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WO 01/20030 PCT/FR00/02578
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT POUR LA
TRIMETHYLAMINE N-OXYDE REDUCTASE, ET LEURS UTILISATIONS,
NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues de
gènes codant
pour la triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase) et utilisables,
notamment en tant
qu'amorces, pour la mise en oeuvre de procédés de détection de bactéries
impliquées dans
i
l'altération des chairs d'animaux aquatiques, et plus particulièrement
d'animaux marins.
Le triméthylamine N oxyde (TMAO) est un des principaux constituants de petit
poids
moléculaire des animaux marins, où il peut représenter jusqu'à 1% de leur
poids sec. En
anaérobiose, certaines bactéries utilisent le TMAO comme accepteur exogène
d'électrons pour
leur respiration. Le TMAO est alors réduit en triméthylamine (TMA), composé
très volatil,
responsable en grande partie de l'odeur nauséabonde des poissons en voie de
décomposition. La
réduction du TMAO en TMA a été mise en évidence chez les bactéries marines,
comme celles
du genre Shewanella, Photobacterium ou Yibrio (1, 2), chez des bactéries
photosynthétiques
isolées dans les eaux saumâtres, comme celles du genre Rhodobacter (3), mais
aussi chez
plusieurs entérobactéries, comme Escherichia coli, Salmonella typhimuriur~c ou
Proteus
vulgaris (4).
L'enzyme responsable de la réduction du TMAO en TMA, correspond à la
triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase), dont les propriétés ont été
étudiées chez
différents organismes. A titre d'exemple, il existe chez E. coli deux enzymes
distinctes
responsables de la réduction du TMAO : la TMAO réductase et 1â DMSO réductase.
La TMAO
réductase, qui est responsable de 90% de la réduction du TMAO, est une
molybdoenzyme
périplasmique de 90 kDa, pouvant être trouvée sous forme de monomère ou de
dimère (5). Les
TMAO réductases des différentes bactéries étudiées sont toutes des
molybdoenzymes de 80
100 kDa qui peuvent être retrouvées sous forme de monomère, dimère ou
tétramère. Ces
protéines sont toutes inductibles en anaérobiose par le TMAO, mais aussi par
le DMSO
(diméthylsulfoxyde). Enfin, hormis chez P. vulgaris, les TMAO réductases sont
toutes
localisées dans le périplasme de la bactérie.
L'étude du système TMAO réductase au niveau génétique et moléculaire a été
réalisée
chez les entérobactéries E. coli et celles du genre Rhodobacter. Les deux
TMAO/DMSO
réductases des bactéries du genre Rhodobacter et la TMAO réductase inductible
d'E. coli
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présentent une homologie au niveau de leur séquence primaire (6, 7, 8). La
structure globale de
la TMAO réductase d'E. coli pourrait se rapprocher de celles décrites pour
Rhodobacter
sphaeroides ou Rhodobacter capsulatus. Chez E. coli, les gènes qui codent pour
les différents
composants du système TMAO réductase sont organisés en opéron : l'opéron
torCAD, qui code
pour les trois protéines TorC, TorD et TorA (6). Chez Rhodobacter, les gènes
qui codent pour
les différents composants du système TMAO/DMSO réductase sont également
organisés en
opéron : fopéron dorCDA, qui code pour trois protéines DorC, DorD (également
appelé Dora)
et DorA, possédant des homologies avec respectivement les protéines TorC, TorD
et TorA
d'E.coli (9, 10).
Une étude phylogénétique par séquencage de l'ADNr 16S a été réalisée sur une
bactérie
isolée à partir d'un poisson péché dans la baie de Marseille, et gardé à
température ambiante
dans de l'eau de mer filtrée. Les résultats obtenus montrent que cette
bactérie, qui possède une
activité TMAO réductase importante, correspond à une nouvelle espèce du genre
Shewanella,
proche de Shewanella putrefaciens. Elle a été appelée Shewanella massilia.
Excepté la protéine
TorE, les produits des gènes de l'opéron torECAD de S. massilia possèdent de
fortes
homologies avec les protéines impliquées dans les systèmes TMAO réductase d'E.
coli et des
bactéries du genre Rhodobacter (19). De même, la structure globale de la TMAO
réductase de
S. massilia présente des homologies avec les structures déjà décrites des
TMAO/DMSO
réductases des bactéries du genre Rhodobacter (20).
L'altération des chairs de poissons, comme de la plupart des aliments, est
essentiellement
due à l'activité métabolique de certaines bactéries, pouvant représenter
jusqu'à 10g cellules par
gramme de produit. Les premières modifications post mortem qui surviennent au
niveau des
chairs dé poissons ne sont pas nécessairement dues aux bactéries; mais à
certaines réactions
d'autolyse. Cependant, le développement microbien constitue très vite
l'élément majeur de
l'altération, le tissu musculaire du poisson constituant un substrat pour la
croissance
bactérienne. Plusieurs facteurs intrinsèques aux chairs de poissons peuvent
expliquer leur très
grande altérabilité, comparée à d'autres produits alimentaires : une
hydratation importante, un
pH post mortem élevé (> 6), une forte teneur en substances azotées non
protéiques, dont le
TMAO forme la part essentielle et, une faible teneur en protéines de soutien
(11, 12). Ces
différentes caractéristiques contribuent au développement d'une flore
microbienne d'altération
spécifique des chairs de poissons. De façon intéressante, la diversité des
espèces de poissons ne
semble pas avoir d'incidence sur la nature ou le nombre de bactéries
initialement présentes sur
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le poisson: En revanche, la microflore bactérienne du poisson semble
directement liée à
l'environnement naturel où il évolue. Ainsi, la contamination de l'eau qui
dépend
essentiellement de la température, la salinité ou la concentration en oxygène
dissous, semble
jouer un rôle déterminant. L'origine des bactéries retrouvées au niveau des
chairs de poissons
ne provient pas uniquement de la microflore des poissons vivants : des
bactéries contaminantes
peuvent notamment provenir de la chaîne du froid (la glace, les récipients
contenant les
poissons, les étapes de transformation...). Parmi l'ensemble de la flore
microbienne retrouvée
au niveau des chairs de poissons, une partie seulement est rendue responsable
du phénomène de
putréfaction. Tandis qu'une contamination bactérienne ne rend pas
nécessairement les chairs de
poissons impropres à la consommation, certaines bactéries entraînent
rapidement des
changements désagréables dans la texture, la saveur ou l'odeur dégagée (13).
Les produits de la mer représentent donc ' une denrée hautement périssable,
posant de
nombreux problèmes de conservation aux industriels de la pêche. La maîfirise
de la qualité
fraîcheur de ces produits constitue ainsi une préoccupation de plus en plus
importante pour
l'ensemble du secteur de la pêche (producteurs, transformateurs ou
distributeurs), conduisant
depuis quelques années les industriels à rechercher de nouvelles techniques
permettant de
rendre compte de l'état de fraîcheur du poisson dans des délais très brefs.
Actuellement, la détermination de (état de fraîcheur des produits de la mer
est
essentiellement fondée sur une appréciation sensorielle (aspect, odeur,
saveur) qui permet au
mieux de conclure à un produit frais, moyennement frais ou impropre à la
consommation. Cette
méthode organoleptique n'est cependant applicable qu'à des produits entiers,
et des analyses
plus fiables en laboratoire sont souvent indispensables.
Lés méthodes basées sur une analyse bactériologique (flore bactérienne totale)
applicables à des produits transformés sont de plus en plus utilisées pour
apprécier l'état de
fraîcheur du poisson. L'estimation directe du nombre de bactéries cultivables
sur un échantillon
de poisson reste la méthode la plus communément utilisée : après croissance
sur différents
milieux (par exemple milieu de citrate de fer), chaque cellule va former une
colonie visible sur
boîtes de pétri, permettant ainsi un dénombrement. Bien que cette technique
soit simple
d'utilisation et assez sensible, elle nécessite cependant un temps
d'incubation pour la croissance
important (de 3 à 5 jours environ). De plus, la composition du milieu de
croissance, ou les
températures retenues pour ces tests (20-30°C), ne permettent pas
toujours de détecter
l'ensemble des bactéries d'altération. Ainsi, la réglementation actuelle qui
préconise une
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température de 30°C pour réaliser ces tests (arrêté de 1979), ne permet
pas de pouvoir détecter
certaines bactéries d'altération comme Photobacterium phosphoreum qui ne
croissent pas à
cette température. Ainsi, même si la mesure non spécifique de la charge
microbienne totale
constitue un bon indicateur de l'état d'hygiène des poissons, elle ne permet
cependant pas
d'évaluer la qualité sensorielle de ce type de produit. L'examen microscopique
des aliments est
une technique rapide pour estimer le niveau de contamination bactérienne. Les
cellules colorées
à facridine orange sont visualisées par une technique de microscopie de
fluorescence ; le
principal inconvénient de cette méthode reste cependant sa faible sensibilité
(entre 104 et 105
cellules).
La dégradation des composants cellulaires du poisson conduit à la production
de
nombreuses substances qui peuvent servir d'indicateur indirect d'une
contamination
bactérienne. Une alternative aux méthodes énumérées ci-dessus a donc consisté
à suivre par des
techniques chimiques, différents produits de dégradation des chairs de
poissons (14). La
détermination de l'azote basique volatile total (ABVT), dont l'ammoniac (NH3)
et la
triméthylamine (TMA) forment la part essentielle, est une technique largement
répandue à
l'heure actuelle pour estimer le degré de décomposition des chairs de
poissons. Le dosage de
l'ABVT a l'avantage d'être simple, rapide et d'un coût de revient très faible.
La détermination
du taux de TMA dans l'ABVT, permet d'apporter un élément qualitatif
supplémentaire au
critère ABVT. Ce critère semble en effet moins dépendant de variations qui
affectent
généralement le taux de TMA ou d'ABVT (l'espèce du poisson, sa teneur en
graisses etc...). La
même méthodologie que pour l'ABVT peut être utilisée pour doser la TMA.
D'autres
techniques colorimétrique, enzymatique ou chromatographiques ont également été
décrites pour
quantifier la TMA (15, 16). Lors de la réaction de réduction du TMAO en TMA
par les
bactéries, les chairs de poissons en décomposition subissent différents
changements : baisse du
potentiel rédox, une augmentation du pH, de la conductivité électrique.
Plusieurs études ont
donc également utilisé ces différents indicateurs pour tenter de suivre
indirectement le
dégagement de TMA. Cependant l'ensemble de ces études n'a jamais permis
d'établir une
corrélation définitive entre le niveau de TMA dégagé et la qualité fraîcheur
des échantillons de
poissons. De nombreux autres produits de dégradation ont également été testés
afm de pouvoir
déterminer par des dosages chimiques le niveau d'altération du poisson : le
sulfure
d'hydrogène, l'hypoxanthine, l'indol, l'histamine et les acides aminés.
Cependant, ces
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différents dosages ne sont significatifs que dans certaines espèces de
poissons, ou à un niveau
d'altération très avancé.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une technique moléculaire
qui
permet d'amplifier de grandes quantités d'une séquence d'ADN cible dans le but
de la
visualiser. Depuis quelques années, la technique de la PCR est de plus en plus
utilisée pour la
détection et l'identification de micro-organismes notamment dans le domaine de
la
bactériologie clinique ou celui de la sécurité des aliments (17, 18).
Actuellement, les tests PCR
appliqués aux produits alimentaires permettent principalement la détection de
bactéries
pathogènes bien déterminées (Shigella, Salmonella, Listeria ...).
La présente invention découle de la mise en évidence par les inventeurs du
fait que les
séquences d'ADN codant pour une protéine du système TMAO réductase, ont une
homologie
suffisante au sein des diverses bactéries, notamment au sein des bactéries
responsables de
l'altération des tissus d'organismes aquatiques, et plus particulièrement au
sein des bactéries
marines, pour permettre la mise en oeuvre de procédés de détection de toutes
bactéries
responsables de (altération des tissus par leur activité TMAO réductase,
lesdits procédés étant
applicables sur tout animal aquatique, et notamment sur tout animal marin.
L'un des buts de la présente invention est de fournir un test de qualité
fraîcheur des
produits aquatiques, et plus particulièrement des produits de la mer, à la
fois rapide, peu
coûteux, et offrant une fiabilité élevée en terme de spécificité et de
sensibilité.
L'un des autres buts de la présente invention est de fournir un test de
détection non pas
d'un type bactérien, mais de l'ensemble des bactéries responsables de
l'altération des tissus
d'organismes aquatiques, et notamment de la putréfaction des chairs de
poissons, à savoir aussi
bien les bactéries marines, que les entérobactéries ou les bactéries isolées
au niveau des eaux
saumâtres.
Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de
bactéries
responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, applicable à
différentes espèces de
poissons provenant de régions géographiques différentes.
Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de
bactéries
responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, suffisamment
sensible pour
détecter des étapes précoces de l'altération.
La présente invention a pour obj et l'utilisation de séquences nucléotidiques
choisies parmi
celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système
triméthylamine N-oxyde
s
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réductase (TMAO réductase) chez les bactéries, ou un fragment de cette
séquence telle qu'une
sonde ou une amorce d'environ 15 à environ 25 nucléotides, ou une séquence
dérivée par
addition, suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides de
cette séquence codant
pour une protéine du système TMAO réductase ou d'un fragment de cette
dernière, ledit
fragment et ladite séquence dérivée étant capables de s'hybrider, notamment
dans les conditions
d'hybridation définies ci-après, avec ladite séquence codant pour une protéine
du système
TMAO réductase, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la
présence de toutes
bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux
aquatiques, chez un
hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du
système
TMAO réductase susmentionnées, sont choisies parmi celles correspondant à
l'opéron torCAD
ou l'opéron dorCDA mentionnés ci-dessus, du systéme TMAO réductase chez les
bactéries.
De préférence, la séquence codant pour une protéine du système TMAO réductase
susmentionnée, est choisie parmi les séquences codant pour la TMAO réductase
chez les
bactéries, encore désignée protéine TorA ou DorA, ou codant pour un cytochrome
de type c
chez les bactéries, encore désigné protéine TorC ou DorC.
Selon un mode particulièrement avantageux de l'invention, les séquences
nucléotidiques
codant pour une protéine du système TMAO réductase sont choisies parmi celles
des bactéries
suivantes
- les bactéries marines, telles que celles du genre Shewanella, Photobacterium
ou Vibrio,
lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes
* la séquence SEQ >D NO :1 codant pour la protéine TorA de Shewanella
massilia représentée sur la figure 1,
* la séquence SEQ )D NO :2 codant pour la protéine TorA de Shewanella
putref'aciens représentée sur la figure 1,
* la séquence SEQ ID NO :3 codant pour la protéine TorA de Shewanella c
représentée sur la figure 2,
* la séquence partielle SEQ m NO :4 codant pour la protéine TorA de
Photobacterium phosphoreum représentée sur la figure 3,
* la séquence codant pour la protéine TorC SEQ m NO :5 de Shewanella
massilia représentée sur la figure 14,
- les bactéries provenant des eaux saumâtres, telles que celles du genre
Rhodobacter, ou
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Roseobacter, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes
* la séquence SEQ >D NO : 6 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter
sphaeroides représentée sur la figure 4,
* la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter
capsulatus représentée sur la figure 4,
* la séquence codant pour la protéine DorC SEQ ID NO : 8 de Rhodobacter
sphaeroides représentée sur la figure 14,
- les entérobactéries, telles que celles du genre Escherichia, ou Salmonella,
lesdites
séquences étant notamment choisies parmi les suivantes
* la séquence SEQ )D NO : 9 codant pour la protéine TorA de Escherichia
coli représentée sur la figure 4,
* la séquence partielle SEQ )D NO : 10 codant pour la protéine TorA de
Salmonella typhimurium représentée sur la figure 5,
* la séquence codant pour la protéine TorC SEQ >D NO : 11 de Escherichia
1 S coli représentée sur la figure 14.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de
séquences
nucléotidiques choisies parmi les fragments des séquences définies ci-dessus,
ou parmi les
séquences dérivées de ces fragments, lesdits fragments ou séquences dérivées
comprenant
environ 15 à 25 nucléotides, et sont utilisés par paires pour former des
couples d'amorces
permettant l'amplification de fragments de gènes codant pour une protéine du
système TMAO-
réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux
aquatiques, selon la
technique PCR.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques susmentionnées sont utilisées
sous forme
de couples d'amorces choisis parmi l'un quelconque des trois groupes d'amorces
suivants
(1) le groupe d'amorces « DDN » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA,
ce
groupe comprenant
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes
- DDN1+ (SEQ ID NO : 12) : S' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de
54 séquences nucléotidiques,
- DDNS+ (SEQ )D NO : 13) : S' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' : mélange de 4
séquences nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes
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- DDN2- (SEQ ID NO : 14) : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3'
mélange de 32 séquences nucléotidiques,
- DDN3- (SEQ ID NO : 15) : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16
séquences nucléotidiques,
- DDN4- (SEQ ID NO : 16) : S' TGr CCd CGr kCG TT~ AAG AC 3' : mélange de 24
séquences nucléotidiques,
- DDNS- (SEQ ID NO : 17) : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6
séquences nucléotidiques,
(2) le groupe d'amorces « BN » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA,
ce
groupe comprenant
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes
- BN1+ (SEQ ID NO : 18) : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16
séquences
nucléotidiques,
- BN3+ (SEQ >D NO : 19) : S ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3 ' : mélange de 96
séquences nucléotidiques,
- BN6+ (SEQ ID NO : 20) : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64
séquences nucléotidiques,
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes
- BN2- (SEQ m NO : 21) : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216
séquences nucléotidiques,
- BN4- (SEQ >D NO : 22) : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192
séquences nucléotidiques,
- BNS- (SEQ )D NO : 23) : S'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3', : mélange de 72
séquences
nucléotidiques,
(3) le groupe d'amorces « BC » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torC,
ce
groupe comprenant
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes
- BC1+ (SEQ ID NO : 24) : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256
séquences nucléotidiques,
- BC2+ (SEQ ID NO : 25) : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96
séquences nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes
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- BC2- (SEQ )D NO : 26) : S' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96
séquences nucléotidiques,
- BC3- (SEQ m NO : 27) : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128
séquences
nucléotidiques,
dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T),
m = (A,C),
w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G, T),
les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des
amorces d'un
couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+,
BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une
des compositions
de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples
d'amorces
étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants
(a) le couple DDN1+ / DDNS-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant
pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de
bases (bp), et
notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la
protéine TorA
chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les
nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia
représenté sur la figure
4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant
pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les
nucléotides situés aux
positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(c) le-couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant pour
la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les
nucléotides situés aux
positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant pour
la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment
polypeptidique
délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine
TorC de S. massilia
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représentée sur la figure 14.
Les hôtes susceptibles d'être porteurs de bactéries impliquées dans le
processus de
dégradation des chairs d'animaux aquatiques, telles que décrites ci-dessus,
sont des organismes
aquatiques, notamment des organismes marins tels que les poissons et les
crustacés, et plus
particulièrement les poissons d'Atlantique tels que la sole, le .cabillaud, ou
les poissons de la
mer Méditerranée tels que le rouget de roche, la dorade, ainsi que certains
animaux des eaux
douces ou saumâtres.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de
séquences i
nucléotidiques décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de
détection de la
présence de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs
d'animaux aquatiques,
dans le cadre d'un procédé d'évaluation de l'état de fraîcheur des animaux
aquatiques sur
lesquels est prélevé l'échantillon testé, lorsque ces derniers sont extraits
de leur environnement
naturel.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique correspondant à
l'une des
séquences suivantes
- DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3',
- DDNS+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3',
- DDN2- : S'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3',
- DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3',
- DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3',
- DDNS- : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3',
- BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3',
- BN3+ : S' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3',
- BN6+ : S ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ',
- BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3',
- BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3',
- BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3',
- B C 1 + : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ',
- BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3',
- BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3',
- BC3- : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3',
dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T),
m = (A,C),
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w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention a également pour obj et toute composition de séquences
nucléotidiques en
mélange, correspondant à l'une des compositions suivantes
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes
- DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences
nucléotidiques,
- DDNS+ : S' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' . mélange de 4 séquences
nucléotidiques,
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes
- DDN2- : S'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' : mélange de 32 séquences
nucléotidiques,
- DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3' : mélange de 16 séquences
nucléotidiques,
- DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences
nucléotidiques,
- DDNS- : S' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences
nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes
- BN1+ : 5' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
- BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences
nucléotidiques,
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes
- BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' : mélange de 216 séquences
nucléotidiques,
- BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' : mélange de 192 séquences
nucléotidiques,
- BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes
- BC1+ : S' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences
nucléotidiques,
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- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3 ' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes
- BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
- BC3- : S' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences
nucléotidiques,
dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T),
m = (A,C),
w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention concerne également les couples d'amorces choisis au sein de l'un
des groupes
d'amorces suivants
(1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant
1 les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes
- DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences
nucléotidiques,
- DDNS+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3' : mélange de 4 séquences
nucléotidiques,
~ les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes
- DDN2- : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3' : mélange de 32 séquences
nucléotidiques,
- DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3 ' : mélange de 16 séquences
nucléotidiques,
- DDN4- : S' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3' : mélange de 24 séquences
nucléotidiques,
- DDNS- : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3' : mélange de 6 séquences
nucléotidiques,
(2) le groupe d'amorces « BN » comprenant
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes
- BN1+ : S' C bGA yAT CsT rCT GCC 3' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
- BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences
nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes
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- BN2- : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3' . mélange de 216 séquences
nucléotidiques,
- BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3' . mélange de 192 séquences
nucléotidiques,
- BNS- : 5'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3' : mélange de 72 séquences nucléotidiques,
(3) le groupe d'amorces « BC » comprenant
~ les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes
- BC1+ : S' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3' : mélange de 256 séquences
nucléotidiques,
- BC2+ : 5' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
1 les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes
- BC2- : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences
nucléotidiques,
- BC3- : 5' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3' : mélange de 128 séquences
nucléotidiques,
dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T),
m = (A,C),
w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T),
les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des
amorces d'un
couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+,
BN+ ou BC+
susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une
des compositions
de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples
d'amorces
étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants
(a) le couple DDN1+ / DDNS-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant
pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de
bases (bp), et
notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la
protéine TorA
chez les bactéries du genre Shéwanella, tel que le fragment de 821 bp délimité
par les
nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia
représenté sur la figure
4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant
pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les
nucléotides situés aux
positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
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(c) le couple BN6+ BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant pour
la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les
nucléotides situés aux
positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène
codant pour
la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et
notamment à
l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC
chez les bactéries
du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment
polypeptidique
délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine
TorC de S. massilia
représentée sur la figure 14.
L'invention a également pour objet une. méthode de détection de toutes
bactéries
impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques chez un hôte
susceptible d'être
porteur de telles bactéries, ladite méthode étant effectuée à partir d'un
échantillon biologique
prélevé sur cet hôte, cet échantillon biologique correspondant notamment à un
fragment sous-
cutané de chair de (animal aquatique en question, et étant caractérisée en ce
qu'elle comprend
une étape d'hybridation d'au moins une séquénce nucléotidique telle que
définie ci-dessus, avec
des fragments de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de
bactéries
impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques susceptibles
d'être présentes
dans l'échantillon biologique prélevé sur ledit hôte, suivie d'une étape de
révélation, notamment
par électrophorèse, de la présence éventuelle dans ledit échantillon de gènes
codant pour une
protéine du système TMAO-réductase, ou de fragments de ces gènes, dont le
nombre de copies
a été le cas échéant amplifié.
L'invention a plus particulièrement pour objet une méthode de détection telle
que définie
ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes
- le traitement d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte afm
d'extraire l'ADN total
de cet hôte et de rendre le génome de ces bactéries accessible aux séquences
nucléotidiques ou
amorces définies ci-dessus, ce traitement étant notamment effectué à l'aide
d'une technique
d'extraction rapide de l'ADN basée sur la fixation des acides nucléiques à des
billes de silice,
- l'amplification du nombre de copies de gènes codant pour les protéines du
système
TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs
d'animaux aquatiques,
ou de fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans cet
échantillon, à l'aide des
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séquences nucléotidiques ou amorces susmentionnées,
- la détection de la présence éventuelle d'un nombre amplifié de copies de
gènes codant
pour une protéine du système TMAO-réductase des bactéries susmentionnées, ou
de fragments
de ces gènes, et donc de la présence de telles bactéries dans l'échantillon
biologique étudié.
Avantageusement, les méthodes de détection selon l'invention, sont
caractérisées en ce
que l'amplification du nombre de gènes codant pour les protéines du système
TMAO-réductase
comprend les étapes suivantes
- la prédénaturation de l'ADN double brin total de l'hôte en ADN mono-brin, de
préférence dans un tampon constitué de IOmM Tris-HCl pH 8,3, SOmM KCI, l,SmM
MgCl2,
0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP,
dGTP, dTTP)
à une concentration de 100 p,M chacun, et des couples d'amorces, tels que
définis ci-dessus, par
chauffage entre environ 90 °C et environ 100 °C, avantageusement
à 94 °C, pendant environ
1,5 minute,
- l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape
précédente
d'ADN polymérase, par exemple la Taq polymérase,
1 chauffage à environ 94°C pendant environ 30 secondes, ce qui
correspond à
l'étape de dénaturation proprement dite,
1 puis chauffage entre environ 35°C à environ 60 °C, et
notamment à environ 45°C
ou 55°C, pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape
d'hybridation des amorces
avec les gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de
bactéries, ou des
fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon
biologique étudié,
~ et enfin, chauffage à 72 °C, pendant environ 45 secondes, ce qui
correspond à
l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers
l'autre, produisant
ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments des gènes
codant pour les
protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ces dernières séquences
étant délimitées
par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées,
- la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 15 et
environ 35 fois,
avantageusement environ 30 fois.
L'invention concerne également les trousses ou kits pour la mise en oeuvre
d'une
méthode de détection susmentionnée, caractérisés en ce qu'ils comprennent
- une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou amorces telles que définies ci-
dessus,
- une ADN polymérase,
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- un milieu réactionnel avantageusement constitué de IOmM Tris-HCl pH 8,3,
SOmM
KCI, l,SmM MgClz, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des
ADN (dCTP,
dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 pM chacun.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant
- la séquence représentée sur la figure 2 du gène torA codant pour la protéine
TorA de la
bactérie marine Shewanella C,
- ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du
code
génétique, et codant pour la protéine TorA de Shewanella C, dont la séquence
peptidique est
représentée sur la figure 6,
- ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée,
notamment par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35. % à 100 % avec la séquence
nucléotidique
susmentionnée représentée sur la figure 2,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une
séquence
dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de
préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention a également pour objet tôute séquence peptidique codée par la
séquence
nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2, et comprenant
- la séquence en acides aminés représentée sur la figure 6 de la protéine TorA
de
Shewanella c,
- ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment
par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence
peptidique
susmentionnée représentée sur la figure 6,
- ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence
dérivée de
cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence
constitué d'au
moins environ S acides aminés.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant
- la séquence partielle représentée sur la figure 3 du gène codant pour la
protéine TorA de
la bactérie marine Photobacterium phosphoreum,
- ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du
code
génétique, et codant pour le fragment de la protéine TorA de Photobacterium
phosphoreum
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dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 7,
- ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée,
notamment par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence
nucléotidique
susmentionnée représentée sur la figure 3,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une
séquence
dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de
préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence
nucléotidique susmentionnée représentée sur le figure 3, et comprenant
- la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 7 de la
protéine TorA de
Photobacterium phosphoreum,
- ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment
par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence
peptidique
susmentionnée représentée sur la figure 7,
- ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence
dérivée de
cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence
constitué d'au
moins environ 5 acides aminés.
L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique comprenant
- la séquence partielle représentée sur la figure 5 du gène codant pour la
protéine TorA de
la bactérie marine Salmonella typhimurium,
- ou--toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence
du code
génétique, et codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium dont la
séquence
peptidique est représentée sur la figure 8,
- ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée,
notamment par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence
nucléotidique
susmentionnée représentée sur la figure 5,
3 0 - ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une
séquence
dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de
préférence constitué
d'au moins environ 15 nucléotides.
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L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence
nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, et comprenant
- la séquence en acides aminés représentée sur la figure 8 de la protéine TorA
de
Salmonelle typhimurium,
- ou une séquence dérivée de la séquence peptidique .susmentionnée, notamment
par
substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite
séquence dérivée
ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence
peptidique
susmentionnée représentée sur la figure 8,
- ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence
dérivée de
cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence
constitué d'au
moins environ S acides aminés.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui
suit de
l'obtention d'amorces de l'invention, et de leur utilisation pour la mise en
oeuvre d'un procédé
de détection selon (invention.
1 S Description des figures
- la figure 1 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes
torA de
Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S.c.), et de Shewanella
putrefaciens
(torA/S.p.).
- la figure 2 représente la séquence nucléotidique complète du gène torA
codant pour la
TMAO réductase de Shewanella c.
- la figure 3 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA
codant pour la
TMAO réductase de Photobacterium phosphoreum.
- la-figure 4 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes
torA de
Shewanella massilia (torA/S.m.), de E. coli (torA/E. c.), de Rhodobacter
sphaeroides
(TorA/R.s.), et Rhodobacter capsulatus (TorA/R.c.). Les flèches indiquent la
position des
différentes amorces sur le gène torA de la bactérie Shewanella massilia,
élaborées à partir des
régions conservées. Plus particulièrement, les positions des différentes
amorces « DDN » et
« BN » sur le gène torA de S. massilia sont les suivantes
DDNl+ : 620 BNl+ : 1628
3 0 DDNS+ : 1428 BN3+ : 621
DDN2- : 1684 BN6+ : 1657
DDN3- : 2201 BN2- : 2403
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DDN4- : 2325 BN4- : 2023
DDNS- : 1450 BNS- : 946
- la figure 5 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA
codant pour la
TMAO réductase de Salmonella typhimurium.
- la figure 6 représente la séquence peptidique complète de la TMAO réductase
de
Shewanella c.
- la figure 7 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de
la protéine
TorA de Photobacterium phosphoreum (TorA/P.p.), déduit du fragment d'ADN
amplifié chez
P. phosphoreum à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDNS-, avec les régions
protéiques
correspondantes des protéines TorA de Shewanella massilia (TorA/S.m.), de E.
coli
(TorA/E.c.), et de Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.).
- la figure 8 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de
la protéine
TorA de Salmonella typhimurium (TorA/S.t.), déduit du fragment d'ADN amplifié
chez S.
typhimurium à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDNS-, avec les régions
protéiques
correspondantes de la protéine TorA de E. coli (TorA/E. c.), de la protéine
DorA de
Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.), et de la protéine TorA de Shewanella
massilia
(TorA/S.m.).
- la figure 9 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région
très conservée
du gène qui code pour la TMAO réductase des bactéries du genre Shewanella et
de E. coli,
utilisée pour l'élaboration d'une des amorces moléculaires « DDN » selon
l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces DDN sur le
gène torA
codant pour la TMAO réductase de différentes bactéries du genre Shewanella et
de E. coli,
(b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces .DDN (DDNl+); la zone
encadrée correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code
pour la TMAO
réductase des bactéries du genre Shewanella [Shewanella massilia (torAlS.
massilia),
Shewanella putrefaciens (torAlS. putrefaciens), Shewanella c (torAlS. c)] et
de E. coli.
- la figure 10 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de
la PCR lorsque
l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Shewanella
massilia (pistes 1,
2, 3 et 4), de Shewanella c (pistes 5, 6, 7 et 8) et de Shewanella
putrefaciens MR-1 (pistes 9,
10, 11 et 12) en utilisant les amorces moléculaires DDN1+/DDNS- (pistes 1, 5
et 9 ; taille
attendue : 820 pb), DDNS+/DDN2- (pistes 2, 6 et 10 ; taille attendue : 234
pb), DDNS+/DDN3-
(pistes 3, 7 et 11 ; taille attendue : 740 pb), DDNS+/DDN4- (pistes 4, 8 et 12
; taille attendue
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866 pb). Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 11 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de
la PCR lorsque
l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Photobacterium
phosphoreum
en utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDNS- (piste 1 ; taille attendue :
820 pb),
DDNS+/DDN2- (piste 2 ; taille attendue : 234 pb), DDNS+/DDN3- (piste 3 ;
taille attendue
740 pb) et DDNS+/DDN4- (piste 4 : taille attendue : 866 pb). Pistes M :
marqueurs de taille.
- la figure 12 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de
la PCR lorsque
(amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de S. massilia
(pistes l, 4, 7 et
10), de E. coli (pistes 2, 5, 8 et 11) et de S. typhimurium (pistes 3, 6 et
9), en utilisant les
couples d'amorces moléculâires DDN1+lDDNS- (pistes 1 à 3 ; taille attendue :
820 pb),
DDNS+/DDN2- (pistes 4 à 6 ; taille attendue : 234 pb), DDNS+/DDN3- (pistes 7 à
9 ; taille
attendue : 740 pb), DDNS+/DDN4- (pistes 10 et 11 ; taille attendue : 866 pb).
Pistes M
Marqueurs de taille.
- la figure 13 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région
très
conservée du gène qui code pour la TMAO réductase des bactéries du genre
Shewanella,
Rhodobacter et de E. coli, utilisée pour l'élaboration d'une des amorces
moléculaires « BN »
selon l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces BN sur le
gène torA
codant pour la TMAO réductase de différentes bactéries du genre Shewanella,
Rhodobacter et
E. coli,
(b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces BN (BN3+); la zone
encadrée
correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code pour la TMAO
réductase
des bactéries Shewanella massilia (torAlS. massilia), de E. coli, de
Rhodocbacter sphaeroides
(dorAlR. sphaeroides), et de Rhodocbacter capsulatus (dorAlR. capsulatus).
- la figure 14 représente l'alignement de séquences protéiques du cytochrome
TorC de S.
massilia (TorC/S.m.), de E. coli (TorC/E.c.) et du cytochrome DorC de R.
sphaeroides
(DorC/R.s.). Les flèches indiquent la position des différentes amorces sur le
gène torC de la
bactérie Shewanella massilia, élaborées à partir des régions conservées. A
titre d'exemple, le
couple BC1+BC2- conduit à l'amplification du fragment d'une taille de 197 bp
du gène codant
pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide
de 66 acides
aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 114 et 179 de la
séquence peptidique
de TorC de S. massilia. Le couple BC1+/BC3- conduit à l'amplification du
fragment d'une
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taille de 719 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce
fragment codant pour
le polypeptide de 240 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux
positions 114 et
353 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia. Le couple BC2+/BC3-
conduit à
l'amplification du fragment d'une taille de 542 bp du gène codant pour la
protéine TorC chez S.
massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 181 acides aminés délimité
par les acides
aminés situés aux positions 173 et 353 de la séquence peptidique de TorC de S.
massilia.
- la figure 15 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits
de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de E.
coli (piste 1), de S.
typhimurium (piste 2), de P. phosphoreum (piste 3), de S. massilia (piste 4),
de R. sphaeroides
(piste 5), ou d'Erwinia chrysanthemi (piste 6) en utilisant les amorces
moléculaires BC1+ et
BC2-. La taille du fragment d'ADN attendue (177 paires de bases) est indiquée
par une flèche.
Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 16 représente l'influence de l'ADN chromosomique de poisson sur la
spécificité des amorces moléculaires selon l'invention. L'amplification PCR
est réalisée à l'aide
des amorces moléculaires DDNl+ et DDNS- en présence de 2,5 p,g (Pistes 1 et
4), 5 pg (Pistes
2 et S), ou 10 pg (Pistes 3 et 6) d'ADN chromosomique purifié de Hareng. Les
pistes 4, 5 et 6
correspondent aux essais réalisés en ajoutant 2,5 p1 de suspension cellulaire
de Shewanella
massilia au mélange réactionnel. Pistes M : marqueurs de taille.
- la figure 17 représente l'électrophorèse en gel d'agarose (2%) des produits
de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à partir d'ADN total extrait à partir de
chairs de poissons en
décomposition (cabillaud : piste 1 à 3 ; sole : piste 4 à 6 ; dorade : piste 7
à 9 et rouget de
roche : piste 10 à 12) à l'aide des amorces BN6+/BN4- (pistes 1, 4, 7 et 10,
taille attendue : 364
pb), amorces BN6+/BN2- (pistes 2, 5, 8 et 11, taille attendue : 711 pb),
amorces
DDN1+/DDNS- (pistes 3, 6, 9 et 12, taille attendue : 820 pb). Pistes M :
standard de taille
(échelle 1 Kb de BRL).
- la figure 18 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits
de la PCR
lorsque l'amplification est réalisée à l'aide des amorces moléculaires
BC1+/BC2- sur deux
préparations différentes d'ADN total d'un rouget de roche en voie de
putréfaction (piste 1 et 2).
La flèche indique le fragment d'ADN amplifié de 177 paires de bases.
- la figure 19 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes
torA de
Photobacterium phosphoreum (torA/P.p.), de Shewanella putrefaciens
(torA/S.p.), de
Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S.c.), et de Salmonelle
typhimurium
21
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(torA/S.t.).
A) METHODES D'ETUDES
Elaboration d'amorces spécifiques à partir du gène codant pour l'enzyme TMAO
réductase : sondes moléculaires « DDN », « BN » et « BC ».
La première étape de l'étude ci-dessous porte sur l'élaboration d'amorces (ou
sondes)
moléculaires utilisables pour une réaction PCR, et sur l'étude de leur
spécificité pour
différentes bactéries impliquées dans l'altération des chairs de poisson. La
deuxième étape
porte sur l'application de la technique PCR sur des chairs de poisson.
>7 Elaboration et validation d'amorces moléculaires servant à la réaction PCR.
Le choix des amorces nucléotidiques est une étape critique pour la réussite
d'un test PCR.
Ces amorces doivent être élaborées à partir de régions hautement conservées du
gène qui code
pour la TMAO réductase chez l'ensemble des bactéries responsables de la
dégradation des
chairs de poissons. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour élaborer ces
amorces.
(1) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées
chez
les bactéries du genre Shewanella et chez E. coli : amorces « DDN ».
L'élaboration d'amorces très peu dégénérées à partir de régions protéiques
conservées est
très difficile en raison de la dégénérescence du code génétique.
Les amorces moléculaires, appelées « DDN », ont été définies à partir de
l'alignement de
séquences nucléiques du gène torA des différentes bactéries du genre
Shewanella et d'E. coli
(Figure 9): En effet, plusieurs régions d'ADN du gène torA chez ces bactéries
présentent un
degré d'identité de séquence élevé avec très peu de mésappariements.
Les amorces moléculaires DDN sont les amorces moléculaires DDN1+, DDN2-, DDN3-
,
DDN4-, DDNS- et DDNS+ telles que définies ci-dessus.
Pour l'ensemble des réactions PCR, la température d'appariement est portée à
55°C afin
de rendre l'amplification plus spécifique et donc de limiter l'apparition de
bandes d'ADN
contaminantes. Ceci est rendu possible par la faible dégénérescence des
amorces nouvellement
synthétisées. L'amplification PCR met en jeu 30 cycles de réactions
successives. Chaque cycle
comprend une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 s, une étape
d'hybridation à 45°C
pendant 30 s et une étape d'élongation à 72°C pendant 45 s.
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a) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection du système TMAO
réductase des bactéries du genre Shewanella.
La première série d'expériences, utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDNS-,
DDNS+/DDN2-, DDNS+/DDN3-, DDNS+/DDN4-, a été réalisée sur l'ADN chromosomique
de la souche Shewanella massilia (S. massilia). Les couples d'amorces
DDN1+/DDN2-,
DDNl+/DDN3- et DDN1+/DDN4- ont volontairement été écartés du fait de
l'éloignement de
leurs positions sur le gène torA.
Les résultats, regroupés dans la figure 10 (pistes 1 à 4), révèlent pour la
majorité des
couples d'amorces moléculaires utilisés, l'amplification d'un fragment unique
d'ADN
spécifique à la taille attendue. Bien que pour le couple d'amorces DDNS+/DDN2-
(piste 2), un
fragment d'ADN non spécifique, supplémentaire d'environ 300 paires de base,
soit amplifié,
les amorces moléculaires DDN se révèlent être spécifiques du système TMAO
réductase de S.
massilia.
Les couples d'amorces DDN ont ensuite été testés sur d'autres bactéries
appartenant au
genre Shewanella. La même série d'expériences a été réalisée en utilisant
comme matrice
l'ADN chromosomique de la souche Shewanella c et S. putrefaciens MR-1.
L'ensemble des
couples d'amorces permet d'amplifier un fragment d'ADN spécifique à la taille
attendue pour
ces deux bactéries (figure 10).
Les différents couples d'amorces DDN permettent donc de détecter l'ensemble
des
bactéries Shewanella testées.
b) Utilisation des .amorces moléculaires DDN pour la détection du gène codant
pour
la TMAO réductase chez la bactérie marine Photobacterium phosphoreum, et pour
la mise
en oeuvré du séquençage dudit gène.
Photobacterium phosphoreum (P. phosphoreum) est une bactérie qui comme S.
putrefaciens est dans un certain nombre de cas rendue responsable de
l'altération des chairs de
poissons marins (12, 21). Elle appartient à la famille des Vibrionaceae, et
possède une
température optimale de croissance de 15°C. C'est une bactérie très peu
étudiée, dont le
système TMAO réductase putatif est absolument inconnu à ce jour.
Afin de vérifier la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention sur
des bactéries
distinctes du groupe des Shewanella, et susceptibles de contaminer les chairs
de poissons, une
souche P. phosphoreum de collection a été obtenue par l'ATCC (American Type
Culture
Collection n° 11040) . Les premiers essais de croissance réalisés sur
cette bactérie sur milieu
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marin (Difco) à 15°C ont montré que l'ajout de TMAO au milieu de
culture améliore de façon
significative sa vitesse de croissance. La densité optique (D06~) obtenue
après 24 heures de
croissance est de 0,28 pour la souche cultivée en absence de TMAO, et de 0,47
pour la souche
cultivée en présence de TMAO. Ce résultat est en accord avec la présence d'une
TMAO
réductase respiratoire chez P. phosphoreum. Une amplification.génique a été
réalisée à partir de
l'ADN chromosomique de cette bactérie (préparé à partir de 10 ml de culture en
milieu marin)
en utilisant l'ensemble des couples d'amorces moléculaires DDN.
Les résultats, présentés dans la figure 11, montrent que les amorces DDN
permettent
dans tous les cas l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique. Les
différentes tailles de
fragments d'ADN sont en accord avec celles obtenues pour l'amplification
réalisée sur le
chromosome des bactéries du genre Shewanella.
Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez P. phosphoreum
correspond
bien à une partie du gène codant pour la TMAO réductase de P. phosphoreum, le
séquençage
dudit fragment a été réalisé. Ainsi, le séquençage d'environ 600 nucléotides
du fragment
amplifié à partir du couple d'amorces moléculaires DDN1+/DDNS- a été réalisé.
Le produit
PCR directement purifié par Geneclean (Bio101) a été séquencé par la technique
de terminaison
des chaînes (22) en utilisant l'amorce moléculaire DDN1+. La séquence
protéique déduite de
cette séquence nucléique a été alignée avec celles de diverses TMAO réductases
(figure 'n.
Cette séquence protéique présente environ 60 % d'identité avec une région de
la TMAO
réductase de S. massilia. Les homologies observées sont suffisamment élevées
pour conclure
que le fragment d'ADN séquencé correspond bien à une partie du gène qui code
pour la TMAO
réductase de P. phosphoreum.
Ces résultats mettent en évidence la présence d'un système TMAO réductase chez
la
bactérie P. phosphoreum, et valident la méthode de détection selon l'invention
par le test PCR,
puisque ce dernier permet de détecter le système TMAO-réductase chez des
bactéries
d'altération relativement éloignées du point de vue phylogénétique.
c) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection de gènes codant
pour
la TMAO réductase d'entérobactéries, et pour la mise en oeuvre du séquençage
desdits
gènes.
Afin de vérifier que le test PCR est valide pour la détection
d'entérobactéries telle que E.
coli ou certaines bactéries pathogènes comme Salmonella typhimurium, la même
expérience
PCR que celle décrite ci-dessus a été réalisée, avec comme ADN matrice de
l'ADN
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chromosomique de E. coli et de S. typhimurium.
Chez S. typhimurium, la région promotrice du système TMAO réductase a pu être
mise en
évidence par une approche PCR (23).
Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 12. Les quatre couples
d'amorces
moléculaires DDN1+/DDNS-, DDNS+/DDN2-, DDNS+/DDN3- et DDNS+/DDN4- permettent
l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique chez E. coli (piste 2, 6, 10 et
16). Dans le cas
de S. typhimurium, le couple d'amorces DDNl+/DDNS- permet également
l'amplification d'un
fragment d'ADN, de 820 paires de bases, compatible avec un fragment spécifique
du système
TMAO réductase (piste 3).
Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez S. typhimurium
correspond bien
à une partie du gène codant pour la TMAO réductase de S. typhimurium, le
séquençage dudit
fragment a été réalisé. La séquence protéique, déduite à partir d'une partie
de ce fragment
d'ADN (477 nucléotides), possède d'importantes homologies avec la séquence
protéique de
diverses TMAO réductases (figure 8). Elle présente en outre plus de 88 %
d'identité avec la
séquence de la TMAO réductase d'E. coli et 45 % avec celle de l'enzyme chez S.
massilia. Le
fragment d'ADN amplifié à l'aide des amorces DDN1+/DDNS- correspond donc
vraisemblablement à une partie du gène qui code pour la TMAO réductase de S.
typhimurium.
d) Conclusion
Ainsi que cela a été précédemment décrit, le couple d'amorces DDN1+/DDNS-
permet de
détecter le gène torA des bactéries marines (Shewanella et P. phosphoreum),
mais également
des entérobactéries (E. coli et S. typhimurium).
Les mêmes tests PCR ont été réalisés sur des bactéries isolées au niveau des
eaux
saumâtres-(Rhodobacter) qui peuvent éventuellement être retrouvées au niveau
des chairs de
poissons. Afin de réaliser ces tests, des échantillons d'ADN chromosomique de
la bactérie R.
sphaeroides ont été utilisés comme ADN matrice.
La bactérie R. sphaeroides possède un système DMSO/TMAO réductase proche de
celui
décrit chez E. coli (9, 10). Bien que l'enzyme terminale de cette bactérie
puisse réduire
indifféremment le TMAO et le DMSO, elle possède de nombreuses homologies de
séquences
protéiques avec la TMAO réductase d'E. coli ou S. massilia (respectivement
47,5% et 45%
d'identité).
Cependant, les tests PCR réalisés avec les sondes moléculaires DDN n'ont pas
permis
d'amplifier un fragment d'ADN correspondant au gène de la TMAO réductase de
cette bactérie.
2s
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(2) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées
chez
l'ensemble des bactéries étudiées : amorces « BN ».
Afin d'élargir encore le spectre de détection des amorces moléculaires du test
PCR, la
séquence nucléique du gène de la TMAO/DMSO réductase des bactéries du genre
Rhodobacter
(R. sphaeroides et R. capsulatus) a été intégrée à l'alignement réalisé à
partir des séquences du
gène torA des bactéries du genre Shewanella et d'E. coli.
Une nouvelle série d'amorces, dénommées « BN », a ainsi été élaborée (Figure
13).
Pour l'ensemble des expériences, l'amplification PCR est réalisée avec une
température
d'hybridation de SS°C. A cette température, une petite partie seulement
des amorces présentes
dans le mélange va pouvoir s'hybrider de manière spécifique à l'ADN matrice.
Pour cette
raison, une quantité plus importante d'amorces moléculaires est ajoutée au
mélange réactionnel
(environ 100 pmoles dans SO ~l final).
Les amorces BN obtenues sont les amorces BNl+, BN2-, BN3+, BN4-, BNS-, BN6+
telles que définies ci-dessus.
Le tableau 1 ci-dessous représente les résultats obtenus quant à l'application
des amorces
moléculaires BN sur l'ADN de différentes bactéries.
L'amplification est réalisée à partir de 5 ng d'ADN chromosomique bactérien.
La
réaction PCR met en jeu 30 cycles de réactions successives.
+ : Un fragment d'ADN spécifique à la taille attendue est amplifié
: Aucune amplification
Tableau 1
Bactries Amorces Amorces Amorces Amorces Amorces
BN1+BN2- BN1+BN4-BN3+BNS- BN6+BN4- BN6+BN2-
S. massilia + + + + +
Shewanella + + + + +
c
S. putrefaciens+ + + + +
P. phosphoreum+ + + + +
E. coli + - + + +
S. typhimurium- - + + +
R. sphaeroides- - - + +
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Deux couples d'amorces : BN6+/BN2- et BN6+/BN4-, permettent d'amplifier un
fragment d'ADN spécifique chez l'ensemble des bactéries testées, et notamment
chez R.
sphaeroides.
Les amorces BN se révèlent donc parfaitement appropriées pour la détection des
bactéries
qui possèdent un système TMAO réductase, et qui sont susceptibles de
contaminer les chairs de
poissons.
D'autre part, l'utilisation lors de la PCR d'une température d'hybridation
élevée (55°C),
et d'une quantité plus importante d'amorces moléculaires dégénérées, a permis
d'améliorer de
façon significative la spécificité de l'amplification.
(3) Amorces moléculaires élaborées à partir du gène codant pour le cytochrome
TorC du système TMAO réductase : amorces « BC ».
L'étude du système TMAO réductase chez différentes bactéries a permis de
montrer que
la chaîne de transfert d'électrons jusqu'à l'enzyme terminale TorA fait
intervenir dans tous les
cas un cytochrome pentahémique de type c, le cytochrome TorC (ou DorC) (6, 9,
10, 19).
Afin de mettre en évidence le système TMAO réductase chez les bactéries
d'altération,
des amorces nucléiques dirigées contre le gènè codant pour ce cytochrome ont
été élaborées.
Le mufti-alignement de séquences protéiques, présenté dans la figure 14, fait
apparaître
de nombreuses régions protéiques conservées entre les cytochromes du système
TMAO
réductase de différentes bactéries : S. massilia, E. coli, R. sphaeroides.
Certaines de ces régions
conservées correspondent aux sites de fixation des hèmes de type c (motif
CxxCH) et sont donc
retrouvées dans un grand nombre de cytochromes tétrahémiques de classe
NapC/NirT
impliqués-dans d'autres systèmes respiratoires (24). Le cytochrome TorC
possède néanmoins la
particularité de contenir un domaine carboxy-terminal additionnel qui fixe un
cinquième hème
(6, 19).
Les amorces moléculaires BC sont les amorces BC1+, BC2+, BC2- et BC3- telles
que
définies ci-dessus. Pour élaborer lesdites amorces, les régions protéiques
conservées ont été
recherchées parmi l'ensemble des cytochromes de classe NapC/NirT (sondes BC2+
et BC2-),
mais aussi uniquement parmi les cytochromes TorC (sondes BC1+ et BC3-). La
position et
l'orientation des quatre amorces moléculaires dégénérées BC sont indiquées
dans la figure 14.
Les amorces moléculaires BC sont capables de s'hybrider au gène codant pour le
cytochrome TorC du système TMAO réductase.
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La réaction PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles utilisées
avec les
amorces moléculaires BN. Elle met en jeu 30 cycles de réaction successives.
Chaque cycle est
constitué d'une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 s, d'une étape
d'hybridation à 55°C
pendant 30 s et d'une étape d'élongation pendant 45 s.
Environ 100 pmoles de chaque amorces moléculaires sont ajoutées au mélange
réactionnel (volume final 50 p.1). Parmi les trois couples d'amorces
moléculaires testés
(BC1+BC2-, BC1+BC3- et BC2+BC3-), le couple BC1+BC2- a permis d'amplifier un
fragment d'ADN à la taille attendue (177 paires de bases) pour l'ensemble des
bactéries
précédemment testées (figure 15 ; pistes 1 à 5). Ce résultat nous permet
d'envisager
l'utilisation du couple d'amorces moléculaires BC1+BC2- pour le test PCR.
En parallèle, la même expérience PCR a été réalisée avec le couple d'amorces
BC1+BC2- à partir du chromosome de la bactérie Erwinia chrysanthemi,
entérobactérie
phytopathogène qui serait dépourvue d'un système TMAO réductase (4). Dans ce
cas, aucun
fragment d'ADN d'une taille compatible avec celle attendue pour une
amplification à partir du
gène torC n'est observé (figure 15, piste 6).
Le couple d'amorces BC1+BC2- semble donc reconnaître spécifiquement le
cytochrome
TorC du système TMAO réductase.
(4) Application de la technique de la PCR aux cellules entières
Pour la réalisation d'un test PCR destiné à être utilisé directement à partir
d'échantillons
de poissons, il est important de s'affranchir de l'étape de préparation de
l'ADN chromosomique
des bactéries. Pour cette raison, les expériences de PCR utilisant les couples
d'amorces DDN,
BN et BC- ont été reproduites à partir de bactéries entières de S. massilia.
Les colonies
bactériennes isolées sur boîte sont remises en suspension dans 200 p1 d'eau
distillée stérile
(D06oo comprise entre 0,1 et 0,5). La réaction PCR est alors réalisée dans les
conditions
précédemment décrites avec pour matrice 2,5 ~1 de la suspension cellulaire
(dans 50 ~1 de
volume final). Pour l'ensemble des réactions PCR réalisées (avec les amorces
DDN, BN et
BC), le résultat obtenu est équivalent à celui observé avec de l'ADN
chromosomique purifié.
Les bactéries sont donc bien lysées au cours de la première étape de la PCR
qui correspond à
une incubation à 94°C des échantillons pendant 1,5 min. Ce résultat
positif permet d'envisager
une utilisation du test PCR directement à partir des chairs de poissons.
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II) Application du test PCR-TMAO aux chairs de poissons
Après avoir vérifié la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention
sur des
bactéries responsables de l'altération des produits de la mer, l'étape
suivante consiste donc dans
l'application directe du test PCR à des chairs de poissons.
Les quatre couples d'amorces DDN1+/DDNS-, BN6+BN4-, BN6+BN2- et BCl+BC2-
ont été choisis pour réaliser ces tests car ils permettent l'amplification
d'un fragment d'ADN
spécifique pour la grande majorité des bactéries précédemment testées.
(1) Influence de l'ADN chromosomique du poisson lors de l'amplification PCR du
gène de la TMAO réductase des bactéries.
Pour l'utilisation du test PCR sur des échantillons de chairs de poissons, il
faut d'abord
vérifier que l'ADN chromosomique du poisson ne rentre pas en compétition avec
l'ADN
bactérien, lors de l'hybridation des amorces moléculaires.
Afin de tester l'influence de l'ADN chromosomique du poisson sur la
spécificité des
1 S amorces moléculaires selon l'invention, des concentrations variables d'ADN
chromosomique
purifié de sperme de hareng ont été ajoutées au mélange réactionnel de la PCR
contenant ou
non 2,5 ~l de suspension cellulaire de la bactérie S. massilia.
La figure 16 obtenue avec le couple d'amorces DDNI+/DDNS- montre qu'aucun
fragment d'ADN n'est amplifié en absence de bactérie ajoutée au mélange
réactionnel (piste 1 à
3) et ceci, quelle que soit la concentration d'ADN chromosomique de poisson.
Si on ajoute la
bactérie S. massilia au mélange réactionnel (pistes 4 à 6) un fragment d'ADN
spécifique est
amplifié. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les couples d'amorces
BN6+BN2-,
BN6+BN4- ou BC1+BC2-, et permettent ainsi de conclure que la, présence d'ADN
étranger
dans le mélange réactionnel de la PCR n'interfère pas avec la spécificité des
amorces
moléculaires selon l'invention.
Ces résultats importants permettent donc d'exclure l'éventualité d'une
amplification non
spécifique qui serait due à l'ADN chromosomique du poisson.
(2) Extraction de l'ADN total des chairs de poissons et validation de la
technique
PCR.
Traditionnellement, les tests de détection des micro-organismes, lors du
contrôle
microbiologique des aliments, nécessitent une première étape de pré-
enrichissement des
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bactéries sur un milieu sélectif.
Dans la perspective d'un test rapide de qualité fraîcheur, la technique de la
PCR a été
appliquée directement à des échantillons de poisson. Différentes conditions
d'extraction de
l'ADN total des chairs de poissons en voie d'altération (ADN bactérien + ADN
du poisson) ont
donc été testées.
Dans un premier temps, une technique rapide d'extraction de l'ADN des cellules
a été
testée en traitant les échantillons de poisson au NaOH/SDS (25). Cette
technique permet la lyse
cellulaire et donc l'extraction de l'ADN chromosomique total. La préparation
se fait à partir
d'environ 25 mg de chairs prélevés sur un poisson (rouget de roche) gardé 12
heures à
température ambiante. Après 10 min d'incubation à 95°C, 5 w1 du mélange
de chairs de poisson
homogénéisées sont utilisés directement dans le mélange réactionnel de la PCR.
Toutefois, par cette technique rapide d'extraction de l'ADN total, l'ensemble
des
réactions PCR réalisées avec les différentes amorces moléculaires n'a pas
permis d'amplifier un
fragment d'ADN spécifique. La présence de plusieurs substances inhibitrices de
la PCR
contenues dans les chairs de poissons pourrait expliquer ce résultat. En
effet, des composés
présents en grande quantité dans certains produits alimentaires (graisses,
protéines...) peuvent
avoir une influence sur l'efficacité de la PCR (26). Afin de vérifier cette
hypothèse, les mêmes
tests PCR ont été réalisés en rajoutant aux échantillons de chairs de poissons
5 ng d'ADN
chromosomique de S. massilia. Toutefois, comme précédemment, aucun fragment
d'ADN n'a
été amplifié par PCR, quelles que soient les amorces moléculaires utilisées.
Ces résultats permettent de conclure que la réaction PCR est inhibée par
certains
composés contenus dans les chairs de poissons.
La technique de purification de l'ADN chromosomique total des chairs de
poissons,
utilisée selon la présente invention, doit donc permettre d'éliminer
l'ensemble des composés
inhibiteurs de la PCR.
Un kit d'extraction rapide de l'ADN (environ 1 heure), basée sur la fixation
des acides
nucléiques à des billes de silice, a ainsi été testé (kit commercialisé sous
la dénomination
« High Pure PCR Template Preparation Kit » par Boehringer Mannheim/Roche).
Après fixation
de l'ADN, cette technique permet en effet d'éliminer les sels, les protéines
et d'autres
impuretés cellulaires par une simple étape de lavage.
L'extraction de l'ADN total (ADN bactérien + ADN de poisson) a été réalisée
sur quatre
espèces de poisson différentes en voie de décomposition (gardés 12 h à
température ambiante)
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2 espèces de la mer Méditerranée (rouget de roche et dorade), et 2 espèces de
l'Atlantique (sole
et cabillaud). A partir d'environ 50 mg de chairs de ces poissons (prélevés
sous la peau), 1 à 4
p.g d'ADN chromosomique total ont ainsi été purifiés. Environ 25 ng de cet ADN
sont alors
ajoutés au mélange réactionnel de la PCR (volume final 50 p1). Pour l'ensemble
des réactions
PCR, la température d'hybridation est portée à 55°C, et 100 pmoles de
chaque amorces
moléculaires sont ajoutées au mélange réactionnel.
La figure 17 regroupe les résultats obtenus en utilisant les couples d'amorces
DDN1+/DDNS-, BN6+/BN2- et BN6+/BN4-. Pour l'ensemble des espèces de poissons
testées,
un fragment d'ADN unique est amplifié, et ceci avec chacun des couples
d'amorces utilisés.
La taille du fragment d'ADN amplifié correspond à la taille attendue pour une
amplification à partir du gène torA. Ce résultat indique que les différents
fragments d'ADN ont
bien été amplifiés à partir du gène torA des bactéries présentes sur les
chairs de poisson.
De même, les tests réalisés sur deux autres espèces de poissons en voie de
putréfaction (7
jours sous glace fondante), le maquereau (poisson gras) et le merlan, ont
permis de mettre en
évidence le gène torA des bactéries d'altération.
Ainsi, l'utilisation des couples d'amorces moléculaires DDNl+/DDNS-, BN6+/BN2-
et
BN6+/BN4- peut être envisagée pour l'application du test PCR à des chairs de
poissons.
De plus, l'utilisation d'un filtre de billes de silice est une méthode
adéquate pour purifier
l'ADN total contenu dans les chairs de poissons. Cette technique est très
rapide (environ une
heure), et très facile à mettre en oeuvre comparativement à une extraction
isoamylalcool/chloroforme qui nécessite plusieurs étapes pour éliminer les
protéines contenues
dans les chairs de poissons (28).
L'amplification réalisée dans les mêmes conditions avec le couple d'amorces
BC1+/BC2
a également donné des résultats encourageants sur l'ADN total de chairs d'un
rouget de roche
en voie de putréfaction (figure 18). En effet, malgré un bruit de fond
important,
l'électrophorèse en gel d'agarose des produits de la PCR révèle la présence du
fragment de 177
paires de bases.
L'application de la technique à un suivi d'altération de cabillaud a permis de
montrer que
la technique est en corrélation directe avec la qualité fraîcheur des chairs
de poisson au cours de
leur conservation dans le temps.
III) Conclusion
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Les couples d'amorces moléculaires selon l'invention permettent donc de
détecter le gène
torA chez les bactéries marines, mais également chez des bactéries
relativement éloignées
phylogénétiquement, à savoir les entérobactéries et les bactéries des eaux
saumâtres.
L'application du test PCR aux chairs de poissons donne des résultats
encourageants
S puisque les amorces moléculaires selon l'invention permettent de détecter le
gène torA de
bactéries présentes sur le poisson en voie de putréfaction. L'amplification
PCR ne pouvant être
appliquée directement à des échantillons de chairs de poissons, une extraction
de l'ADN total
de ces chairs est au préalable nécessaire.
De plus, la technique est directement liée à la qualité fraîcheur des chairs
de poissons et
est plus sensible que les techniques classiques comme l'ABVT.
B) MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Isolement des souches bactériennes, milieux et conditions de croissance
Le poisson utilisé pour l'isolement des souches bactériennes Shewanella c et
Shewanella
massilia correspond à un rouget de roche (Mullus surmuletus) pêché en mer
Méditerranée au
large de Marseille, et gardé à température ambiante pendant 48 heures dans un
tube stérile
contenant de l'eau de mer. L'eau de mer a été préalablement stérilisée à
travers un filtre
millipore (0,45pM).
Les souches Shewanella sont cultivées en anaérobiose ou en aérobiose à
30°C dans du
milieu LB (« Luria Broth » : extrait de levure 10 g/1, bacto-peptone Sg/1 et
NaCI Sg/1). Les
bactéries E. coli et Salmonella typhimurium sont cultivées à 37°C sur
milieu LB. La souche
Photobacterium phosphoreum a été obtenue par l'ATCC (n°11040) et ne
pousse pas sur les
milieux conventionnels tel que le milieu LB. Elle est cultivée à 15°C
sur milieu marin (marine
broth ; Difco).
2) Techniques de PCR
a) PCR standards
Les amplifications PCR standards sont réalisées dans les conditions décrites
dans la
référence (6). Le mélange réactionnel (50 p1) contient 10 ng d'ADN
chromosomique, 0,2 ~g de
chacune des sondes oligonucléotidiques, 100 p.M de chacun des quatre
désoxyribonucléotides
triphosphates (dXTPs), 10 mM de Tris/HCl (pH 8,3), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de
KCI, 0,01
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de gélatine et une unité d'ADN polymérase (Taq polymérase, Boehringer
Mannheim/Roche).
Le mélange réactionnel est finalement recouvert par 50 ~1 d'huile minérale
afin d'empêcher
l'évaporation durant le processus de la PCR.
L'amplification, réalisée dans un appareil thermocycleur (MJ Research), met en
jeu 30
cycles de réactions, un cycle comprenant une étape de dénaturation à
94° C pendant 30
secondes, une étape d'hybridation à 55°C pendant 30 secondes et une
étape d'élongation à 72 °C
pendant environ 45 secondes (lkb/min). L'ADN est préalablement dénaturé durant
1,5 min à
94°C avant d'entamer le premier cycle. 10 ~,1 de chacun des produits
d'amplification sont
ensuite analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose.
b) Conditions PCR avec les amorces moléculaires dégénérées selon l'invention
Les amorces moléculaires selon l'invention, notamment les amorces dénommées
« DDN », « BN » ou « BC », sont telles que définies ci-dessus.
Le mélange réactionnel (50 p1) contient soit 10 ng d'ADN chromosomique de la
bactérie, soit 5 ~l de suspension cellulaire (D06oo = 0,5-1) soit 25 ng d'ADN
total extrait à
partir de poisson, 100 pM de chacun des quatre désoxyribonucléotides
triphosphates (dXTPs),
0,8 ~,g de chacun des mélanges d'amorces selon l'invention, 10 mM Tris-HCl (pH
8,3), 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KCI, 0,01 % de gélatine et une unité de Taq polymérase.
La réaction PCR met en jeu 30 cycles de réactions successives constituées
d'une étape de
dénaturation à 94° C pendant 30 secondes suivie d'une étape
d'hybridation à SS°C ou 45°C
pendant 30 secondes, puis d'une étape d'élongation à 72 °C pendant 45
secondes. L'ADN est
préalablement dénaturé durant 1,5 min à 94°C avant d'entamer le premier
cycle.
3) Préparation d'ADN chromosomique des bactéries
La préparation d'ADN chromosomique des bactéries est réalisée à partir de 10
ml de
culture (D06oo ~ 1). Après centrifugation des cellules à 10 000 rpm pendant 10
min, le culot est
resuspendu dans 1 ml d'EDTA 10 mM (pH 8). La lyse des cellules est obtenue par
addition de
SDS (0,5 % final). Cette solution est mélangée à un volume égal
d'isoamylalcool/chloroforme
(1:24). Après centrifugation pendant 20 min à 7 000 rpm, la phase supérieure
est récupérée.
Cette opération est reproduite plusieurs fois afin d'éliminer la plus grande
quantité de protéines
résiduelles. L'ADN est finalement précipité par ajout de NaCI (0,3 M final) et
d'éthanol (2,2
Vol).
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4) Préparation de l'ADN chromosomique totale des chairs de poissons en voie de
putréfaction pour la PCR
a) Préparation rapide à l'aide d'un kit basé sur la fixation de l'ADN à des
billes de
sillice (High pure PCR template Preparation Kit, Boehringer Mannheim/Roche)
25 mg de chairs de poissons sont incubés 45 min à 55°C .dans 200 p1 de
tampon de lyse
(urée 4 M, Tris 200 mM, NaCI 20 mM et EDTA 200 mM, pH 7,4) en présence de 40
p1 de
protéinase K (0,8 mg). Afin de faciliter la lyse cellulaire, l'échantillon est
préalablement broyé
à l'aide d'un scalpel. 200 ~1 de tampon de fixation (guanidine-HCl 6 M, urée
10 mM, Tris-HCl
mM et Triton 20% v/v, pH 4,4) sont ajoutés à l'échantillon qui est ensuite
incubé pendant 10
10 min à 72°C. Cette solution est mélangée à 100 ~1 d'isopropanol puis
centrifugée à 8 000 rpm
pendant 1 min à travers un filtre à base de billes de sillice (tube High Pure
Filter + tube
collecteur). Les impuretés résiduelles sont éliminées par deux étapes de
lavage (tampon de
lavage : NaCI 20 mM, Tris-HCl 2 mM, éthanol 80% v/v, pH 7,5). L'ADN est
ensuite élué dans
un tampon d'élution (Tris 10 mM, pH 8,5).
b) Extraction d'ADN des cellules par traitement au NaOA/SDS
mg de chairs de poissons sont prélevés sur un poisson en voie de putréfaction
(après
16 heures d'incubation dans un tube stérile gardé à température ambiante), et
placés dans 50 p1
d'une solution de NaOH 0,05 M, SDS 0,25%. Après broyage des cellules,
l'échantillon est
incubé 15 min à 95 °C. 450 ~,1 d'eau stérile sont ajoutés au mélange et
les débris cellulaires sont
20 alors éliminés par une étape de centrifugation de 2 min à 8 000 g. 5 ~,1 du
surnageant obtenu
sont directement utilisés pour le test PCR.
c) Extraction isoamylalcooUchloroforme
La préparation d'ADN chromosomique totale par extraction
isoamylalcool/chloroforme
est réalisée à partir de 25 mg de chairs de poissons contaminées comme décrit
précédemment
25 pour l'ADN bactérien. Le nombre d'étapes d'extraction est en revanche
augmenté afin de
pouvoir éliminer les quantités importantes d'impuretés contenues dans les
échantillons de
chairs de poissons.
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<400> 1
atgaacagaa gagacttttt aaagggtatc gcctcatcct ctttcgttgt cttaggtggc 60
agctcagtgt taacgccctt aaatgcctta gccaaagcgg gcatcaatga agatgaatgg 120
ctaaccacag gttcacactt cggcgccttt aaaatgaagc gcaaaaacgg cgtcattgcc 180
gaagtgaaac ccttcgactt agataagtat ccaacggata tgattaacgg catccgcggc 240
atggtctaca atccatcgcg tgtacgttac cctatggtgc gcttagattt tttactcaaa 300
ggtcataaga gtaataccca tcaacggggt gatttccgct ttgttcgcgt aacgtgggac 360
aaggcattaa cactgtttaa gcattcatta gatgaagtcc aaacccaata cggtccatca 420
ggtctgcatg cggggcaaac cggttggcgc gccactggtc aactgcattc cagcacgagt 480
catatgcaac gtgcggtggg gatgcacggc aactatgtta agaaaatcgg cgactactcc 540
acaggtgcag gccaaactat tctgccctac gtgttaggtt caaccgaagt gtatgcccag 600
ggcacttcat ggccgctgat cttagaacac agcgacacta tcgtgctgtg gtcgaacgat 660
ccgtacaaga acctgcaagt gggttggaat gcggaaaccc atgaatcttt tgcttatctt 720
gcgcagttaa aagagaaagt gaagcaaggc aagatccgcg tgatcagtat cgaccctgtg 780
gtgactaaga cccaagccta tttgggctgc gagcaactct acgttaaccc acagacagat 840
gtgaccttaa tgctggccat cgcccacgag atgatcagca aaaagctcta cgacgataaa 900
tttatccaag gctacagctt aggttttgaa gagtttgtgc cctatgtgat gggtactaaa 960
gatggcgtag ccaaaacccc agaatgggcc gcgcctatct gtggtgttga agçccatgtt 1020
atccgcgact tggctaaaac cttagtcaag ggccgcactc agttcatgat gggctggtgt 1080
atccagcgcc agcaacacgg cgaacaaccc tattggatgc cggcggtact ggcgaccatg 1140
atcggccaaa tcggtctacc cggtggtggc atcagctatg gtcaccacta ctcgagtatc 1200
ggcgtgcctt catcgggtgc cgctgcgcca ggtgccttcc cccgtaactt ggacgaaaat 1260
caaaagccac tctttgatag ctcagacttc aagggcgcga gtagcacgat tccggttgcc 1320
cgctggattg atgcgattct cgaacccggt aaaaccattg atgctaacgg ctcgaaagtg 1380
gtttatcccg atatcaagat gatgattttc tcgggtaata atccttggaa ccatcaccaa 1440
gacagaaacc gcatgaagca agccttccat aagcttgagt gtgtggtcac tgtcgatgtg 1500
aactggacgg caacttgccg cttctcggat atcgtactgc ccgcttgtac tacctatgag 1560
cgcaacgata tcgacgtgta cggcgcctat gctaaccgcg gtattttagc catgcagaaa 1620
atggttgagc cactgtttga tagcttgtcg gattttgaaa ttttcactcg ctttgccgcc 1680
gtactcggca aagagaaaga atacacccgt aacatgggcg aaatggagtg gttagaaacc 1740
ctctataacg aatgtaaagc cgccaacgcg ggcaagtttg agatgcctga ctttgcgact 1800
ttctggaaac aaggttatgt gcattttggt gacggtgaag tctggacgcg ccatgcagac 1860
tttagaaacg atcctgaaat caatccacta ggcacgcctt caggtttgat tgaaatcttt 1920
agccgtaaga ttgatcaatt cggttacgat gactgtaaag gtcacccaac gtggatggag 1980
aaaaccgagc gtagtcatgg cggccctggc tctgacaagc atccgatttg gttgcagtca 2040
tgccatccag acaaacgttt acactcgcag atgtgtgagt cgcgagaata ccgcgagact 2100
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tacgcagtca atggccgtga gcctgtgtat atcagccctg tcgacgcaaa agcacgtggc 2160
atcaaagatg gcgatatagt gcgagtcttt aacgaccgtg gccaactgtt ggcgggtgct 2220
gtggtatcgg acaacttccc taaagggatt gtgcgaattc acgaaggcgc gtggtatggg 2280
ccagtaggta aagatggtag cactgaaggt ggtgctgaag tcggcgccct gtgtagttat 2340
ggcgatccta acaccctcac tttagacata ggcacctcta aacttgccca agcttgctca 2400
gcctatactt gcttagtcga gtttgaaaaa taccaaggca aagtgcctaa ggtcagctcc 2460
ttcgatggcc cgatcgaagt cgaaatc 2487
<210> 2
<211> 2486
<212> ADN
<213> Shewanella putrefaciens
<400> 2
atgaacagaa gagacttttt aaaaggctta gcctcaacct ctttcgttgc tttaggtggc 60
agctcagtac tagcgccctt aaatgcgctg gccaatactg gcctgaatga aaacgaatgg 120
ctgaccactg gctcccactt cggtgccttt aaaatcaagc gtaaaaacgg catgattgcc 180
gaagtcaaag ccttcgattt agataaatat ccaacggata tgattaacgg tatccggggt 240
atggtctata acccatcccg cgtgcgttac ccgatggttc gcttagactt tttactaaaa 300
ggccataaga gtaataccca gcagcggggg gatttccgct ttgttcgtgt gacctgggat 360
aaagcattaa agctgtttaa acactcactc gatgaggtcc aaaccaagta cggtccatcg 420
ggcttacacg caggacaaac tggttggcgc gccacggggc aactgcattc cagcaccagc 480
catatgcagc gcgcggtggg gatgcacggt aattttgtga aaaaaatcgg cgactactcc 540
accggtgcag gccaaccatt ctgccctatg tattaggctc aaccgaagta tatgcccaag 600
gcacctcttg gccactgatc ttagaaaaca gcaacacgat tgtgctgtgg tcaaacaatc 660
cttacaaaaa cctgcaagtg ggctggaacg ctgaaaccca tgaggccttt gcgtacctcg 720
cgcaattaaa agagaaggtc aaacagggta aaatccgcgt gatcagtatc gaccctgtgg 780
tgactaaaac ccaggcttac cttggctgtg agcagttgta tgtgaaccca cagactgacg 840
tgacgctgat gctggccatc gcccatgaga tgatcaccca aaagctacac gatgagaaat 900
tcatccaagg ttacagctta ggctttgaag agtttgtgcc ttacgtgatg ggcactaaag 960
atggtatcgc caaaacccct gagtgggcgg cgcctatctg cggtgttgaa ccacacatta 1020
tccgcgatct ggccaaaacc ttagttaagg gccgtaccca aataatgatg ggttggtgta 1080
ttcagcgcca acaacacggt gagcaacctt actggatggc cgcagtactt gcgaccatga 1140
taggccaaat cggcttaccc ggcggtggta ttagctatgg tcaccactac tccagtattg 1200
gtgtgccggc gaccacagct gcagctccgg gcgctttccc acgtaactta gacgagaatc 1260
aaaaaccgct gtttgacagc acagacttta aaggcgcaag cagcacgatt cccgttgccc 1320
gctggattga tgcgattctc gaacccggca aaaccattga tgccaacggt tctaaagtgg 1380
tatatcccga tattaagatg atgattttct cgggtaataa cccatggaac caccatcaag 1440
accgtaaccg catgaagcaa gccttccaaa agcttgaatg cgtggtctct attgatgtga 1500
actggacagc cacttgtcgt ttctccgaca tcgtgttgcc agcttgcacc acctatgagc 1560
gtaacgatat cgacgtgtac ggtgcctatg ccaaccgcgg tattctggcg atgcagaaaa 1620
tggtcgagcc tttgtttgaa agcttgtctg actttgagat ctttactcgt tttgccgcgc 1680
tgctgggtaa agagaaagaa tacacccgca atatgagcga aatggagtgg atagaaaccc 1740
tctataacga gtgtaaagcc gctaacgccg gtaagtatga gatgcctgac tttgccacct 1800
tctggaagca aggttatgta cactttggtg aaggcgaatt atggacgcgc cacgctgact 1860
ttagaaacga tcctgaaatc aacccattag gcacgccttc cggtttgatt gaaatcttca 1920
gtcgtaagat tgaacaattt ggctatgatg actgccaagg ccatcctatg tggatggaaa 1980
aagctgaacg cagccatggt ggtccaggtt cgaataaata tcctatgtgg ttgcaatctt 2040
gccatccgga tcaccgctta cactcacaaa tgtgtgagtc aaaggaatac cgcgaaacct 2100
acacagttaa tggtcgcgaa cctgtgtata ttagccctga agatgctaaa acccgtggca 2160
ttaaagatgg cgatatcgtg cgggtcttta acgaccgagg tcaactgtta gctggcgcag 2220
tggtatcgga tcgtttccct aaaggtgtag tgcgaattca tgaaggtgca tggtatggcc 2280
cagtgggtaa agatggcagc gttgaaggcg gagccgaaat cggtgccctg tgcagctatg 2340
gtgaccctaa taccctaacc ttagacattg gtacctctaa gttggctcaa gcttgctcag 2400
cctatacatg tctggttgag tttgaaaaat accaaggtaa agcacctaag gttagctcct 2460
tcgatggtcc tatcgaagtt gaaatc 2486
<210> 3
<211> 2487
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
<212> ADN
<213> Schewanella c
<900> 3
atgaacagaa gagacttttt aaagggtatc gcctcatcct ctttcgttgt cttaggtggc 60
agctcagtgt tagcgccctt aaatgcctta gccaaaacgg gcatcaatga agacgaatgg 120
ctaaccacag gttcacactt cggcgccttt aaaatgaagc gcaaaaacgg cgtcattgcc 180
gaagtgaaac ccttcgactt agataagtat ccaacggata tgattaacgg catccgcgac 240
atggtctaca atccatcgcg tgtacgttac cctatggtgc gcttagattt tttactcaaa 300
ggtcataaga gtaataccca tcaacggggt gatttccgct ttgttcgtgt aacatgggac 360
aaggcattaa cactgtttaa gcattcatta gatgaagtcc aaacccaata cggtccatca 420
ggtctgcatg cgggtcaaac tggttggcgc gccacgggtc aactgcattc cagcacgagt 980
catatgcaac gtgcggtggg gatgcacggc aactatgtga agaaaatcgg cgactactcc 540
acaggtgcag gccaaacaat tctgccctac gtgttaggtt caaccgaagt gtatgcccaa 600
ggcacttcat ggccgctgat cttagaacac agcgacacta tcgtgctctg gtcgaacgat 660
ccgtacaaga acctgcaagt gggttggaat gcggaaaccc atgaatcttt tgcttatctt 720
gcgcagttaa aagagaaagt gaagcaaggc aagatccgtg ttatcagtat cgaccctgtg 780
gtgactaaga cccaagccta tttgggctgt gagcaactct acgttaaccc acagacagac 840
gtgactttaa tgctggccat cgcccacgag atgatcagca aaaagctcta cgacgataaa 900
tttatccaag gctacagctt aggttttgaa gagtttgtgc cctatgtgat gggtactaaa 960
gatggcgtag ccaaaacccc agaatgggcc gcgcctatct gtggtgttga agcccatgtt 1020
atccgcgact tggctaaaac cttagtcaag ggccgcactc agttcatgat gggctggtgt 1080
atccagcgcc agcaacacgg cgaacaaccc tattggatgg cggcggtact ggcgaccatg 1140
atcggccaaa tcggtctacc cggtggtggc atcagttatg gtcaccacta ctcgagtatc 1200
ggcgtgcctt catcgggtgc cgcggcgcca ggtgctttcc cccgtaactt ggacgaaaat 1260
caaaagccac tatttgatag ctcagacttc aagggcgcga gcagcacaat tccggttgcc 1320
cgctggattg atgcgattct cgaacctggt aaaaccattg atgctaacgg ctcgaaagtg 1380
gtttatcccg atatcaagat gatgattttc tcgggtaata atccttggaa ccatcaccaa 1440
gacagaaacc gtatgaagca agccttccat aagcttgagt gtgtggtcac tgttgatgtg 1500
aactggacgg caacttgccg cttctcggat atcgtactac ccgcttgtac tacctatgag 1560
cgcaacgata tcgacgttta cggcgcctat gctaaccgcg gtattttagc catgcagaaa 1620
atggttgagc cactgtttga tagcttgtcg gattttgaaa ttttcactcg ctttgccgcc 1680
gtacttggta aagagaaaga atacacccgt aacatgggcg aaatggagtg gctagaaacc 1740
ctctataacg aatgtaaagc cgccaacgcg ggcaagtttg agatgcctga ctttgcgact 1800
ttctggaaac aaggttatgt gcattttggt gacggtgaac tctggacgcg ccatgcagac 1860
tttagaaacg atcctgaaat caatccacta ggcacgcctt caggtttgat tgaaatcttt 1920
agccgtaaga ttgatcaatt cggttacgat gactgtaaag gtcacccaac ttggatggag 1980
aaaaccgagc gtagccatgg cggccctggt tctgacaagc atccgatttg gttgcagtca 2040
tgccacccag acaaacgctt acactcgcaa atgtgtgagt cgcgagaata ccgcgagacc 2100
tacgcagtca atggccgtga gcctgtgtat atcagccctg tcgacgcaaa agcgcgcggc 2160
ataaaagatg gcgatatagt gcgagtcttt aacgaccgtg gccaactgtt ggcgggtgca 2220
gtggtatcgg acaacttccc tactggtatt gtgcggattc acgaaggcgc atggtatggg 2280
ccagtaggta aagatggtag cactgaaggt ggggctgaag tcggcgccct gtgcagttat 2340
ggcgatccta acaccctcac tttagacata ggcacatcta aacttgccca agcttgctca 2400
gcctatactt gcttagtcga gtttgagaaa taccaaggca aagtgcctaa ggtcagctcc 2460
ttcgatggcc ctatcgaagt cgaaatc 2487
<210> 4
<211> 1080
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: séquence
partielle codant pour la protéine TorA de
Photobacterium phosphoreum
<400> 4
acaatactga aagattgtaa gacattgata tggtggtcaa atgatccgat taaaaacagt 60
caggttggct ggcagtgtga gactcatggt tcttatgagt attatgcgca attaaagcag 120
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
aaggtcgcag atggtgggat ccgtatgatc tcggtcgatc ctgtagtgtc gaaatcgcaa 180
aaatatttta actgtgagca ccaatacgtc aatcctcaaa ctgacgttcc tttcatgctt 240
gctattgcgc atacattgta taaagaagat ctgtacgata aacaatttct ggaaacttac 300
actttaggct tcaatgaatt cttgccttac ttattgggta caggcaaaga taaaatagcc 360
aaaacgccag aatgggcaga gccaatttgt ggcgttaaag cagaggctat tcgagaattt 420
gctcgcggat tagttaaaaa ccgtacgatg ataatgtttg gttgggctgt acagcgtcaa 480
caacacggtg agcagcctta ttggatggga gcagtgctgg cttcgatgtt aggccaaata 540
ggcttacctg gtggagggat ttcctattct cacttttaca gtggcgttgg gttacctttc 600
agtactgcag ctgggccggg gggatttccg cgtaatgttg atgaaggcca~acagccgatt 660
tggaataata acgattttaa aggctacagt tcgacaattc cggtcgcaag atggattgat 720
gcgatcatgg aaccaggtaa aaaaattcaa tataacggcg ctaatgtggt gttgcctgat 780
attaagatga tggtctttag tggttgtaat ccgtggaatc atcatcaaca acgtaatcgt 890
atgaaacaag catttagaaa gctgcaaacc gtggttaata ttgattatac atggacacca 900
acctgtcgtt tttccgatat tgtattacct gcttgtaccc aatttgagcg tagtgattta 960
gatcaatatg gtacttattc aactagcggt attttagcga tgcataagct aattgatccg 1020
ctttatcaat caaaaacaga ctttcagata tttactgaat taaccgaacg ctttgggaaa 1080
<210> 5
<211> 392
<212> PRT
<213> Shewanella massilia
<400> 5
Met Lys Trp Leu Thr Asn Leu Trp Arg Thr Leu Asn Lys Pro Thr Lys
1 5 10 15
Ala Leu Thr Leu Gly Ala Val Ser Ile Ser Ala Phe Ile Met Gly Ile
20 25 30
Ile Phe Trp Gly Gly Phe Asn Thr Ala Leu Glu Ala Thr Asn Thr Glu
35 40 45
Ala Phe Cys Ile Ser Cys His Ser Met Glu Ser Lys Pro Tyr Gln Glu
50 55 60
Leu Gln Glu Thr Val His Trp Ser Asn His Phe Gly Val Arg Ala Thr
65 70 75 80
Cys Pro Asp Cys His Val Pro His Asn Trp Ser Arg Lys Ile Ala Arg
85 90 95
Lys Met Glu Ala Ser His Asp Val Trp Gly Trp Leu Phe Asn Thr Val
100 105 110
Asn Thr Pro Glu Lys Phe Glu Ala Lys Arg Leu Glu Met Ala Ser Arg
115 120 125
Glu Trp Lys Arg Phe Asp Arg Asp Asn Ser Leu Ala Cys Lys Asn Cys
130 135 140
His Asn Tyr Asn Ser Met Lys Trp Glu Ala Met Ser Pro Leu Ala Gln
145 150 155 160
Lys Gln Met Lys Arg Ala Ala Glu Ile Asp Gln Ser Cys Ile Asp Cys
165 170 175
His Lys Gly Ile Ala His His Leu Pro Glu Met Gly Thr Ala Arg Ala
180 185 190
4
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
Pro Glu Leu Ile Ala Glu Val Gly Ala Gly Val Ser Ser Val Glu Thr
195 200 205
Asn Gln Thr Tyr Tyr Ser Ala Leu Thr Lys Pro Leu Phe Phe Thr Asp
210 215 220
Lys Gly Asp Val Glu Ala Gly Thr Leu Asn Val Ala Thr Lys Val Lys
225 230 235 240
Val Leu Glu Thr Gln Gly Lys Arg Ile Lys Ile Gly Ile Asp Gly Trp
245 250 255
Arg Lys Lys Ile Gly Ala Gly Arg Val Ile Tyr Met Asp Phe Gly Val
260 265 270
Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Thr Lys Asp Ala Ala Glu Thr Gly Gly
275 280 285
Val Ile Gln Thr Phe Glu Glu Lys Glu Asp Pro Met Thr Gly Leu Lys
290 295 300
Trp Gln Arg Ile Glu Ala Gln Ile Trp Thr Asp Lys Asp Tyr Leu Leu
305 310 315 320
Thr Glu Leu Gln Pro Leu Trp Gly Tyr Ala Arg Asp Thr Phe Arg Ser
325 330 335
Ser Cys Ser Val Cys His Thr Gln Pro Asp Glu Ala His Phe Asp Ala
340 345 350
Asn Thr Trp Pro Gly Met Phe Gln Gly Met Leu Ala Phe Val Asn Met
355 360 365
Asp Gln Asp Thr Gln Ala Leu Val Gln Lys Tyr Leu Gln Glu His Ser
370 375 380
Ser Thr Phe Val Lys Lys Glu His
385 390
<210> 6
<211> 2523
<212> ADN
<213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 6
atgccccgcc cgggacgaag cccggcaaga ccgtcatacg gaagaaagga aagccagatg 60
actaagttgt caggtcagga gctgcatgcc gaactctcgc ggcgcgcctt cctgagctat 120
acggcggctg tgggggctct cggtctctgc ggcacctcgc tcctcgcgca gggagcccgc 180
gcggaaggtc tcgccaacgg cgaggtcatg tcgggctgcc actggggcgt gttcaaggcc 240
cgggtcgaga acggccgcgc cgtggccttc gagccctggg acaaggaccc cgcgccgtcg 300
caccagctgc cgggcgtgct cgattcgatc tattcgccca cgcggatcaa atatccgatg 360
gtgcgccgcg aattcctcga gaagggcgtg aacgccgacc gctccacccg cggcaacggc 420
gacttcgtcc gcgtcacctg ggatgaagcg ctcgacctcg tggccaagga actgaagcgc 480
gttcaggaaa gctacgggcc caccggcacc ttcggcggct cctacggctg gaaaaacccg 540
ggccggctgc acaactgtca ggtcctcatg cgccgcgcgc tgaatctcgc gggcgggttc 600
gtgaactcgt cgggcgacta ttcgaccggc gccgcgcaga tcatcatgcc gcatgtcatg 660
ggcacgctcg aggtctacga gcagcagacc gcctggcccg tggtggtgga caacaccgaa 720
ctgatggtct tctgggccgc cgatccggtg aagaccaacc agatcggctg ggtggtcccc 780
gaccatggcg ccttcgcggg catgcaggca atgaaggaaa agggcaccaa ggtcatctgc 840
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
atcaaccccg tgcgcaccga gacggccgac tatttcggcg ccgaactcgt gtcgccgcgg 900
ccgcagaccg acgtggcgct gatgctcggc atggcgcaca cgctctacag cgaagatctg 960
cacgacaagg acttcatcga aaactgcacc tcgggcttcg acatcttcgc ggcctacctg 1020
accggcgaga gcgacggcac gcccaagacg gccgaatggg ccgccgagat ctgcggcctg 1080
ccggccgagc agatcaagga actcgcccgc cgcttcgtgg gcggccggac gatgctcgcc 1140
gcgggctggt cgatccagcg gatgcaccat ggcgaacagg cgcactggat gctcgtcacg 1200
ctggcctcga tgatcggcca gatcggtctt ccgggcggcg gcttcggcct tagctaccat 1260
tactccaacg gtggctcgcc cacgagcgac ggcccggcgc tgggcggtat ttcggacggc 1320
ggcaagccgg tcgaaggtgc ggcctggctg tcggcgagcg gcgcggcttc gatcccctgc 1380
gcccgggtgg tggacatgct gctcaatccg ggcggcgagt tccagttcaa cggtgccacg 1440
gcgacctatc ccgacgtgaa gctggcctac tgggtgggcg gcaacccctt cgcgcaccac 1500
caggaccgca accggatgct caaggcctgg gaaaagctcg agaccttcat cgtgcaggac 1560
ttccagtgga ccgccaccgc gcgccacgcc gacatcgtcc tgccggcgac gacctcctac 1620
gaacgcaacg acatcgagtc ggtgggcgac tattcgaacc gcgccatcct cgcgatgaag 1680
aaggtggtcg atccgctcta cgaggcccgg tcggactacg acatcttcgc agccctgacg 1740
gagcgtctgg gcaagggcaa ggaattcacc gaaggccgcg acgagatggg ctggatcagc 1800
tcgttctacg aggcggcggt gaagcaggcc gagttcaagc agatggagat gccgtcgttc 1860
gaggacttct ggtcggaagg gatcgtcgag ttcccgatca ccgagggcgc gaacttcgtt 1920
cgctatgccg acttccgcga ggatccgctg ttcaaccccc tcggcacgcc ctcgggcctg 1980
atcgagatct actcgaagaa catcgagaag atgggctatg acgattgccc ggcccatccg 2040
acctggatgg aaccggccga gcgtctcggc gggccggggg cgaaatatcc gctccatgtg 2100
gtggcgagcc acccgaactc gcggctgcac tcgcagctga acggcacctc gctgcgcgac 2160
ctctatgcgg tcgcggggca cgagccctgt ctcatcaacc ccgacgatgc ggccgcgcgc 2220
ggcatcgcgg acggcgatgt gctgcgggtg ttcaacgacc gcgggcagat cctcgtgggc 2280
gcgaaggtga gcgacgcggt gatgccgggc gcgatccagg tctacgaggg cggctggtac 2340
gacccgctcg acccctcgga ggaaggcacg ctcgacaaat acggcgacgt gaacgtgctg 2400
tcgctcgacg tcggcacctc gaagctggcg cagggcaact gcggccagac catcctcgcg 2460
gatgtcgaaa aatatgcggg cgcgccggtg acggtgaccg tgttcgacac gccgaaggga 2520
ccc 2523
<210> 7
<211> 2475
<212> ADN
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 7
atgacgaagt tttccggaaa cgagctgcgc gcagagcttt accgccgcgc tttcctcagc 60
tactcggttg caccgggcgc gctgggcatg ttcggccggt cgcttctggc caagggcgcc 120
cgcgccgagg cgctggccaa tggcacggtg atgtcgggca gccactgggg cgtctttacc 180
gcgacggtcg aaaacggccg cgccaccgcc ttcaccccct gggaaaaaga cccgcatccg 240
acgccgatgc tggaaggcgt gctggactcg atctattcgc cgacgcggat caaatatccg 300
atggtgcggc gcgaattcct cgaaaaaggc gtgaatgctg atcgctccac ccgcggcaac 360
ggcgattttc gtcccgtcag ctgggatcag gcgctcgatc tgcatggtcg cgg:cgaggtc 420
aaacgggtcg aaggagacct acggcccgca ggcgtctttg gcggctccta tggctggaaa 480
agccccgggc ggctgcacaa ttgcaccacg cttctgcgcc ggatgctgac gctggcgggc 540
ggctatgtga acggcgcggg cgattattcg accggcgcgg cgcaggtgat catgccgcat 600
gtggtcggca cgctggaagt ctatgaacag cagaccgcct ggccggtgct ggcggaaaac 660
accgaagtca tggtgttctg ggccgccgat ccgatcaaga cagcagatat cggctgggtg 720
tatcccgaac atggcgccta tccggggact gaggcgctca aggccaaggg caccaaggtc 780
atcgtcatcg atccggtccg caccaagacg gtcgaattct tcggcgcgga tcacgtcacg 840
ccgaaaccgc agaccgatgt ggcgatcatg ctgggcatgg cgcatacgct ggtggccgaa 900
gacctgtatg taaaggactt catcgccaac tacacctcgg gcttcgacaa gttcctgccc 960
tatctgatgg gcgagaccga cagcacgccg aagaccgccg aatgggcgtc ggatatcagc 1020
ggcgttccgg ccgagacgat caaggaactg gcgcggctgt tcaaatcgaa acgcacgatg 1080
ctggcggcgg gctggtcgat gcagcggatg catcacggcg agcaggcgca ttggatgctg 1140
gtgacgctgg cctcgatgct gggtcagatc gggctgcggg gcggcggctt cgggctgtcc 1200
tatcactatt cgggcggtgg cacgccctcg agcagcggtc cggcgctttc gggcatcacc 1260
gatggcgggc gacgaagggg ccggaatggc tggcggcgag cggcgcttcg gtgtatcccg 1320
gtggcgcgcg tggtcgacat gctggaaaac cccggcgccg aattcgactt caacggtacg 1380
cggtcgaaat tcccggatgt gaagatggcc tattgggttg gcggaacccc ttcgtgtcac 1440
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
catcaggacc gcaaccgcat ggtcaaggcc tgggaaaaac tggaaacctt catcgtgcat 1500
gacttccagt ggacgcccac ggcgcggcat gccgacatcg tgctgcccgc gacgaccagc 1560
tatgaacgca acgacatcga gacgatcggc gattattcga acaccggcat cctggcgatg 1620
aagaagatcg tcgagccgct ttacgaagcc cgcagcgatt acgacatctt cgccgcggtc 1680
gccgaacggc tgggcaaggg caaggagttc accgaaggca aggacgagat gggctggatc 1740
aagtccttct acgacgatgc cgccaagcag gcaaagcggg ggtcgagatg ccccgccttc 1800
gacgccttct gggcggaagg gatcgtggaa ttcccggtca ccgacggcgc ggacttcgtg 1860
cgctatgcca gcttccggga agatccgctg ctcaacccgc tgggcacgcc gaccggcctg 1920
atcgagatct actcgaagaa catcgagaag atgggctatg acgactgccc ggcgcatccg 1980
acctggatgg aaccgcttga acggctcgac gggccggggg cgaaatatcc gctgcacatc 2040
gcggctcgca cccgttcaac cggtgtactc gcacccgttc accggctcaa cggcacggtg 2100
ctgcgcgaag gctatgcggt gcaggggcac gagccctgcc tgatgcaccc cgacgacgcc 2160
gccgcgcgcg gcatcgccga tggcgacgtg gtgcgggtgc acaatgatcg cggtcagatc 2220
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ggctggtatg atccctcgga cgtgaccgag gcggggacgc tcgacaaata cggcgacgtt 2340
aacgtgctgt cggccgatat cggcatgtcg aaactggcgc agggcaactg tggtcagacc 2400
gtgctggccg aggtcgagaa atacaccggc cccgccgtca ccctgaccgg ctttggtcgc 2460
gcgaaggcgg tcgaa 2475
<210> 8
<211> 404
<212> PRT
<213> Rhodobacter sphareroides
<400> 8
Met Gly Arg Ser Cys Gly Gln Ala Ser Glu Ala Lys Val Ile Gly Arg
1 5 10 15
Ile Trp Lys Ala Phe Trp Arg Pro Ser Thr Lys Trp Gly Leu Gly Val
20 25 30
Leu Leu Val Thr Gly Gly Ile Ala Gly Ala Val Gly Trp Asn Gly Phe
35 40 45
His Tyr Val Val Glu Lys Thr Thr Thr Thr Glu Phe Cys Ile Ser Cys
50 55 60
His Ser Met Arg Asp Asn Asn Tyr Glu Glu Tyr Lys Thr Thr Ile His
65 70 75 80
Tyr Gln Asn Thr Ser Gly Val Arg Ala Glu Cys Ala Asp Cys His Val
85 90 95 ._
Pro Lys Ser Gly Trp Lys Leu Tyr Arg Ala Lys Leu Leu Ala Ala Lys
100 105 110
Asp Leu Trp Gly Glu Ile Arg Gly Thr Ile Asp Thr Arg Glu Lys Phe
115 120 125
Glu Ala His Arg Leu Glu Met Ala Glu Thr Val Trp Ala Asp Met Lys
130 135 140
Ala Asn Asp Ser Ala Thr Cys Arg Thr Cys His Ser Phe Glu Ala Met
145 150 155 160
Asp Phe Ala His Gln Lys Pro Glu Ala Ser Lys Gln Met Gln Gln Ala
165 170 175
Met Asn Glu Gly Gly Thr Cys Ile Asp Cys His Lys Gly Ile Ala His
180 185 190
7
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
Lys Met Pro Asp Met Ala Ser Gly Tyr Arg Ala Leu Phe Ser Lys Leu
195 200 205
Glu Lys Ala Ser Gln Ser Leu Lys Pro Arg Lys Gly Glu Thr Leu Tyr
210 215 220
Pro Leu Arg Thr Ile Glu Ala Tyr Leu Glu Lys Pro Ser Gly Glu Lys
225 230 235 240
Ala Lys Ala Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ala Thr Pro Met Gln Val Val
245 250 255
Asp Val Thr Gly Asp Trp Val Gln Val Ala Val Lys Gly Trp Gln Gln
260 265 270
Glu Gly Ala Glu Arg Val Ile Tyr Glu Lys Gln Gly Lys Arg Ile Phe
275 280 285
Asn Ala Ala Leu Ala Pro Ala Ala Thr Gly Ser Val Val Pro Gly Ala
290 295 300
Ser Met Val Asp Pro Asp Thr Glu Gln Thr Trp Thr Asp Val Ser Leu
305 310 315 320
Thr Ala Trp Val Arg Asn Arg Asp Leu Thr Gly Asp Gln Glu Ala Leu
325 330 335
Trp Gln Tyr Gly Lys Gln Met Tyr Asn Gly Ala Cys Gly Met Cys His
340 345 350
Val Leu Pro His Pro Glu His Phe Leu Ala Asn Gln Trp Ile Gly Thr
355 360 365
Leu Asn Ala Met Lys Ser Arg Ala Pro Leu Asp Asp Glu Gln Phe Arg
370 375 380
Leu Val Gln Arg Tyr Val Gln Met His Ala Lys Asp Val Glu Pro Glu
385 390 395 400
Gly Ala Ala Glu
<210> 9
<211> 2544
<212> ADN
<213> Escherichia coli
<400> 9
atgaacaata acgatctctt tcaggcatca cgtcggcgtt ttctggcaca actcggcggc 60
ttaaccgtcg ccgggatgct ggggccgtca ttgttaacgc cgcgacgtgc gactgcggcg 120
caagcggcga ctgacgctgt catctcgaaa gagggcattc ttaccgggtc gcactggggg 180
gctatccgcg cgacggtgaa ggatggtcgc tttgtggcgg cgaaaccgtt cgaactggat 240
aaatatccgt cgaaaatgat tgccggattg ccggatcacg tacacaacgc ggcgcgtatt 300
cgttatccga tggtacgcgt ggactggctg cgtaagcgcc atctcagcga tacctcccag 360
cgcggtgata accgttttgt gcgcgtgagc tgggatgaag ccctcgacat gttctatgaa 420
gaactggaac gcgtgcagaa aactcacggg ccgagtgcct tgctgaccgc cagtggttgg 480
caatcgacgg ggatgttcca taacgcttcg gggatgcgtg cgaaacgtat tgccttgcat 540
ggtaatagcg ttggtacggg cggagattac tctaccggtg ctgcgcaggt gatcctgccg 600
8
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
cgcgtagtcg gttcgatgga agtgtatgaa cagcaaacct cctggccgct ggtattgcag 660
aacagcaaaa ccattgtgct gtggggctcc gatttgctga aaaaccagca agcgaactgg 720
tggtgcccgg atcacgatgt ttatgaatat tacgcgcagc taaagcgaaa gtcggccgcc 780
ggtgaaattg aggtcatcag catcgatccg gttgtcacat ccacccatga gtatctgggc 840
ggggagcatg tgaagcacat tgcggttaac ccgcaaactg acgtgccgct gcaactcgcg 900
ctggcacata cgctgtacag tgaaaacctg tacgacaaaa acttccttgc taactactgt 960
gtgggttttg aggagttcct gccgtatctg ctgggtgaga aagacggtca gccgaaagat 1020
gccgcatggg ctgaaaaact gagcggcatt gatgccgaaa ccattcgtgg gctggcgcgg 1080
cagatggcgg cgaacagaac gcaaattatt gctggctggt gcgtgcagcg tatgcagcac 1140
ggtgaacagt gggcgtggat gattgtggtt ctggcggcga tgctggggca aattggcctg 1200
ccaggtggtg gttttggttt tggctggcac tacaacggcg caggcacgcc ggggcgtaaa 1260
ggcgttattc tgagtggttt ctccggctct acgtcgattc cgcctgttca cgacaacagt 1320
gactataaag gctacagcag cactattccg attgcccgtt ttatcgatgc gatcctcgaa 1380
ccggggaaag tgatcaactg gaacggtaaa tcggtaaaac tgccgccgct gaaaatgtgt 1440
atttttgccg gaactaaccc attccatcgc catcagcaga tcaaccgcat tattgaaggc 1500
ttgcgcaacg tggaaacggt tatcgccata gataaccagt ggacctcaac ctgccgcttt 1560
gccgatatcg tactgcctgc gaccacgcag tttgagcgta acgatctcga ccagtacggc 1620
aatcactcca accgtggcat tatcgccatg aaacaggtgg tgccgccgca gttcgaggcg 1680
cgcaacgact tcgatatttt ccgcgagctg tgccgtcgct ttaatcgcga agaagccttt 1740
accgaagggc tggacgaaat gggctggctg aaacgcatct ggcaggaagg tgtacagcaa 1800
ggcaaaggac gcggcgttca tctgccagcg tttgatgact tctggaataa caaagagtac 1860
gtcgagtttg accatccgca gatgtttgtt cgccaccagg cattccgcga agatccggat 1920
ctcgaaccgc tgggcacgcc gagtggcctg attgagatct actcgaaaac tatcgccgat 1980
atgaactacg acgattgtca ggggcatccg atgtggtttg agaaaatcga acgctcccac 2040
ggtgggcctg gctcgcaaaa gtatccgttg catctgcaat ctgtgcatcc ggatttccga 2100
cttcactcgc agttatgtga gtcggaaacg ctgcgtcacg aatatacggt agcgggtaaa 2160
gagccagtat tcattaaccc gcaggatgcc agcgcgcgcg gtattcgtaa cggtgatgtg 2220
gtacgcgtct ttaacgctcg cggtcaggtg atggcagggg cagtggtttc tgaccgctat 2280
gcacccggcg tggcacgaat tcacgaaggg gcatggtacg atccagataa aggcggcgag 2340
ctgggtgcgc tgtgcaaata cggtaacccc aacgtgttga ccatcgacat cggtacatcg 2400
cagctcgcgc aggcgaccag tgcgcacact acgctggtgg aaattgagaa gtacaacgga 2460
acagtggagc aggtgacggc gtttaacggc cccgtggaga tggtggcgca gtgcgaatat 2520
gttcccgcgt cgcaggtgaa atca 2544
<210> 10
<211> 477
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: séquence
partielle codant pour la protéine TorA de
Salmonella typhimurium
<400> 10
atgaaacagg tggtgtcgcc gcagtttgaa gcgcgtaacg actttgatat tttccgcgat 60
ctctgccgac gctttaaccg tgaagcggca ttcacggaag gtcttgatga aatgggctgg 120
ctgaaacgca tctggcagga agggagccag cagggaaaag gtcgcggtat ccacttaccg 180
attttcgagg tgttctggaa tcaacaggag tacatcgagt ttgatcatcc gcagatgttt 240
gtacgccatc aggctttccg tgaagatccg gacctggagc cgttgggcac gccaagcggt 300
ttgatcgaga tttactccaa aaccatcgcc gacatgcaat acgacgatgg tcagggccat 360
cccatgtggt tcgaaaaaat cgaacgctcg catggcgggc cgggatcgca gcgctggccg 420
ctgcacttac aatccgtcca ccctgatttc cgtctgcatt cccaactgtt gcgagtc 477
<210> 11
<211> 390
<212> PRT
<213> Escherichia coli
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
<400> 11
Met Arg Lys Leu Trp Asn Ala Leu Arg Arg Pro Ser Ala Arg Trp Ser
1 5 10 15
Val Leu Ala Leu Val Ala Ile Gly Ile Val Ile Gly Ile Ala Leu Ile
20 25 30
Val Leu Pro His Val Gly Ile Lys Val Thr Ser Thr Thr Glu Phe Cys
35 40 45
Val Ser Cys His Ser Met Gln Pro Val Tyr Glu Glu Tyr Lys Gln Ser
50 55 60
Val His Phe Gln Asn Ala Ser Gly Val Arg Ala Glu Cys His Asp Cys
65 70 75 80
His Ile Pro Pro Asp Ile Pro Gly Met Val Lys Arg Lys Leu Glu Ala
85 90 95
Ser Asn Asp Ile Tyr Gln Thr Phe Ile Ala His Ser Ile Asp Thr Pro
100 105 110
Glu Lys Phe Glu Ala Lys Arg Ala Leu Leu Ala Glu Arg Glu Trp Ala
115 120 125
Arg Met Lys Glu Asn Asn Ser Ala Thr Cys Arg Ser Cys His Asn Tyr
130 135 140
Asp Ala Met Asp His Ala Lys Gln His Pro Glu Ala Ala Arg Gln Met
145 150 155 160
Lys Val Ala Ala Lys Asp Asn Gln Ser Cys Ile Asp Cys His Lys Gly
165 170 175
Ile Ala His Gln Leu Pro Asp Met Ser Ser Gly Phe Arg Lys Gln Phe
180 185 190
Asp Asp Val Arg Ala Ser Ala Asn Asp Ser Gly Asp Thr Leu Tyr Ser
195 200 205
Ile Asp Ile Lys Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Gly Asp Lys Glu Ala Ser
210 215 220
Gly Ser Leu Leu Pro Ala Ser Glu Val Lys Val Leu Lys Arg Asp Gly
225 230 235 240
Asp Trp Leu Gln Ile Glu Ile Thr Gly Trp Thr Glu Ser Ala Gly Arg
245 250 255
Gln Arg Val Leu Thr Gln Phe Pro Gly Lys Arg Ile Phe Val Ala Ser
260 265 270
Ile Arg Gly Asp Val Gln Gln Gln Val Lys Thr Leu Glu Lys Thr Thr
275 280 285
Val Ala Asp Thr Asn Thr Glu Trp Ser Lys Leu Gln Ala Thr Ala Trp
290 295 300
Met Lys Lys Gly Asp Met Val Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Ala T~r
305 310 315 320
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
Ala Asp Ser Leu Tyr Asn Gly Thr Cys Asn Gln Cys His Gly Ala Pro
325 330 335
Glu Ile Ala His Phe Asp Ala Asn Gly Trp Ile Gly Thr Leu Asn Gly
340 345 350
Met Ile Gly Phe Thr Ser Leu Asp Lys Arg Glu Glu Arg Thr Leu Leu
355 360 365
Lys Tyr Leu Gln Met Asn Ala Ser Asp Thr Ala Gly Lys Ala His Gly
370 375 380
Asp Lys Lys Glu Glu Lys
385 390
<210> 12
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: AMORCE
PCR
<400> 12
cggvgaytac tcbachggtg c 21
<210> 13
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificiellé: amorce
PCR
<400> 13
atygatgcga tyctcgaacc 20
<210> 14 ~ '-
<211> 25
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 14
cgtamwsgtc gakatcgttr cgctc 25
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
11
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 15
gactcacaya wytgygagtg 20
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 16
tgrccdcgrk cgttaaagac 20
<210> 17
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 17
ccvggttcga gratcgcatc 20
<210> 18
<211> 16
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 18
cbgayatcst rctgcc 16
<210> 19
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 19
ggmgaytayt cbacmggygc 20
<210> 20
12
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 20
twygarcgya acgaymtcga 20
<210> 21
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 21
ggvycrtacc abscvccttc 20
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 22
atcarrccns wvggcgtgcc 20
<210> 23
<211> 17 '
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 23
gbcacrtcdg tytgygg 17
<210> 24
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 24
13
CA 02384637 2002-03-11
WO 01/20030 PCT/FR00/02578
acnccngara arttygargc 20
<210> 25
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 25
tgyathgayt gycayaargg 20
<210> 26
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 26
ccyttrtgrc artcdatrca 20
<210> 27
<211> 17
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
PCR
<400> 27
ttngcrtcra artgngc 17
14
