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WO 01/21819 1 PCT/FR00/02565
PROCEDE DE MODIFICATION GENETIQUE DE LACTOBACILLUS
DELBRUECKII
La présente invention est relative à la
modification génétique de Lactobacillus delbrueckii.
Les bactéries lactiques sont très utilisées en
industrie agroalimentaire, particulièrement pour la
fabrication de divers produits fermentés ; en outre, leur
innocuité a fait préconiser leur utilisation pour la
production par génie génétique de diverses substances
destinées notamment à une utilisation thérapeutique.
La modification génétique des bactéries
lactiques permet d'adapter leurs caractéristiques selon
l'utilisation envisagée, que ce soit par l'introduction
et l'expression d'ADN étranger, ou par la surexpression
ou au contraire l'inactivation de gènes naturellement
présents chez lesdites bactéries. Pour qu'une
modification soit stable, elle doit être intégrée dans le
chromosome bactérien. Dans ce but, la modification
souhaitée est insérée dans un plasmide non-réplicatif
portant un marqueur de sélection. Le vecteur ainsi obtenu
est introduit dans les bactéries ; on récupère ensuite
les bactéries exprimant le marqueur de sélection, qui
sont celles qui ont intégré le vecteur dans leur
chromosome.
La modification résulte de 2 évènements de
faible fréquence . 1) l'introduction du plasmide dans les
bactéries ; 2) l'intégration dudit plasmide dans le
chromosome. Le taux de modification que l'on peut espérer
est le produit des probabilités de ces deux évènements ;
il est donc très faible, surtout dans le cas de bactéries
appartenant à des espèces dites « réfractaires » à la
transformation, ce qui est le cas de nombreuses espèces
de bactéries lactiques. Parmi celles-ci on mentionnera en
particulier l'espèce Lactobacillus delbrueckii, qui
comprend notamment les sous-espèces Lb. delbrueckii
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subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lattis, et Lb.
delbrueckii subsp. delbrueckii.
Un seul exemple de vecteur permettant
l'intégration dans le chromosome de Lb. delbrueckii est
décrit dans l'art antérieur . il s'agit du plasmide
conjugatif pAM(31, décrit comme non-réplicatif chez Lb.
delbrueckii. La Demande EP 0603416 au nom de MEIJI MILK
PRODUCTS CO LTD rapporte l'utilisation de ce plasmide
pour intégrer une modification dans le chromosome de
Lb. delbrueckii . un marqueur de sélection (résistance à
l'érythromycine), a été inséré dans un fragment homologue
à une région du chromosome de Lb. delbrueckii, et
l'ensemble a été introduit dans le plasmide pAM(31. Le
plasmide intégratif ainsi construit a été multiplié chez
Lactococcus lattis, puis transféré par conjugaison chez
Lb. delbrueckii ; les transconjugants/intégrants sont
ensuite sélectionnés sur la base de la résistance à
l'érythromycine résultant de l'intégration, par
recombinaison homologue, de l'insert du plasmide dans
l'ADN chromosomique.
Ces modifications étant obtenues à très faible
fréquence, il est souhaitable de disposer d'autres
vecteurs intégratifs adaptés à Lb. delbrueckii et
facilitant l'obtention des souches modifiées et la
sélection des intégrants.
Pour augmenter le taux de modification et
faciliter le criblage des bactéries modifiées, il a été
proposé d'utiliser comme vecteurs des plasmides
conditionnels. On qualifie ici de « conditionnel » un
vecteur, par exemple un plasmide, dont au moins l'une des
fonctions de réplication, de partition, ou de stabilité
n'est active que dans certaines conditions (par exemple
de température, de pH, de concentration en sels minéraux,
de présence dans le milieu de culture d'un composé
particulier, etc.) soit du fait qu'une ou plusieurs des
protéines intervenant dans cette fonction comportent)
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une ou des mutations) rendant l'activité conditionnelle,
soit du fait qu'une ou plusieurs des protéines
intervenant dans cette fonction sont placées sous
contrôle d'un promoteur inductible.
BISWAS et al., J. Bacteriol., 175, 3628-3635,
(1993) ; MAGUIN et al., J. Bacteriol., 178, 931-935,
(1996) et la Demande PCT WO 93/18164 décrivent ainsi des
vecteurs intégratifs qui comprennent le système de
réplication du réplicon mutant pVE6002 (CNCM I-1179)
également dénommé pG+host, dérivé thermosensible (Ts) du
plasmide pWV0l, du fait d'une mutation au niveau de la
séquence codant la protéine RepA.
La modification peut ainsi être effectuée en
deux étapes . dans la première, le plasmide est introduit
à température permissive dans les bactéries, ce qui
permet une première sélection de celles dans lesquelles
il s'est établi ; dans la seconde, ces bactéries sont
cultivées à température non-permissive pour la
réplication du plasmide, ce qui permet de sélectionner
celles dans lesquelles les séquences introduites sont
intégrées dans le chromosome.
La Demande PCT WO 93/18164 décrit
l'utilisation de ces plasmides chez diverses espèces de
bactéries lactiques, dont Lb. delbruckii subsp.
bulgaricus.
En poursuivant leurs recherches, les
Inventeurs ont à présent constaté que d'autres plasmides
utilisés dans les bactéries lactiques étaient capables de
se répliquer dans Lb. delbrueckii â des températures
pouvant atteindre jusqu'à 37°C environ, qui permettent la
croissance de cette espèce, mais étaient thermosensibles
à des températures plus élevées, généralement à partir de
42°C, température optimale de croissance de cette espèce.
Il s'agit notamment de dérivés du plasmide
pIP501 ; il a été montré que ce plasmide peut être
transféré par conjugaison chez Lb. delbrueckii subsp.
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bulgaricus et s'y répliquer [LANGELLA et CHOPIN, FEMS
Microbiol. Lett., 60, 149-152, (1989). I1 a été décrit
comme thermosensible chez B. subtilis et plusieurs
lactobacilles dont L. helveticus [BHOWMICK et STEELE, J.
Gen. Microbiol., 139, 1433-1439, (1993)], L. plantarum
[RIXON et al., FEMS Microbiol. Lett., 71, 105-110,
(1990)] et L. acidophilus [LUCHANSKI et al., Mol.
Microbiol., 2, 637-646, (1988)] mais pas chez Lb.
delbrueckii. Les Inventeurs ont établi aue des dérivés de
pIP501 sont thermosensibles chez Lb. delbrueckii ; ils
peuvent en effet se répliquer et se maintenir à 35-37°C
environ dans cette espèce bactérienne, mais leur
réplication et/ou leur maintien sous forme stable sont
inhibés à partir de 42°C environ.
Ces dérivés de pIP501 ont été utilisés par les
Inventeurs pour transformer Lb. delbrueckii et ont permis
à température non-permissive, d'obtenir des intégrants.
La présente invention a en conséquence pour
objet l'utilisation d'un plasmide comprenant le système
de réplication thêta de pIP501 ou un système de
réplication apparenté, en tant que vecteur conditionnel,
thermosensible, d'intégration permettant d'introduire une
modification de l'information génétique d'une bactérie de
l'espèce Lb. delbrueckii.
Cette modification est introduite dans le
chromosome via un ou plusieurs évènements de
transposition et/ou de recombinaison homologue.
On définit ici comme « système de réplication
apparenté au système de réplication thêta de pIP501 »
tout système de réplication thêta possédant les
caractéristiques fonctionnelles, et notamment la
thermosensibilité chez Lb delbrueckii, de pIP501. Ceci
englobe en particulier tout système de réplication thêta
comprenant .
- une origine de réplication ori possédant au
moins 80% d'identité, de préférence au moins 85%
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d'identité, et avantageusement au moins 90% d'identité,
au niveau de la séquence nucléotidique, avec l'origine de
réplication ori de pIP501 et/ou ;
- une séquence codant une protéine rep dont la
séquence peptidique possède au moins 85% d'identité, de
préférence au moins 90% d'identité, et avantageusement au
moins 95% d'identité, avec celle de la protéine repli de
pIPS0l.
La séquence de l'origine de réplication ori de
pIP501 est décrite notamment par BRANTL et BEHNKE
[Molecular Microbiology, 6, 3501-3510 (1992)] ; la
séquence codant la protéine repli de pIP501 est identifiée
notamment dans la séquence complète de pGB3631 (dérivé de
pIP501), publiée par BRANTL et al., [Gene, 142, 155-156,
(1994)], et accessible sous le numéro X72021.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec
une séquence de référence est défini ici comme le
pourcentage de résidus de cette séquence qui sont
identiques avec ceux de la séquence de référence sur un
alignement des 2 séquences assurant une correspondance
maximale entre les positions des résidus.
La présente invention a en particulier pour
objet un procédé pour modifier l'information génétique
portée par le chromosome d'une bactérie de l'espèce
Lb delbrueckii, caractérisé en ce qu'il comprend .
a) la construction d'un plasmide intégratif, par insertion
d'au moins une séquence d'ADN capable de s'intégrer
dans le chromosome bactérien, dans un vecteur
conditionnel comprenant le système de réplication thêta
de pIP501 ou un système de réplication apparenté, ledit
vecteur portant en outre au moins un marqueur de
sélection ;
b) l'introduction du plasmide dans ladite bactérie et la
multiplication de celle-ci, en conditions permissives
pour la réplication et le maintien sous forme stable
dudit plasmide ;
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c) la multiplication des bactéries exprimant au moins un
marqueur de sélection du plasmide à l'issue de l'étape
b), en conditions non-permissives pour la réplication
et/ou le maintien sous forme stable du plasmide ; et
optionnellement,
d) la récupération des bactéries exprimant au moins un
marqueur de sélection provenant du plasmide, à l'issue
de l'étape c).
Selon une variante du procédé conforme à
l'invention, on peut omettre l'étape de multiplication de
la bactérie en conditions permissives pour la réplication
et le maintien du plasmide sous forme stable ; dans ce
cas, aprës l'introduction du plasmide dans la bactérie,
on effectue directement la multiplication de celle-ci en
conditions non-permissives pour la réplication et/ou le
maintien sous forme stable du plasmide.
Avantageusement, on peut, après avoir obtenu
des bactéries portant la modification souhaitée, éliminer
des séquences provenant du vecteur mis en ouvre à l'étape
a), dans les cas où il n'est pas souhaitable de conserver
ces séquences, par exemple dans le cas de bactéries
destinées à une utilisation industrielle, notamment à la
préparation d'aliments.
Dans ce cas le procédé conforme à l'invention
comprend en outre les étapes suivantes .
e) l'excision des séquences provenant du vecteur, par
multiplication des bactéries exprimant, à l'issue de
l'étape c), au moins un marqueur de sélection provenant
du plasmide, et avantageusement,
f) l'élimination de l'ADN excisé, par multiplication des
bactéries obtenues à l'étape e) en conditions non-
permissives pour la réplication et le maintien du
vecteur sous forme plasmidique stable.
Des vecteurs conditionnels comprenant le
système de réplication thêta de pIP501, ou un système
apparenté, utilisés chez Lb. delbrueckii pour la mise en
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ouvre de la présente invention sont des plasmides
thermosensibles capables de se répliquer et de se
maintenir à 35-37°C dans cette espèce bactérienne, et
dont la réplication et/ou le maintien sous forme stable
sont inhibés à partir de 42°C environ.
Ces plasmides portent en outre au moins un
marqueur de sélection, à savoir un gène pouvant
s'exprimer chez Lb. delbrueckii et dont l'expression
confère aux bactéries l'hébergeant un phénotype
distinctif permettant leur sélection. I1 peut s'agir par
exemple d'un marqueur de résistance, conférant un
caractère de résistance à une substance habituellement
toxique pour la bactérie, par exemple un antibiotique, ou
bien d'un marqueur d'auxotrophie conférant la capacité de
croître en l'absence d'un nutriment habituellement
indispensable à la bactérie. Les bactéries exprimant ces
marqueurs sont par exemple facilement sélectionnées par
leur survie sur milieu sélectif , à savoir en présence de
ladite substance toxique ou en l'absence dudit nutriment.
Ainsi, à l'issue de l'étape b) du procédé ci-dessus, les
bactéries dans lesquelles le plasmide est présent peuvent
être sélectionnées sur la base de l'expression d'un
marqueur de sélection provenant du plasmide. De même, à
l'issue de l'étape c), les bactéries dans lesquelles
l'ADN du plasmide a été intégré au chromosome peuvent
être sélectionnées sur la base de l'expression d'un
marqueur de sélection provenant du plasmide construit à
l'étape a).
Une autre possibilité de sélection à l'issue de l'étape
c) consiste à utiliser une propriété de la souche qui
découle de l'intégration du plasmide et/ou de l'excision
des séquences du vecteur. Par exemple, on peut utiliser
un plasmide conditionnel comprenant un marqueur de
sélection M (par exemple un marqueur de résistance), et
une séquence d'ADN capable de s'intégrer par
recombinaison homologue dans un gène bactérien X, ledit
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gène X étant indispensable dans certaines conditions pour
la bactérie (par exemple un gène essentiel pour sa
croissance sur un milieu donné), l'intégration du
plasmide inactivant le gène X, et l'excision des
séquences du vecteur restaurant son activité. Dans ce
cas, les bactéries dans lesquelles l'ADN plasmidique a
été intégré peuvent être sélectionnées sur la base de
l'expression du marqueur de sélection M, en conditions
dans lesquelles le gène X n'est pas indispensable, et les
bactéries dans lesquelles les séquences du vecteur
intégré ont été excisées peuvent être sélectionnées, en
conditions dans lesquelles le gène X est indispensable,
sur la base de la restauration de son activité. Ce mode
de sélection permet également en outre de sélectionner en
une seule étape des bactéries dans lesquelles
l'intégration de l'ADN plasmidique et l'excision des
séquences du vecteur ont eu lieu ; dans ce cas les
bactéries sont directement cultivées en conditions dans
lesquelles le gène X est indispensable, et qui sont
également sélectives pour le marqueur M. Les bactéries
sélectionnées seront celles dans lesquelles l'intégration
du plasmide et l'excision des séquences du vecteur (y
compris le marqueur M) ont restauré l'activité du gène X.
Des séquences d'ADN capables de s'intégrer
dans le chromosome d'une bactérie de l'espèce
Lb. delbrueckii comprennent notamment .
- des séquences choisies sur la base de leur
homologie avec une portion du chromosome où
l'on souhaite introduire une modification,
c'est à dire présentant une homologie
suffisante avec cette portion du chromosome
pour pouvoir recombiner avec elle ;
des séquences transposables, notamment des
transposons ou des séquences d'insertion
(IS) ; de telles séquences peuvent
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s'insérer au hasard ou avec une certaine
spécificité dans le chromosome bactérien.
Les modifications que l'on souhaite intégrer
dans le chromosome bactérien peuvent être apportées par
la simple intégration de ces séquences, celle-ci pouvant
par exemple entraîner l'inactivation d'un gène à
l'intérieur duquel elle s'effectue. Il est également
possible d'utiliser ces séquences pour intégrer un
fragment d'ADN, notamment un gène d'intérêt d'origine
hétérologue, ou un fragment d'ADN de Lb. delbrueckii
préalablement modifié, dans le chromosome bactérien.
Dans le cas de l'intégration par recombinaison
homologue, par exemple, on peut apporter à l'intérieur
d'une séquence identique à celle de la région du
chromosome que l'on souhaite modifier, des modifications
par insertion, délétion, ou substitution, pouvant aller
d'un seul nucléotide à plusieurs milliers de nucléotides.
La séquence ainsi modifiée est insérée à l'étape a) du
procédé selon l'invention, dans un vecteur conditionnel
chez Lb. delbrueckii, comprenant le système de
réplication thêta de pIP501 ou un système apparenté, tel
que défini ci-dessus. L'intégration s'effectue par
recombinaison (simple crossing-over) entre le fragment
d'ADN chromosomique cloné et la région homologue du
chromosome bactérien. Cet événement de recombinaison
créant des duplications de la région d'homologie, de part
et d'autre des séquences du vecteur, la structure
intégrée dans le chromosome est constituée des séquences
du vecteur encadrées de part et d'autre par une copie de
la région d'homologie, comme le montre la Figure 1.
L'utilisation de séquences pouvant s'intégrer
par recombinaison homologue permet notamment .
- d'inactiver un (ou des) gènes)
bactériens) ;
- de modifier l'expression des gènes et/ou
l'activité des produits codés par ces gènes ;
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- d'introduire, de façon stable, de nouvelles
fonctions dans le chromosome ;
- d'étudier et d'utiliser l'expression des
gènes in si tu ;
- de muter le chromosome par intégration via
des fragments chromosomiques aléatoires ;
- d'insérer, de façon stable, des séquences
destinées à marquer les souches. Ces séquences serviront
par la suite de traceurs ;
- d'introduire plusieurs modifications
séquentielles dans une même souche.
Dans le cas de l'intégration par
l'intermédiaire d'une séquence transposable, la séquence
transposable sera insérée dans le plasmide ;
l'intégration dans le chromosome permet de réaliser la
modification, d'obtenir ainsi des mutants présentant des
caractères intéressants et de caractériser plus aisément
le ou les gènes) muté(s). La structure transposée dans
le chromosome, peut être constituée des séquences du
vecteur encadrées de part et d' autre par une copie de la
séquence transposable.
Ces séquences transposables peuvent provenir
de bactéries appartenant à l'espèce Lb. delbrueckii, ou
provenir d'autres espèces bactériennes, notamment
d'autres bactéries lactiques. I1 peut s'agir de
transposons ou de séquences d'insertion.
Des séquences transposables fonctionnelles
chez Lb. delbrueckii peuvent être identifiées en insérant
une séquence transposable à tester (transposon ou
séquence d'insertion), dans un vecteur à réplication
conditionnelle chez Lb. delbrueckii comprenant le système
de réplication thêta de pIP501 ou un système apparenté,
tel que défini ci-dessus, en mettant en ouvre les étapes
b) et c) du procédé conforme à l'invention, et en
recherchant la présence de transposants à l'issue de ces
étapes.
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Les Inventeurs ont ainsi mis en évidence 2
séquences d'insertion fonctionnelles chez Lb.
delbrueckii. La présente Invention a également pour objet
l'utilisation de l'une ou l'autre de ces séquences pour
modifier le chromosome de Lb. delbrueckii.
I1 s'agit de la séquence d'insertion dénommée
IS1223 précédemment mise en évidence par WALKER et al.
(J. Bacteriol., 176, 5330-5340, 1994) chez Lb. johnsonii,
et de la séquence d'insertion dénommée IS1201,
précédemment mise en évidence par TAILLIEZ et al. (Gene,
145, 75-79, 1994) chez Lb. helveticus.
La présente invention a également pour objet
tout plasmide intégratif résultant de l'insertion de
l'une de ces 2 séquences dans un vecteur à réplication
conditionnelle chez Lb. delbrueckii, et notamment dans un
vecteur comprenant le système de réplication de pVE6002,
tels que ceux décrits dans la Demande PCT WO 93/18164 ou
dans un vecteur comprenant le système de réplication
thêta de pIP501 ou un système apparenté, tel que défini
ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la
présente invention, ledit vecteur est un vecteur non-
conjugatif.
Des plasmides intégratifs conformes à
l'invention sont notamment illustrés par le plasmide
pVI49 et le plasmide pVI52. Le plasmide pVI49 hébergé par
la souche VI209 de E. coli, et le plasmide pVI52, hébergé
par la souche VI217 de E. coli, ont été déposés selon le
Traité de Budapest le 17 septembre 1999, sous les numéros
respectifs I-2317 et I-2318, auprès de la CNCM
(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), 25
rue du Docteur Roux, à Paris.
Dans les deux cas de figure . intégration par
recombinaison homologue ou par transposition d'un élément
mobile, l'excision des séquences provenant du vecteur
peut s'effectuer, au cours de l'étape e) du procédé
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conforme à l'invention, par recombinaison entre les
séquences homologues flanquant les séquences du vecteur.
Par exemple, dans le cas de l'intégration par
recombinaison homologue, un second événement de
recombinaison (double crossing-over) peut avoir lieu
entre les régions homologues dupliquées de part et
d'autre des séquences du vecteur. Cet événement conduit à
l'excision des séquences du vecteur, et permet, pour une
fraction des clones, de substituer la forme sauvage
chromosomique par la forme modifiée plasmidique comme le
montre la Figure 1.
Légende de la Figure 1 .
A, B : ADN chromosomique cloné dans le vecteur ;
1 . modification ;
RC . réplicon conditionnel ;
M . marqueur de sélection ;
P . conditions permissives
NP . conditions non-permissives.
Par exemple, dans le cas de l'intégration par
certaines séquences transposables, celles-ci constituent
également de part et d'autre des séquences du vecteur,
des régions homologues favorables à des événements de
recombinaison qui conduisent à l'excision des séquences
du vecteur, et de l'une des copies de l'IS, l'autre
demeurant dans le chromosome bactérien au site de
transposition.
La Figure 2 représente l'excision des
séquences d'un vecteur par recombinaison homologue entre
des IS.
Légende de la Figure 2 .
I . séquence d'insertion ;
M . marqueur de sélection ;
NP . conditions non-permissives.
Les bactéries sélectionnées à température non
permissive pendant l'étape c) (>42°C), sont cultivées
sans pression de sélection pour permettre la
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recombinaison entre les régions homologues flanquant les
séquences du vecteur.
Après élimination des séquences excisées,
conformément à l'étape f) du procédé conforme à
l'invention, on obtient ainsi .
- dans le cas d'un plasmide comprenant une
séquence capable de s'intégrer par
recombinaison homologue, une bactérie
différant de la bactérie-hôte d'origine par
la présence, dans son chromosome, de la
modification apportée par cette séquence ;
- dans le cas d'un plasmide comprenant une
séquence transposable, une bactérie
différant de la bactérie-hôte d'origine par
la présence, dans son chromosome, d'une
copie de ladite séquence transposable.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples non-limitatifs d'obtention de
plasmides intégratifs et de leur utilisation che z Lb.
delbrueckii.
EXEMPLE 1 . SELECTION DE PLASMIDES THERMOSENSIBLES CHEZ
Lb. delbrueckii
Obtention des plasmides
Un plasmide navette L. bulgaricus - E. coli
constitué de pGB3631 (un dérivé séquencé de pIP501,
[BRANTL et al., Gene, 142, 155-156, (1994)]) et de
l'origine pSKII de E. coli a étê construit. Ce plasmide,
dénommé pVI1055, est représenté sur la figure 3. I1 porte
un gène ery de résistance à l'érythromycine (Ery).
Un autre dérivé de pIP501, le plasmide pGB3050
[LE CHATELIER et al., Plasmid, 29, 50-61, (1995)] a
également été testé.
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Mise en évidence de la thermosensibilité chez
Lb. delbrueckii
Transformation des bactéries
Des bactéries de la souche ATCC 11842 de Lb.
delbrueckii subsp. bulgaricus ou de la souche VI104
déposée selon le Traité de Budapest le 17 septembre 1999,
sous le numéro I-2316, auprès de la CNCM (Collection
Nationale de Cultures de Microorganismes), 25 rue du
Docteur Roux, à Paris, sont cultivées en milieu MRS, 0,1~
glycine (DIFCO) jusqu'en début de phase stationnaire.
Elles sont ensuite centrifugées et lavées dans du tampon
d'électroporation (0,4 M sucrose, 1 mM MgCl2, 5 mM KH2P04,
pH 6,0) et mises en suspension dans ce même tampon à une
concentration correspondant à une D06oo d'environ 50. La
suspension est incubée 20 min à 45°C puis refroidie sur
de la glace. Une aliquote de 80 ~,1 de la suspension est
mélangée avec l'ADN plasmidique (--1,5 ~g) et le mélange
est transféré dans une cuve d'électroporation de 0,2 cm.
L'électroporation est effectuée à 1 kV, 800 S2, et 25 ~F.
Immédiatement après l'électroporation, le
mélange est dilué dans 2 ml de milieu d'expression (0,2 M
sucrose, 5% lait écrémé en poudre, 0,1~ extrait de
levure, 1% casaminoacides, 25 mM MgCl2). Après incubation
pendant 3 h à 37°C dans ce milieu, les cellules sont
étalées sur des boites de milieu sélectif (MRS Agar avec
10 ~,g/ml d'érythromycine) ; les boites sont incubées en
jarre d'anaérobiose à 37°C pendant 48 h, et les colonies
résistantes à l'érythromycine sont sélectionnées.
Thermosensibilité de dérivés de pIP501 (réplication
thêta
La thermosensibilité de pGB3050 et de pVI1055
a d'abord été évaluée par des essais de transformation de
Lb. delbrueckii, (ATCC 11842 ou VI104) selon le protocole
décrit ci-dessus, avec des étalements sur milieu sélectif
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à 37°C et 42°C. Pour les 2 plasmides, on obtient des
transformants à 37°C mais pas à 42°C.
La thermosensibilité de pVI1055 a ensuite été
confirmée par comparaison de sa stabilité à 37°C et à
44°C. Une culture en MRS/Ery (10 ~.g/ml) à 37°C a été
diluée en MRS sans Ery puis incubée en parallèle à 37°C
et à 44°C. Des prélèvements sont effectués à différents
temps, et les cellules sont étalées après dilution sur
MRS et MRS/Ery, afin de déterminer la proportion de
cellules ayant perdu le plasmide.
A 37°C, environ 30% des cellules ont perdu le
plasmide pVI1055 après 48 heures. A 44°C, la stabilité de
pVI1055 est nettement affectée puisque -100% des cellules
ont perdu le plasmide après 48 heures.
EXEMPLE 2 . MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE DE
TRANSPOSITION DE SEQUENCES D'INSERTION (IS) CHEZ Lb.
delbrueckii.
Des séquences d'insertion isolées de bactéries
lactiques ont été clonées dans pVI1055. A température
permissive pour la réplication du plasmide, la
multiplication d'un transformant génère une population
bactérienne contenant le plasmide. L'IS présente sur le
plasmide dans la population bactérienne peut transposer
dans le chromosome. En cas de transposition de l'IS, la
structure transposée présente dans le chromosome, peut
correspondre au vecteur plasmidique, encadré de part et
d' autre par une copie de l' IS, comme le montre la Figure
4. A température non permissive (44°C), les plasmides
contenant les IS conduisent à l'obtention de clones EryR
avec une fréquence supérieure à celle observée pour
pVI1055, le plasmide sans IS. Dans le cas d'obtention de
clones EryR, l'analyse structurale de l'ADN chromosomique
par Southern Blot avec une sonde correspondant à l'IS
testée, permet de vérifier que l'intégration résulte bien
d'un événement de transposition.
CA 02385072 2002-03-14
CA 02385072 2002-03-14
WO 01/21819 16 PCT/FR00/02565
Mise en évidence de la transposition
Les IS 1223 (WALKER and KLAENHAMMER, 1994,
référence précitée), et 1201 (TAILLEZ et al., 1994,
référence précitée) ont été clonées dans le plasmide
pVI1055, générant respectivement les plasmides pVI48,
pVI49 (correspondant aux 2 orientations de l'IS1223J, et
pVI52.
Les propriétés de ces 2 IS et la nature des
plasmides obtenus sont indiquées dans le tableau 1 ci
après.
TABLEAU I
IS Origine Tailles (pb) Vecteurs finaux
b
1223 L. jonshon 1502 pV148/pV149
1201 L. helveticus 1387 pV152
a: tance corresponaant a ris encaaree ses repentions airectes ~uK~
b: La mention de deux plasmides indique que 1'1S a été clonée dans les deux
orientations
Pour rechercher l'activité de transposition,
les souches contenant les plasmides porteurs des IS à
tester ont êté cultivées à 37°C en MRS/Ery (10 ~g/ml).
Puis les cellules sont diluées en MRS et incubées à 44°C.
A différents temps, des échantillons sont prélevés et
étalés sur boîtes MRS (pour déterminer le compte de
cellules viables) et sur MRS/Ery (compte de cellules
EryR) .
Résultats
IS1223 (pVI48/pVI49) . Les plasmides pVI48 ou
pVI49 ont été introduits chez VI104. En présence de
l'IS1223, la fréquence des cellules EryR est plus élevée
qu'avec pVI1055 seul. Après digestion, les ADN
chromosomiques des clones EryR, obtenus sont hybridés
avec l'IS1223. Dans tous les cas, les clones EryR
résultent d'événements de transposition.
IS1201 (pVI52) . le plasmide pVI52 a été
introduit dans VI104. La fréquence d'intégration de pVI52
est plus élevée que celle de pVI1055 seul. Tous les
clones EryR analysés par Southern résultent de
transposition.
WO01/21819 cA o23a5o~2 201 03-14 pCT~R00/02565
Ces résultats démontrent l'activité de
transposition des IS 1223 et 1201 chez Lb. delbrueckii.
