit
Quiaex (Quiagen).
Environ 10pg d'ADN génomique de la souche RPA-BIOCAT826
ont été digéré par 100 unités d'EcoRl pendant 16h à 37°C. La technique
classique de Southern Blot a ensuite été employée afin de déterminer la taille
2s du fragment EcoRl hybridant avec la sonde HRPA1 décrite ci-dessus. Après
migration sur gel d'agarose de la digestion EcoRl ci-dessus, transfert sur une
membrane Hybond N+ (Amersham) par hybridation à 55°C pendant 19h dans
une solution aqueuse d'hybridation (0,5 % SDS ; 6% SSC ; 0,25% de lait
écrémé en poudre) avec la sonde HRPA1 marquée au phosphore 32 grâce au
3o kit Ready-To-Go (Pharmacia Biotech) selon les indications du fabriquant et
lavage à 55°C par une solution de 0,2 SSC et 0,1% SDS, la membrane a
été
mise en autoradiographie pendant 19 h à -80°C. Le développement du film
a
révélé un signal d'hybridation de taille voisine de 7,3 kb.
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Une banque partielle génomique de la souche RPA-BIOCAT826
a donc été réalisée en digérant 100 Ng d'ADN génomique de cette souche par
1000 unités de l'enzyme EcoRl pendant 20 h à 37°C. Après migration sur
gel
d'agarose, la zone correspondante aux fragments de taille comprise entre 7 et
s 8 kb a été découpée et l'ADN extrait du gel par éléctroélution dans un
boudin
de dialyse (membranes Spectra/Por de Spectrum Medical Industries, Inc).
Après précipitation à l'éthanol, l'ADN a été ligaturé dans un volume final de
10
NI au vecteur pBIueScript II SK (Stratagene) préalablement ouvert par l'enzyme
EcoRl puis dephosphorylé avec la phosphatase alcaline de crevette (United
1o States Biochemicals). Après incubation du mélange de ligation 14h à
16°C, un
dixième du mélange a été utilisé pour transformer par électroporation des
cellules d'E. coli DHSalpha. Environ 3000 transformants ont été analysés par
hybridation de colonies transférées sur membrane de nylon en utilisant la
sonde HRPA1. Douze colonies donnant un signal d'hybridation positif ont été
is purifiées sur milieu gélosé LB contenant 100 trglml d'ampicilline. Les
plasmides de douze colonies purifiées ont été extraits et des digestions EcoRl
des ces plasmides ont été analysées par Southern blot avec la sonde HRPA1
pour confirmer la présence d'un fragment d'environ 7,3 kb hybridant avec cette
sonde. Après une analyse de restriction avec diverses enzymes, un fragment
2o de 2,7 kb Sacl I et un fragment de 1,6 kb Sacl I ont été sous-clonés dans
le
vecteur pBIueScript II SK ouvert par Sacll pour donner respectivement les
vecteurs pRPA-BCAT135 et pRPA-BCAT134. Le séquençage partiel de ces
deux vecteurs a été réalisé (Genome Express, Grenoble) et a révélé la
présence d'une phase ouverte de lecture de 1818 bp (SEQ ID N°6) dont la
2s séquence peptidique déduite présente 85% d'identité avec la protéine HrpA1
de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular Plant-
Microbe Interactions, 5 : 390-396).
3o EXEMPLE 3
Construction de souches dérivées de RPA-BIOCAT826
contenant une délétion dhrpA1-C2
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La délétion dhrpA1-C2 a été construite in vifro en clonant dans le
plasmide pJQ200SK (Quandt et Hynes, 1993, Gene 127 : 15-21 ) un fragment
de pRPA-BCAT134 et un fragment de pRPA-BCAT91 (cf figure 1 ). Le
plasmide pRPA-BCAT91 a été ouvert par Ncol puis traité à la polymérase I
s (fragment de Klenow) pendant 15 min à 30°C en présence de 25pM de
dNTP.
Après extraction au phénol/chloroforme/alcool isoamylique puis précipitation à
l'éthanol, l'échantillon a été repris dans 40 p1 d'eau pour étre traité par 20
unités de Xbal à 37°C puis et 20 unités d'Apol à 50°C. Le
fragment d'environ
1,2 kb a alors été séparé sur gel et récupéré avec le kit Quiex II (Quiagen).
Le
io fragment d'environ 1,3 kb Rsal-Sacll de pBCAT134 a été purifié de façon
identique. Ces deux fragments ont été ligaturés au vecteur pBIueScript II SK
ouvert par les enzymes Sacll et Xbal pour donner le plasmide pRPA-
BCAT139. Un fragment Sacl-Xbal d'environ 2,5 kb porteur de la délétion d
hrpA1-C2 a alors pu être extrait de ce plasmide pour être cloné dans le
is plasmide pJQ200KS ouvert par les enzymes Sacl et Xbal. Le plasmide
résultant a été nommé pRPA-BCAT140. C'est un plasmide non réplicatif chez
X. campestris, porteur du marqueur de résistance à la gentamycine permettant
de sélectionner les clones de X. campestris ayant intégré le plasmide par
recombinaison homologue et porteur du marqueur de sélection positive sacB
2o qui permet de sélectionner les clones ayant éliminé le marqueur de
résistance
à la gentamycine suite à un deuxième événement de recombinaison
homologue.
Le plasmide pRPA-BCAT140 a été introduit dans la souche RPA-
BIOCAT826 par conjugaison. Pour ce faire, ont été mélangés sur milieu
2s gélosé MSX 40 p1 d'une culture en phase exponentielle de la souche
DHSalpha hébergeant pRPA-BCAT140, 40 NI d'une culture en phase
exponentielle de la souche HB101 hébergeant le plasmide pRK2013 (Ditta et
al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 7347-7351 ) et 40 p1 d'une culture
de
la souche RPA-BIOCAT826 en phase exponentielle dans un milieu MSX.
3o Après incubation pendant 24h à 30°C, les clones de X. campestris
ayant
intégré le plasmide pRPA-BCAT140 ont été purifiés deux fois de suite sur un
milieu gélosé MSX contenant 15 Ng/ml de gentamycine. Huit clones ont
ensuite été étalés sur une surface d'environ 1 cmz sur un milieu gélosé MSX
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contenant 5% de sucrose. Après une incubation de 72h à 30°C, des
colonies
ont été isolées par deux purifications successives sur milieu gélosé MSX.
Environ 300 colonies ont ensuite été repiquées sur milieu gelosé MSX
contenant 15 Ng/ml de gentamycine afin d'identifier les clones sensibles à la
s gentamycine (de 90 à 100 % des clones en fonction des essais). Une
quarantaine de ces clones ont ensuite été analysés par Southern Blot en
utilisant une digestion EcoRl-BamHl de leur ADN génomique et la sonde
HRPA1. Environ 25 % des clones présentaient un signal différent de celui de
la souche sauvage RPA-BIOCAT826 et cohérent avec l'intégration de la
io délétion dhrpA1-C2. Cinq clones ont été retenus pour la suite des
expériences : souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021, 1022.
EXEMPLE 4
1s Caractérisation par Southern Blot des souches dérivées de
RPA-BIOCAT826 contenant une délétion dhrpA~-C2
Les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022 ont
été caractérisées en analysant les profils d'hybridation de digestions d'ADN
2o génomique EcoRl, BamHl et EcoRl-BamHl avec les sondes HRP3'A1, HRPBS
et HRPC2.
La sonde HRP3'A1 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,6
kb Sacll du plasmide pRPA-BCAT134 par migration sur gel et utilisation du kit
Quiaex.
2s La sonde HRPC2 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,2
kb EcoRl-Xbal du plasmide pRPA-BCAT91 par migration sur gel et utilisation
du kit Quiaex.
La sonde HRPB5 a été obtenue en purifiant le fragment de 1,5 kb
BamHl du plasmide pRPA-BCAT129 par migration sur gel et utilisation du kit
3o Quiaex. Le séquençage de cet insert a révélé notamment une phase ouverte
de lecture (SEQ ID n°7) dont la séquence peptidique déduite présente
77%
d'identité avec la protéine HrpBS de X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et
al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interactions, 8 : 845-854). Le plasmide pRPA-
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BCAT129 a été obtenu en clonant les fragments BamHl d'ADN génomique de
la souche RPA-BIOCAT826 de taille comprise entre 1,3 et 1,9 kb dans le
vecteur pBIueScriptIISK et en criblant les colonies avec une sonde HRPB de
manière analogue à celle décrite dans l'exemple 2. La sonde HRPB a été
s obtenue par PCR en utilisant les amorces RST2 et RST3 (Leite et al., 1994,
Appl. Environ. Microbiol. 60 : 1068-1077) et la matrice plasmidique pB10g (U.
Bonis, communication personnelle). Le plasmide pB10g correspond au
plasmide pBluescriptKS dans lequel est cloné le fragment de 7,3 kb BamHl
contenant la région hrp8 et le gène hrpA9 de Xanthomonas campestris pv
io vesicaforia (Fenselau et al., 1995, Mol. Plant-Microbe Interactions, 8 :
845-
854). La réaction de PCR a été réalisée avec 40 pmole de chaque amorce, 50
ng de pB10g, 0,2 mM dNTP, 1,25 U de polymérise Pwo (Boehringer
Mannheim) dans un volume final de 50 NI du tampon de cette enzyme. Après
une incubation de 5 min à 95°C, le mélange a d'abord subi 24 cycles
is comprenant une incubation de 30 secondes à 95°C, puis 40 secondes à
une
température allant de 70°C à 63°C (par pas de 0,3°C par
cycle) et 1 min à
72°C, puis 6 cycles comprenant une incubation de 30 secondes à
95°C, suivie
de 40 secondes à 63°C et d'une minute à 72°C, et enfin 5 min à
72°C. Le
fragment d'environ 840 bp a ensuite été purifié sur gel d'agarose et à l'aide
du
2o kit Quiaex (Quiagen).
L'analyse en Southern Blot a été réalisée en marquant les
sondes à l'aide du kit « Megaprime DNA labelling system » (Amersham) selon
les instructions fournies. Après migration sur gel d'agarose, les digestions
d'ADN génomiques ont été transférées sur membranes Hybond N+
2s (Amersham) selon les indications fournies, puis incubées dans la solution
d'hybridation composée d'un tampon phosphate 0,5M et de SDS 7% (115 ml
de NazHP04 1 M, 84,6 ml de NaH2P04 M, 200 ml H20, 28 g SDS). Les
sondes marquées sont incubées 5 min à 100 °C, puis 5 min à température
ambiante avant d'être diluées dans 12 ml de solution d'hybridation et incubées
30 5 min à 100°C. Ce mélange est alors mis au contact des membranes
pendant
6 à 20 h à 65°C. Celles-ci sont ensuite lavées 10 à 15 minutes dans un
tampon phosphate 0,1 M contenant 1 % de SDS (42,3 ml Na2HP04 1 M, 57,7 ml
NaHzP04 1 M, 900 ml H20, 10 g SDS) puis mis en exposition.
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Les résultats obtenus avec la sonde HRPBS (figure 2) montrent,
pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à environ 4,8 kb avec
la digestion EcoRl et un signal à 1,6 kb avec la digestion BamHl et la
digestion
EcoRl-BamHl. Ces résultats sont en accord avec la cartographie de Arlat et al.
s (Molecular Plant-Microbe Interactions, 1991, 4 : 593-601) et la localisation
du
gène hrp85 décrit ci-dessus. Aucune des souches RPA-BIOCAT étudiées ne
montre de signal d'hybridation avec HRPBS, ce qui est cohérent avec
l'intégration de la délétion dhrpAl-C2 dans le génome de ces souches RPA
BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022 (La figure 2 ne montre que le résultat
1o d'hybridation obtenu avec les souches RPA-BIOCAT).
Les résultats obtenus avec la sonde HRPC2 (figure 3) montrent,
pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à environ 5,5 kb avec
les digestions EcoRl et un signal à environ 2,6 kb avec la digestion EcoRl-
BamHl. Ces résultats sont en accord avec la cartographie de Arlat et al.
1s (Molecular Plant-Microbe Interactions, 1991, 4: 593-601), l'organisation
des
gènes hrp chez X. campestris pv vesicatoria (Fenselau et al., 1992, Molecular
Plant-Microbe Interactions, 5 : 390-396) et la localisation du gène hrp85
décrit
ci-dessus. Les résultats obtenus avec les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017,
1019, 1021 montrent un signal entre 7 et 8 kb avec les digestions BamHl et un
2o signal à 4,4 kb avec les digestions EcoRl-BamHl. Compte tenu de la
cartographie présentée dans la figure 1, ces résultats sont cohérents avec
l'intégration de la délétion dhrpAl-C2 dans le génome des souches RPA-
BIOCAT 1016, 1017, 1019, 1021 et 1022.
Enfin, les résultats obtenus avec la sonde HRP3'A1 montrent,
2s pour la souche RPA-BIOCAT826, un signal d'hybridation à 7,3 kb environ pour
la digestion EcoRl-BamHl. Avec les souches RPA-BIOCAT 1016, 1017, 1019,
1021, ce signal d'hybridation est à 4,4 kb, ce qui est cohérent avec
l'intégration
de la délétion dhrpA1-C2 dans le génome des ces souches.
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EXEMPLE 5
Virulence des souches dérivées de RPA-BIOCAT826
contenant une délétion HrpA1-C2
s
Les tests de virulence ont été effectués sur des plants de choux
(8rassica oleracera var. captiva cultivar Siria) dont les semences ont été
obtenues auprès de Clause Semences (av. Lucien Clause, 91221 Brétigny-
sur-Orge, France). Les plantes ont été cultivées en cellule climatique selon
les
io paramètres suivants : 14 heures à 25°C, 55% d'humidité, intensité
lumineuse
saturante (4000 W/m) ; 10 heures à 25°C, 60% d'humidité. Elles ont été
infectées au stade 2 feuilles soit environ 13 jours après semis. Pour chaque
souche testée, 8 plants ont été utilisés en perçant la première feuille dans
la
nervure centrale de la partie terminale à l'aide d'un cure-dent infecté. La
is contamination du cure-dent a été réalisée en immergeant sa pointe dans une
culture de la souche étudiée de 2 jours en milieu MSX (environ 108
bactéries/ml). Les contrôles négatifs étaient constitués par un mélange de
souches de X. campestris pv vesicatoria (souche B229R1 = RPA-BIOCAT381
et souche B230R11 = RPA-BIOCAT382 ), phytopathogènes de référence sur
2o piments isolées chez Clause Semences. Les contrôles positifs étaient
constitués par un mélange de souches de X. campestris pv campestris
(souche 2963 = RPA-BIOCAT379 et souche 63C2AM = RPA-BIOCAT380),
phytopathogènes de référence sur choux isolées chez Clause Semences. Les
symptômes (lésions jaunes en forme de V) ont été lus et mesurés 12 et 14
2s jours après infection. Pour chaque plante, une note a été donnée selon la
correspondance suivante : 0, aucun symptôme ; 1, dépigmentation localisée à
proximité du point d'infection ; 2, nécrose inférieure à 0,5 cmz ; 3, nécrose
de
0,5 à 1,5 cm2 ; 4, nécrose supérieure à 1,5 cm2 ; 5, nécrose généralisée de la
feuille. La somme des notes des 8 plantes infectées avec la même souche est
30 la note de pathogénicité de cette souche (Tableau 1 ).
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Tableau 1 : Phytopatogénicité des souches de Xanthomonas
SOUCHES J + J + 14
12
B I OCAT 381 0 0
/382
BIOCAT 379/380 32 39
BIOCAT826 28 34
BIOCAT 1016 4 4
BIOCAT 1017 5 5
BIOCAT 1019 2 3
BIOCAT 1021 1 1
BIOCAT 1022 4 5
Alors que la souche RPA-BIOCAT826 provoque le flétrissement
progressif de la feuille, les souches construites provoquent au maximum un
flétrissement nécrotique. localisé, ce qui traduit une absence de
pathogénicité.
1o
EXEMPLE 6
Production de xanthane par les souches dérivées de RPA-
BIOCAT826 contenant une délétion HrpA1-C2
La productivité de xanthane des souches a été évaluée en
mesurant la matière sèche précipitable à l'isopropanol contenu dans 40 ml de
culture. Après 24 heures de préculture en MSX, 100 ml de milieu MSX en
fioles erlenmeyers de 500 ml ont été inoculés avec approximativement le
2o même nombre de bactéries (0,4 ml de préculture de OD660 = 0,25). Après 6
jours d'incubation à 30°C sous agitation (200 tours/min), 40 grammes de
cultures ont été prélevés et mélangés à 150 ml d'isopropanol. Après
filtration,
les fibres récupérées ont été lavées deux fois par 70 ml d'isopropanol avant
d'être séchées puis pesées en sortie d'étuve. L'opération réalisée sur trois
cultures indépendantes de la souche RPA-BIOCAT826 a montré une variabilité
de la productivité de l'ordre de 10 %. Les résultats obtenus avec la souche
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RPA-BIOCAT826 et ses dérivées OhrpA1-C2 sont regroupés dans le tableau
2.
Tableau 2 : Productivité de xanthane de RPA-BIOCAT826 et de
s ses dérivés dhrpA1-C2.
SOUCHE POIDS SEC Xt PRODUCTIVITE /
BIOCAT826 0,323 8,1 x 10-3
BIOCAT 1016 0,362 9,0 x 10-3
BIOCAT 1017 0,366 9,1 x 10-3
BIOCAT 1019 0,371 9,3 x 10-3
BIOCAT 10_21 0,334 8,4 x 10-3
L BIOCAT 1022 ~ 0,329 8,2 x 10-3
Les productivités sont exprimées en grammes de
1o matière sèche extractible à l'isopropanol par grammes de culture.
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1
LISTE DE SEQUENCES
<110> RHODIA CHIMIE
<120> Nouvelles souches bactériennes, notamment de
Xanthomonas, en particulier Xanthomonas campestris
<130> BFF 99/0315
<140> FR 9907963
<141> 1999-06-22
<160> 7
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 20
<212> ADN
<213> Séauence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 1
aaattcgtca agggtgatgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 2
gttccacctg gtcgacaagc 20
<210> 3
<211> 1189
<212> ADN
<213> Xanthomonas campestris
<400> 3
aaattcgtca agggtgatgc gatcgccggc ctggtgatca ccatggtcaa catcttggcc 60
ggcatcgtgg taggcgtgac ctaccacggc atgagcgcgg gcgaggccgc caaccgcttt 120
gcgatcctgt cggtaggcga tgcgatggtg tcgcagatcg cctcgctgct gatctcggtg 180
gcggccggcg tcatgatcac ccgcgtcgcc aacgagaatg aaaccaagat cagctcgctc 240
gggctcgaca tcggccgcca gctcaccagc aacgcacgtg ccttgatggc agcgagtgtg 300
ctgctggcct gctttgcgtt cgtgccggga tttccggcgc tgctgttcct gctgctggca 360
gcggcggtcg gtgccggggg ctatacgatc tggcgcaagc aacgcgacac cagcgggagc 420
gatcagcccg cactgccatc aaccagccgc aaaggtgcca aaggcgatgc gccgcacatc 480
cgcaagagcg ccccggattt cgcctcgccc ttgtcgatgc ggctttcgcc gcaactggct 540
gcacggctcg acccggcgct gctggatcag gcgatcgaaa gcgagcggag gcaattggtc 600
gagctgctgg gattgccgtt cccggggatc gcgatatggc agagcgaatc cctgcagggc 660
ctgcagtacg aagtgttgat ccacgatgtg ccggaaaccc gcagcgcgtt gagcgatacg 720
gcggacatgc agaaagcgct ggcccaacaa gccatcgcac cgttgcatgc acgcgcgcat 780
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2
ctgttcgtcg gcatccagga gacgcagtgg atgctggaac aggtgggcgc ggactatccc 840
gggctggttg cagaggtcaa caaggccatg ccagcccaac gcatcgccga tgtgttgcgg 900
cgactgctgg aagaacgcat cccggtgcgc aacatcaaga gcatcctgga gagcctggtg 960
gtgtggggac cgaaggaaaa ggatctgctg atgctgaccg agtatgtgcg ctgcgatctc 1020
ggccgctatc ttgcgcacac cgcgaccgca ggcaccggac agctgcctgc ggtgatgctc 1080
gaccacgccg tggaacagtt gatccggcag tcgattcgcg ccacaccggc cggcaatttc 1140
ctggcgctgc caccggagca ggccaatcag cttgtcgacc aggtggaaa 1189
<210> 4
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 4
gatccaacag ctggacaacc 20
<210> 5
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 5
aacggaatct tcgacaggcc 20
<210> 6
<211> 1818
<212> ADN
<213> Xanthomonas campestris
<400> 6
atggcatacg cctgtcctcc agttcaccgc catcgacgcg cgccgttggc cgctgccttg 60
ttgcttggct tgctgccgct gctgccgccg catgccaacg ccgcgtcggt gccgtggcac 120
tcgcgcagct tcaaatacgt tgccgaccgc aaggatctca aggaggtgct gcgcgacctg 180
tccgccagcc aatccatcac cacctggatt tcaccggagg tgaccggcac gctcagtggc 240
aaattcgaag ccactccgca gaagtttctc gacgatctat cgggcacgtt cggttttgtc 300
tggtattacg atggctcggt gctcagaatc tggggcgcga acgagaccaa gaatgcgacc 360
ttgagtttgg gcgctgcatc gacgagtgcg ctgcgcgatg cgcttgcgcg catgcggctg 420
gacgatccgc gctttccggt ccgttatgac gagacagcgc acctggcggt ggtgtcgggc 480
ccgccgggtt atgtggatac cgtcgcggcg atcgccaagc aggtcgagca ggtcgcgcgc 540
caacgcgacg ccaccgaagt gcaggtgttt cagctgcatt atgcgcaggc ggccgaccac 600
accacccgca tcggtggtca agacatccag gtgccgggca tggccagcct gttgcgcaac 660
atatacggcg tgcgtggcgc gcccactgcg gcgctgcccg ggccaggcgc gaatttcggg 720
cgtgtgcaac cgatcggcgg tggctcgtcc aataccttcg gcaacagcgg tcagcgccag 780
agtggcggca gcggcattct cggtttgcct gcgtcgtggt tcggcgctgg gtcgccgtcc 840
gagcgggtgc cggtcagtcc gccgttgccg ggcagtggca atagcgccaa tgcgccggcc 900
agcgtgtggc cggagatgag ccaggccaga cgcgatgcgc cgctggcggt ggacgccggc 960
agcggcggtg agctggcatc cgacgcgccg gtgatcgaag ccgacccgcg caccaacggc 1020
attctcattc gcgaccgccc cgagcggatg gccgcctatg gcacgttgat ccagcagctc 1080
gacaaccgtc ccaagctgct gcagatcgat gccaccatca tcgagatccg cgacggcgcc 1140
ctgcaggatc tcggcgtgga ctggcggttc cacagccggc gtgtggatgt gcagaccggc 1200
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gacgggcgtg gtggccagct tggctacgat ggcagcttga gcggtgcagc agccgccggt 1260
gcagccgcgc cgttgggcgg gacgttgacc gctgtcctgg gcgatgcagg gcgttacctg 1320
atgacgcgcg tctcggcgct cgagcagacc aacaaggcca agatcgtctc caccccgcag 1380
gtggcgacgc tggacaacgt ggaagcggtg atggaccaca agcaacaggc attcgtgcgt 1440
gtcagcggtt atgcatccgc cgacctctac aacctgtccg cgggtgtatc gctacgcgta 1500
ttgccaagtg tggtgccggg gtcgccaaat ggtcagatgc gcctggatgt gcgtatcgaa 1560
gacgggcagt tgggcgccaa taccgtcgat ggcattcccg tcatcacctc cagcgagatc 1620
accacgcagg ccttcgtcaa cgagggccag agcctgctga tcgccggtta tgcttccgac 1680
accgatcaga cagatctgaa caacgtcccc gggctgtcca ggattccatt ggtcggcaac 1740
ctgttcaagc atcgccagca gagcgggtcg cggttgcagc ggttgttcct gctgaccccg 1800
catatcgtct cgccctga 1818
<210> 7
<211> 702
<212> ADN
<213> Xanthomonas campestris
<400> 7
atgcgtcttt ggctgaggtc cacaccggaa gcggtcggcc ttgactgcga ggtcatccca 60
cgcgaggcat tggcctgtgt gctggaactg gacgcagcgg gtgcacaggt gcacgcgcgt 120
tgcgcgcagg cgctggcgga cgcccagacg cgtgcgcagg cgctgctcga cgctgcccaa 180
cggcaggccg aggccatcct tcaggatgcc cacgacaggg ccgagcgcag tgcacgcctg 240
ggctatgccg ccgggctgcg ccgtcagctc gacgcgtgga acgagcgcgg cgtgcggcat 300
gccttcgcgg cccaggacgc cgcacggcgc gcccgcgagc gcctggccga gatcgtcgcg 360
cacgcctgcg agcaggttct gcacgggcac gatcctgcgg cgctgtacgc gcgcgccgca 420
caggcgctgg acggcgccct ggacgaggcg aacgccctgc aggtgagcgt gcatcccgat 480
gcgctggacg atgcacggcg cgccttcgat gcggccgcag cggccggcgg atggagcatg 540
ccggtggaac tgtgcggtga tacgactctg gccttgggtg cctgcgtgtg cgaatgggat 600
accggcgtgt tcgagaccga tctgcgtgat cagctgcgca gtctccggcg cgtcattcgc 660
cgcgtgttgg ccacgccgca ggcggtgccg gatgcttgct ga 702
