Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 PCT/FR00/02786
PEPTIDES AYANT UNE ACTIVITÉ DE STIMULATION
DE LA REPONSE IMMUNITAIRE ET DE RÉGÉNÉRATION TISSULAIRE.
La présente invention concerne une nouvelle
- famille de molécules peptidiques ayant la capacité
notamment de stimuler l'expression des cytokines de
l'inflammation et de favoriser la régénération des
tissus. L'invention se rapporte donc également aux
compositions pharmaceutiques contenant au moins un des
peptides.
On connaît dans l'art antérieur de nombreux
facteurs de croissance angiogéniques comme les facteurs
HARP, MK, FGF-1, FGF-2, VEGF, HIV1-tat, HIV2-tat, HGF,
HB-EGF ou encore l'angiogenine. Parmi ceux-ci, HARP
, (Heparin Affin Regulatory Peptide), aussi appelé PTN
(Pleiotrophin) ou encore HB-GAM (heparin binding-growth
associated molecule), constitue avec MK (Midkine) une
famille de ces facteurs de croissance/différenciation
structurellement apparentés qui se lient à l'héparine,
. et présentent 50% d'homologie en acides aminés (1, 2).
Le facteur de croissance HARP est un
polypeptide de 168 acides aminés contenant un motif N-
terminal hydrophobe de 32 acides aminés correspondant à
un peptide signal. Sous sa forme mature, HARP est une
protéine sécrétée de 136 acides aminés, dans sa forme
courte, ou 139 acides aminés, dans sa forme longue, dont
le poids moléculaire apparent, déterminé en SDS-PAGE en
conditions réductrices, est de 18 kDa.
Initialement HARP a été isolé à partir de
cerveaux de nouveaux nés de rat comme une molécule
induisant in vitro une croissance neuritique (3)
suggérant que ce polypeptide est impliqué dans la
maturation des cellules neuronales (4). Plus tard, des
études ont montré que ce polypeptide était aussi présent
. dans des tissus non-neuronaux, dont le co?ur (5),
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 PCT/FR00/02786
l'utérus (6), les cartilages (7), et les extraits d'os
(8), démontrant que la fonction de HARP n'est pas
limitée à une activité promotrice d'une croissance
neuritique comme précédemment rapporté (3 ) .
HARP est capable de stimuler la croissance
de cellules fibroblastiques, épithéliales et
endothéliales in vitro (6, 9) . Cette activité mitogèr~e a
été depuis confirmée par l'utilisation de protéines
recombinantes produites à partir de systèmes
d'expression eucaryote (9, 12). HARP induit également in
vitro la formation de pseudo-capillaires (12). In vivo,
dans différents modèles tissulaires, la localisation de
HARP est notamment associée aux cellules endothéliales
des capillaires sanguins (16). A l'heure actuelle, les
données concernant HARP suggèrent que ce polypeptide
joue un rôle dans les mécanismes complexes impliqués
dans l'angiogénèse et la néoangiogénèse tumorale. De
nombreuses recherches ont été effectuées dans cette voie
afin de déterminer l'implication de HARP dans la
progression tumorale, notamment dans les tumeurs
hormono-dépendantes comme le sein ou la prostate.
Des études relatives aux propriétés
biologiques de HARP ont été effectuées par de nombreux
laboratoires (2) et en dépit de résultats controversés,
' il apparaît admis que HARP, tout comme MK, est impliqué
dans le contrôle de la prolifération cellulaire (2, 9-
11). De plus, il a été démontré que les protéines
recombinantes purifiées humaines de HARP sont
mitogéniques pour les cellules endothéliales (9,12), et
exercent in vitro une activité angiogénique (12). De
nombreuses études ont montré l'implication de HARP et MK
dans des procédés de développement (10, 13, 14). Des
études de distribution de l'ARNm de la protéine HARP
pendant le développement embryonnaire et postnatal
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 3 PCT/FR00/02786
suggèrent des fonctions importantes dans la croissance
cellulaire et la différenciation (15). Toutefois, les
fonctions physiologiques in vivo de ces molécules ne
sont que très peu connues. La présence de transcripts de
HARP dans les tissus adultes incluant les méninges,
l'iris, les testicules et l'utérus indiquent aussi un
rôle physiologique durant l'âge adulte.
Les travaux de recherche réalisés dans le
cadre de la présente invention ont porté sur de nombreux
facteurs de croissance angiogéniques, comme FGF-1, FGF
2, VEGF, HIV1-tat, HIV2-tat, HB-EGF, Angiogenin, HARP et
MK, et ont permis aux inventeurs d'identifier des
séquences peptidiques qui se retrouvent dans plusieurs
de ces facteurs. A partir de celles-ci, les inventeurs
ont construit des molécules peptidiques riches en acide
aminés basiques lysine (K) et arginine (R).
Le tableau I ci-dessous rapporte des
portions de séquences riches en acides aminés basiques
de plusieurs facteurs de croissance où les positions des
acides aminés basiques sont sensiblement alignées.
Tableau I
Facteur de croissance S ence
HARP (1-14) GKKEKPEKKVKKSD
HIV-2-tat (70-92) K-GLGICYERKGRRRRTPKKTK-TH
HB-EGF (85-114) ATPNKEEHGKRKKKGKGLGKKRDPCLRKYK
HARP (108-132) KLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKML
FGF-2 (116-141) RSRKYTSWYVALKRTG YKLGSKTGPG P
HGF (25-50) IAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTT
VEGF (145-170) RGKGKGPKRKRKKSRYKSWSVPCGP
HIV1-tat (41-65) KGLGISYGRKKRRQRRRPPQGN AH
MK (106-122) PKTKAKAKAKKGKG-KD
MK (1-11) KKKDKVKKGGP
An io mine (24-50) RYCESIMRRRGLTSPCKDINTFIN
FGF-1 (15-42) KFNLPPGNYKKPKLLYCSNGGHFLRILP
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 4 PCT/FR00/02786
FGF-1 (115-140) KKHAEKNWFVGLKKNGSCKRGPRTHYGOK
L'invention a donc pour objet un peptide
répondant à la formule (I) suivante .
(A) n - A1 - A1 - A2 - A1 - A3 - A4 - A1 - (A) m
. Dans laquelle .
. A est un acide aminé quelconque,
. n et m sont chacun des nombres entier de 0
à 20 dont la somme n + m est comprise entre 0 et 20, de
préférence entre 0 et 15 et tout préférentiellement
entre 0 et 10,
A1 est un acide aminé basique et plus
particulièrement la lysine (Lys) ou l'arginine (Arg),
. A2 est un acide aminé choisi parmi . les
acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la
glycine (Gly), l'acide aspartique (Asp),
. A3 est un acide aminé choisi parmi . les
acides aminés basiques, la proline (Pro), l'acide
glutamique (Glu), la glutamine (Gln),
. A4 est un acide aminé choisi parmi . les
_ acides aminés basiques, l'acide glutamique (Glu), la
glycine (Gly), la sérine (Ser), la valine (Val).
Les peptides de formule (I) selon
l'invention seront aussi désignés "pAHA" pour "peptide
angiogénique de HARP".
L'invention envisage plus particulièrement,
les peptides de formules suivantes .
(II) (A)n - Lys - Lys - Glu - Lys - Pro - Glu - Lys -
(A)m
(III) (A)n - Arg - Lys - Gly - Arg - Arg - Arg - Arg -
3 0 (A) m
(IV) (A)n - LyS - Arg - LyS - LyS - LyS - Gly - LyS -
(A)m
(V) (A)n - LyS - LyS - Lys - Lys - Glu - Gly - LyS -
(A)m
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 5 PCT/FR00/02786
(VI) (A)n - Arg - Lys - Arg - Lys - Lys - Ser - Arg -
(A)m
(VII) (A)n - Lys - Lys - Arg - Arg - Gln - Arg - Arg -
(A)m
(VIII) (A)n - LyS - LyS - ASp - LyS - Val - LyS - LyS -
(A)m
dans lesquelles A, n et m ont la même
signification que dans la formule (I).
Le peptide de formule (II) a été défini plus
particulièrement à partir de la séquence de HARP (1-14).
Le peptide de formule (III) a été défini
plus particulièrement à partir de la séquence de HIV tat
(70-92) .
Le peptide de formule (IV) a été défini plus
particulièrement à partir de la séquence de HB-EGF (85
114 ) .
Le peptide de formule (V) a été défini plus
particulièrement à partir de la séquence de HARP (108-
132 ) .
Le peptide de formule (VI) a été défini plus
particulièrement à partir de la séquence de VEGF (145-
170) .
Le peptide de formule (VII) a été défini
plus particulièrement à partir de la séquence de HIV tat
(41-65).
Le peptide de formule (VIII) a été défini
plus particulièrement à partir de la séquence de MK (1-
11) .
Les peptides de l'invention peuvent être
préparés par synthèse chimique ou par des techniques
d'expression génétique à partir de la séquence
polynucléotidique correspondante par des techniques
connues de l'homme du métier.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 6 PCT/FR00/02786
Les inventeurs ont mis en évidence que les
peptides pAHA présentent des propriétés angiogéniques et
cicatrisantes comme HARP et à des doses comparables
(ED50# 5-50 ng/ml). Ils ont en effet observé l'activité
remarquable de ces peptides sur l'ischémie vasculaire
(angiogénèse) et la régénération musculaire et la
cicatrisation. Ils ont aussi montré que les peptides de
l'invention sont capables de stimuler l'expression des
cytokines de l'inflammation et sont donc utiles pour
prévenir ou traiter les maladies liées à
l'immunodépression, et tout particulièrement le sida.
L'invention se rapporte donc également à une
composition pharmaceutique contenant un ou plusieurs des
peptides précédents, associés dans ladite composition
avec un ou plusieurs véhicules pharmaceutiquement
acceptables.
Compte tenu des propriétés des peptides
décrits ci-dessus sur la régénération tissulaire,
l'invention concerne tout particulièrement une
composition comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et
éventuellement un autre composé, utile pour favoriser la
régénération et la croissance cellulaire, comme la
croissance musculaire, et donc dans la cicatrisation.
Du fait des propriétés des peptides décrits
ci-dessus sur l'angiogénèse, l'invention concerne tout
particulièrement une composition comprenant un ou
plusieurs peptides pAHA, et éventuellement un autre
composé, utile pour prévenir ou traiter l'ischémie
vasculaire.
Comme indiqué précédemment, les travaux de
recherche effectués dans le cadre de l'invention, ont
permis de mettre en évidence des propriétés inattendues
des pAHA sur la prolifération des cellules circulantes
du sang, et tout particulièrement des cellules
mononucléées du sang périphérique. Une étude détaillée
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 PCT/FR00/02786
7
de cette propriété a permis de montrer les propriétés
stimulatrices de pAHA sur certaines cytokines, tout
particulièrement les cytokines de l'inflammation.
Il a en effet été observé la présence d'ARNm
de la protéine HARP dans les cellules des vaisseaux
sanguins, à la fois des cellules endothéliales et des
cellules des muscles lisses, ainsi que dans les glandes
mammaires humaines ( 16 ) . En outre, il a été rapporté que
HARP est un facteur de croissance angiogénique (12) et
qu'il est synthétisé et localisé dans les cellules
endothéliales vasculaires (16).
Les inventeurs ont donc évalué l'activité in
vitro de ce facteur de croissance sur des PBMCs
(cellules mononucléées humaines du sang périphérique)
fraîchement isolées en incubant des PBMCs avec le
facteur HARP ou avec un peptide pAHA. Les résultats
obtenus montrent que HARP et pAHA sont capables de
stimuler l'incorporation de thymidine tritiée dans le
noyau des PBMCs. Ces résultats démontrent donc que la
molécule HARP ainsi que le peptide pAHA stimulent
fortement la prolifération des cellules mononucléées
humaines du sang périphérique, et plus particulièrement
après une semaine on observe une augmentation de la
population des lymphocytes T.
Les différentes expériences menées par les
inventeurs ont montré que HARP est actif sur la
prolifération des lymphocytes à des concentrations très
faibles, de l'ordre de 10 pM. Ce résultat étonnant a
conduit les inventeurs à considérer que le facteur HARP
doit se fixer à son récepteur sur les PBMCs avec une
forte affinité.
Après incubation des PBMCs avec le facteur
HARP, aucune augmentation du taux d'IL2 n'a été
observée. Les inventeurs ont donc conclu que HARP n'agit
pas sur la production des interleukines IL2, mais que
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 8 PCT/FR00/02786
HARP, et pAHA, se fixent avec une forte affinité à un
récepteur spécifique présent sur les lymphocytes, et
induisent l'activation des sites des interleukines, tout
particulièrement des sites de IL2.
A ce jour, les récepteurs de HARP sont très
peu connus. La présence de site de liaison de forte
affinité (Kd = 600pM) avec HARP dans les cellules NIH
3T3 a déjà été rapporté (20). Ces sites de liaison de
HARP ont aussi été retrouvés dans plusieurs types
cellulaires, incluant les cellules de rein de rats,
cellules de l'adénocarcinome mammaire d'homme, cellules
du carcinome épidermique d'homme, cellules de
l'hépatocarcinome humain, neuroblastes de souris, et
cellules du phéochromocytome.
I1 est communément admis qu'aucune réponse
biologique transmise par HARP n'a été observée sur ce
type de cellules, et par conséquent que ces sites de
fixation ne peuvent pas être considérés comme des
récepteurs fonctionnels. Des études parallèles décrivent
les interactions entre HARP et les protéoglycane sulfate
heparan, comme syndecan-1 et syndecan-3. Il a été montré
que Syndecan-3 interagit avec HARP avec un Kd apparent
de 800pM. Ce protéoglycane sulfate heparan est impliqué
dans l'activité d'excroissance neuritique de HARP
puisque les anticorps anti-syndecan-3 peuvent bloquer
cette activité (21).
Plus récemment, un rapport de Maeda et al.
décrit la fixation de HARP avec des sites de fixation de
faible (Kd=3nM) et de forte (Kd=250pM) affinité au
phospacan, un variant extracellulaire d'un récepteur
similaire une protéine tyrosine phosphatase (3, RPTP (3
(22) .
De façon intéressante, bien que MK (Midkine)
et HARP appartiennent à la même famille de molécules, et
que les deux induisent une excroissance neuritique (17,
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 9 PCT/FR00/02786
23), aucune induction d'incorporation de thymidine
tritiée chez les PBMCs n'a été détectée en utilisant MK,
suggérant que MK et HARP se fixent sur des récepteurs de
surface différents, ce qui a d'ailleurs été récemment
~ démontré (24, 25). De plus, les deux molécules sont
exprimées et isolées en utilisant des méthodes
expérimentales analogues, incluant le même système
recombinant d'expression et les mêmes techniques de
purification. Le fait que l'incorporation de thymidine
tritiée s'observe uniquement avec HARP, et non avec MK
exclut la présence d'un contaminant bactérien présentant
une activité mitogène vis à vis des PBMCs.
Selon les donneurs de PBMCs, des indices
différents de stimulation ont été observés. L'effet
mitogénique induit par HARP le plus signifiant est mieux
observé en utilisant des cellules quiescentes, sans
activation des PBMCs par des lectines, comme PHA
préconisé pour l'activité mitogénique induite par IL2.
Ce résultat confirme bien le fait que HARP n'induit pas
~ une stimulation de la production d'IL2.
Les résultats obtenus montrent donc que le
peptide pAHA agit sur la prolifération de cellules
immunitaires, et plus spécifiquement sur les lymphocytes
T. En conséquence, l'invention se rapporte plus
particulièrement à une composition pharmaceutique
comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et
éventuellement un autre composé, utile pour stimuler la
prolifération des cellules mononucléées du sang, et tout
particulièrement des lymphocytes T. La stimulation de la
prolifération des cellules lymphocytaires T est tout
particulièrement utile dans le traitement des malades
immuno-supprimés.
Une autre observation a été faite sur des
cellules provenant de sang de patients atteints de sida.
- Dans l'exemple 4 ci-après, les inventeurs montrent
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 10 PCT/FR00/02786
comment la stimulation des cellules du sang du malade
par les peptides de l'invention permet d'amplifier in
vitro la réplication du virus HIV et ainsi de favoriser
sa détection et donc son typage. Des compositions
comprenant des peptides de l'invention sont donc aussi
utiles pour le diagnostic d'une infection par les virus
HIV.
En matière de traitement d'une infection par
les virus HIV, l'efficacité des agents anti-viraux sera
- renforcée en les administrant préalablement ou
simultanément avec un ou plusieurs peptides de
l'invention. En effet, les peptides de l'invention vont
favoriser la réplication et la libération des virus HIV
in vivo, notamment des virus HIV résiduéls, qui restent
présents dans l'organisme après un traitement anti-
viral. L'administration des peptides selon l'invention,
en activant ces virus, les rendrait ainsi plus
accessibles aux agents antiviraux, et plus aisément
destructibles.
Il est par ailleurs connu que, outre IL2,
les cytokines de manière générale jouent un rôle sur la
prolifération cellulaire, plus particulièrement des
cellules du sang. Les inventeurs ont donc cherché à
mettre en évidence le rôle de HARP et de pAHA sur
_ l'expression des cytokines. I1 a ainsi été mis en
évidence des propriétés inductrices de l'expression des
cytokines de l'inflammation. Par cytokines de
l'inflammation il faut . entendre préférentiellement
TNFalpha, IL1, IL6, et INFgamma.
Les inventeurs ont donc testé l'induction de
l'expression de trois cytokines de l'inflammation
(TNFalpha, IL1 et IL6) par les cellules PBMCs traitées
par HARP, et l'induction de l'expression d'IL6 par deux
peptides pAHA conformes à la présente invention dont les
séquences sont rapportées dans l'exemple 5 ci-après. Les
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 11 PCT/FR00/02786
résultats obtenus avec la molécule HARP indiquent que
HARP est capable d'induire d'une façon dose dépendante
l'expression des cytokines TNFalpha, IL1 et IL6.
Les résultats obtenus avec les deux peptides
pAHA montrent qu'ils sont capables de stimuler
l'expression d'IL6. Une augmentation de l'expression de
ces cytokines est également détectée après adjonction
aux cellules d'autres peptides conformes à la présente
invention, issus de l'angiogenine et de la protéine tat
(voir tableau I). Aucune expression de ces cytokines
inflammatoires n'est détectée lorsque la molécule HARP
est dénaturée.
Ces résultats montrent que HARP et pAHA ont
in vitro et in vivo la capacité de stimuler plus de 100
fois la production de cytokines de l'inflammation. En
conséquence, l'invention se rapporte tout
particulièrement à une composition pharmaceutique
comprenant un ou plusieurs peptides pAHA, et
éventuellement un autre composé, utile pour stimuler la
production des cytokines de l'inflammation. Une telle
composition selon l'invention est donc particulièrement
indiquée dans la prévention ou le traitement des
maladies liées à l'immunodépression.
Ces travaux ont montré que les tissus
traités par HARP ou pAHA présentent un nombre de
cellules mononucléées très important favorisant ainsi la
régénération musculaire. Ces résultats combinés à ceux
décrits précédemment concernant l'effet des peptides
pAHA sur la régénération cellulaire et tissulaire,
démontrent l'effet de HARP et de pAHA sur le
régénération tissulaire, et plus particulièrement des
tissus musculaires.
Ces résultats permettent en outre d'utiliser
les peptides de l'invention ou une composition les
contenant pour favoriser la croissance et la
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 12 PCT/FR00/02786
différentiation de cellules en culture, notamment de
cellules lymphoïdes, comme des cellules endothéliales et
des lymphocytes. T. En effet, la culture de ces cellules
est souvent pratiquée dans le cadre de tests de
diagnostic.
Comme indiqué précédemment les peptides de
l'invention peuvent être produit par expression
génétique d'une séquence polynucléotidique codant
lesdits peptides. L'invention a donc aussi pour objet
une molécule d'acide nucléique constituée par ou
comprenant au moins une séquence polynucléotidique
codant pour un peptide défini précédemment. De telles
molécules d'acide nucléique sont plus particulièrement
des vecteurs, comme des plasmides qui peuvent être
utilisés pour transformer des cellules hôtes in vitro ou
in vivo. On entend par cellules hôtes par exemples des
bactéries permettant la production des peptides de
l'invention. On entend aussi des cellules de mammifère
tout particulièrement humaine, utiles pour des méthodes
de thérapies cellulaires ou géniques des pathologies
décrites précédemment pour lesquelles les peptides de
l'invention sont utiles. L'invention a donc encore pour
objet des compositions comprenant comme principe actif
au moins une molécule d'acide nucléique ou des cellules
définies ci-dessus.
D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront dans la description qui suit
concernant des exemples se référant aux dessins en
annexe dans lesquels .
La figure 1 montre la stimulation de
l'incorporation de thymidine tritiée dans les PBMCs
stimulées ou non par HAR.P. Barre blanche; cellules non
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 13 PCT/FR00/02786
stimulées ; barre hachurée . cellules stimulées par
100 ng/ml d'HARP.
La figure 2 représente l'effet dose réponse
de HARP testé sur les PBMCs. A) Les cellules sont
cultivées en absence ou en présence de différentes
concentrations allant de 0,1 à 100 ng/ml d'HARP (~-~)
ou de Midkine (MK) (O-O). Chacune des valeurs
représente la moyenne des cpm obtenus ~ la déviation
standard. B) Les cellules sont incubées avec la toxine
tétanique (TT) à 1800 UI/ml, la phytohémagglutinine
(PHA) à 2,5 ug/ml, l'interleukine-2 (IL2) à 50 UI/ml, ou
non traitées (NT) comme contrôles internes de
stimulation.
La figure 3 représente l'effet dose réponse
de HARP sur des PBMCs traitées par un anti CD3. Les
cellules sont cultivées comme il a été décrit
précédemment. I1 est à noter que si l'on traite les
cellules avec 100 ng/ml de HARP en présence de CD3 une
forte mortalité cellulaire est alors observée. Barre
noire; HARP seul, barre blanche; HARP + anti CD3.
La figure 4 représente l'effet dose réponse
de HARP sur des PBMCs traités par la toxine tétanique.
Les cellules sont cultivées comme il a été décrit
précédemment. I1 est à noter que si l'on traite les
cellules avec 100 ng/ml de HARP en présence de toxine
tétanique (800 UI/ml) une forte mortalité cellulaire est
alors observée. Barre hachurée . HARP seul; barre
blanche . HARP + toxine tétanique.
La figure 5 représente l'effet de la
protéine HARP sur la réplication du virus HIV par mesure
de l'immuno-réactivité p24. Des PBMCs issues d'un
patient infecté par HIV sont incubées suivant le
protocole décrit dans le ~1 pendant 3 jours avec des
concentrations variables de HARP (0,1-100 ng/ml). La
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 14 PCT/FR00/02786
réplication virale est estimée par mesure de
l'immunoréactivité associée à la protéine p24 présente
dans le milieu de culture. (*) faible mortalité
cellulaire; (**) forte mortalité cellulaire. La
production du virus est évaluée par le test "Abott HIV
Ag monoclonal" qui est un dosage immunoenzymatique sur
phase solide de type sandwich. Les virus présents dans
l'échantillon à tester sont lysés par du Triton X100
puis le lysat est incubé avec des billes en polystyrène
recouvertes d'anticorps monoclonal anti-p24. Après
incubation, les billes sont lavées, et la présence
d'immunoglobulines spécifiques est révélée par
incubation avec un deuxième anticorps anti-Ig de souris
couplé à la peroxydase. La révélation est faite en
rajoutant un substrat de la peroxydase; l'ortho-
phénylénediamine
La figure 6 représente l'activation des
cellules mononucléées du sang périphérique par les
peptides HARP. Les PBMCs sont cultivés pendant 7 jours
dans du milieu de culture RPMI contenant 10~ de sérum de
veau foetal en l'absence ou en présence de 1 ng/ml de la
protéine HARP ou de 1 ug/ml des peptides 1 ou 2.
L'incorporation de thymidine tritiée est déterminée
comme décrit précédemment .
La figure 7 représente l'étude de l'effet de
HARP sur l'expression d'IL1 après 3 jours (barres
blanches) ou 7 jours de culture (barres noires). Le
dosage de ces cytokines est réalisé à l'aide d'un test
ELISA commercialisé par R&D.
La figure 8 représente l'effet de HARP sur
l'expression de TNFOC après 3 jours (barres blanches) ou
_ 7 jours de culture (barres noires). Le dosage de ces
cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA
commercialisé par R&D.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 15 PCT/FR00/02786
La figure 9 représente l'effet de HARP sur
l'expression d'IL6 après 3 jours (barres blanches) ou 7
jours de culture (barres noires). Le dosage de ces
cytokines est réalisé à l'aide d'un test ELISA
commercialisé par R&D.
La figure 10 représente l'expression de IL6
par les peptide 1 et 2 correspondant aux parties NHZ et
COOH du polypeptide HARP. Le dosage de ces cytokines est
réalisé à l'aide d'un test ELISA commercialisé par R&D
après 7 jours d'incubation.
La figure 11 représente l'effet des peptides
HARP sur la régénération musculaire. Le muscle soléaire
de rat adulte est écrasé, traité ou non par les peptides
puis prélevé après 4 jours de régénération .
1 . traité par du PBS (50 ~,1)
2 . traité par le peptide 1 (50 ~,1, 1 ~.i.g)
3 . traité par le peptide 2 (50 ~Ll, 1 ~.g)
La figure 12 illustre l'effet angiogénique
du peptide 1 testé dans la CAM.
A . traitement avec le peptide 1
B . témoin traité avec du PBS
La figure 13 est une représentation
schématique du plasmide utilisé pour produire le peptide
correspondant à la partie N terminale (résidus 1 à 14)
de HARP.
Exemple 1 Effet de la protéine HARP sur la
prolifération des cellules mononucléées humaines issues
de sana périphérique.
Les cellules mononucléées humaines provenant
de différents donneurs sains, sont isolées à partir du
sang périphérique après centrifugation sur coussin de
Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech) comme il est décrit
par le fabriquant. Les cellules sont lavées, puis
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 16 PCT/FR00/02786
cultivées dans du milieu RPMI 1640 supplémenté par 10%
de sérum de veau fatal inactivé par la chaleur (56°C, 30
min), 100 unités/ml de pénicilline et 100 ug/ml de
streptomycine. Les cellules, ensemencées à 106 cellules
par ml dans une boîte de culture à 96 puits à fond rond
(Costar), sont cultivées pendant 7 jours en présence ou
non de la protéine HARP recombinante humaine produite
chez Coli, à la concentration de 100 ng/ml. Dans les
dernières 18 heures de culture, 1 ~Ci de thymidine
tritiée est ajouté dans chacun des puits. La
radioactivité incorporée dans les noyaux des cellules
est ensuite mesurée à l'aide d'un compteur à
scintillation. Les résultats obtenus sont représentés
sur la figure 1.
L'analyse de ces résultats nous indique que
le polypeptide HARP est capable de stimuler
l'incorporation de thymidine tritiée dans le noyau des
PBMCs. Suivant les donneurs, il est à noter que l'index
de stimulation, défini comme le rapport de la
radioactivité incorporée dans les cellules traitées par
HARP sur celui des cellules témoins, non traités par
HARP, varie de 2,3 à 51,7 fois (cf résultats de
l'expérience N°4 et N°7). Cette diversité de réponse
peut suggérer qu'il existe une relation entre la réponse
des cellules à HARP et l'état d'activation du système
immunitaire de l'individu testé. L'histogramme présenté
en insert dans la figure 1 montre que le traitement par
100 ng/ml de HARP induit un accroissement du nombre de
cellules de 2,9 fois par rapport au témoin non traité,
démontrant que l'incorporation de thymidine observée est
bien proportionnelle au nombre de cellules. Ce comptage
cellulaire a été effectué avec les cellules utilisées
pour l'incorporation de thymidine tritiée de
l'expérience N° 7.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 1,~ PCT/FR00/02786
La courbe dose réponse de la protéine HAR.P
(0,1 à 500 ng/ml) testée sur les PBMCs est présentée sur
la figure 2A.
L'analyse de cette courbe nous indique qu'un
' effet maximal est obtenu pour une concentration de HARP
de 1 ng/ml de milieu de culture induisant une
stimulation de l'incorporation de DNA de 4,5 à 7,5 fois
par rapport à une culture témoin réalisée sans
adjonction de HARP. I1 est à noter que l'on peut
observer une décroissance de la radioactivité incorporée
pour des doses plus élevées de HARP allant de 1 à 500
ng/ml. Aucune stimulation n'est observée en utilisant la
protéine Midkine (MK), protéine présentant 50%
d'homologie en acides aminés avec HARP, testée dans une
gamme de concentration allant de 0,1 à 500 ng/ml. Les
contrôles positifs de stimulation ont été réalisés en
utilisant de la phytohemagglutinine (PHA) 2,5 ug/ml et
la toxine tétanique (TT) 1800 UI/ml (fig. 2B). Aucune
stimulation n'est observée après addition d'IL2 montrant
~ une absence d'activation des cellules utilisées pour ces
tests.
Exemple 2 Rôle de la protéine HARP comme
co-stimulateur de la réponse immunitaire spécifique.
L'activation des lymphocytes T peut être
obtenue via l'activateur du récepteur à l'antigène (TCR)
associé au système majeur d'histocompatibilité (CMH).
Cette activation nécessite outre la reconnaissance
spécifique TCR-CMH/antigène, l'action de molécules
d'adhésion jouant un rôle de coactivation et
d'amplification de la réponse. Suivant ces données, nous
avons étudié si HARP pouvait amplifier la prolifération
cellulaire soit par stimulation du récepteur aux
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 18 PCT/FR00/02786
lymphocytes T à l'aide d'un anti CD3 ou par un antigène
mémoire, la toxine tétanique.
a) Effet de la protéine HARP sur la
stimulation induite par le récepteur des lymphocytes T.
L'activation du récepteur des lymphocytes T
est obtenue en traitant des lymphocytes par un anticorps
monoclonal anti CD3 (1/100, Immunotech) . L'effet de HARP
sur la prolifération cellulaire des PBMCs, est testé en
ajoutant une concentration optimale de HARP (1 ng/ml, cf
exemple 1) en présence ou non d'ami CD3. Les cultures
ainsi que la quantification de la thymidine tritiée
incorporée sont réalisées comme il est décrit dans
l'exemple 1. Les résultats obtenus, sont présentés dans
la fig. 3.
En absence de HARP, l'anticorps anti CD3
(1/100) stimule, après 7 jours d'incubation avec les
cellules, l'incorporation de thymidine tritié de 25 fois
(témoin; 600 ~ 60 cpm, anti CD3; 15000 ~ 200 cpm). A la
dose de 1 ng/ml de HARP et en absence d'ami CD3 on
observe pour ce donneur une amplification de 5,8 fois
par rapport au témoin (témoin; 600 ~ 60 cpm, HARP; 3500
~ 200 cpm) . A cette même dose de HARP, une amplification
de 33 fois dans la réponse est observée lorsque l'on
réalise une costimulation des cellules par HARP/anti CD3
(témoin; 600 ~ 60 cpm, HARP/anti CD3; 20000 ~ 200 cpm) .
Ce résultat nous indique que la protéine HARP exerce une
activité de costimulation additive des lymphocytes dont
le TCR est activé. A des concentrations plus élevées de
HARP (10 et 100 ng/ml) et en présence d'ami CD3, une
incorporation de thymidine plus faible et très faible
est observée.
Nous avons observé dans ces cultures une
forte mortalité cellulaire qui n'est pas observée quand
HARP est utilisé seul à ces mêmes doses. Ces résultats
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 19 PCT/FR00/02786
montrent que HARP a un effet costimulateur dose
dépendant de la réponse immunitaire associée aux
lymphocytes T.
b) Effet de la protéine HARP sur la
stimulation induite par un antigrène mémoire.
Des cellules PBMCs cultivées dans les
conditions décrites dans le ~1, sont stimulées par la
toxine tétanique (1800 UI/ml, Mérieux) seule ou en
association avec la protéine HARP utilisée à une
concentration allant de 0,1 à 100 ng/ml. La toxine
tétanique va spécifiquement amplifier une sous
populâtion de lymphocytes T mémoires.
L'adjonction de la toxine tétanique à des
PBMCs, stimule, après 7 jours d'incubation,
_ l'incorporation de thymidine tritiée de 71 fois (témoin;
600 ~ 60 cpm, toxine tétanique; 43000 ~ 500 cpm) alors
qu'une stimulation de 5,8 fois par rapport au témoin non
stimulé est observée lorsque les cellules sont incubées
avec HARP à 1 ng/ml (témoin; 600 ~ 60 cpm, HARP; 3500 ~
200 cpm). Une stimulation de l'incorporation de
thymidine tritiée de 108 fois par rapport au témoin est
observée lorsque les cellules sont costimulées par HARP
à la dose de 1 ng/ml et la toxine tétanique (témoin;
600~ 60 cpm, HARP/toxine tétanique; 65000~ 700 cpm). Les
résultats présentés sur la figure 2 nous montrent une
synergie d'action sur la stimulation des PBMCs entre un
antigène mémoire et HARP.
Exemple 3 Détermination de la population
cellulaire amplifiée après traitement par HARP dans une
culture de PBMCs.
Les cellules ont été isolées du sang
périphérique de sujets normaux, donneurs de sang,
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 0 PCT/FR00/02786
prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les
cellules mononucléées ont été séparées par gradient de
ficoll, comptées et ajustées à 106 cellules par ml. Les
cellules sont incubées pendant 5 jours à 37°C en
atmosphère humide avec 5% de C02 en présence de HARP ou
d'autres peptides à des concentrations qui sont
mentionnées dans chacun des exemples décrits.
Le tableau II présente les effets de la
molécule HARP testée à une concentration de 1 ug/ml sur
la prolifération de cellules lymphoïdes.
Tableau II
Antico s Tmoin HARP Variation
CCD19 2 4 -
CCD2 92 95 -
CCD4 47 68 +45
CCD8 33 22 -
CCD16/56 17 18 -
CCD25 12 47 -
CCD45RA 58 34 -
CCD45R0 30 64 +113
RA/RO 1.9 0.5 -
CCD4+CD45RA+ 22 15 -31
CCD4+CD45R0+ 21 49 +133
RA/RO 1 0.3 -
L'analyse des résultats présentés dans ce
test nous indique qu'après traitement d'une culture de
PBMCs par HAR.P, on retrouve un fort enrichissement soit
45% de la population lymphocytaire CD4+. Une forte
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 21 PCT/FR00/02786
augmentation CD45R0 est également observée (+113%)
correspondant à une augmentation des CD4 à mémoire
CD4+/CD45R0+ (+133%). Ces résultats nous indiquent que
l'on observe une amplification de lymphocytes CD4+
exprimant le CD45R0 caractéristique des lymphocytes T
mémoire. Cet exemple illustre le rôle adjuvant de HARP
dans la réponse immunitaire notamment par amplification
et coactivation de la sous population lymphocytaire
CD45R0.
Exemple 4 Action de la molécule HARP sur
des cellules mononucléées issues du sana périphériaue
provenant d'individus infectés par le VIH.
L'activation des lymphocytes T et des
monocytes par les cytokines induit une production et/ou
une activation des facteurs nucléaires de la cellule
hôte capables de réactiver la transcription virale.
Cette réactivation virale induite par IL1 et le TNFOc
dépend en partie de l'activation du facteur NF-tcb. Au
cours de l'infection par le VIH, la sécrétion par les
monocytes circulants de cytokines IL1, IL6 et en
particulier TNFa qui sont capables d'induire ou
d'augmenter la réplication du VIH dans les lymphocytes
T/monocytes suggère que ces cytokines peuvent augmenter
la progression de la maladie. Les résultats de la figure
5, indiquent que les PBMCs provenant d'un malade sidéen
(CD4 < 200/mm3) activés uniquement par la protéine HARP,
sont capables de produire du virus VIH mesuré par la
production de l'antigène viral p24. Cette production est
maximale pour une concentration de HARP de 1 ng/ml. Pour
une concentration de 100 ng/ml on observe une mort
cellulaire importante. On peut donc par cet exemple,
proposer d'une part que HARP peut permettre d'amplifier
in vitro l'expression de la P24 et être utilisée pour le
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 22 PCT/FR00/02786
typage des souches virales HIV, et d'autre part in vivo
comme 1) inducteur de la réplication du virus,
facilitant ainsi l'action d'agents antiviraux sur des
- lymphocytes infectés quiescents ou 2) à des doses
importantes (correspondantes aux effets observés in
vitro à 100 ng/ml, induire la mort des cellules T
chroniquement activées (voir les exemples précédents
illustrés par les fig. 3 et 4)
Exemple 5 Activation des lymphocytes par
des peptides HARP.
Suivant le protocole décrit à l'exemple 1,
les inventeurs ont testé la capacité de deux peptides
dont les séquences correspondent à la partie NHz
terminale et COOH terminale de HARP à induire une
multiplication cellulaire de PBMCs. Les séquences de ces
peptides sont les suivantes .
Peptide 1 . NHZ-AEAGKKEKPEKKVKKSDCGEW-COOH;
21 acides aminés.
Peptide 2 . NHz-AESKKKKKEGKKQEKMLD-COOH; 18
acides aminés.
Les résultats sont présentés dans la figure
6 et montrent que comparativement à la protéine HARP, le
peptide 2 est capable d'induire une réponse d'activation
des PBMCs meilleure que HARP, près de deux fois
supérieure. Pour des concentrations comparables, le
peptide 1 a un effet plus faible, près de moitié moins
que HARP, mais nettement supérieur au contrôle (plus de
deux fois).
Exemple 6 Induction de l'expression de
TNFOC, IL6 et IL1 par des cellules PBMCs traitées par
HARP.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 PCT/FR00/02786
23
Les cellules ont été isolées du sang
périphérique de sujets normaux, donneurs de sang,
prélevé sur tube Vacutainer contenant de l'EDTA. Les
cellules mononucléées ont été séparées par gradient de
ficoll, comptées et ajustées à 106 cellules par ml. Les
cellules sont incubées pendant 3 ou 7 jours à 37°C en
atmosphère humide avec 5% de C02 en présence de
concentration variable HARP allant de 1 à 1000 ng/ml ou
de différents peptides qui sont mentionnés dans les
légendes des figures.
Les résultats sont représentés sur les
figures 7, 8 et 9. L'analyse de ces résultats nous
indique que la molécule HARP est capable d'induire d'une
façon dose dépendante l'expression des cytokines IL1(3
(fig.7) , TNFOC (fig.8) et IL6 (fig.9) .
Cet exemple montre que les peptides 1 et 2
dont la structure est donnée dans l'exemple 5 sont
capables de stimuler l'expression d'IL6. Une
augmentation de l'expression de ces cytokines est
également détectée après adjonction aux cellules des
peptides tat ou d'autres molécules (angiogénine,
protéine tat; résultat non montré) présentant un domaine
protéique homologue. Aucune expression de ces cytokines
inflammatoires n' est détectée dans ce système lorsque la
molécule HARP est dénaturée ou lorsque les cellules sont
traitées avec du LPS.
Exemple 7 Effet des peptides HARP dans la
réaénération musculaire.
L'effet des peptides 1 et 2, dont la
structure est définie dans l'exemple 5, sur la
régénération musculaire a été testé suivant le protocole
énoncé ci-dessous et suivant la technique décrite dans
la publication de Bassaglia et colt (Bassaglia, Y., and
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 24 PCT/FR00/02786
Gautron, J. (1995) ; Fast and slow rat muscle degenerate
and regenerate differently after whole crush injury ; J.
Muscle Res. Cell Motil. 16, 420-429). Après une
anesthésie du rat (rat Wistar de 2 à 3 mois), le muscle
soléaire est, après dénervation, soumis à un écrasement
à l'aide d'une pince à bout plat. L'échantillon à tester
est alors inj ecté sous un volume de 50 ~..~,1 de PBS . Après
quatre jours de traitement, les animaux sont sacrifiés,
les muscles sont prélevés puis congelés dans l'azote
liquide. Des coupes de 8 ~tm sont réalisés au cryostat
puis colorées en utilisant le trichrome de Masson.
Les résultats sont présentés sur la figure
11. L'analyse de ces coupes indique que le muscle traité
par 1 ~Lg de peptide 1 présente un nombre de cellules
. mononucléées (fig. 11.2) beaucoup plus important que les
muscles traités par le peptide 2 (fig. 11.3) ou injecté
seulement par 50 E.L1 de PBS (fig. 11.1). Cette
observation indique que l'injection du peptide 1 dans un
muscle écrasé, induit après 4 jours de traitement une
augmentation du nombre de cellules mononucléées
présentes dans les tubes endomysiaux favorisant la
régénération tissulaire.
Exemt~le 8 Effet des peptides IiARP sur
l'anaioaénèse.
Le "Chicken allantoic membrane test" (CAM
test) a été utilisé dans cette étude pour évaluer in
vivo l'effet des peptides HARP 1 et 2 sur l'induction
d'une angiogénèse. La structure de ces peptides est
présentée dans l'exemple 5. La procédure expérimentale
est la suivante .
Des veufs de poulet fécondés sont incubés à
37°C pendant 3 jours. Après cette période d'incubation,
deux orifices sont pratiqués dans la coquille et 3 à 4
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 25 PCT/FR00/02786
ml d'albumine sont aspirés à la seringue. Les
échantillons à tester sont déposés sur des disques de
méthyl cellulose de 3 mm de diamètre. Après séchage,
chaque disque est déposé au jour 4 dans l'orifice ainsi
pratiqué. Après une période allant de 9 à 13 jours,
l'observation est effectuée. Chaque point de dosage est
réalisé 10 fois et chaque dosage est répété 3 fois.
L'ensemble des ces résultats est présenté dans le
tableau 3 ci-dessous.
Tableau III
chantillon FGF-2 Tmoin HARP Peptide Peptide
(100 ng) (1, 5 1 2
~.,I,g) (1, 5 ~,l,g)(1, 5 ~.g)
Rponse ++++ + / ++ ++ - -
-
L'effet du peptide 1 sur l'induction d'une
angiogénèse dans la CAM est illustré dans l'exemple
suivant (fig. 12).
Exemple 9 Expression et dosage de
l'activité mitoaène du peptide correspondant à la partie
N terminale de la molécule HARP (résidu 1 à 14).
Le peptide N terminal (acides aminés 1-14)
de 1'HARP humain est obtenu par recombinaison dans un
système d'expression eucaryote.
Ce peptide est réalisé à partir du cDNA de
1'HARP humain sous cloné EcoRI dans le vecteur
d'expression eucaryote PcDNA-3 (InVitroGen) par création
d'un codon stop au niveau de l'acide aminé numéro 15
(kit mutagénèse dirigée, QuickChange, Stratagene US).
Une représentation schématique du plasmide
utilisée est donnée à la figure 13 en annexe.
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 6 PCT/FR00/02786
Après vérification de la mutation générée
par séquençage, des cellules eucaryotes (NIH 3T3) sont
transfectées avec cette construction (Fungene, Roche,
NJ USA). L'expression est suivie par Western blot à
partir des milieux de culture conditionnés par les
cellules transfectées en utilisant l'anticorps anti N
terminale de HARP (résidus 1-15, commercialisé par Santa
Cruz, Ca, USA). Les cellules sont cultivées pendant 72 h
en présence de butyrate puis le milieu conditionné est
récupéré. Après purification du peptide impliquant une
chromatographie cationique et une phase réverse (Waters,
Symmetry ~, C18, 5 um, 4,6 x 250 mm). L'élution de la
colonne est réalisée par un gradient linéaire
d'acétonitrile. La présence de peptide dans les
fractions éluées est suivie par mesure de la densité
optique à 220 nm. Le dosage de l'activité mitogène
induite par le peptide ainsi purifié est réalisé selon
le protocole suivant .
Les cellules utilisées sont des cellules
HUVEC (Clonetics) utilisées entre les passages 1 à 5.
Chacun des puits d'une boite de culture de 48 puits
(Costar) sont incubés pendant 1 nuit à 4°C avec une
solution d'HARP (100 ng/ml), de peptide HARP purifié
(100 ng/ml) ou seulement du tampon en contrôle négatif.
Aprés rinçage des puits par une solution de PBS, les
cellules sont ensemencées à raison de 2 x 104 cellules
par cm2 dans du milieu de culture DMEM contenant 2% de
serum de vaeu foetal. Chaque dosage est réalisé en
triplicate.
L'induction de la prolifération cellulaire
est estimée par comptage des cellules après 72 heures de
culture.
Les résultats sont présentés dans le tableau
IVci-dessous et indiquent que le peptide HARP
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 ~ PCT/FR00/02786
correspondant à la partie N terminale de HARP et produit
par génie génétique induit la prolifération cellulaire
des cellules endothéliales.
Tableau IV
Echantillon test Nombre de cellules
HAR.P 129000 26000
Contrle 30000 8100
Pe tide HARP 12000 14000
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 8 PCT/FR00/02786
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.
l.Bohlen P and Kovesdi I. 1991. HBNF and MK,
members of a novel Bene family of heparin-binding
proteins with potential roles in embryogenesis and brain
fonction. Prog. Growth Factor Res. 3: 143.
- 2. Laaroubi K, Vacherot F, Delbe J, Caruelle
D, Barritault D and Courty J. 1995. Biochemical and
mitogenic properties of the heparin-binding growth
factor HARP. Prog. Growth Factor Res. 6:25.
3. Rauvala H. 1989. An 18-kd heparin-binding
protein of developing brain that is distinct from
fibroblast growth factors. EMBO J. 8:2933.
4. Merenmies J and Rauvala H. 1990.
Molecular cloning of the 18-kDa growth associated
protein of developing brain. J. Biol. Chem. 265:16721
5. Hampton B S, Marshak D R and Burgess W H.
1992. Structural and functional characterization of
full-length heparin-binding growth associated molecule
Mol. Biol. Cell. 3:85.
6. Mimer P G, Li Y S, Hoffman R M, Kodner C
M, Siegel N R and Deuel T F. 1989. A novel 17 kD
heparin-binding growth factor (HBGF-8) in bovine uterus:
purification and N terminal amino acid sequence.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 165: 1096.
7. Neame P J, Young C N, Brock C W, Treep J
T, Ganey T M, Sasse J and Rosenberg L C. 1993.
Pleiotrophin is an abondant protein in dissociative
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 2 9 PCT/FR00/02786
extracts of bovine fetal epiphyseal cartilage and nasal
cartilage from newborns. J. Orthop. Res. 11 :479.
8. Gieffers C, Engelhardt W, Brenzel G,
Matsuishi T and Frey J. 1993. Receptor binding of
osteoblast-specific factor I (OSF-I/HB-GAM) to human
osteosarcoma cells promotes cell attachment. Eur. J.
Cell. Biol. 62:352.
9. Fang W, Hartmann N, Chow D T, Riegel A T
and Wellstein A. 1992. Pleiotrophin stimulates
fibroblasts and endothelial and epithelial cells and is
expressed in human cancer. J. Biol. Chem. 267:25889.
10. Szabat E and Rauvala H. 1996. Role of
HB-GAM (heparin-binding growth-associated molecule) in
proliferation arrest in cells of the developing rat limb
and its expression in the differentiating neuromuscular
system. Dev. Biol. 178:77
11. Wellstein A et al. 1992. A
heparin-binding growth factor secreted from breast
cancer cells homologous to a developmentally regulated
cytokine. J. Biol. Chem. 267:2582.
12. Laaroubi K, Delbe J, Vacherot F,
Desgranges P, Tardieu M, Jaye M, Barritault D and Courty
J. 1994. Mitogenic and in vitro angiogenic activity of
human recombinant heparin affin regulatory peptide.
Growth Factors 10:89.
13. Peng H B, Ali A A, Dai Z, Daggett D F,
Raulo E and Rauvala H. 1995. The yole of heparin-binding
growth-associated molecule (HB-GAM) in the postsynaptic
induction in cultured muscle cells. J. Neurosci. 15:3027
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 3 0 PCT/FR00/02786
14. Mitsiadis T A, Salmivirta M, Muramatsu
T, Muramatsu H, Rauvala H, Lehtonen E, Jalkanen M and
Thesleff I. 1995. Expression of the heparin-binding
cytokines, midkine (MK) and HB-GAM (pleiotrophin) is
associated with epithelial-mesenchymal interactions
during fetal development and organogenesis. Development
121:37.
15. Vandervinden J M, Mailleux P, Schiffmann
S N and Vanderhaeghen J J. 1992. mRNA in developing
Cellular distribution of the new growth factor
pleiotrophin (HB-GAM) and adult rat tissues. Anat.
Ernbryol. 186:387.
16. Ledoux D, Caruelle D, Sabourin C, Liu J,
Crepin M, Barritault D and Courty J. 1997. Cellular
distribution of the angiogenic factor heparin affin
regulatory peptide (HARP) mRNA and protein in the human
. mammary gland. J. Histochem. Cytochem. 45:1.
17. Seddon AP, Hulnes JD, Decker MM, Kovesdi
I, Fairhurst JL, Backer J, Dougher-Vermazen M and Bohlen
P. 1994. Refolding and characterization of human
recombinant heparin-binding neurite-promoting factor.
Protein expr. Purif. 5:14
18. Smith P et al. 1985. Measurement of
protein using bicichoninic acid. Anal. Biochem 150:543
19. Nvotny WF, Maffi T, Mehta RL and Milner
PG. 1993. Identification of novel heparin-releasable
proteins, as well as the cytokines midkine and
pleiotrophin, in human postheparin plasma. Arterioscler.
. Thromb. 13:1798
CA 02387604 2002-04-12
WO 01/27136 31 PCT/FR00/02786
20. Kuo MD, Huang SS and Huang JS. 1992.
Characterization of heparin-binding growth-associated
factor receptor on NIH 3T3 tells. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 182:188
21. Raulo E, Chernousov MA, Carey DJ, Nolo R
and Rauvala H. 1994. Isolation of a neuronal tell
surface receptor pf heparin binding growth-associated
~ molecule (HB-GAM). Identification as N-syndecan
(syndecan-3). J.Biol.Chem. 269:12999
22. Maeda N, Nishiwaki T, Shintani T,
Hamanaka H and Noda M. 1996. 6B4
proteoglycan/phosphacan, an extracellular variant of
receptor-like protein-tyrosine phosphatase
zeta/RPTPbeta, binds pleiotrophin/heparin-binding
growth-associated molecule (HB-GAM). J.Biol.Chem.
271:21446
23. Kretschmer PJ, Fairhurst JL, decker MM,
Chan CP, Gluzman Y, Bohlen P and Kovesdi I. 1991.
Cloning, characterization and developmental regulation
of two members of a novel human Bene family of neurite
outgrouwth-promoting proteins; Grouwth factors 5:99
24. Ratovitski E and burrow CR. 1997.
Midkine stimulates Wilms' tumor tell proliferation via
signaling receptor. Cell.Mol.Biol. 43:425
25. Ratovitski E, Kotzbauer T, Milbrandt J,
Lowenstein CJ and Burrow CR. 1998. Midkine induces tumor
tell proliferation and binds to a hight affinity
signaling receptor associated with JAK tyrosine kinases.
J.Biol.Chem. 273:3654
