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UTILISATION DES ACIDES QUINIQUE, SHIHIMIQUE ET DE LEURS
DÉRIVES POUR LA PRÉPARATION DE LIGANDS DU RÉCEPTEUR DU
MANNOSE
La présente Invention se rapporte à (utilisation des acides quinique,
shikimique et de leurs dérivés pour la préparation de ligands du récepteur du
mannose,
. aux ligands ainsi préparés, ainsi qu'aux applications thérapeutiques et
diagnostiques de
ces ligands.
Les cellules dendritiques, qui représentent une lignée particulière de
leucocytes originaires de la moelle osseuse et qui sont présentes dans
pratiquement
tous les tissus de l'organisme, jouent un rôle clé dans le contrôle des
réponses
immunitaires. En effet, ces cellules apparaissent être les seules cellules
capables in
vivo de présenter les antigènes aux lymphocytes T naïfs et matures, et
d'induire, par
activation de ces lymphocytes T, une réponse immunitaire de type T auxiliaire
(J. BLANCHEREAU et R.M. STEINMANN, Nature, 1998, 392, 245-252).
L'activation des lymphocytes T par les ~ cellules dendritiques
implique une reconnaissance et une internalisation préalables des antigènes
par ces
dernières. Or, il a été montré que finternalisation des antigènes par les
cellules
dendritiques s'effectue non seulement par macropinocytose, mais également par
un
mécanisme d'endocytose ayant pour médiateur, un récepteur spécifique des
hydrates
de carbone et dénommé récepteur du mannose (A. AVR.AMEAS et al., Eur. J.
Immunol., 1996, 26, 394-400).
Le récepteur du mannose appartient à la famille des C-lectines qui
représente un groupe de glycoprotéines calcium-dépendantes formant des
liaisons
non-covalentes avec les hydrates de carbone. Si, comme son nom (indique, le
récepteur du mannose se lie préférentiellement au D-mannose, il apparaît se
lier
également à d'autres hydrates de carbone comme le L-fucose, le D-glucose et la
N-acétyl-D-glucosamine qui, comme le D-mannose, comprennent deux fonctions
hydroxyles portées par deux atomes de carbone adjacents du cycle qui les
constitue. Il
semble que la liaison entre le récepteur du mannose et ces hydrates de carbone
s'établisse par la coordination d'un ion calcium entre des résidus acide aminé
du site
de reconnaissance de ce récepteur et les deux fonctions hydroxyles adjacentes
desdits
hydrates de carbone (W.I. WEIS et al., Nature, 1992, 360, 127-134).
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Par ailleurs, comme c'est le cas pour toutes les lectines, la
reconnaissance des hydrates de carbone par le récepteur du mannose, bien que
spécifique, est faible, de l'ordre de 10'~ à 10'3 M. La liaison simultanée de
plusieurs
molécules d'hydrates de carbone à plusieurs sites de reconnaissance du
récepteur du
mannose permet de compenser cette faible affinité. Ce phénomène est appelé «
effet
de groupe ».
Il a également été montré, non seulement que l'internalisation, par
les cellules dendritiques, d'antigènés mannosylés est notablement supérieure à
celle
d'antigènes non-mannosylés, mais qu'une culture de populations clonales de
lymphocytes T de spécificité restreinte à certains complexes peptide-HLA de
classe II,
réalisée en présence, d'une part, de cellules dendritiques et, d'autre part,
de protéines
ou de peptides mannosylés se traduit par une stimulation de ces lymphocytes de
200 à
10 000 fois plus élevée que celle obtenue lorsque ces mêmes protéines et
peptides ne
sont pas mannosylés (M.C.A.A. TAN et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27 2426-
2435).
Il est apparu, de ce fait, possible d'induire, de stimuler ou de
moduler une réponse immunitaire en favorisant l'internalisation d'un antigène
par les
cellules dendritiques via le récepteur du mannose, par le couplage de cet
antigène avec
une structure chimique porteuse de plusieurs molécules d'un hydrate de carbone
spécifiquement reconnu par ce récepteur (M.C.A.A. TAN et al., ibid).
Ceci présente un intérêt tout particulier en vaccinologie et
notamment pour le développement de vaccins à base de peptides synthétiques. En
effet, si ces derniers présentent (avantage d'être à la fois chimiquement
définis, de
composition précise, affranchis des difficultés de la production biologique,
purifiés et,
enfin, de distribution aisée en raison de leur stabilité, ils présentent
généralement
l'inconvénient majeur d'être faiblement immunogènes.
C'est ainsi que les Inventeurs ont proposé de modifier des antigènes
peptidiques en les greffant sur une structure dendrimérique comprenant un
coeur de
type arbre de L-lysine lié à plusieurs restes glycosyles et, notamment, à des
restes
D-mannose (C. GR.ANDJEAN et al., lleme Réunion Peptides et Protéines, 17-22
Janvier 1999, AUSSOIS, FRANCE).
Toutefois, il apparaît que, dans l'optique du développement à une
échelle industrielle d'un médicament et, notamment, d'un vaccin, (utilisation
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d'hydrates de carbone naturels comme le D-mannose ou le D-glucose, est
susceptible
de poser un certain nombre de difficultés, tant sur un plan technique que
financier, en
raison de ce que ces composés sont difficiles à lier à d'autres structures
chimiques et
sont instables dans de nombreux milieux réactionnels - en particulier, dans
les milieux
acides - et dans de nombreux milieux biologiques.
Le problème se pose, par conséquent, de disposer de composés
présentant, vis-à-vis du mannose récepteur, une affinité et une spécificité
telles qu'ils
puissent être reconnus par ce récepteur et se lier sélectivement avec lui,
tout en étant
dépourvus des inconvénients propres aux hydrates de carbone naturels.
Or, les Inventeurs, toujours dans le cadre de leurs recherches sur le
récepteur du mannose, ont constaté que, de manière surprenante, les acides
quinique,
shikimique et leurs dérivés qui représentent, de par leur nature
carbocyclique, des
composés chimiquement plus stables que les hydrates de carbone naturels, et
donc
plus faciles à utiliser dans des processus de synthèse, sont capables de mimer
le
D-mannose vis-à-vis de son récepteur, c'est-à-dire de se lier sélectivement à
ce
dernier, et par conséquent de remplacer avantageusement les hydrates de
carbone
naturels dans la préparation de ligands destinés à favoriser (internalisation
d'une
substance par des cellules exprimant ce récepteur ou un récepteur de la
famille des
C-lectines lui étant apparenté.
La présente Invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un
composé répondant à la formule générale (Ia) et/ou d'au moins un composé
répondant
à la formule générale (Ib)
O Rs O R5
O R4
6 2 2 6
5 3 3 5
Rt0 4 OR3 RIO 4 OR3
OR2 OR2
(Ia)
dans lesquelles
- Ri, Rz, R3 et R4 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome
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d'hydrogène ou un groupe protecteur,
- RS représente un groupe -OH, un groupe -SH, un groupe -NH-NH2, un atome
d'halogène, ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou
insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12
atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée
étant
éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène et portant
éventuellement
au moins un groupe nucléophile ou au moins un groupe électrophile,
en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille
des
C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou pour la préparation d'un tel
ligand.
Au sens de la présente Invention, on entend par groupe
« protecteur » un groupe protecteur d'une fonction hydroxyle ou d'un diol
(auquel cas
deux groupes choisis parmi Rl, R2, R3 et R4 peuvent être reliés de façon
covalente l'un
à l'autre pour former ensemble un cycle), tel que défini dans l'ouvrage
Protective
Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE et P.G.M. WUTS, Seconde Edition
1991, J. WILEY and Sons. A titre d'exemples et de façon non-limitative, on
peut citer
les groupes triméthylsilyle, triéthylsilyle, trüsopropylsilyle,
tertiobutyldiméthylsilyle,
tertiobutyldiphénylsilyle, triméthylsilyléthyléther, tert-butoxyméthyle,
méthoxy-
méthyle, benzyloxyméthyle, 2-méthoxyéthoxyméthyle, méthylthiométhyle, acétyle,
ou 2',3'-diméthoxybutane-2',3'-diyle.
Par ailleurs, on entend par groupe o nucléophile u un groupe
possédant une paire d'électrons libres, c'est-à-dire un groupe donneur
d'électrons, et
par groupe o électrophile o un groupe possédant une orbitale moléculaire
vacante de
faible énergie capable d'interagir avec la paire d'électrons libres d'un
groupe
nucléophile. La présence d'au moins un groupe nucléophile ou électrophile dans
les
composés de formules (Ia) et (Ib) permet avantageusement leur incorporation
dans
d'autres structures, telles que des structures porteuses, en faisant réagir ce
groupe
nucléophile ou électrophile avec des fonctions réactives correspondantes
portées par
ladite structure, comme cela sera décrit en détails ci-après.
Dans le cadre de la présente Invention, le groupe nucléophile est, de
préférence, choisi parmi les groupes amines, thiols, ~3-aminothiols, alcools,
hydrazide
et dérivés d'hydrazide, hydrazine et dérivés d'hydrazine, hydroxylamine et
dérivés
d'hydroxylamine, tandis que le groupe électrophile est, de préférence, choisi
parmi les
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groupes a-oxo-aldéhydes, -CORa (avec par exemple Ra = H, halogène,
imidazolyle,
hétérocycle aromatique), -COzRa (avec par exemple Ra = H, aryle,
succinimidyle,
sulfosuccinimidyle, hétérocycle aromatique) et ses dérivés (anhydrides
symétriques,
anhydrides mixtes, esters activés), -OCORa (avec par exemple Ra = halogène,
imidazolyle, hétérocycle aromatique), -OCOZRa (avec par exemple Ra = aryle,
hétéroaryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle), -OCSRa (avec par exemple Ra =
halogène, imidazolyle, hétérocycle aromatique), -OCSORa (avec par exemple Ra =
aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle, hétérocycle aromatique), -NRaCORb
(avec
par exemple Ra = méthyle et Rb = halogène, imidazolyle, hétérocycle
aromatique),
-NRaCOORb (avec par exemple Ra - H et Rb - aryle, succinimidyle,
sulfosuccinimidyle), -NRaCSRb (avec par exemple Ra = H et Rb = halogène,
imidazolyle, hétérocycle aromatique), -NR~CSORb (avec par exemple Ra = H et Rb
=
aryle, succinimidyle, sulfosuccinimidyle), -NCO, -NCS, maléimide et
halogénures
d' alkyles.
A titre d'exemples et de façon non-limitative, dans les formules
générales (Ia) et (Ib)
- des atomes d'halogène convenables sont le brome, le chlore et le
fluor ; et
- des chaînes carbonées convenables sont des groupes alkyles
(méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, tertiobutyle, pentyle, ...), des
groupes alkényles
(vinyle, allyle, butényle, pentényle, ...), des groupes alkynyles (éthynyle,
propynyle,
butynyle, pentynyle, ...), des groupes cycloalkyles (cyclopentyle,
cyclohexyle, ...), des
hétérocycles (pipérazine, ...), des groupes aryles (phényle, crésyle, ...),
des groupes
hétéroaryles (pyridine, pyrimidine, pyrazine, ...), des groupes
polyéthylèneglycols ou
encore des polyamines.
Les composés répondant aux formules générales (Ia) et (Ib)
constituent des mimes du D-mannose. Ils peuvent être utilisés, en tant que
tels, comme
ligands du récepteur du D-mannose, ou être liés à d'autres composés pour
conduire à
(obtention de ligands au sein desquels ils joueront le rôle de mimes du D-
mannose.
Aussi, s'il convient que, dans les ligands tels que prêts à être utilisés, les
composés de
formules générales (Ia) et (Ib) présentent au moins deux fonctions hydroxyles
libres
vicinales, de manière à être en mesure de mimer le D-mannose et à permettre à
ces
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ligands d'être reconnus par le récepteur du mannose et de se lier à ce
dernier, il n'est
toutefois pas nécessaire que ces composés présentent initialement deux
fonctions
hydroxyles vicinales libres.
Ainsi, conformément à (Invention, il est tout à fait possible
d'utiliser, pour la préparation d'un ligand, au moins un composé de formule
(Ia) et/ou
au moins un composé de formule (Ib) comprenant, sur deux atomes de carbone
adjacents du cycle, deux groupes hydroxyles protégés par un groupe protecteur,
les
autres groupes portés par les atomes du cycle pouvant être éventuellement eux
aussi
protégés. Cela sera même souhaitable dans un certain nombre de cas, notamment
pour
éviter que des groupes portés par les atomes de carbone du cycle du composé de
formule générale (Ia) ou (Ib) n'interferent lors du couplage dudit composé
pour
conduire à des cyclisations intramoléculaires ou des dimérisations. Bien
entendu, les
groupes protégeant les deux fonctions hydroxyles portées par les deux atomes
de
carbone adjacents du cycle seront éliminés préalablement à toute utilisation
du ligand,
l'élimination des autres groupes protecteurs étant facultative.
Selon une disposition préférée de (Invention, les composés de
formules générales (Ia) et/ou (Ib) sont choisis de telle sorte que les groupes
-ORZ et
-OR3 soient en relation trans, de manière à mimer les deux hydroxyles portés
par Ie
cycle du D-mannose qui apparaissent être impliquées dans la liaison entre ce
composé
et son récepteur.
De préférence, les composés de formule (Ia) et/ou (Ib) sont tels que
RS représente un groupe hydroxyle (auquel cas le cycle porte, en position 1,
un groupe
carboxyle).
En effet, la présence d'un groupe carboxyle sur le cycle des
composés de formules (Ia) et (Ib) offre l'avantage de conférer à ces composés
de
nombreuses possibilités de couplage, par exemple par (intermédiaire d'une
liaison de
type amide, ester, thioester, hydrazide ou hydroxamate. Par ailleurs, ces
couplages
peuvent être aisément réalisés par une simple activation de ce groupe
carboxyle selon
les techniques d'activation classiquement utilisées pour la synthèse
peptidique et,
notamment, pour la synthèse peptidique sur support solide. Ces techniques sont
décrites, par exemple, dans l'ouvrage The Practice of Peptides Synthesis, M.
et A.
BODANSKY, 1984, SPRINGLER-VERLAG, Berlin.
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Selon une disposition particulièrement préférée de (Invention, le
composé de formule (Ib) est tel que R~, RZ et R3 représentent des atomes
d'hydrogène
et RS représente un groupe hydroxyle (-OH). Si, en outre, les groupes -ORS et -
OR2 se
troûvent en relation cis, et les groupes -ORZ et -OR3 se trouvent en relation
trans, la
configuration étant 3R, 4S et SR, le composé résultant consiste en de (acide
(-)-shikimique (ou acide 3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexène-1-carboxylique).
Selon une autre disposition préférée de (Invention, le composé de
formule (Ia) est tel que R,, R2, R3 et R4 représentent des atomes d'hydrogène
et RS
représente un groupe hydroxyle (-OH). Si, en outre, les groupes -ORZ et -OR3
se
trouvent en relation trans, alors que les groupes -ORl et -OR4 se trouvent
chacun en
relation cis par rapport au groupe -OR2, et la configuration est 1s", 3R, 4s"
et SR, alors
le composé résultant consiste en de (acide (-)-quinique (ou acide 1,3,4,5-
tétrahydroxy-
cyclohexane-carboxylique).
Les acides (-)-shikimique et (-)-quinique sont disponibles
commercialement, par exemple auprès des Sociétés ALDRICH ou ACROS.
Selon encore une autre disposition préférée de (Invention, le
composé de formule (Ia) est tel que R,, R2, R3 et R4 représentent des atomes
d'hydrogène et RS représente un groupe -NH-(CHZ)2-SH. Il s'agit alors d'un
dérivé de
l'acide quinique.
D'une manière générale, il est bien entendu que les formules (Ia) et
(Ib), qui représentent les acides quinique et shikimique et certains de leurs
dérivés,
obtenus par substitution des hydroxyles portés aux positions 2, 3 et 4 (et
éventuellement en position 1) du cycle, et par substitution de la fonction
carbonyle
située en position 1 du cycle (groupe RS), ne sont pas limitatives, et que
tout autre
dérivé des acides quinique et shikimique pourrait être utilisé sans sortir du
cadre de la
présente Invention.
La présente Invention a également pour objet un composé utile en
tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des
C-lectines apparenté au récepteur du mannose, ou en tant que composé
intermédiaire
pour la préparation d'un tel ligand, lequel composé étant caractérisé en ce
qu'il répond
à la formule générale (III) ci-après
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(BiM)rnW)nA~P~y (IU)
dans laquelle
- B' répond à une ou plusieurs formules générales (IIa) ou (IIb) ci-après
O W-
OH
6 2
3
HO 4 OH H
OH OH
(IIa) (IIb)
où W représente une liaison ou une chaîne carbonée linéaire,
ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de
carbone et
éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote,
ladite
chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides
aminés,
A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel,
- Y représente le reste d'un composé d'intérêt Y',
- m est un nombre entier compris entre 1 et 32,
1 S - n est un nombre entier compris entre 0 et 32,
- y est un nombre entier compris entre 1 et 4, et
- M, N et P représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B1
et A
quand n = 0 ou B ~ et X quand n est différent de 0, entre X et A quand n est
différent de 0, et entre A et Y, et comprennent, indépendamment les uns des
autres,
une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester,
thioester,
hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, amine, carbonate, cardamaie,
thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine.
Dans la formule (III), ainsi que dans tout ce qui suit, des exemples
d'atomes d'halogène et de chaînes carbonées convenables sont tels que décrits
précédemment en rapport avec les composés de formules générales (Ia) et (Ib).
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Le composé répondant à la formule générale (III) comprend donc
* en tant qu'éléments obligatoires
~ un ou plusieurs restes B1 répondant chacun à l'une des formules générales
(IIa) ou (IIb), ce ou ces restes étant destinés à jouer le rôle de mimes du
D-mannose vis-à-vis du récepteur du mannose et résultant de la liaison entre
un ou plusieurs composés répondant à la formule générale (Ia) et/ou (Ib)
précédemment définie et le composé A', éventuellement via X', et de la
déprotection des groupes hydroxyles, dans le cas où le ou lesdits composés
de formule générale (Ia) et/ou (Ib) présente initialement des groupes
hydroxyles protégés ;
~ un ou plusieurs restes Y d'un composé Y' correspondant à un composé
d'intérêt ;
~ le reste A d'un composé A' présentant au moins une double fonctionnalité,
puisque son rôle est de porter à la fois le ou les restes B1 et le ou les
restes Y ;
et
* en tant qu'élément(s) accessoire(s), le ou les restes X d'un composé X', ce
ou ces
restes X jouant le rôle, lorsqu'ils sont présents, de bras espaceur entre BI
et A, de
façon à contrôler la distance entre les différents restes B1, lorsque
plusieurs
d'entre eux sont présents dans le composé de formule générale (III) (c'est-à-
dire
lorsque m est supérieur à 1). Bien que des restes X de nature oligopeptidique
aient été décrits, on ne sortirait pas du cadre de la présente Invention en
utilisant,
en tant que composé X', des composés de nature différente, pourvu qu'ils
soient
aptes à jouer le rôle de bras espaceur entre B1 et A. A titre d'exemples et de
façon non limitative, on peut citer l'acide mercaptopropionique, les
thioamines,
les bromoamines et les bras espaceurs du type polyéthylèneglycol comme le
4,7,10-trioxa-1,13-tridécane diamine.
Au sens de la présente Invention, on entend par o composé
d'intérët u un composé dont on cherche à favoriser finternalisation par des
cellules via
le récepteur du mannose ou un récepteur de la famille des C-lectines apparenté
à ce
dernier (cellules dendritiques, cellules des lignées monocytes-macrophages,
...).
A cette fin, le composé d'intérêt peut être lié au reste A, à raison de 1
à 4 molécules de composé d'intérêt par molécule de composé de formule générale
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(III), par des groupes de liaison P résultant chacun de la réaction entre deux
groupes
fonctionnels portés, pour le premier, par ledit composé d'intérêt et pour le
second, par
le composé A'. On obtient un ligand apte, de par la présence du ou des restes
B~, à se
lier spécifiquement au récepteur du mannose ou à tout récepteur apparenté à ce
dernier
et, de par sa liaison avec le composé d'intérêt, à favoriser finternalisation
de ce dernier
par les cellules exprimant ce type de récepteur.
Selon une disposition avantageuse de l'Invention, le composé A' est
formé d'un enchaînement comprenant plusieurs restes d'un composé au moins
trifonctionnel, liés les uns aux autres par des liaisons covalentes, et propre
à offiir, au
niveau des groupes fonctionnels libres de ces restes (c'est-à-dire des groupes
fonctionnels qui ne sont pas engagés dans une liaison covalente), plusieurs
sites
d'ancrage pour le ou les composés de formule générale (Ia) et/ou (Ib) ou,
lorsque X
est présent, le composé X', et pour le composé Y'.
Selon une modalité préférée de cette disposition, le composé A'
comprend de 2 à 32 et, de préférence, de 4 à 16 restes d'un composé
trifonctionnel.
Conformément à l'Invention, le composé A' peut se présenter soit
sous une forme linéaire, soit sous une forme ramifiée et, notamment, de type
arborescente (dite « dendrimérique »). Des exemples de structures ramifiées
particulièrement bien adaptées à la préparation d'un ligand du récepteur du
mannose
selon (Invention sont illustrés dans les Figures 1A et 1B qui représentent, de
manière
très schématique, un composé A' sous la forme de deux dendrimères différents.
De préférence, le composé A' comprend un enchaînement d'acides
aminés, identiques ou différents, sélectionnés dans le groupe constitué par la
lysine,
fhydroxylysine, la sérine, la thréonine, la cystéine, fornithine, l'acide
aspartique et
(acide glutamique. Cet acide aminé peut ëtre aussi bien de la série L que de
la série D
et le composé A' peut même comprendre à la fois des résidus de la série L et
des
résidus de la série D.
Un composé A' à base de lysine est préféré, (utilisation de la lysine
étant en effet particulièrement bien adaptée à la réalisation d'un ligand du
récepteur du
mannose selon (Invention, dans la mesure oû iI a été montré que des
macromolécules
à base de lysine sont dénuées d'immunogénicité intrinsèque (TAM, Proc. Natl.
Acad
Sci. USA, 1988, 85, 540).
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Toutefois, il est possible d'utiliser, en tant que composé A', des
enchaînements de composés trifonctionnels autres que les acides aminés cités
ci-
dessus, pour autant qu'ils présentent une biocompatibilité satisfaisante. A
titre
d'exemples et de façon non-limitative, on peut citer la 3,3'-
iminobis(propylamine), la
2,2'-iminobis(éthylamine), l'acide gallique, le tris(2-
carboxyéthyl)nitrométhane (M.
BRETTEICH et al., Synlett, 1998, 1396), le tris(hydroxyméthyl)aminométhane (P.
R.
ASHTON et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 3429) et la (dihydroxy)propylamine.
Accessoirement, le composé A' peut comprendre, en outre, un ou
plusieurs restes correspondant à un ou plusieurs composés différents du
composé au
moins trifonctionnel qui en constitue l'élément de base. Ce ou ces restes
n'ont en
principe pas vocation à assurer une quelconque liaison entre les différents
éléments
composant le ligand. En fait, leur présence est soit destinée à conférer à ce
ligand des
caractères additionnels tels qu'une ou plusieurs possibilités supplémentaires
de
couplage (par exemple, en vue de la réalisation ultérieure d'un dimère de ce
ligand),
soit liée à la nécessité d'utiliser, au cours de sa préparation, des composés
additionnels, tels que des bras espaceurs. Il va de soi que ces composés, tout
en étant
différents du composé au moins trifonctionnel constituant (élément de base du
composé A', seront de préférence de la même nature que celui-ci. Ainsi, par
exemple,
ils seront préférentiellement des acides aminés dans le cas où le composé A'
comprend
un acide aminé.
Conformément à (Invention, n, qui représente le nombre de restes X
présents dans le composé de formule générale (III), peut être
~ soit égal à 0, auquel cas le ou les restes B 1 sont directement liés
au reste A,
. soit compris entre 1 et 32, auquel cas, si n est égal à 1, le ou les
restes B ~ sont liés au reste A par (intermédiaire d'un seul reste X, tandis
que, si n est
différent de 1, chaque reste X peut servir d'élément de liaison entre un ou
plusieurs
restes B' et le reste A.
Quant aux groupes de liaison M, N et P, ils sont choisis,
indépendamment les uns des autres, parmi les groupes de liaison qui
comprennent une
fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester,
thioester,
hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, amine, carbonate, carbamate,
thiocarbonate,
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thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine. A titre d'exemples et de façon
non-
limitative
- une liaison oxime peut être formée par réaction d'un groupe
O-alkylamine avec un groupe carbonyle,
- une liaison hydrazone peut être formée par réaction d'un groupe
hydrazine avec un groupe carbonyle,
- une liaison amide (respectivement, ester) peut être formée par
réaction d'un groupe amine (respectivement, alcool) avec un groupe acide
activé ou
anhydride ou halogénure d'acide,
- une liaison thioester peut être formée par réaction d'un groupe
thiol avec un groupe acide activé ou anhydride ou halogénure d'acide,
- une liaison hydrazide peut être formée par réaction d'un groupe
hydrazine avec un groupe acide activé, anhydride ou halogénure d'acide,
- une liaison éther peut ëtre formée par réaction d'un groupe alcool
avec un groupe halogénure d'alkyle,
- une liaison thioéther peut être formée par réaction d'un thiol avec
un groupe halogénure d'alkyle,
- une liaison amine peut être formée par réaction entre un groupe
amine et un halogénure d'alkyle,
- une liaison carbonate peut être formée par réaction d'un groupe
chloroformate avec un groupe alcool,
- une liaison carbamate peut être formée par réaction d'un groupe
chloroformate avec un groupe amine,
- une liaison thiocarbonate peut être formée par réaction d'un
groupe chlorothioformate avec un groupe alcool,
- une liaison thiocarbamate peut être formée par réaction d'un
groupe chlorothioformate avec un groupe amine,
- une liaison urée peut être formée par réaction d'un groupe
isocyanate avec un groupe amine,
- une liaison thiourée peut être formée par réaction d'un groupe
isothiocyanate avec un groupe amine,
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WO 01/09173 13 PCT/FR00/02194
- une liaison thiazolidine peut être formée par réaction d'un groupe
(3-aminothiol avec un groupe carbonyle, tandis que
- une liaison hydroxamate peut ëtre formée par réaction entre un
groupe acide activé et un groupe hydroxylamine.
On comprendra dès lors que, dans la formule générale (III), B', A et
X représentent les restes de composés portant naturellement des groupes
fonctionnels
propres à conduire, par réaction les uns sur les autres, à l'obtention des
groupes de
liaison M, N et P tels que définis ci-dessus, ou de composés ayant été
modifiés de
manière à porter de tels groupes fonctionnels.
A cet égard, il convient de préciser que, conformément à l'Invention,
le composé répondant à la formule générale (III) peut être préparé
- soit par une synthèse convergente, c'est-à-dire par assemblage de
composés disponibles dans le commerce et éventuellement modifiés pour les
besoins
de la préparation du composé répondant à la formule générale (III), et/ou de
composés
préalablement synthétisés.
Ainsi, par exemple, le composé de formule générale (III) peut ëtre
obtenu en couplant, dans un premier temps, le ou les composés répondant à la
formule
générale (Ia) et/ou (Ib) avec le composé X', puis en couplant le composé
résultant de
ce premier couplage avec le composé A', et enfin en couplant le composé
résultant de
ce deuxième couplage avec le composé Y', ce dernier couplage étant
éventuellement
suivi de la déprotection des groupes hydroxyles portés par le ou les restes
B~, dans le
cas où le ou les composés de formule (Ia) et/ou (Ib) portent de tels groupes.
En variante, le composé de formule générale (III) peut être obtenu
en couplant un composé résultant du couplage entre un ou plusieurs composés
répondant à la formule générale (Ia) et/ou (Ib) et le composé X', avec un
composé
résultant, lui, du couplage entre le composé A' et le composé Y', ce dernier
couplage
pouvant, là encore, être suivi d'une déprotection telle que susdite.
Bien entendu, tout autre ordre d'assemblage peut également être
envisagé pour autant qu'il permette d'obtenir un composé répondant à la
formule
générale (III).
- soit par une stratégie de synthèse récurrente, notamment dans le
cas où les composés Y', A' et X' sont constitués par des acides aminés. Ainsi,
les
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composés Y', A' et X' peuvent être formés et assemblés les uns aux autres par
addition
successive des acides aminés qui les composent, par exemple selon les
techniques de
synthèse peptidique sur support solide dérivées de la méthode initialement
décrite par
MERRIFIELD (The Chemistry of Solid Phase Peptide Synthesis, STEWART et
YOLJNG Ed., 1984).
- soit encore par une stratégie de synthèse pour partie convergente
et pour partie récurrente.
Selon une disposition préférée de (Invention, le composé répond à la
formule générale (III) dans laquelle m est un nombre entier compris entre 4 et
16, n
est un nombre entier compris entre 2 et 8, X représente le reste d'un
oligopeptide
comprenant de 2 à 4 résidus d' acides aminés, tandis que A représente le reste
d'un
enchaînement comprenant de 2 à 8 résidus de lysine et se présentant sous la
forme
d'un dendrimère.
Selon une autre disposition préférée de l'Invention, le composé de
formule générale (III) est tel que B' représente le reste d'un ou plusieurs
composés
choisis parmi (acide (-)-shikimique et l'acide (-)-quinique.
Selon (usage auquel est destiné le ligand, le composé d'intérêt Y'
peut être un antigène et, notamment, un antigène vaccinal tel qu'un peptide de
synthèse correspondant à un ou plusieurs épitopes d'une protéine d'un agent
pathogène, un antigène sous-unité protéique ou polysaccharidique, une fraction
bactérienne ou virale purifiée, un anticorps tel qu'une immunoglobuline ou un
sérum
antilymphocytes, un acide nucléique ou un fragment d'un acide nucléique
(séquence
d'ARN ou d'ADN) codant pour une protéine d'intérêt ou pour un ou plusieurs
déterminants antigéniques de cette protéine, un principe actif médicamenteux
tel qu'un
immunostimulant, un immunosupresseur, un cytostatique ou un antibiotique, et
peut, à
ce titre, être aussi bien une substance de nature protéinique, peptidique,
osidique ou
polyosidique, lipidique, lipoprotéinique, lipopolyosidique, polynucléotidique,
qu'un
composé issu de la chimie.
Le composé d'intérêt peut également être un marqueur détectable
propre à permettre une révélation de la présence du ligand dans le milieu où
il se
trouve, tel qu'un radioisotope, un fluorochrome ou une enzyme.
Bien entendu, il est aussi possible que le composé d'intérêt Y' soit
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constitué d'une association de plusieurs susbtances de nature différente comme
par
exemple, un antigène ou un anticorps lié à un marqueur détectable.
La présente Invention a aussi pour objet un composé utile en tant
que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du
mannose
ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du
mannose,
lequel composé est caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (V) ci-
après
(B2M)rn(XN)nA (V)
dans laquelle
- BZ répond à une ou plusieurs formules générales (IVa) ou (IVb) ci-après
O W_ O W_
OR4
s 2 2 s
5 3 3
RIO 4 OR3 RIO 4 OR3
OR2 OR2
(Na) (IVb)
où R,, R2, R3, Rd et RS sont tels que définis précédemment en
rapport avec les composés de formules générales (Ia) et (Ib), et où W est tel
que défini
précédemment en rapport avec les composés de formules générales (11a) et
(IIb),
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides
aminés,
A représente le reste d'un composé A' au moins difonctionnel,
- m est un nombre entier compris entre 1 et 32,
- n est un nombre entier compris entre 0 et 32, et
- M et N représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B2 et
A
quand n = 0 ou BZ et X quand n est différent de 0, et entre X et A quand n est
différent de 0, et comprennent, indépendamment l'un de l'autre, une fonction
choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester,
hydrazide,
hydroxamate, éther, thioéther, amine, carbonate, carbamate, thiocarbonate,
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thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine.
Ainsi, dans la formule générale (V), le ou les restes BZ résultent du
couplage d'un ou plusieurs composés répondant à la formule générale (Ia) et/ou
(Ib)
avec le composé A', éventuellement via X'.
Dans le composé de formule générale (V), M, N, m, n, ainsi que les
composés A' et X', sont tels que décrits en relation avec la formule générale
(III).
Par ailleurs, le composé de formule générale (V) peut être, comme le
composé répondant à la formule générale (III), préparé par une synthèse
convergente,
par une synthèse récurrente, ou encore par une synthèse pour partie
convergente et
pour partie récurrente.
Selon une disposition préférée de l'Invention, le composé de
formule générale (V) est tel que Bz représente un reste d'un ou plusieurs
composés
choisis parmi (acide (-)-shikimique et (acide (-)-quinique, éventuellement
sous forme
protégée.
La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant
que composé intermédiaire pour la préparation d'un ligand du récepteur du
mannose
ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au récepteur du
mannose,
lequel composé est caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (VI)
ci-après
(B ~ M)n,A (V1)
dans laquelle
- B1 et M ont la même signification que dans la formule générale (III),
- m est un nombre entier compris entre 50 et 500, et
- A représente le reste d'un polymère A' capable de former un complexe non-
covalent avec un composé d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
Au sens de la présente Invention, on entend par o polymère u un
ensemble de molécules de poids moléculaire variable, résultant de
l'enchaînement de
plusieurs monomères.
Ce polymère est choisi parmi des composés capables de donner lieu,
au contact d'un composé d'intérët, à la formation d'un complexe non-covalent
avec ce
composé, par exemple par l'intermédiaire de liaisons ioniques, de liaisons
dipolaires
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WO 01/09173 17 PCT/FR00/02194
ou d'interactions électrostatiques, le complexe ainsi obtenu étant alors
susceptible
d'ëtre utilisé en tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur
de la
famille des C-lectines apparenté à ce dernier.
De préférence, le polymère A' est un polymère cationique. A titre
d'exemples et de façon non-limitative, des polymères cationiques convenables
sont
des polymères de lysine tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA sous
les
références P0296, P6403, P4408, P7886, P0899, P 1149 ou encore P0124, et des
polyéthylèneimines, tels que celui commercialisé par la Société FERMENTAS sous
la
référence EXGEN 500 en tant que réactif de transfection cellulaire.
La présente Invention a également pour objet un composé utile en
tant que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des
C-lectines apparenté au récepteur du mannose, lequel composé est caractérisé
en ce
qu'il se présente sous la forme d'un complexe non-covalent entre un composé
répondant à la formule générale (VI) telle que définie ci-dessus et un composé
d'intérêt, tel qu'un acide nucléique.
Les ligands conformes à l'Invention sont de grand intérêt. En effet,
tout en étant aptes à être reconnus de manière très satisfaisante par le
récepteur du
mannose et à se lier spécifiquement avec lui, ils présentent l'avantage de
pouvoir être
préparés aisément et à des coûts compatibles avec une exploitation
industrielle,
notamment par les nombreuses techniques de synthèse peptidique sur support
solide.
Ces ligands sont susceptibles de trouver de nombreuses applications
telles que
- la préparation de médicaments et, plus particulièrement, la
préparation de vaccins et de médicaments destinés à assurer la vectorisation
d'un
principe actif vers des cellules cibles exprimant le récepteur du mannose ou
un
récepteur lui étant apparenté,
- la transfection de séquences d'ADN et d'ARN et ses multiples
utilisations en thérapie génique ; dans ce dernier cas, on utilisera des
ligands se
présentant sous la forme de complexes non-covalents entre un composé de
formule
générale (VI) et une séquence polynucléotidique, et
- la préparation de réactifs de laboratoire et, notamment, de
réactifs de diagnostic.
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WO 01/09173 1 g PCT/FR00/02194
La présente Invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins un
composé répondant à la formule générale (Ia) et/ou d'au moins un composé
répondant
à la formule générale (Ib) pour la préparation d'un médicament capable de se
lier au
récepteur du mannose ou à tout récepteur de la famille des C-lectines
apparenté au
S récepteur du mannose.
La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant
que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-
lectines
apparenté au récepteur du mannose, tel que précédemment défini, pour
(utilisation en
tant que médicament.
Un tel médicament est susceptible de trouver en premier lieu des
applications dans toutes les indications thérapeutiques dans lesquelles on
recherche
une induction, une modulation ou une suppression des réponses immunitaires et,
plus
particulièrement, de celles qui sont sous le contrôle des cellules T. A titre
d'exemples
et de façon non-limitative, on peut citer
- la prévention et le traitement des maladies infectieuses et,
notamment, la vaccinologie, auquel cas le composé d'intérêt sera un antigène
vaccinal
ou un acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique codant pour une
protéine
vaccinale ou pour un ou plusieurs déterminants antigéniques d'une telle
protéine, et
l'immunothérapie anti-infectieuse non-spécifique ;
- le traitement des maladies auto-immunes telles que le lupus
érythémateux disséminé, la polyarthrite rhumatoïde ou la maladie de WEGENER ;
- le traitement des déficits immunitaires congénitaux ou acquis ;
- la prévention ou le traitement des états d'hypersensibilité ;
- le traitement des pathologies cancéreuses ; et
- la prévention des rejets dans les greffes d'organes.
Ce médicament est également susceptible d'être utilisé pour la
vectorisation d'un principe actif non-immunomodulateur vers des cellules
cibles
exprimant un récepteur de la famille des C-lectines. Ainsi, par exemple, les
composés
utiles en tant que ligands conformes à l'Invention peuvent trouver des
applications en
antibiothérapie, pour la vectorisation d'antibiotiques telles que les
fluoroquinones ou
la colistine vers des cellules des lignées des monocytes-macrophages infectées
par des
bactéries ou par des mycobactéries, ou dans le traitement de maladies liées à
une
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déficience enzymatique cellulaire comme la maladie de GAUCHER, auquel cas ils
serviront à vectoriser l' enzyme déficiente jusqu' aux cellules de KUPFER.
La présente Invention a encore pour objet un composé utile en tant
que ligand du récepteur du mannose ou de tout récepteur de la famille des C-
lectines
apparenté au récepteur du mannose, tel que précédemment défini, pour
l'utilisation in
vitro.
La présente Invention a, en outre, pour objet un réactif de diagnostic,
caractérisé en ce qu'il comprend un composé utile en tant que ligand du
récepteur du
mannose ou de tout récepteur de la famille des C-lectines apparenté au
récepteur du
mannose, tel que précédemment défini.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente Invention comprend
encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui
suit, qui
se rapporte à des exemples de préparation de composés utiles en tant que
composés
intermédiaires pour la préparation de ligands du récepteur du mannose
conformes à
(Invention, de ligands du récepteur du mannose conformes à l'Invention et de
démonstration des propriétés biologiques de ces ligands, ainsi qu'aux dessins
annexés
dans lesquels
- les Figures 1A et 1B illustrent deux exemples de conformations
ramifiées susceptibles d'être présentées par le composé A' ;
- les Figures 2A, 2B et 2C illustrent les structures chimiques de six
composés utiles en tant que composés intermédiaires pour la préparation de
ligands
conformes à l'Invention ;
- les Figures 3 et 4 illustrent les structures chimiques de 4 ligands
conformes à l'Invention préparés à partir des composés montrés sur les Figures
2A et
2B ;
- la Figure 5 illustre les structures chimiques de deux ligands
répondant à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 33F et 34F ;
- les Figure 6 et 7 illustrent les structures chimiques de quatre
ligands répondant à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 41F,
42F, 43F
et 44F ;
- les figures 8 et 9 illustrent les structures chimiques d'un dérivé de
l'acide quinique (composé G), de deux dendrimères (composés H et I) et de deux
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antigènes peptidiques (composés J et K) utilisables pour former des ligands
répondant
à la formule (III) conforme à l'Invention, dénommés 51 et 52 ;
- les Figures 10 et 11 illustrent les structures chimiques de deux
ligands répondant à la formule (III) conformes à l'invention, dénommés Sl et
52 ;
- la Figure 12 illustre la capacité du méthyl-quinate à inhiber
l'internalisation du composé 31F, porteurs de résidus du D-mannose, comme
décrit
dans l'exemple 8 ci-après ;
- la Figure 13 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs
moyennes des intensités de fluorescence présentées par des cellules
dendritiques
traitées par 2 ligands conformes à (Invention (-~- et -~-) et par 2 composés
témoins
(-o- et -a-) à des concentrations comprises entre 1 et 10 ~M ;
- la Figure 14 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs
moyennes des intensités de fluorescence présentées par des cellules
dendritiques
traitées par 2 ligands conformes à (Invention (-~- et -~-) et par 2 composés
témoins
(-o- et -o-) à une concentration de 5 p,M après une préincubation desdites
cellules en
présence de solutions de mannane de concentrations comprises entre 10'~ et 10
mg/ml ;
- la Figure 15 illustre le pourcentage d'internalisation spécifique de
ligands di-, tétra- ou octavalents par le récepteur du mannose, comme décrit
dans
l'exemple 8 ci-après ;
- la Figure 16 illustre la structure chimique d'un ligand dénommé
61F, constitué d'un dendrimère comprenant 4 résidus L-lysine portant 4 restes
de
D-mannose, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC), comme décrit dans
l'exemple 9 ci-après ;
- la Figure 17 illustre le pourcentage de cellules positives détectées
lors de l'incubation de cellules Cos-1 avec différents composés, tel que
décrit dans
l'exemple 9 ci-après.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés
uniquement à titre d'illustrations de (objet de (Invention et n'en constituent
en aucune
manière une limitation.
Dans ce qui suit, on utilisera les formules suivantes
Ac20 : anhydride d'acétyle
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Boc : t-butyloxycarbonyle
'Bu : tert-butyle
DCC : dicyclohexylcarbodümide
DCM : dichlorométhane
DIEA : düsopropyléthylamine
DMF : diméthylfonnamide
éq. : équivalent
EDTA : éthylène diamide tétraacétique
ESI-MS : spectrométrie de masse à électrospray
Fmoc : 9-fluorénylméthoxycarbonyle
HOBt : N hydroxybenzotriazole
HBTU : N oxyde d'hexafluorophosphate de [(1H benzotriazol-1-yl)
(diméthylamino)-
méthylène]-N méthylméthanaminium
MBHA : 4-méthylbenzhydrylamine
1 S Mtt : 4-méthyltrityle
NMP : N méthylpyrrolidone
PBS : tampon phosphate
Pmc : 2,2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle
RMN : résonance magnétique nucléaire
RP-HPLC : chromatographie liquide haute performance en phase inverse
TFA : acide trifluoroacétique
TNBS : acide 2,4,6-trinitrobenzène sulfonique
TOF-PDMS : spectrométrie à temps de vol et désorption plasma
Trt : trityle
Par ailleurs, dans le cadre des exemples qui suivent
~ la mesure des rotations optiques a été effectuée avec un polarimètre PERKIN
ELMER 241 et les valeurs [a.]p sont exprimées en unités de 10-~ degrés.cm2/g ;
~ les chromatographies liquides haute performance en phase inverse semi-
préparatives et analytiques ont été réalisées à (aide d'un système SHI1~~IADZU
LC-9A ou LC-4A, en utilisant une colonne BECKMANN ultrapore C-8 (300 A,
S p,m, 4,6 x 250 mm) ou HYPERSIL hyperprep C-18 (300 A, 8 p.m, 15 x 500 mm),
un débit de 1 ou de 3 ml/minute, une détection à 215 ou à 230 nm, et fun des 5
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systèmes d'élution suivants
- système A : TFA à 0,05% dans de Peau
- système B : TFA à 0,05% dans un mélange acétonitrile/eau (80:20)
- système C : TFA à 0,05% dans un mélange acétonitrile/eau (60:40)
- système D : tampon phosphate 50 mM, pH 6,95
- système E : un mélange de tampon phosphate 50 mM, pH 6,95, et d'acétonitrile
(50:50)
- système F : TFA à 0,05% dans un mélange eau/isopropanol (60:40) ;
~ les spectres TOF-PDMS ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre de
masse à
désorption par plasma APPLIED BIOSYSTEMS Bio-Ion 20 ;
~ les spectres ESI-MS ont été enregistrés à (aide d'un spectromètre de masse à
source
d'ionisation par électrospray Micromass Quatro II ; tandïs que
~ les spectres RMN IH et'3C ont été enregistrés à l'aide d'un spectromètre de
masse
BRUKER DRX 300 ou DRX 600 ; les déplacements chimiques sont exprimés en
ppm, en prenant comme standard interne, le tétraméthylsilane, celui du sel de
sodium de (acide triméthylsilylpropionique deuteré.
EXEMPLE 1 : PRÉPARATION DE COMPOSES UTILES EN TANT QUE
COMPOSES INTERMÉDIAIRES POUR LA PRÉPARATION DE LIGANDS
CONFORMES A L'INVENTION
Six composés se présentant sous la forme de dendrimères et
répondant à la formule générale (V) dans laquelle
~ m représente un nombre entier égal à 4, 8 ou 16,
~ BZ représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique,
~ n est un nombre entier égal à 2, 4 ou 8 (dans le cas où m est respectivement
égal à
4, 8 et 16),
~ X représente le reste d'un tripeptide de séquence (S1) ci-après
Lys-Cys(tert-butylthio)-Gly-OH (S1)
~ A représente le reste d'un dendrimère comprenant 2, 4 ou 8 (dans le cas où m
est
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respectivement égal à 4, 8 et 16) résidus L-lysine et présentant, d'une part,
2, 4 ou 8
groupes chloroacétyles pour sa liaison avec un nombre équivalent de
tripeptides et,
d'autre part, un groupe amine libre propre à permettre sa liaison avec une
molécule
d'intérêt,
~ M représente un groupe amide (-CO-NH-), tandis que N représente un groupe
thioéther (-CHZ-S-CHZ-CO-),
ont été préparés.
La préparation de ces composés a été réalisée en utilisant une
stratégie de synthèse convergente, c'est-à-dire en procédant
- en premier lieu, à la préparation des dendrimères A',
- puis, à la préparation des tripeptides de séquence (S 1 ) et à leur couplage
avec deux
molécules d'acide (-)-shikimique ou (-)-quinique, et
- enfin, au couplage des dendrimères A' et des tripeptides porteurs des restes
acide
(-)-shikimique ou (-)-quinique, par déprotection de la fonction thiol de ces
tripeptides et par formation d'une liaison thioéther entre cette fonction
thiol et un
groupe chloroacétyle desdits dendrimères A'.
Les structures chimiques de ces composés, qui seront dénommés
dans ce qui suit
~ composés 21, 23 et 25, pour ce qui est des composés comprenant
respectivement 4,
8 et 16 restes acide (-)-shikimique, et
~ composés 22, 24 et 26, pour ce qui est des composés contenant respectivement
4, 8
et 16 restes acide (-)-quinique,
sont représentées sur les Figures 2A, ZB et 2C.
1.1 - Préuaration des dendrimères A'
Chaque dendrimère A' a été préparé à une échelle de 0,5 mmole par
une synthèse sur support solide, à partir de 15 g d'une résine MBHA
initialement
chargée à 0,4 mmoles/g (Société SENN CHEMICALS) et en utilisant
~ une stratégie Boc/benzyle pour la protection des acides aminés à coupler,
~ un mélange HBTU/HOBtIDIEA dans du DMF, en tant que réactifs d'activation
pour les couplages des acides aminés, et
~ des tests à la ninhydrine -(KAISER et al., Anal. Biochem., 1970, 34, 595) et
au
TNBS -(HANCOCK et BATTERSBY, Anal. Biochem., 1976, 71, 261) pour le
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contrôle des opérations de couplage et de déprotection.
Afin d'abaisser la charge en fonctions amines libres de la résine à
une valeur de 0,1 mmoles/g, 0,25 équivalent (par fonction amine devant réagir)
de
Boc-/3-Ala-OH a été, dans un premier temps, couplé à cette résine, en présence
d'un
mélange HBTU/HOBt/DIEA (0,25 : 0,25 : 0,75 éq. par fonction amine devant
réagir)
dans du DMF (durée de la réaction : 1 heure). Puis, les groupes amines de la
résine
restées libres ont été protégés par acétylation, en faisant réagir la résine
avec un
mélange Ac20/DIEA/DCM (5:10:85) pendant 10 minutes.
Le deuxième couplage - correspondant en fait au premier couplage
d'une L-lysine - a été réalisé en utilisant 4 équivalents (par fonction amine
devant
réagir) de Boc-L-Lys(2-chlorobenzyloxycarbonyle)-OH, c'est-à-dire d'une L-
lysine
dont la chaîne latérale est protégée par un groupe 2-chlorobenzyloxycarbonyle,
en
présence d'un mélange HBTU/HOBt/DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant
réagir) dans du DMF (durée de la réaction : 45 minutes).
Le troisième couplage a, lui, été effectué en utilisant 4 équivalents
de Boc-L-Lys(Boc)-OH, en présence d'un mélange HBTU/HOBt/ DIEA (4:4:12 éq.
par fonction amine devant réagir) dans du DMF (durée de la réaction : 45
minutes).
A l'issue de ce troisième couplage, un tiers de la résine a été
déprotégé, puis acylé par 8 équivalents d'anhydride chloroacétique préformé
(via une
activation par du DCC), pour obtenir un dendrimère (dénommé composé 13 dans ce
qui suit) comprenant 2 résidus L-lysine et présentant d'une part, un groupe
amine libre
(qui n'est autre que le groupe s-amine de la première L-lysine ayant été
couplée à la
(3-alanine) et d'autre part, 2 groupes chloroacétyles.
Les deux autres tiers de la résine ont fait (objet d'un quatrième
couplage pour obtenir la fixation de deux L-lysines supplémentaires. Ce
couplage a
été réalisé avec 4 équivalents de Boc-L-Lys(Boc)-OH, en présence d'un mélange
HBTU/HOBt/DIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du DMF
(durée de la réaction : 45 minutes).
A l'issue du quatrième couplage, la moitié de la résine restante (soit
1/3 de la quantité de résine initiale) a été à son tour déprotégée et acylée
par 8
équivalents d'anhydride chloroacétique préformé pour obtenir un dendrimère
(dénommé composé 14 dans ce qui suit) comprenant 4 résidus L-l~sine et
présentant à
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la fois un groupe amine libre et 4 groupes chloroacétyles.
La seconde moitiée de la résine restante a été soumise à un
cinquième couplage avec 4 équivalents de Boc-L-Lys(Boc)-OH, comme décrit
précédemment. Les opérations de déprotection et d'acylation de la résine par
l'anhydride chloroacétique ont été reconduites encore une fois pour obtenir un
dendrimère à 8 résidus L-lysine (dénommé composé 15 dans ce qui suit)
présentant un
groupe amine libre et 8 groupes chloroacétyles.
En pratique, lors de chaque opération de couplage, l'HBTU (1 éq.
par rapport à l'acide aminé à coupler), après dissolution dans le DMF, a été
ajouté à
une solution contenant (acide aminé à coupler (0,25 éq. par rapport aux
fonctions
-NHZ pour la ~3-alanine, et 4 éq. pour le couplage des lysines), de l'HOBt (1
éq. par
rapport à, l'acide aminé) et de la DIEA (3 éq. par rapport à l'acide aminé)
dans du
DMF. L'ensemble a été mélangé pendant 1 minute à température ambiante, puis
ajouté
à la résine préalablement imbibée par du DMF. La suspension a été agitée
mécaniquement pendant toute la durée de la réaction.
Par ailleurs, entre chaque opération de couplage, la résine a été
successivement filtrée, lavée 3 fois avec du DMF (3 x 2 minutes) et du DCM
(3 x 2 minutes), traitée par un mélange TFA/DCM (50:50, 1 x 2 minutes,
1 x 20 minutes) propre à permettre le clivage des groupements protecteurs Boc,
lavée
à nouveau par du DCM (2 x 2 minutes), neutralisée avec un mélange DIEA/DCM
(5:95 ; 3 x 1 minute) et lavée une dernière fois avec du DCM (2 x 1 minute).
Le clivage des dendrimères et leur déprotection ont été obtenus en
faisant réagir la résine avec 11 ml d'un mélange HF/anisole (10:1) par gramme
de
résine, à 0°C et pendant 60 minutes. A la suite de quoi, ils ont été
successivement
précipités dans du tert-butylméthyléther froid, centrifugés, dissout dans de
Peau,
lyophilisés et purifiés par une RP-HPLC serai-préparative [gradient (A/8) :
100:0 à
50:50 en 120 minutes].
Ont été ainsi obtenus
~ 160 mg de dendrimère 13 (Rdt : 52%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 498 (M+H)+;
~ 215 mg de dendrimère 14 (Rdt : 42%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 928 (M+Na)+ ;
et
~ I82 mg de dendrimère 15 (Rdt : 20%) ; spectre TOF-PDMS : m/z 1726 (M+H)+.
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1.2 - Préparation des trineptides porteurs des restes acide (-)-shikimiaue et
(-)-guiniaue
La préparation des tripeptides porteurs des restes acide
(-)-shikimique et (-)-quinique a été réalisée sur support solide, en
synthétisant dans un
premier temps le peptide de séquence (S1) et en couplant dans un deuxième
temps une
molécule de ce tripeptide avec 2 molécules d'acide (-)-shikimique ou 2
molécules
dérivées de l'acide (-)-quinique, par formation d'une liaison entre les
groupes amine
de la L-lysine N-terminale dudit tripeptide et le groupe carboxyle desdits
acides.
Ont été ainsi obtenues
~ d'une part, la N",N' di-[(3R,4S,SR)-3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexenecarbox-1-
yl]-L-
lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cystéyl-glycine, qui sera dénommée composé 1 dans
ce
qui suit, et
~ d'autre part, la IVa,N~ di-[(1s~,3R,4s",SR)-1,3,4,5-tétrahydroxy-1-
cyclohexane
carbox-1-yl]-L-lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cystéyl-glycine, qui sera dénommée
composé 3 dans ce qui suit.
a) Préparation du composé 1
Le composé 1 a été préparé à une échelle de 2 mmoles à (aide d'une
résine Fmoc-glycine p-benzyloxybenzyle (disponible sous la dénomination
commerciale Fmoc-Gly-O-Wang auprès de la Société NOVABIOCHEM) chargée à
0,8 mmoles/g, et en utilisant
~ une stratégie Fmoc pour la protection des fonctions amine des acides aminés
à
coupler,
~ un mélange HBTUIDIEA dans de la NMP, en tant que réactifs d'activation pour
les
couplages des acides aminés,
~ un mélange pipéridine/NMP pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
~ des tests à la ninhydrine et au TNBS pour le contrôle des réactions de
couplage et
de déprotection.
Après élimination des groupements Fmoc protégeant les fonctions
amine des résidus glycine de la résine, par traitement de cette dernière par
un mélange
pipéridine/NMP (20:80) pendant 20 minutes, le couplage du résidu S-(tert-
butylthio)
L-cystéine a été réalisé en utilisant 2 équivalents (par groupe amine devant
réagir) de
Fmoc-L-Cys(tert-butylthio)-OH en présence du mélange HBTCJ/DIEA (2:3 éq.) dans
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de la NMP (durée de la réaction : 40 minutes). L'utilisation d'un groupe tert-
butylthiol
comme groupement protecteur de la fonction thiol du résidu L-cystéine a été
choisie
en raison de ce que ce groupe est à la fois peu sensible aux conditions
réactionnelles
utilisées au cours des opérations de couplage et de clivage, tout en étant
susceptible
d'être aisément éliminé par l'action de trialkylphosphines.
Ce premier couplage a été suivi d'un second couplage destiné à fixer
la L-lysine du tripeptide, lequel a été effectué en utilisant 2 équivalents de
Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH en présence de 5 équivalents de mélange HBTU/DIEA (2:3
éq.) dans de la NMP (durée de la réaction : 40 minutes).
Puis, il a été procédé au couplage des deux molécules d'acide
(-)-shikimique en activant 2 équivalents (par fonction amine devant réagir) de
cet
acide par,un mélange HBTU/DIEA (1:1 éq.) dans de la NMP pendant 30 secondes,
et
en ajoutant ledit acide à la résine préalablement imbibée dans du NMP (durée
de la
réaction : 40 minutes).
Au terme de cette opération de couplage, le solvant a été filtré, la
résine a été lavée successivement avec de la NMP (3 x 2 minutes) et du DCM (3
x 2
minutes), puis séchée.
Le clivage du composé 1 a été réalisé en traitant la résine par 25 ml
d'un mélange TFA/HZO/MezS (95:2,5:2,5) à la température ambiante pendant
2 heures. La solution a été concentrée sous pression réduite et le résidu
ainsi obtenu a
été dissous dans de Peau, puis soumis à une lyophilisation conduisant à
(obtention
d'1,64 g d'une poudre jaune pâle. 107 mg de cette poudre ont été purifiés par
une
RP-HPLC semi-préparative [gradient (AB) : 100:0 à 50:50 en 110 minutes], ce
qui a
permis d'obtenir, après lyophilisation, 15 mg de composé 1 pur, soit un
rendement de
14%.
Le composé 1 présente les caractéristiques suivantes
Rotation optictue : [a]D -117 (c 0.19, H20) ;
Spectre RMN'H : 8H(300 MHz; HZO-D20 90:10) 1.16 (3 x 3 H, 3 s, C(CH3)3), 1.14
1.35 (2 H, m, 2 lysyl y-H), 1.37-1.44 (2 H, m, 2 lysyl S-H), 1.62-1.75 (2 H,
m, 2 lysyl
(3-H), 2.00-2.11 ( 2 H, m, 2 6-H), 2.59 ( 1 H, dd, J 11.3 et J 17.4, 1 6-H),
2.60 (1 H,
dd, J 11.1 et J 17.0, 1 6-H), 2.90 (1 H, dd, Ja,p 7.0 et Ja,a~ 14.1, 1 cystéyl
(3-H), 3.04-
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3.16 (2 H, m, 2 lysyl E-H), 3.09 ( 1 H, dd, Ja,p 4.9 et Jp,p~ 14, 1 cystéyl (3-
H), 3.58 et
3.59 (2 H, 2 dd, J3,4 4.6 et J4,5 9.2, 2 4-H), 3.73-3.76 (2 H, m, 2 glycyl a-
H), 3.83-3.88
(2 H, m, 2 5-H), 4.17 (1 H, m, lysyl a-H), 4.25-4.29 (2 H, m, 2 3-H), 4.52 (1
H, m, 1
cystéyl a-H), 6.22 et 6.28 (2 H, 2 br d, J2,3 4.0, 2 2-H), 7.86 (1 H, t,
JE,rrH 5.4, 1 lysyl
ENH), 8.02 (1 H, t, Ja,NH 5.6, 1 glycyl NH), 8.06 (1 H, d, Ja,NH 6.6, 1 lysyl
°'NH), 8.32
( 1 H, d, Ja,NH 7.7, 1 cystéyl NH);
Spectre RMN ~3C : 8o(8I.3 MHz; H20-DZO 90:10) 22.9 (lysyl y-C), 28.3 (lysyl b-
C),
29.4 (C(CH3)3), 30.7 (lysyl (3-C), 31.7 et 31.5 (2 6-C), 39.8 (lysyl s-C),
40.6 (cystéyl
(3-C), 41.8 (glycyl a-C), 48.7 (C(CH3)3), 53.3 (cystéyl a-C), 54.9 (lysyl a-
C), 66.3 et
66.8 (2 4-C et 2 5-C), 71.9 et 72.0 (2 3-C), 131.1 et 132.1 (2 1-C), 133.1 et
133.7 (2 2-
C), 170.5, 171.0, 172.7, 173.4 et 174.6 (S XC=O) ;
Spectre TOF-PDMS : m/z 729 (M+Na)+.
Les constantes de couplage entre les protons 3-H/4-H et 4-H/5-H des
deux restes acide (-)-shikimique présents dans le composé 1 telles que
déterminées par
spectrométrie RMN 'H sont respectivement de 4,6 et 9,2 Hz. Ces constantes sont
compatibles avec une orientation pseudo-équatoriale des fonctions hydroxyles
portées
par les atomes de carbone situés en positions 4 et 5 desdits acides et
viennent
confirmer l'analogie de structure existant entre l'acide (-)-shikimique et le
D-mannose.
b) Préparation du composé 3
Le composé 3 a été préparé à une échelle de 2 mmoles à (aide d'une
résine Fmoc-glycine o-methoxy p-(benzyloxy)benzyle (disponible sous la
dénomination commerciale Fmoc-Gly-Sasrin auprès de la Société BACHEM) chargée
à 0,8 mmoles/g et en utilisant
~ une stratégie Fmoc/tert-butyle pour la protection des acides aminés à
coupler,
~ un mélange HBTU/DIEA dans de la NMP, en tant que réactifs d'activation pour
les
couplages des acides aminés,
~ un mélange pipéridine/NMP pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
~ des tests à la ninhydrine et au TNBS pour le contrôle des opérations de
couplage et
de déprotection.
Les couplages de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine et de la L-lysine
ont été réalisés dans des conditions identiques à celles utilisées pour la
préparation du
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composé 1.
Par contre, le couplage des deux molécules d'acide (-)-quinique a
été, lui, effectué selon un protocole opératoire différent de celui utilisé
pour le
couplage de l'acide (-)-shikimique. En effet, il s'est avéré que l'activation
de l'acide
(-)-quinique se traduisait immédiatement par la formation d'une y-lactone
bicyclique,
par estérification entre le groupe carboxyle porté par le carbone situé en
position 1 et
le groupe hydroxyle porté par le carbone situé en position 3 de cet acide, et
qu'il était
donc nécessaire de protéger les fonctions hydroxyle de (acide (-)-quinique
avant de
procéder à son couplage.
Il a donc été choisi de soumettre l'acide (-)-quinique à une
peracétylation par de l'anhydride acétique, de manière à obtenir (acide
(ls",3R,4s",SR)-1,3,4,5-tétraacétoxycyclohexane-1-carboxylique qui n'est autre
que le
dérivé tétraacétylé de l'acide (-)-quinique et qui sera dénommé composé 9 dans
ce qui
suit, puis de transformer ce dernier en son fluorure d'acide (dénommé composé
18
dans ce qui suit) en traitant le composé 9 par du fluorure de cyanuryle.
Pour ce faire, une goutte d'acide perchlorique a été ajoutée, à
température ambiante et sous agitation, à une suspension contenant 4 g (21
mmoles)
d'acide (-)-quinique dans 30 ml d'un mélange acide acétique/Ac20 (2:1).
L'agitation a
été poursuivie pendant 12 heures au terme desquelles le mélange résultant a
été dilué
avec du chloroforme et soumis à une extraction par une solution saturée en
bicarbonate de sodium, puis par de l'eau. La couche organique a été séchée par
du
sulfate de sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu a
été précipité
par addition de pentane pour donner 6,45 g de composé 9, soit un rendement de
86%.
La transformation de l'acide 9 en son fluorure a été réalisée en
ajoutant, goutte à goutte et sous agitation, 937 p,1 (11,10 mmoles) de
fluorure de
cyanuryle à une solution comprenant 500 mg (1,39 moles) de composé 9 dans 6 ml
de
chlorure de méthylène et 112 u1 ( 1,39 mmoles) de pyridine, et en portant le
mélange
résultant à reflux pendant 2 heures. Un précipité blanc s'étant formé, ce
mélange a été
filtré, puis il a été soumis à une extraction par de Peau. L'élimination du
solvant de la
couche organique, après séchage de cette dernière par du sulfate de sodium, a
conduit
à l'obtention d'une huile correspondant au composé 18 et qui a été soumise à
un
séchage sous vide pendant plusieurs heures.
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Les composés 9 et 18 présentent les caractéristiques spectrales
suivantes
Composé 9
~ectre RMN 'H : 8H(300 MHz; CDCl3) 1.87 (1 H, dd, JS,~ 10.2 et J6,6~ 13.6, 6-
H),
1.96, 1.98, 2.03 et 2.08 (4 x 3 H, 4 s, 4 CH3), 1.98-2.03 (1 H, m, 6'-H), 2.36
(1 H, dd,
JZ,2~ 15.9 et JZ, 3 3.3, 2-H), 2.50 (1 H, dd, J2,2~ 15.9 et JZ~,~ 3.2, 2'-H),
4.97 (1 H, dd, J3,a
3.4 et J4,5 9.4, 4-H), 5.31 (1 H, ddd, J4,5 9.4, J5,6 10.2 et JS,~~ 4.2, 5-H),
5.50 (1 H, m, 3-
H);
Spectre RMN ~3C : S~(81.3 MHz; CDC13) 21.0, 21.1, 21.2 et 21.4 (4 CH3), 32.0
et
36.3 (2-C et 6-C), 66.7, 67.7 et 71.3 (3-C, 4-C et S-C), 78.8 (1-C), 170.1-
170.5 (4
COZMe), 173.1 (COZH) ;
Composé 18
Spectre RMN IH : 8H(300 MHz; CDCl3) 1.97-2.05 (1 H, m, 6-H), 2.03, 2.06, 2.08
et
2.16 (4 x 3 H, 4 s, 4 CH3), 2.45 ( 1 H, dd, J2,2~ 15.4 et J2,3 3.7, 2-H), 2.50-
2.66 (2 H, m,
2'-H et 6'-H), 5.08 (1 H, dd, J3,4 3.5 et J4s 9.1, 4-H), 5.38 (1 H, ddd, Ja,s
9.1, J5,6~ 9.1
etJS,~ 5.1, 5-H), 5.56 (1 H, m, 3-H) ;
Spectre RMN 13C : 8(81.3 MHz; CDCl3) 20.4, 20.6, 20.8 et 20.9 (4 CH3), 31.9 et
35.4
(2-C et 6-C), 66.0, 68.2 et 70.4 (3-C, 4-C et 5-C), 76.7 (J~,F 53.2, 1-C),
160.3 (J~F
373.4, COF), 169.6, 169.7, 169.8 et 169.8 (4 COZMe).
Le couplage des deux molécules de composé 18 a été réalisé en
acylant la résine une première fois par 2 équivalents (par fonction amine
devant
réagir) de composé 18 en présence de 3 équivalents de DIEA dans de la NMP
(durée
de la réaction : 60 minutes), puis, après avoir lavé la résine avec de la NMP
(3 x 2
minutes) et du DCM (3 x 2 minutes), en facylant une seconde fois, mais en
utilisant 1
équivalent des différents réactifs.
Au terme de cette opération de couplage, le solvant a été filtré, la
résine a été lavée successivement avec de la NMP (3 x 2 minutes) et du DCM (3
x 2
minutes), puis séchée.
Le clivage du composé 3 a été obtenu en traitant la résine par 20 ml
d'un mélange CHZCIz/TFAfPr3SiH (95:2:3) (4 x 5 minutes). La solution a été
concentrée sous pression réduite et le résidu ainsi obtenu a été dissout dans
de Peau,
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puis soumis à une lyophilisation conduisant à l'obtention d'1,40 g d'un
composé brut
qui a été dissout dans 25 ml de méthanol. A la solution ainsi obtenue, a été
ajouté,
goutte à goutte et sous âgitation, du méthylate de sodium méthanolique 1 M
jusqu'à
l'obtention d'un pH d'environ 9, puis on a laissé ce mélange réagir pendant 3
heures,
en contrôlant le déroulement de la réaction par une RP-HPLC. Le mélange a été
ensuite concentré sous pression réduite. Un échantillon de 100 mg du résidu a
été
purifié par une RP-HPLC semi-préparative [gradient (AB) : 100:0 à 90:10 en 10
minutes, puis 90:10 à 50:50 en 70 minutes] pour conduire à l'obtention, après
lyophilisation, de 41 mg de composé 3 pur, soit un rendement de 59%.
Le composé 3 présente les caractéristiques suivantes
Rotation ontique : [a]D -73 (c 0.49, Hz0) ;
Spectre I~MN IH : 8H(300 MHz; H20-D20 90:10) 1.12 (3 x 3 H, s, 3 CH3), 1.15-
1.22
(2 H, m, 2 lysyl y-H), 1.34 (2 H, quintet, JY,s 7.2 et Js,E 7.2, 2 lysyl 8-H),
1.57-1.90 (10
H, m, 2 lysyl ~i-H, 4 2-H et 4 6-H), 2.83 (1 H, dd, Ja,p 8.6 et Jp,~~ 14, 1
cystéyl (3-H),
3.02 (3 H, m, 1 cystéyl [3-H et 2 lysyl s-H), 3.33 (2 H, dd, J3,4 9.6 et Ja,s
2.9, 2 4-H),
3.79 ( 2 H, d, Ja,NH 5.8, 2 glycyl a-H), 3.80-3.90 (2 H, m, 2 5-H), 4.01 (2 H,
br s, 2 3-
H), 4.11 (1 H, dt, Ja,NH 7.0 et Ja,p 7.2, 1 lysyl a-H), 4.54 (1 H, dt, Ja,NH
7.6 et JQ,~ 6.0,
1 cystéyl a-H), 8.02 ( 1 H, t, J°"NH 5.9, 1 lysyl ENH), 8.11 ( 1 H, d,
Ja,rrH 7.0, 1 lysyl
°'NH), 8.21 ( 1 H, t, Ja,NH 5.8, 1 glycyl NH), 8.35 ( 1 H, d, Ja,NH
7.6, 1 cystéyl IVH) ;
~ectre RMN'3C : 8(81.3 MHz; Hz0-D20 90:10) 22.7 (lysyl y-C), 28.3 (lysyl S-C),
29.4 (C(CH3)3), 30.9 (lysyl (3-C), 37.5 (2 2-C), 39.4 (lysyl s-C), 40.7
(cystéyl [3-C et 2
6-C), 41.8 (glycyl a-C), 48.6 (C(CH3)3), 53.1 (cystéyl a-C), 54.4 (lysyl a-C),
66.7 et
66.8 (2 3-C), 70.8 (2 5-C), 75.4 (2 4-C), 77.2 (2 1-C), 172.5, 173.4, 174.4,
177.1 et
177.4 (S XC=O) ;
Spectre ESI-MS : m/z 741 (M-H)-.
Les constantes de couplage entre les protons 3-H/4-H et 4-H/5-H des
deux restes acide (-)-quinique présents dans le composé 3 telles que
déterminées par
spectrométrie RMN 1H sont respectivement de 9,6 et 2,9 Hz. Ces constantes sont
compatibles avec une conformation « chaise » du cyclohexane plaçant le groupe
amide en position équatoriale, les hydroxyles 3 et 4 en relation trans di-
équatoriale et
les hydroxyles 4 et 5 en relation cis équatoriale-axiale.
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WO 01/09173 32 PCT/FR00/02194
1.3 - Couplages des dendrimères A' et des tripentides porteurs des restes
acide (-)-shikimique et (-)-quinique
Les coûplages des composés 13, 14 et 15 et des composés 1 et 3 ont
été réalisés selon une procédure comprenant 2 étapes, à savoir
~ une première étape visant à réduire la liaison disulfure (S-SBu') que
présente
chacun des composés 1 et 3, en traitant ces composés par du tri-n-
butylphosphine
dans un mélange n-propanol/eau dégazés (50:50), de manière à obtenir
l'élimination du groupe protecteur tert-butylthiol porté par chacun des
composés 1
et 3 et, partant, la déprotection de leur fonction thiol, et
~ une seconde étape visant à faire réagir les composés 1 et 3 ainsi réduits
avec les
composés 13, 14 et 15, dans un mélange DMF/eau dégazés (90:10) et en présence
de carbonate de potassium, de maniére à obtenir la formation d'une liaison
thioéther
entre la fonction thiol des composés 1 et 3 et l'une des fonctions
chloroacétyles des
composés 13, 14 et 15.
Ainsi, à une solution contenant 1,5 équivalent (par groupe
chloroacétyle devant réagir à la deuxième étape) de composé 1 ou de composé 3
dans
1 ml d'un mélange n-propanol/eau dégazés (50:50), a été ajouté 1 équivalent de
tri-n-
butylphosphine. Chaque mélange réactionnel a été laissé, sous agitation et
sous azote,
à température ambiante pendant 24 heures, puis les solvants et le tert-
butylmercaptan
libéré ont été évaporés sous pression réduite et les résidus ont été séchés
sous vide
pendant 15 minutes.
Chacun de ces résidus, après dissolution dans un mélange DMF/eau
dégazés (90:10), a été ajouté à 1 équivalent (1-5 p,moles) d'un composé 13, 14
ou 15 et
à 20 équivalents de carbonate de potassium. Chaque mélange réactionnel a été
laissé,
sous agitation et à température ambiante, pendant 72 à 96 heures - les
réactions étant
contrôlées par des RP-HPLC -, puis, dilué dans de l'eau et lyophilisé. Les
résidus ont
été alors purifiés par des RP-HPLC semi-préparatives.
Ont été ainsi obtenus
~ 3,39 mg de composé 21 (Rdt : 61 %) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
70:30
en 70 minutes,
~ 5,98 mg de composé 22 (Rdt : 66%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
75:25
en 25 minutes, puis isocratique,
CA 02388663 2002-O1-29
WO 01/09173 33 PCT/FR00/02194
~ 2,25 mg de composé 23 (Rdt : 42%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
80:20
en 35 minutes, puis isocratique,
~ 5,75 mg de composé 24 (Rdt : 56%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
75:25
en 25 minutes, puis isocratique,
~ 3,15 mg de composé 25 (Rdt : 43%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
75:25
en 40 minutes, puis isocratique, et
~ 7,03 mg de composé 26 (Rdt : 61 %) en utilisant un gradient (A/C) 100:0 à
80:20 en
35 minutes, puis isocratique,
se présentant tous sous la forme d'une poudre blanche.
Les composés 21 à 26 présentent les caractéristiques spectrales
suivantes
Composé 21
Spectre RMN ~H
8H(600 MHz; Hz0-DZO 90:10) 1.31-1.46 (8 H, m, 8 lysyl y-H), 1.43-1.60 (6 H, m,
6
lysyl 8-H), 1.64 (2 H, m, 2 lysyl 8-H), 1.68-1.89 (8 H, m, 8 lysyl ~3-H), 2.17-
2.23 (4 H,
m, 4 6-H), 2.46 and 2.51 (2 x 1 H, 2 dt, Ja,a~ 15.4 and Ja,p 6.2, 2 alanyl a-
H), 2.70-
2.80 (4 H, m, 4 6'-H), 2.89-2.95 (2 H, m, 2 cystéyl ~3-H), 2.96-3.01 (2 H, m,
2 lysyl s-
H), 3.06 (2 H, dd, Ja,p 5.3 and ,Ip,p~ 14.9, 2 cystéyl Vii'-H), 3.21 (2 H, m,
2 lysyl s-H), ),
3.25 (2 H, m, 2 lysyl s-H), 3.27 (1 H, d, J 16.5, CHH), 3.30 (1 H, d, J 16.5,
CHI,
3.33 (2 H, s, CHZ), 3.41-3.50 (2 x 1 H, 2 ddt, Ja,p 6.2, JR,p~ 12.6 and Jp,NH
6.2, 2 (3-
alanyl [3-H), 3.71-3.76 (4 H, m, 4 4-H), 3.95 (4 H, d, Ja,NH 6.3, 4 glycyl a-
H), 4.00-
4.05 (4 H, m, 4 5-H), 4.25 (2 H, dt, Ja,p 5.6 and Ja,rrH 6.3, 2 lysyl a-H),
4.32-4.38 (4
H, m, 4 lysyl a-H), 4.42-4.44 (4 H, m, 4 3-H), 4.58-4.62 (2 H, m, 2 cystéyl a-
H), 6.38
and 6.44 (2 x 2 H, 2 br d, JZ,3 4.0, 2 x 2 2-H), 6.90 ( 1 H, s, NHFi), 7.54
(br s, ENH2),
7.60 ( 1 H, s, NHI~, 8.07 (2 H, t, Ja,NH 6.8, 2 lysyl ENH), 8.15 ( 1 H, t,
Ja,NH 6.2, (3-
alanyl NH), 8.24 ( 1 H, t, J~,HH 6.3, 1 lysyl ENH), 8.25-8.27 (2 H, m, 2 lysyl
°'NH), 8.31
and 8.32 (2 x 1 H, 2 t, Ja,NH 6.3, 2 glycyl NH), 8.42 (1 H, d, Ja,NH 6.8, 1
lysyl «NH),
8.47 ( 1 H, d, Ja,NH 6.3, 1 lysyl °'NH), 8.61 (2 H, d, Ja,NH 7.6, 2
cystéyl NH) ;
Spectre ESI-MS : m/z 1660.4 (M-H)-, 829.9 (M-2H)Z'.
CA 02388663 2002-O1-29
WO 01/09173 34 PCT/FR00/02194
Composé 22
Spectre RMN 1H
8H(300 MHz; HZO-D20 90:10) 1.22-1.28 (8 H, m, 8 lysyl y-H), 1.34-1.43 (6 H, m,
6
lysyl 8-H), 1.52 (2 H, m, 2 lysyl 8-H), 1.57-1.64 (8 H, m, 8 lysyl (3-H), 1.65-
1.99 (16
H, m, 8 2-H and 8 6-H), 2.33 (2 H, t, Ja,p 6.3, 2 ~i-alanyl a-H), 2.69-2.84 (4
H, m, 2
cystéyl (3-H and 2 lysyl E-H), 2.92 (2 H, dd, Ja,p 5.3 and Jp,p~ 14, 1 2
cystéyl (3-H),
2.98-3.11 (6 H, m, 6 lysyl s-H), 3.15 and 3.19 (2 x 2 H, 2 s, 2 CHZ), 3.23 and
3.34 (2 x
1 H, 2 ddt, Ja,p 5.3, Jp,p~ 13.0 and Jp,NH 5.7, 2 (3-alanyl (3-H), 3.38 (4 H,
dd, J3,4 3.1 and
Ja,S 9.7, 4 4-H), 3.76 and 3.77 (4 H, 2 t, JQ,NH 6.3, 2 glycyl a-H), 3.87-3.96
(4 H, m, 4
5-H), 4.06 (4 H, br s, 4 3-H), 4.10-4.16 (4 H, m, 4 lysyl a-H), 4.60-4.64 (2
H, m, 2
cystéyl ~i-H), 6.73 and 7.42 (2 x 1 H, 2 s, NHH and NHl~, 7.96 (1 H, t, Ja,~
5.7, (3-
alanyl NH), 8.07 (1 H, t, Ja,NH 6.3, 1 lysyl ENH), 8.10 (1 H, t, Ja,NH 6.9, 1
lysyl ENH),
8.11 (2 H, t, Ja,NH 6.3, 2 glycyl NH), 8.12 ( 1 H, t, JE,NH 6.8, 1 lysyl ~NH),
8.13 (2 H, d,
Ja,NH 6.8, 2 lysyl «NH), 8.25 ( 1 H, d, Ja,NH 6.7, 1 lysyl °'NH), 8.29
( 1 H, d, Ja,rrH 6.3, 1
lysyl °'NH), 8.39 (2 H, d, Ja,NH 7.6, 2 cystéyl NH ;
Spectre ESI-MS : m/z 1732.5 (M-H)', 865.6 (M-2H)2'.
Composé 23
Spectre ESI-MS : mesuré : 3235.0, calculé : 3235.6, m/z 1616.4 (M-2H)2-,
1077.3 (M-
3H)3-, 807.7 (M-4H)4'.
Composé 24
Spectre ESI-MS : mesuré : 3379.0, calculé : 3379.7, m/z 1688.3 (M-2H)z',
1125.3 (M-
3H)3', 843.8 (M-4H)4'.
Composé 25
Spectre ESI-MS : mesuré : 6382.0, calculé : 6383.0, m/z 1594.5 (M-4H)4',
1275.5 (M-
SH)5', 1062.8 (M-6H)6-, 910.8 (M-7H)''.
Composé 26
Spectre ESI-MS : mesuré : 6671.0, calculé : 6671.2, m/z 2221.9 (M-3H)3',
1666.7 (M-
4H)4', 1333.1 (M-SH)5', 1110.8 (M-6H)G', 952.0 (M-7H)''.
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WO 01/09173 35 PCT/FR00/02194
EXEMPLE 2 . PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
Quatre ligands - qui seront dénommés ligands 21F, 22F, 23F et 24F
dans ce qui suit - et répondant à la formule générale (III) dans laquelle
~ m représente un nombre entier égal à 4 ou 8,
B 1 représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique,
~ n est un nombre entier égal à 2 ou 4 (dans le cas où m est respectivement
égal à 4 et
8),
. X représente le reste d'un tripeptide de séquence (S 1 ) telle que définie
dans
l'exemple 1,
A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 2 ou 4 (dans le cas où m
est
respectivement égal à 4 et 8) résidus L-lysine et présentant, d'une part, 2 ou
4
groupes chloroacétyles pour sa liaison avec un nombre équivalent de
tripeptides et,
d'autre part, un groupe amine libre propre à permettre sa liaison avec Y,
. Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine,
M représente un groupe amide (-CO-NH-), N représente un groupe thioéther
(-CHZ-S-CHZ-CO-), tandis que P représente un groupe thiourée (-NH-CS-NH-),
ont été préparés en couplant les composés 1 et 3, après déprotection de leur
fonction
thiol dans des conditions identiques à celles décrites au ~ 1.4 dudit exemple
1, avec
des composés 13 et 14 ayant préalablement réagi avec du FITC.
Ainsi, comme décrit au ~ 1.4 de l'exemple 1, à une solution
contenant 1,5 équivalent (par groupe chloroacétyle devant réagir
ultérieurement) de
composé 1 ou de composé 3 dans 1 ml d'un mélange n-propanol/eau dégazés
(50:50),
a été ajouté 1 équivalent de tri-n-butylphosphine. Chaque mélange réactionnel
a été
laissé, sous agitation et sous azote, à température ambiante pendant 24
heures, puis les
solvants ont été évaporés sous pression réduite et les résidus ont été séchés
sous vide
pendant 15 minutes.
Par ailleurs, 1 équivalent (1-2,5 p,moles) de composé 13 ou 14 a été
mis à réagir avec 1,1 équivalent de FITC et 4 équivalents de
düsopropyléthylamine
dans 1 ml de DMF dégazé, à température ambiante et à (obscurité, pendant 4
heures
au terme desquelles chaque mélange réactionnel a été ajouté à une solution
comprenant l'un des résidus précédemment obtenus dans 300 u1 d'eau dégazée.
Les
CA 02388663 2002-O1-29
WO 01/09173 36 PCT/FR00/02194
parois des récipients contenant lesdits mélanges réactionnels ont été rincées
avec
200 ~.l de DMF dégazé et le pH des différents mélanges réactionnels a été
amené à
une valeur de 8-8,5 par addition de carbonate de potassium.
Ces mélanges réactionnels ont ensuite été laissés à (obscurité
pendant 48 heures, les réactions étant contrôlées par des RP-HPLC. Puis,
chaque
mélange réactionnel a été dilué dans de Peau contenant 10% d'acide acétique et
lyophilisé et les résidus ont été purifiés par des RP-HPLC semi-préparatives.
Ont été ainsi obtenus
~ 1,82 mg de ligand 21F (Rdt : 46%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
75:25
en 15 minutes, puis 75:25 à 65:35 en 30 minutes,
~ 1,42 mg de ligand 22F (Rdt : 27%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
75:25
en 15 minutes, puis 75:25 à 65:35 en 30 minutes,
~ 4,56 mg de ligand 23F (Rdt : 62%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
85:15
en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 en 30 minutes,
~ 3,57 mg de ligand 24F (Rdt : 50%) en utilisant un gradient (A/C) : 100:0 à
85:15
en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 en 30 minutes,
se présentant tous sous la forme d'une poudre blanche.
Les structures chimiques de ces ligands sont représentées sur les
Figures 3 et 4.
Leurs spectres ESI-MS sont les suivants
~ ligand 21F : m/z 2123.5 (M-H)-, 1062.3 (M-2H)Z'
~ ligand 22F : mesuré : 2051.0, calculé : 2051.2, m/z 1026.1 (M-2H)Z'
~ ligand 23F : mesuré : 3769.0, calculé : 3769.1, m/z 1254.9 (M-3H)3', 941.2
(M-
4H)°-
~ ligand 24F : mesuré : 3624.0, calculé : 3624.1, m/z 1207.0 (M-3H)3-, 905.4
(M-
4H)4-.
EXEMPLE 3 . PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
Deux ligands répondant à la formule générale (III) dans laquelle
~ m est un nombre entier égal à 3,
~ B ~ représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique,
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WO 01/09173 37 PCT/FR00/02194
~ n est un nombre entier égal à 0 (en sorte que X est absent),
. A représente le reste d'un enchaînement linéaire A' comprenant 3 résidus L-
lysine
et présentant 3 groupes amines libres pour son couplage avec les trois
molécules
d'acide (-)-shikimique ou (-)-quinique et étant, d'autre part, lié à Y via une
liaison
amide,
Y représente un composé d'intérêt formé par trois résidus Arg-Gly-Arg liés à
un
épitope de classe II, en l'espèce le peptide 323-339 d'ovalbumine de poule
(qui sera
dénommé Ova 323-339 dans ce qui suit),
M et P représentent un groupe amide (-CO-NH-),
ont été préparés.
La préparation de ces ligands a été réalisée en procédant
~ en premier lieu, à la synthèse, sur un support solide, d'un peptide
présentant la
séquence (S2) suivante
323
Ac-Cys [S-(tert-butylthio)]-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Lys(Mtt)-Arg(Pmc)-Gly-Arg
(Pmc)-Ile-S er('Bu)-Gln(Trt)-Ala-V al-His(Trt)-Al a-Ala-His(Trt)-Ala-
339
Glu('Bu)-Ile-Asn(Trt)-Glu('Bu)-Ala-Gly-Arg(Pmc) (S2)
dans laquelle
- les 17 résidus acide aminé situés à l'extrémité C-terminale correspondent à
la
séquence du peptide Ova 323-339,
- le groupe formé par les 3 résidus Arg-Gly-Arg situés en amont de la séquence
dudit peptide Ova 323-339 représente un groupe sensible aux endopeptidases,
- le groupe formé par les 3 résidus Lys-Lys-Lys correspond à (enchaînement des
L-lysine, tandis que
- le résidu S-(tert-butylthio)-L-cystéine acétylée situé à l'extrémité N-
terminale
est destiné à permettre un couplage ultérieur du ligand, par exemple pour
l'obtention d'un dimère ;
~ puis, au couplage des résidus L-lysine de ce peptide et des acides (-)-
shikimique et
(-)-quinique (sous la forme de son dérivé tétra-O-acétylé), par formation
d'une
liaison amide entre les groupes s-amine desdits résidus L-lysine et les
groupes
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WO 01/09173 38 PCT/FR00/02194
carboxyles desdits acides.
Ces ligands seront dénommés respectivement ligand 25 et ligand 28
dans ce qui suit.
Le peptide de séquence (S2) a été synthétisé à une échelle de
0,25 mmole à partir de 337 mg d'une résine MBHA Rink amide chargée à
0,74 mmoles/g (Société SENN CHEMICALS), et en utilisant
- une stratégie Fmoc/tert-butyle pour la protection des acides aminés à
coupler,
- un groupe 2,2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle comme groupement
protecteur des chaînes latérales des L-arginines,
- un groupe tert-butyle comme groupement protecteur des chaînes latérales des
L-sérine et acides L-glutamique,
- un groupe trityle comme groupement protecteur des chaînes latérales de la
L-asparagine, de la L-glutamine et des L-histidines,
- un groupe 4-méthyltrityle comme groupement protecteur des chaînes latérales
des
L-lysines,
- un mélange HBTU/HOBt/DIEA dans du DMF, en tant que réactifs d'activation
pour le couplage des acides aminés,
- un mélange pipéridine/DMF pour éliminer les groupements protecteurs Fmoc, et
- des tests à la ninhydrine et au TNBS pour le contrôle des opérations de
couplage et
de déprotection.
Les couplages des 20 premiers acides aminés ont été réalisés de
façon automatisée au moyen d'un synthétiseur APPLIED BIOSYSTEMS ABI431,
tandis que les couplages des L-lysines et de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine
ont été
effectués manuellement.
Dans tous les cas, ces couplages ont été réalisés en utilisant
4 équivalents (par fonction amine devant réagir) d'acide aminé, en présence du
mélange HBTU/HOBtIDIEA (4:4:12 éq. par fonction amine devant réagir) dans du
DMF, et en activant les acides aminés pendant 1 minute avant de les ajouter à
la
résine. En pratique, le HBTU (4 éq.) a été dissout dans du DMF, puis ajouté à
une
solution contenant (acide aminé à coupler, l'HOBt (4 éq.) et la DIEA (8 éq.)
dans du
DMF. L'ensemble a été mélangé pendant 1 minute, puis ajouté à la résine
préalablement imbibée par du DMF. Le mélange réactionnel résultant a été agité
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mécaniquement pendant toute la durée de la réaction, c'est-à-dire pendant 40
minutes
pour les couplages automatisés et 45 minutes pour les couplages manuels.
Les couplages des L-lysines et de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine ont
tous été suivis d'un traitement de la résine par un mélange Ac20/DIEA/DCM
(5:10:85) d'une durée de 10 minutes destiné à acétyler les groupes amines qui
n'auraient pas été couplés.
Par ailleurs, entre chaque opération de couplage, la résine a été
successivement filtrée, lavée avec du DMF (3 x 2 minutes) et du DCM
(3 x 2 minutes), traitée par un mélange pipéridine/DMF (20:80) pour obtenir le
clivage
des groupements Fmoc, et lavée à nouveau avec du DMF (2 x 2 minutes) et du DCM
(3 x 1 minute).
A (issue du couplage de la S-(tert-butylthio)-L-cystéine et de son
acétylation, les groupes protecteurs 4-méthyltrityles des résidus L-lysine ont
été
hydrolysés en lavant la résine avec un mélange TFA/DCM (1:99) en flux continu
jusqu'à disparition de sa coloration jaune.
Les couplages du peptide de séquence (S2) avec les acides
(-)-shikimique et (-)-quinique ont été réalisés en faisant réagir, à
température ambiante
et pendant 45 minutes, des fractions de la résine ainsi lavée avec 4
équivalents d'acide
(-)-shikimique ou 4 équivalents d'acide tétra-O-acétyl-(-)-quinique
préalablement
activés par 4 équivalents de HBTU et 4 équivalents de HOBt, en présence de 12
équivalents de DIEA dans du DMF, et en contrôlant les réactions par des tests
à la
nynhidrine et au TNBS.
Le clivage des produits résultants et leur déprotection ont été réalisés
en traitant la résine par 10 ml d'un mélange TFA/H20fPr3SiH (95:2,5:2,5) par
gramme de résine, à température ambiante et pendant 90 minutes. A la suite de
quoi,
ils ont été successivement précipités dans du diéthyléther froid, centrifugés,
dissout
dans de Peau, lyophilisés et purifiés par une RP-HPLC semi-préparative
[gradient
(A/B) : 100:0 à 50:50 en 120 minutes].
Ont été ainsi obtenus
~ 48 mg de ligand ZS (Rdt : 29%) en utilisant un gradient (A/B) : 100:0 à
50:50 en
100 minutes ; et
~ 25 mg d'un composé 26 (Rdt : 15%) en utilisant un gradient (A/B) : 100:0 à
60:40
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en 100 minutes.
Ce composé 26 a été soumis à une désacylation pour obtenir le
ligand 28. Pour ce faire, à 23 mg du composé 28 en solution dans 10 ml de
méthanol
distillé sur magnésium, ont été ajoutés 300 u1 d'une solution 1M de
méthanolate de
sodium dans du méthanol. Le mélange réactionnel a été agité à température
ambiante,
sous azote, pendant 45 minutes et la réaction a été stoppée par l'addition de
quelques
gouttes d'acide acétique. Le brut réactionnel a été concentré sous pression
réduite et a
été purifié par RP-HPLC en utilisant un gradient (AB) : 100 :0 à 80 :20 en 30
minutes, puis 80 :20 à 70 :30 en 25 minutes, puis isocratique pendant 10
minutes pour
conduire à 15 mg de ligand 28 (Rdt : 75%).
Les spectres ESI-MS des ligands 25 et 28 sont les suivants
~ ligand, 25 : mesuré : 3228.0, calculé : 3228.7, m/z 1076.9 (M+3H)3+, 808.0
(M+4H)'+, 646.7 (M+SH)5+
~ ligand 28 : mesuré : 3283, calculé : 3282.7, m/z 1641.9 (M+2H)z+, 1094.9
(M+3H)3+, 821.4 (M+4H)4+, 657.4 (M+SH)5+.
EXEMPLE 4 . PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
Deux ligands répondant à la formule générale (III) conforme à
l'invention (Figure 5), dans laquelle
~ m est un nombre entier égal à 2,
~ n est un nombre entier égal à 1,
~ y est un nombre entier égal à 1,
~ B~ représente un reste acide (-)-quinique (ligand 33F) ou (-)-shikimique
(ligand
34F),
~ A représente le reste d'un dipeptide comprenant 1 résidu L-lysine et 1
résidu
(3-alanine (N°'-(chloroacétyl)-L-lysyl-~3-alanine-amide, dont la
structure chimique
est représentée sur la Figure 5),
~ X représente un tripeptide de formule (S 1 ), telle que définie dans
l'exemple 1,
. Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine,
~ M, N et P représentent respectivement un groupe amide (-CO-NH-),
thioéther (-CHZ-S-CHz-CO-) et thiourée (-NH-CS-NH-),
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ont été préparés.
a) Préparation du dipeptide Na-(chloroacétyll-L-lysyl-Q-alanine-
amide.
Ce dipeptide est synthétisé manuellement à l'aide d'une résine Rink
amide-AM-PS (0.70 mmol/g, Senn Chemicals) en utilisant une stratégie Fmocltert-
butyle, à une échelle de 0.7 mmole. Le couplage est suivi par un test au TNBS
: du
HBTU dissous dans du NMP (4 éq.), est ajouté à un mélange de l'acide aminé (4
éq.),
d'HOBt (4 éq.) et de DIEA (8 éq.) dans le NMP. Après 1 minute d'agitation, le
mélange réactionnel est ajouté à la peptidyl-résine (1 éq.) préalablement
imbibée de
NMP comprenant du DIEA (4 éq.), et agité pendant 40 minutes. La peptidyl-
résine
(c'est-à-dire dire la séquence peptidique sur support solide) est filtrée,
lavée par du
NMP (3 x 2 minutes) et du CHZC12 (3 x 2 minutes). Les groupements protecteurs
Fmoc sont supprimés par un traitement avec de la pipéridine à 20% dans le NMP
(1 x
2 minutes, 1 x 20 minutes), suivi d'un lavage avec du NMP (2 x 2 minutes) et
du
CHZCIz (2 x 1 minutes). Après la seconde étape de couplage, la peptidyl-résine
est
déprotégée et acylée en utilisant un excès (4 éq.) d'anhydride chloroacétique,
préparé
via une activation DIC. Enfin, le dipeptide est séparé du support et déprotégé
sous
l'action d'un mélange TFA-TIS-HZO 90:5:5 (11 ml par gramme de peptidyl-
résine),
pendant 1,5 h à température ambiante, précipité dans un mélange diéthyléther-
heptane
(1:l) froid, centrifugé, dissous dans l'eau et lyophilisé. Le dipeptide (184
mg, 65%)
est obtenu sous la forme d'une poudre blanche après purification par RP-HPLC
(avec
le gradient suivant : 100:0 à 90:10 (A/B) en 20 minutes), suivie d'une
lyophilisation.
Son analyse est la suivante : TOF-PDMS m/z 292.6 (M+H)+; RMN 1H (D20-H20
10:90): 8 8.37 (d, J = 6.8 Hz, 1 H, lysyl «NH), 8.07 (t, J = 5.7 Hz, 1 H, (3-
alanyl NH),
7.40 (s large, 1H, NHZ), 4.11 (dt, J= 6.8 et 6.8 Hz, 1H, lysyl a-H), 4.01 (s,
2H, CHZ),
3.31 (dt, J = 5.7 et 6.6 Hz, 2H, (3-alanyl (3-H), 2.84-2.81 (m, 2H, lysyl E-
H), 2.33 (t, J
= 6.6 Hz, 2H, ~3-alanyl a-H), 1.72-1.53 (m, 4H, lysyl (3- et 8-H), 1.42-1.22
(m, 2H,
lysyl y-H); RMN 13C (D20-Hz0 10:90): S 175.7, 172.4, et 168.6 (3 COIS, 53.2
(lysyl
a-C), 41.0 (CHZ), 38.4 (lysyl s-C), 34.8 et 33.5 ((3-alanyl ci-C et ~i-C),
29.4 (lysyl (3
C), 25.3 (lysyl 8-C), 21.0 (lysyl y-C).
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WO 01/09173 42 PCT/FR00/02194
b) Obtention des ligand ds repondant à la formule générale (III
conforme à l'invention.
Le couplage du dipeptide préparé en a) avec, d'une part, les
tripeptides porteurs des restes (-)-shikimique (composé 1) et (-)-quinique
(composé 3),
dont la synthèse est décrite dans l'exemple 1, et d'autre part, avec une
molécule de
fluorescéine, est effectué conformément au protocole décrit dans l'exemple 2.
On
obtient ainsi les ligands 33F et 34F.
5,04 mg (80% de rendement) de ligand 33F ont été obtenus sous la
forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC (gradient : 100:0 à
85:15 (A/C) en 15 minutes, puis 85:15 à 75:25 (A/C) en 30 minutes, puis
gradient
isocratique), suivie d'une lyophilisation. Analyse du ligand 33F : ESI-MS
positive m/z
1300.3 (M+H)+, 650.8 (M+2H)2+; RMN 'H (DMSO-db): 8 10.2 (s large, 1H,
NH-fluor), 8.40-8.32 (m, 3H, H-fluor, lysyl °'NH et lysyl ~NH), 8.31
(t, J = S.1 Hz,
1 H, glycyl NH), 8.24 (d, J= 7.8 Hz, lysyl "NH), 8.10 (t, J = 5.2 Hz, 1 H, (3-
alanyl
NH), 7.82-7.80 (m, 2H, cysteinyl NH et lysyl ENH), 7.80 (d, J = 8.3 Hz, H-
fluor),
7.41 (s large, 1H, NHH), 7.22 (d, J = 8.3 Hz, H-fluor), 6.90 (s large, 1H,
NHF~,
6.74-6.60 (m, 6H, 6 H-fluor).
2,42 mg (80% de rendement) de ligand 34F ont été obtenus sous la
forme d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC (gradient : 100:0 à
85:15 (A/C) en 15 minutes, puis 85:15 à 70:30 (A/C) en 50 minutes), suivie
d'une
lyophilisation. Analyse du ligand 34F : ESI-MS positive m/z 1264.4 (M+H)+,
632.8
(M+2H)2+; ~ 'H (DMSO-d6): 8 10.07 (s, 1H, OH), 9.81 (s large, 1H, NH-fluor),
8.22 (t, J = 5.7 Hz, 1 H, glycyl NH), 8.20 (s large, 1 H, H-fluor), 8.11 (d, J
= 8.0 Hz,
2H, 2 lysyl aNH), 8.01 (t, J = 5.6 Hz, 1H, lysyl ENH), 7.99 (t, J = 5.8 Hz, (3-
alanyl
NH), 7.77 (t, J = 5.6 Hz, 1 H, lysyl ENH), 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 1 H, cysteinyl
NH), 7.69
(d large, J= 8.3 Hz, H-fluor), 7.28 (s large, 1H, NHH), 7.12 (d, J= 8.3 Hz, H-
fluor),
6.80 (s large, 1H, NHI~, 6.74-6.60 (m, 6H, 6 H-fluor), 6.31 et 6.22 (2 s
larges, 2
shikimoyl H-2).
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EXEMPLE 5 . PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
Quatre ligands répondant à la formule générale (III) conforme à
l'invention, dans laquelle
~ m est un nombre entier égal à 8,
~ n est un nombre entier égal à 4,
~ y est un nombre entier égal à 1,
~ B ~ représente un reste acide (-)-shikimique ou (-)-quinique,
~ Y représente le reste d'une molécule de fluorescéine,
. A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 4 résidus L-lysine et
présentant 4 groupes chloroacétyles pour sa liaison avec 4 tripeptides, et un
groupe
amine,libre propre à permettre sa liaison avec Y,
~ X représente le reste d'un tripeptide de séquence (S2) ou (S3), telles
qu'elles
seront définies ci-dessous,
. M, N et P représentent respectivement un groupe amide (-CO-NH-),
thioéther (-CHz-S-CHZ-CO-) et thiourée (-NH-CS-NH-),
ont été préparés selon le protocole suivant.
a) Préparation du composé Q, dérivé de l'acide 4uinique dans lequel
les hydroxvles situés aux positions 3 et 4 sont protégés sous forme d'un
diacétal
Fi ure 6 .
Le composé Q, à savoir l'acide (1s°, 3R, 4s", 5R, 2'S, 3'S)-3,4-D-
(2',3' -diméthoxybutane-2',3'-diyl)-1,3,4, 5-tétrahydroxycyclohexane-1-
carboxylique,
est obtenu à partir 980 mg (3.06 mmol) de l'ester méthylique de l'acide 3,4-0-
(2',3'-
diméthoxybutane-2',3'-diyl)-1,3,4,5-tétrahydroxycyclohexane-1-carboxylique
(décrit
par J.L. MONTCHAMP et al. dans J. Org. Chem., 1996, 61, 3897-3899) dissous
dans
12 ml d'une solution MeOH-aq/NaOH 0.1 M (1:1). Le mélange réactionnel est
agité à
température ambiante pendant 2 h et concentré sous pression réduite. Le résidu
est
séparé à l'aide d'EtOAc et d'acide citrique aqueux (0,1 M). La phase aqueuse
est
extraite deux fois avec EtOAc. Les phases organiques sont réunies, séchées sur
NazSOa, filtrées et concentrées sous pression réduite. On obtient 780 mg
(rendement
de 80%) du composé Q après cristallisation dans Et20-heptane. RMN ~H : 8 (DMSO-
dh) 4.05 ( 1 H, ddd, J 4.6, 10.1 et 12.6 Hz, H-5), 3.89 ( 1 H, s large, H-3),
3.31 ( 1 H, dd,
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J 2.8 et 10.1 Hz, H-4), 3.15 (2 x 3 H, s, 2 OCH3), 1.89 (1 H, dd, J4.6 et 12.6
Hz, H-6),
1.74-1.64 (3 H, m, 2 H-2 et H-6'), 1.23 et 1.14 (2 x 3 H, 2 s, 2 CH3); RMN '3C
: b
(DMSO-d6) 177.0 (C00), 76.0 (C-1), 73.9 (C-4), 69.0 (C-3), 63.8 (C-5), 48.1 et
48.0
(2 OCH3), 39.1 et 39.5 (C-2 et C-6), 18.6 (2 CH3).
S b) Préparation des tripentides de séquences (S2) et (S31.
Ces tripeptides présentent les séquences suivantes
Lys-Cys(tert-butylthio)-Gly-OH (S2)
Lys-Cys(tert-butylthio)-Arg-NHZ (S3)
Les tripeptides (S2) et (S3) sont respectivement neutres et chargés
positivement en milieu physiologique, par opposition au peptide (S1) décrit
dans
l'exemple 1, qui est chargé négativement en milieu physiologique.
Ils sont obtenus selon le même protocole que celui décrit dans
l'exemple 1 pour la synthèse du peptide (S1), si ce n'est que les synthèses
ont été
réalisées à partir d'une résine Rink amide-AM-PS (0.70 mmol/g, Senn
Chemicals), à
une échelle de 0.2 mmole. Le groupement protecteur du Fmoc-L-Arg-OH est un
groupe 2,2,5,7,8-pentaméthylchroman-6-sulfonyle.
c) Couplage de l'acide shikimique et du dérivé de l'acide quinique
(composé Q) sur les peptides (S21 et (S3).
0,2 mmole de chaque peptidyl-résine (c'est-à-dire la séquence
peptidique sur support solide), à savoir 0,2 mmole de séquence (S2), d'une
part, et
0,2 mmole de séquence (S3), d'autre part, sont mis en présence de 123 mg (0.4
mmol,
2 éq.) du composé Q, en présence de BOP (177 mg, 0,4 mmol, 2 éq.) et de DIEA
(140 p.1, 0,8 mmol, 4 éq.) dans le DMF pendant 1 h et à température ambiante.
La
peptidyl-résine est ensuite lavée par du DMF (2 x 2 minutes) et du CHZCIz (3 x
1
minute). Le couplage est effectué une seconde fois.
Par ailleurs, 0,2 mmole de chaque peptidyl-résine sont mis en
présence de 61 mg (0,44 mmol, 2,2 éq.) d'acide shikimique, en utilisant un
activation
par HBTU-HOBt-DIEA [(166 mg, 0,44 mmol, 2,2 éq.), (67 mg, 0,44 mmol, 2,2 éq.),
(146 ml, 0,84 mmol, 4,2 éq.)J dans le NMP, pendant 40 minutes à température
ambiante. La peptidyl-résine est ensuite lavée par du DMF (2 x 2 minutes) et
du
CHZCl2 (3 x 1 minute). Le couplage est effectué une seconde fois.
Les peptidyl-résines sont ensuite lavées par EtzO. Les peptides sont
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séparés du support solide au moyen d'un traitement par un mélange TFA-Hz0-
iPr3SiH
95:2.x:2.5 (10 ml par gramme de peptidyl-résine), pendant 1 h à température
ambiante, précipités dans un mélange diéthyléther-heptane froid, centrifugés,
dissous
dans l'eau, puis lyophilisés. On obtient les peptides (S2)q, (S2)s, (S3)q et
(S3s), qui
correspondent respectivement aux tripeptides (S2) et (S3) portant deux restes
d'acide
quinique (peptides (S2)q et (S3)q) ou deux restes d'acide shikimique (peptides
(S2)s
et (S3)s), comme représentés sur les Figures 6 et 7.
~ Peptide (S'~q
Il s'agit du Na,NE-di-[(ls",3R,4s°,SR)-1,3,4,x-tétrahydroxycyclo-
hexane-I-carbox-1-yl]-L-lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-glycine-amide.
On
obtient 35.6 mg (rendement de 24%) de ce produit sous la forme d'une poudre
blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 72:28 (AB) pendant
20
minutes, puis 72:28 à 62:38 (AB) pendant 30 minutes] suivie d'une
lyophilisation.
RMN IH : 8 (DZO-H20 5:95) 8.50 (1 H, d, J 6.9 Hz, Cysteinyl NH), 8.35 (1 H, t,
J 5.9
Hz, Glycyl NH), 8.16 ( 1 H, d, J 6.9 Hz, Lysyl °'NH), 8.12 ( 1 H, d, J
6.1 Hz, Lysyl
eNH), 7.30 et 7.00 (2 x 1 H, 2 s large, NHZ), 4.52 (1 H, m, Cysteinyl aH),
4.16 (1 H,
dt, J 6.9 et 5.9 Hz, Lysyl aH), 4.09-4.08 (2 H, m, 2 H-3), 3.97-3.90 (2 H, m 2
H-5),
3.85 (1 H, dd, J 5.9 et 10.4 Hz, Glycyl aH), 3.72 (1 H, dd, J 5.9 et 10.4 Hz,
Glycyl
aH), 3.43-3.38 (2 H, m, H-4), 3.14-3.09 (2 H, m, Lysyl sH and Cysteinyl ~3H),
2.94 (1
H, dd, J 8.5 et 14.0, Cysteinyl (3H), 2.05-1.6~ (6 H, m, 2 H-2, 2 H-6 etLysyl
[3H),
1.45-1.38 (1 H, m, Lysyl 8H), 1.23-1.19 (2 H, m, Lysyl yH), 1.20 (3 x 3 H, s,
3 CH3);
RMN 13C: s (DZO-Hz0 5:95) 17î.5, 177.2, 174.7, 174.3 et 172.8 (~ COIS, 77.1 (2
C-
1), 75.~ et 75.4 ( 2 C-4), 70.8 (2 C-3), 66.8 et 66.7 (2 C-5), 54.4 (Lysyl
aC), 53.5
(Cysteinyl aC), 48.6 [C(CH3);], 42.8 (Glycyl aC), 40.7 (2 C-6), 40.3
(Cysteinyl (3C),
39.4 4 (Lysyl sC), 37.5 (2 C-2), 30.8 (Lysyl (3C), 29.4 [C(CHz);], 28.3 (Lysyl
8C),
22.7 (Lysyl yC); ml~ (TOF-PDMS) 765 (M+Na)+.
~ Peptide (S?js
Il s'agit du l~'~,lV~ di-[(3R.4S.SR)-3,4,x-trihydroxy-1-cyclohexene-
carbox-1-yl]-L-lysyl-[S-(tert-but<~lthio)]-L-cysteinyl-glycine-amide. On
obtient 56 mg
(rendement de 40%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après
purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 ( AB) pendant 10 minutes,
puis
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90:10 à 85:15 (A/B) pendant 15 minutes, puis gradient isocratique (A/B)]
suivie d'une
lyophilisation. RMN'H : b (D20-H20 5:95) 8.46 (1 H, d, J 7.1 Hz, Cysteinyl
NH),
8.27 ( 1 H, t, J 5.8 Hz, Glycyl NH), 8.08 ( 1 H, d, J 6.2 Hz, Lysyl "NH), 7.87
( 1 H, t, J
~.~ Hz, Lysyl ENH), 7.26 et 7.0 (2 x 1 H, s large, NHZ), 6.28 et 6.22 (2 x 1
H, 2 d
larges, J 3.7 Hz, 2 H-2), 4.50 ( 1 H, m, Cysteinyl aH), 4.26 (2 H, m, 2 H-3),
4.17 ( 1 H,
dt, J 6.2 et 6.4, Lysyl aH), 3.89-3.83 (2 H, m, 2 H-5), 3.80 et 3.76 (2 x 1 H,
2 dd, J 5.8
et 15.4 Hz, 2 Glycyl aH), 3.71-3.54 (2 H, m, 2 H-4), 3.12-3.06 (2 H, m, Lysyl
EH et
Cysteinyl [3H), 2.90 ( 1 H, dd, J 8.9 et 14.0 Hz, Cysteinyl ~3H), 2.62-2.53 (2
H, m, 2 H-
6), 2.05 (2 H, dd, J6.9 et 18.7 Hz, 2 H-6'), 1.76-1.56 (2 H, m, 2 Lysyl [iH),
1.43-1.37
(2 H, m. 2 Lysyl 8H), 1.27-1.15 (2 H, m, 2 Lysyl yH), 1.15 (3 x 3 H, s, 3
CH3); REIN
~3C : S (Dz0-H~0 5:95) 175.0, 174.4, 172.9, 171.0 et 170.5 (~ CON), 133.7 et
133.0
(2 C-2), 132.2 et 131.0 (2 C-1), 72.0 et 71.9 (2 C-3), 66.8 et 66.3 (2 C-4 et
2 C-5),
55.0 (Lysyl aC), 53.7 (Cysteinyl aC), 48.7 [C(CH3)3J, 42.7 (Glycyl acC), 40.2
(Cysteinyl ~C), 39.8 (Lysyl $C), 31.7 et 31.5 (2 C-6), 30.6 {Lysyl ~3C), 29.4
[C(CH3)3J, 28.3 (Lysyl SC), 22.9 (Lysyl yC); m/z (TOF-PDMS) 729 (M+Na)+.
~ Peptide (S3)q
Il s'agit du Na,l~ di-[(ls",3R,4s°,SR)-1,3,4,5-tétrahydroxycyclo-
hexane-1-carbox-1-yl]-L-lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-L-arginine-
amide. On
obtient 45 mg (rendement de 24%) de ce produit sous la forme d'une poudre
blanche,
après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 85:15 (A/B) pendant 15
minutes,
puis 85:15 à 75:25 (A/B) pendant 30 minutes) suivie d'une lyophilisation. RMN
1H : S
(D20-H~0 5:95) 8.39 (1 H, d, J7.0 Hz, Cysteinyl NH), 8.27 (1 H, d, J7.5 Hz,
Lysyl
"NH), 8.14 ( 1 H, d, J 6.9 Hz, Arginyl "NH), 8.12 ( 1 H, t, J 6.1 Hz, Lysyl
~NI~, 7.42 et
7.0 (2 H. 2 s, NHZ), 7.1 (1 H, t, J5.3 Hz, Arginyl iVri), 6.55 (s large,
guanidinium),
4.50 ( 1 H, m, Cysteinyl aH), 4.30-4.10 (2 H, m, Arginyl aH et Lysyl aH), 4.09
(2 H,
s large, 2 H-3), 3.98-3.89 (2 H, m, 2 H-5), 3.43-3.37 (2 H, m, 2 H-4), 3.10-
3.05 (5 H,
m, 2 Arginyl 8H, 2 Lysyl sH et Cysteinyl ~3H), 2.97 ( 1 H, dd, J 8.9 et 14.0
Hz,
Cysteinyl ~3H), 1.95-1.54 (8 H, m, 2 Arginyl [iH, 2 Lysyl ~iH, 2 H-2 et 2 H-
6), 1.55-
1.48 (2 H, m, 2 :lrginyl yH), 1.49-1.32 (2 H, m, 2 Lysyl 8H), 1.27-1.15 ( 2 H,
m, 2
Lysyl yH), 1.20 ( 3 x 3 H, s, 3 CH3); RMN ~3C : b (D20-H~O 5:95) 177.5, 177.2,
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176.2, 174.5 et 172.1 (5 CON), 157.3 [NH(C=NH)NHz], 77.2 (2 C-1), 75.5 (2 C-
3),
70.9 et 70.8 (2 C-5), 66.8 et 66.7 (2 C-4), 55.6 (Cysteinyl aH), 53.6 (Lysyl
aH et
Arginyl aH), 48.8 [C(CH3)3], 41.0 et 40.5 6 (Cysteinyl [iH et Arginyl 8H),
40.7 (2 C-
6), 39.4 (Lysyl sH), 37.5 (2 C-2), 30.9 (Lysyl (3H), 29.4 [C(CH3)3], 28.6 et
28.4 (Lysyl
8H et Arginyl~3H), 24.9 (Arginyl yH), 22.7 (Lysyl yH); m/z (TOF-PDMS) 842
(M+H)+.
~ Peptide (S3)s
Il s'agit du lVal~ di-[(3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexene-
carbox-1-yl]-L-lysyl-[S-(tert-butylthio)]-L-cysteinyl-L-arginine-amide. On
obtient 48
mg (rendement de 26%) de ce produit sous la forme d'une poudre blanche, après
purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes,
puis
90:10 à 85:15 (A/B) pendant 12 minutes, puis gradient isocratique] suivie
d'une
lyophilisation. RMN 1H : 8 (DZO-Hz0 5:95) 8.40 (1 H, d, J 6.8 Hz, Cysteinyl
NH),
8.14 ( 1 H, d, J 7. 8 Hz, Lysyl °'NH), 8.11 ( 1 H, d, J 7.7 Hz, Arginyl
°'NH), 7.92 ( 1 H, t,
J 5.7 Hz, Lysyl eNH), 7.39 et 7.05 (2 x 1 H, 2 s large, NHZ), 7.07 (1 H, t, J
5.4 Hz,
Arginyl sNH), 8.40 (1 H, d, J 6.8 Hz, Cysteinyl NH), 6.55 (s large,
guanidinium), 6.36
et G.27 (2 x 1 H, 2 d large, J3.9 Hz, 2 H-2), 4.52 (1 H, m, Cysteinyl aH),
4.33-4.28 (2
H, m, 2 H-3), 4.21-4.16 (2 H, m, Lysyl aH and Arginyl aH), 3.92-3.88 (2 H, m,
2 H-
5), 3.64-3.60 (2 H, m, 2 H-4), 3.15-2.96 (6 H, m, 2 Cysteinyl (3H, 2 Lysyl sH,
2
Arginyl 8H), 2.65-2.53 (2 H , m, 2 H-6), 2.10 (2 H, d large, J 6.6 Hz, 2 H-
6'), 1.78-
1.65 (4 H, m, 2 Lysyl (3H et 2 Arginyl (3H), 1.54-1.40 (2 H, m, 2 Lysyl 8H et
2
Arginyl yH), 1.31 (3 x 3 H, s, 3 CH3); RMN 13C : ~ (Dz0-Hz0 5:95) 176.3,
174.9,
172.3, 171.0 et 170.5 (5 CON), 157.2 [NH(C=NH)NHZ], 133.6 et 133.0 (2 C-2),
132.4
et 131.1 (2 C-1), 72.0 (2 C-3), 66.8 et 66.2 (2 C-4 and 2 C-5), 55.2 et 54.0
(Lysyl aC
et Arginyl aC), 53.6 (Cysteinyl aC), 48.9 [C(CH3)3], 41.0 (Cysteinyl (3C),
40.1
(Arginyl 8C), 39.7 (Lysyl sC), 31.6 (2 C-6), 30.6 (Lysyl (3C), 29.4 [C(CH3)3],
28.5 et
28.3 (Arginyl (3C et Lysyl SC), 24.9 (Arginyl yC), 22.9 (Lysyl yC); m/z (TOF-
PDMS)
805 (M+Na)+.
d) Préparation du ligand 41F (Figure 61.
6 éq. du peptide (S2)q sont mis en solution dans un mélange dégazé
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de nPrOH-Hz0 50:50 (1 ml). On y introduit 6 éq. de nBu3P. Le mélange est agité
à
température ambiante pendant 24 h, sous azote. Le solvant est évaporé sous
pression
réduite et le résidu obtenu est encore séché sous vide pendant 15 minutes. On
ajoute
500 ~,l du mélange dégazé DMF-aq NaOAc 0.1 M (90:10), puis 0,9 pmol (1 éq.) du
dendrimère de L-lysine 14, dont la préparation est décrite dans l'exemple 1.
Le milieu
réactionnel est agité pendant 24 h à température ambiante, l'avancement de la
réaction
étant suivi par RP-HPLC. De l'isothiocyanate de fluorescéine (4 éq.) est
ajouté et le
milieu est agité sous azote et à l'abri de la lumière pendant une nuit. Le
milieu est
dilué dans de l'eau, lyophilisé et purifié par RP-HPLC [gradient: 100:0 à
85:15 (AB)
pendant 15 minutes, puis 85:15 à 80:20 (AB) pendant 15 minutes, puis gradient
isocratique] pour donner 2,38 mg (rendement de 72%) du ligand 41F sous la
forme
d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé 3763.0,
calculé
3765.1 ; m/z 1883.0 (M+2H)2+, 1255.5 (M+3H)3+.
e) Préparation des ligands 42F (Figure 6), 43F et 44F (Fioure 7).
6 éq. du peptide (S2)s (ou du peptide (S3)s, ou encore du peptide
(S3)q) sont mis en solution dans un mélange dégazé de nPrOH-HZO 50:50 (1 ml).
On
y introduit 6 éq. de nBu3P. Le mélange est agité à température ambiante
pendant 24 h,
sous azote. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu obtenu
est encore
séché sous vide pendant 15 minutes, puis dissous dans 50 p.1 d'eau. 1 éq. (0,5-
1 p,mol)
du dendrimère de L-lysine 14, dont la préparation est décrite dans l'exemple
l, dans
300 p,1 de DMF comprenant 4 éq. de DIEA est ajouté à 1 éq. d'isothiocyanate de
fluorescéine. Le mélange est agité sous azote et à l'abri de la lumière
pendant 2 h. Une
fois la réaction achevée (d'après son suivi par RP-HPLC), le mélange est
ajouté au
milieu réactionnel contenant les composés peptidiques. Le pH du mélange est
ajusté à
8-8,5 par ajout de KZC03 solide. Le mélange est agité sous azote et à l'abri
de la
lumière pendant 24 h, à température ambiante, dilué dans de l'eau, lyophilisé
et purifié
par RP-HPLC pour donner les ligands 42F, 43F ou 44F.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 42F sous la forme
d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à
82:18 (AB) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 72:28 (AB) pendant 30 minutes],
suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé
3620.0,
calculé 3621.0 ; m/z 1207.7 (M+3H)3+, 1001.8 (M+3H-CZSH3gN50")3+, 905.9
CA 02388663 2002-O1-29
WO 01/09173 49 PCT/FR00/02194
(M+4H)4+.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 43F sous la forme
d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à
82:18 (A/B) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 72:28 (A/B) pendant 30 minutes],
suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la suivante : ESI-MS trouvé
4160.0,
calculé 4161.7 ; m/z 1387.6 (M+3H)3+, 1041.0 (M+4H)4+, 833.0 (M+SH)s+.
On obtient 1,3 mg (rendement de 36%) du ligand 44F sous la forme
d'une poudre blanche, après purification par RP-HPLC HPLC [gradient: 100:0 à
82:18 (A/B) pendant 18 minutes, puis 82:18 à 75:25 (A/B) pendant 21 minutes,
puis
gradient isocratique], suivie d'une lyophilisation. Son analyse est la
suivante : ESI-MS
trouvé 4016, calculé 4017.6 ; m/z 1339.9 (M+3H)3+, 1005.2 (M+4H)4+, 804.4
(M+SH)s+.
EXEMPLE 6 . PREPARATION DE LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
Deux ligands répondant à la formule générale (III) conforme à
l'invention, dans laquelle
m est un nombre entier égal à 4 ou à 8,
~ n est un nombre entier égal à 0 (et donc X est absent),
. y est un nombre entier égal à 1,
. B ~ représente un reste acide (-)-quinique,
. Y représente le reste d'un antigène,
~ A représente le reste d'un dendrimère A' comprenant 8 (dans le cas du ligand
51 représenté sur la Figure 10) ou 4 (dans le cas du ligand 52 représenté sur
la
Figure 11 ) résidus L-lysine,
~ M et P représentent respectivement des groupes thioéther (-CHz-S-CHZ-CO-)
et hydrazone (-CO-CH=N-NH-CHZ-CO-),
ont été préparés selon le protocole suivant.
Ces ligands sont obtenus par ligation de dérivés de l'acide quinique,
à savoir l'acide quinique fonctionnalisé pas une fonction thiol (composé G), à
un
dendrimère de lysine (dendrimère H ou I) et à un antigène peptidique (antigène
J ou
K), selon le protocole décrit ci-après.
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WO 01/09173 50 PCT/FR00/02194
a) Préparation du dérivé de l'acide q-uinique (composé G Fieure 8).
Le composé G représente le disulfure de 2-{N,N di-[(ls",3R,4s~,5R)-
1,3,4,5-tétrahydroxycyclohexane-1-carboxamido-1-yl]}éthyl. Il est obtenu en
mélangeant, pendant une nuit et à 50°C, 52 mg (0,3 mmol) d'acide
quinique lactone et
S 34 mg (1 éq.) de chlorhydrate de cystéamine, dans de l'eau dégazée contenant
du
KZC03 solide (pH 8-9). Le mélange est ensuite agité à température ambiante
pendant
24 h, en présence d'air, avant d'être purifié par RP-HPLC [gradient: 100:0 à
80:20
(A/C) pendant 15 minutes, puis isocratique], puis lyophilisé pour donner le
composé
G (70 mg, 71%) sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante
RMN IH : 8 = 8.24 (t, 3J(H,H) = 5.8 Hz, 2 H; 2 NH), 4.05 (ddd, 3J(H,H) = 3, 3
et 6.2
Hz, 2 H; 2 H-3), 3.90 (ddd, 3J(H,H) = 4.7, 9 et 11.6 Hz, 2 H; 2 H-S), 3.40 (t,
3J(H,H) _
6.4 Hz, 4,H; 2 CHZ), 3.38 (dd, 3J(H,H) = 3 et 9 Hz, 2 H; 2 H-4), 2.73 (t,
3J(H,H) = 6.4
Hz, 4 H; 2 CHZ), 1.94-1.83 (m, 6 H; 4 H-2 et 2 H-6), 1.77 (dd, 3J(H,H) = 11.6
et 13.4
Hz, 2 H; 2 H-6'); RMN 13C : b = 177.5 (2 COIS, 77.8 (2 C-1), 75.4 (2 C-4),
70.8 (2
C-3), 66.7 (2 C-5), 40.7 (2 C-6), 38.5, 37.5 et 37.1 (4 CHZ et 2 C-2); TOF-
PDMS:
m/z 469 [M+H]+.
b) Préparation des dendrimères H (Fig_ure 81 et I (Fieure 91.
~ Fonctionnalisation d'une résine amino-PEGA par un bras
espaceur.
On ajoute successivement, à une solution d'ester diméthylique de
l'acide (+)-2,3-O-isopropylidene-D-tartarique (733 p1), 7.2 p1 (4 éq.) d'eau
et 59.6 ~l
(4 éq.) de 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undéc-7-ène, à température ambiante. Le
milieu
réactionnel est agité pendant 1 h, puis ajouté à 0.1 mmol d'une résine amino-
PEGA
(0.4 mmol/g) imbibée dans une quantité minimale de DMF, la résine ayant, au
préalable, été neutralisée par 5% DIEA dans le CHZCIz (2 x 1 minute) et le DMF
(3 x
1 minute). On ajoute ensuite du BOP (177 mg, 4 éq.) dans le DMF (1 ml) et le
mélange obtenu est agité à température ambiante pendant 40 minutes. La résine
est
lavée par du DMF (4 x 2 minutes) et du CHZCIz (2 x Z minutes). Elle est
imbibée de
DMF et acylée par du 1,3-diaminopropane (0.65 ml) à température ambiante
pendant
1 h. Enfin, la résine est lavée par du DMF (3 x 1 minute) et du CHZCl2 (2 x 2
minutes).
CA 02388663 2002-O1-29
WO 01/09173 51 PCT/FR00/02194
~ Synthèse des dendrimères à base de L-lysine.
Ces dendrimères sont synthétisés sur la résine amino-PEGA
fonctionnalisée comme indiqué ci-dessus (0.2 mmol/g, Senn Chemicals) en
utilisant
une stratégie Fmoc/tert-Butyle, à une échelle de 0,1 mmole. Les étapes de
couplage
sont réalisées à l'aide d'un excès de 10 (pour les deux premiers couplages) ou
de 4 éq.
en acides aminés par rapport aux groupements amines réactionnels, l'activation
étant
effectuée par le mélange HBTU-HOBt-DIEA dans le NMP. Les couplages sont
suivis,
par exemple, par le test du TNBS, comme décrit dans l'exemple 4.
Le Fmoc-(3-Ala-OH est d'abord couplé à la résine. Les résidus
lysines sont ensuite introduits : la première lysine introduite est protégée
par un
groupement Boc, les autres lysines étant ajoutées sous la forme de leurs
dérivés Fmoc-
L-Lys(Fmoc)-OH. Après les quatrième et cinquième étapes de couplage, les
peptides
sont déprotégés en phase solide et acylés, dans du DMF, en utilisant un excès
(4 éq.)
d'anhydride chloroacétique, préparé en utilisant une activation au DCC. La
peptidyl-
résine est lavée par du DMF (3 x 1 minute), par du CHZCIZ (3 x 2 minutes) et
par EtzO
(2 x 1 minute), puis séchée. Les groupements Boc du E-NHZ du premier résidu
lysine
et du groupe isopropylidène du bras espaceur fixé sur le support sont éliminés
par un
traitement avec un mélange TFA-HZO-anisole 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 2 h à
température ambiante. La peptidyl-résine est lavée par du CHZC12 (5 x 1
minute) et par
EtaO (2 x 1 minute), puis séchée et imbibée d'AcOH aqueux. On y ajoute du
NaI04
(128.3 mg, 6 éq.) dissous dans un mélange AcOH aqueux (33%)/H20 1:l (2 ml). Le
mélange est agité pendant 5 minutes, puis 200 p1 d'éthylène glycol y sont
ajoutés. La
résine est lavée à l'eau (2 x 6 ml) et les filtrats récupérés sont purifiés
par RP-HPLC.
Après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 50:50 (A/B)
pendant 120 minutes] et lyophilisation, on obtient 28 mg (rendement de 31 %)
du
dendrimère H sous la forme d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante :
m/z
(ESI-MS positive) 1038.4 (M+H20)+, 1020.3 (M+H)+.
Après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 90:10 (A/B)
pendant 10 minutes, puis 90:10 à 70:30 (A/B) pendant 40 minutes, puis
isocratique] et
lyophilisation, on obtient 45 mg (rendement de 23,5%) du dendrimère I sous la
forme
d'une poudre blanche. Son analyse est la suivante : m/z (ESI-MS positive)
1855.5
(M+H20)+, 1838.3 (M+H)+, 919.5 (M+2H)2+.
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WO 01/09173 52 PCT/FR00/02194
c) Préparation des antigènes peptidigues J et K (Figure 81.
Les épitopes (séquences peptidiques dénomées HA3o~-3~9 et TTg3o-sab
sur la Figure 8) sont synthétisés sur une échelle de 0.25 mmole à l'aide d'une
résine
Rink amide-Nleu-AM-PS (0.38 mmol/g, Senn Chemicals), sur un synthétiseur
automatique de peptides Applied Biosystems A431. Le groupement protecteur des
chaînes latérales du Fmoc-L-Lys-OH est le groupe Boc ; le groupement
protecteur
pour Fmoc-L-Ser-OH, Fmoc-L-Glu-OH, Fmoc-L-Thr-OH, Fmoc-L-Tyr-OH et Fmoc-
L-Asp-OH sont le tert-butyle ; le groupement protecteur pour Fmoc-L-Asn-OH,
Fmoc-
L-Gln-OH et Fmoc-L-His-OH est le groupe trityle ; le groupement protecteur
pour
Fmoc-L-Arg-OH est le groupe 2,2,4,6,7-pentaméthyldihydrobenzofuran-5-
sulfonyle.
~ Préparation de l'antigène J (HZN-Gly-HA3o~-319).
Une fois la synthèse peptidique effectuée, la peptidyl-résine
(0,125 mmol) est déprotégée et couplée deux fois manuellement en utilisant un
excès
de 4 éq. d'anhydride bromoacétique, préparé par une activation au DIC (pendant
20
minutes) dans le DMF, suivie d'un lavage au DMF (3 x 1 minute) et au CHZCIz (3
x 2
minutes). 66 mg (4 éq.) de tert-butylcarbazate sont ajoutés à la peptidyl-
résine
imbibée de DMF contenant du DIEA (174 p,1 8 éq.). Le mélange est agité une
nuit,
puis lavé par du DMF (3 x 1 minute), du CHZC12 (3 x 2 minutes) et par EtzO (2
x 1
minutes). Enfin, le peptide est séparé du support et déprotégé au moyen du
mélange
TFA-anisole-H20 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 3 h à température ambiante,
précipité
dans du diéthyléther froid, centrifugé, dissous dans l'eau et lyophilisé. On
obtient
101 mg (rendement de 40%) de l'antigène J sous la forme d'une poudre blanche
après
purification par RP-HPLC semi-préparative [gradient: 100:0 à 50:50 (A/F)
pendant 90
minutes] et lyophilisation. L'analyse de l'antigène J par ESI-MS positive est
la
suivante : m/z 1575 (M+H)+.
~ Préparation de l'antigène K (HZN-Gly-TTs3o-sab).
On procède comme indiqué ci-dessus en rapport avec la préparation
de l'antigène J, aux différences près que
- le peptide est séparé du support et déprotégé au moyen du mélange
TFA-iPr3SiH-H20 95:2.5:2.5 (10 ml), pendant 1,5 h,
- le gradient, pour la purification de l'antigène par RP-HPLC, est le
suivant : 100:0 à 75:25 (A/F) pendant 25 minutes, puis isocratique (A/F).
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WO 01/09173 $3 PCT/FR00/02194
Après purification par RP-HPLC et lyophilisation, l'antigène K est
obtenu sous la forme d'une poudre blanche, avec un rendement de 15%. Son
analyse
par ESI-MS positive est la suivante : calculé 2052.5, trouvé 2052.0 ; m/z:
1026.7
[M+2H]2+, 684.8 [M+3H]3+, 514.0 [M+4H]4+.
d) Préparation des ligands 51 et 52.
~ Ligand 51 (Figure 10).
Le composé G (1,5 éq. / groupes chloroacétiques à substituer), dont
la préparation est décrite au paragraphe a) ci-dessus, est dissous dans le
mélange
nPrOH-Hz0 1:1 (500 p,1). On ajoute du tri-n-butylphosphine (1 éq.). Après une
nuit à
température ambiante sous atmosphère d'azote, le mélange est concentré sous
pression réduite pendant 20 minutes, repris dans 500 p1 d'eau et ajouté à 0,8
p,mol
(1 éq.) de dendrimère I dissous dans 600 ~l de DMF. Le pH est ajusté à 8-8,5
par
addition de potassium de carbonate solide. Le mélange est agité pendant 24 à
48 h à
température ambiante et sous atmosphère d'azote. On ajoute ensuite 350 p.1
d'un
tampon citrate/phosphate et l'antigène peptidique J. Le pH est ajusté à 5,2
par
addition d'HCl aqueux 1N. Le mélange est agité pendant 12 h à température
ambiante,
dilué dans de l'eau, congelé et lyophilisé. 1,52 mg du ligand 51 (rendement de
35%)
sont obtenus, sous la forme d'une poudre blanche, après purification par RP-
HPLC
[gradient: 100:0 à 90:10 (A/B) pendant 10 minutes, puis 90:10 à 75:25 (A/B)
pendant
50 minutes] et lyophilisation. Son analyse par ESI-MS positive est la suivante
calculé 5114.1, trouvé 5112 ; m/z: 1704.9 [M+3H]3+, 1278.9 [M+4H]4+, 1030.9
[M+SH+K]5+, 859.3 [M+SH+K]6+.
~ Ligand 52 (Figure 11).
Le composé G (1,5 éq. / groupes chloroacétiques à substituer) est
dissous dans le mélange nPrOH-H20 1:1 (500 p,1). On ajoute du tri-n-
butylphosphine
(1 éq.). Après une nuit à température ambiante sous atmosphère d'azote, le
mélange
est concentré sous pression réduite pendant 20 minutes. En parallèle, 0.4 mol
du
dendrimère H sont mis en présence de 1 éq. d'antigène K dans le mélange 'BuOH-
HZO (180-20 u1), à température ambiante et sous atmosphère d'azote. Une fois
la
réaction terminée (suivie par RP-HPLC), le milieu réactionnel est ajouté au
composé
G préparé ci-dessus et le pH est ajusté à 8-8.5 par addition de potassium de
carbonate
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solide. Le ligand 52 est ensuite isolé comme décrit ci-dessus pour le ligand
51.
0,71 mg du ligand 52 (rendement de 42%) sont obtenus, sous la forme d'une
poudre
blanche, après purification par RP-HPLC [gradient: 100:0 à 75:25 (A/B) pendant
20
minutes, puis 75:25 à 60:40 (A/B) pendant 30 minutes] et lyophilisation. Son
analyse
par ESI-MS positive est la suivante : calculé 3913.6, trouvé 3912 ; m/z:
1305.0
[M+3H]3+, 979.1 [M+4H]4+, 783.6 [M+SH]5+.
EXEMPLE 7 : PREPARATION DE COMPOSES UTILES EN TANT QUE
COMPOSES INTERMEDIAIRES POUR LA PREPARATION DE LIGANDS
CONFORMES A L'INVENTION
Deux composés répondant à la formule générale (VI) conforme à
l'invention, dans laquelle
m est un nombre entier égal à 58 environ (pour le composé dénommé
« 5% QuinPEI » dans ce qui suit) et 116 environ environ (pour le composé
dénommé « 10% QuinPEI » dans ce qui suit) ,
Bl représente un reste acide (-)-quinique,
M représente une fonction amide (-CO-NH-),
A représente le reste d'un polymère linéaire de polyéthylèneimine (PET),
ont été préparés par condensation du PEI sur l'acide quinique 1,5-lactone (y-
lactone
résultant de l'estérification entre le groupe carboxyle porté par le carbone
situé en
position 1 et le groupe hydroxyle situé en position 5 de l'acide (-)-
quinique), selon le
protocole suivant.
L'acide D(-)-quinique (Aldrich) est transformé en I,5-y-lactone
bicyclique (aussi dénommée "quinide") par chauffage dans du toluène, en
présence
d'acide p-toluènesulfonique, comme décrit notamment par H.O.L. FISCHER dans
Chem: Ber., 1921, 54, 775-785, par M. PHILIPPE et al. dans J. Antibiotics,
1982, 25,
1507-1512 et par P.Q: HUANG et al. dans Tetrahedron Lett., 1995, 36, 8299-
8302.
La lactone (10,1 mg, 58,1 pmol) réagit avec 50 mg de PEI (25 kDa, Aldrich), ce
qui
correspond à 1162 mol de groupes amino, en supposant une masse moléculaire
moyenne en poids de 43 Da pour l'unité répétitive du PEI. La réaction est
effectuée
dans 2 ml d'eau, pendant 24 h et à 50°C. Le milieu réactionnel est
ensuite dilué et
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lyophilisé. On obtient du PEI substitué, à un taux de 5%, par de l'acide
quinique
(dénommé ci-après "5% QuinPEr'). En utilisant deux fois plus de lactone (20,2
mg,
116,2 pmol), on obtient du PEI substitué, à un taux de 10%, par de l'acide
quinique
(dénommé ci-après "10% QuinPEr').
L'achèvement de la réaction est indiqué, par analyse RMN IH et 13C
du milieu réactionnel, par l'absence du signal correspondant à la quinide (la
condensation de la quinide sur le PEI se traduit en effet par l'ouverture du
cycle de la
lactone). Les résultats sont confirmés par quantification de la quantité
d'acide
quinique couplée sur le PEI, réalisée par spectroscopie RMN IH sur des
échantillons
des produits obtenus, purifiés par ultrafiltration sur des membranes amicon~
(30000
Da, Millipore). La teneur du PEI en acide quinique est confirmée en comparant
les
surfaces des pics des protons des CHZ du squelette du polymère et des protons
H-4,
H-5 and H-6 des résidus d'acide quinique.
Le PEI est un polymère branché présentant des amines secondaires
et primaires. L'étude du spectre RMN IH permet de distinguer les acides
quiniques
liés via une liaison amide secondaire ou tertiaire (ces derniers étant
signalés par un
indice '). Ainsi, 5% QuinPEI et 10% Quin PEI contiennent respectivement 30 et
26%
de résidus d'acide quinique branchés via une liaison amide tertiaire, le reste
étant des
liaisons amides secondaires.
Dans les données qui suivent (analyses RMN ~H et 13C effectuées
dans DZO-H20 10:90), la référence interne est le sel de sodium de l'acide
3-(triméthylsilyl) [2,2,3,3-d4J propionique.
5% QuinPEI: RMN ~H S 4.06 (s large, H-3'), 3.98 (ddd, J= 1.1, 3.3
et 7 Hz, H-3), 3.95-3.85 (m, 1 H, H-5'), 3.85 (ddd, J 4.8, 9.1 et 10.5 Hz, H-
5), 3.39
(dd, J= 1.1 et 9.1 Hz, H-4 and H-4'), 3.20, 3.06, 2.71, 2.60 et 2.51 (5 s
large, CH et
CHZ PEI), 1.80-1.68 (m, 4 H, H-2, H-2', H-6 et H-6'); RMN 13C 8 180.7 (CON'),
177.5 (CON), 77.4 (C-1), 77.1 (C-l'), 75.7 (C-4), 75.5 (C-4'), 70.9 (C-3 et C-
3'), 67.5
(C-5), 66.7 (C-S'), 56.5-46.0 (C PEI), 41.1 et 40.8 (C-6 et C-6'), 39.7-37.0
(C PEI),
38.0 (C-2 et C-2').
10% QuinPEI: RMN ~H 8 4.05 (d large, H-3'), 3.96 (ddd, J = 3.2,
3.2 et 7 Hz, H-3), 3.95-3.85 (m, H-5'), 3.85 (ddd, J 4.8, 9.1 et 10.8 Hz, H-
5), 3.37 (dd,
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J = 3.2 et 9.1 Hz, H-4 et H-4'), 3.17, 3.00, 2.65, 2.57 et 2.49 (5 s large, CH
et CHZ
PEI), 1.72-1.69 (m, 4 H, H-2, H-2', H-6 et H-6'); RMN 13C b 181.7 (CON'),
177.3
(CON), 77.4 (C-1), 77.1 (C-l'), 75.7 (C-4), 75.5 (C-4'), 70.9 (C-3 et C-3'),
67.5
(C-5), 66.7 (C-5'), 55.4-46.0 (C PEI), 41.0 (C-6 et C-6'), 40.0-38.0 (C PEI),
37.9 (C-2
et C-2').
EXEMPLE 8 : ACTIVITE BIOLOGIQUE DES LIGANDS CONFORMES A
L'INVENTION
L'activité biologique des ligands conformes à l'Invention a été
vérifiée par une série d'expérimentations in vitro visant à tester leur
aptitude à être
internalisés, via le récepteur du mannose, par des cellules dendritiques
obtenues à
partir de sang périphérique humain.
Les expérimentations rapportées ici ont été réalisées avec les
composés suivants
~ le méthyl-quinate (c'est-à-dire l'ester méthylique de l'acide quinique), qui
est
décrit par E. DELFOURNE et al. dans J. Chem. Res., 1991, 56-57,
le méthyl-a-D-mannopyranoside, commercialisé par la Société LANCASTER,
les ligands liés à de la fluorescéine 23F et 24F dont la préparation est
décrite
dans l'exemple 2 ci-avant,
~ un composé, qui sera dénommé composé 30F dans ce qui suit et se
différenciant des ligands 23F et 24F en ce qu'il comprend 8 chaînes
polyhydroxylées de configuration galacto au lieu des 8 restes acide (-)-
shikimique
ou (-)-quinique, ce composé étant destiné à servir de "témoin" négatif en
raison de
la faible affinité que présente le récepteur du mannose vis-à-vis du D-
galactose et
des composés apparentés à ce dernier, et
~ un composé, qui sera dénommé composé 31F dans ce qui suit et se présentant
sous la forme d'un dendrimère constitué par 8 résidus L-lysine et 8 restes
D-mannose, ce composé étant, lui, destiné à servir de "témoin" positif puisque
le
récepteur du mannose se lie préférentiellement au D-mannose.
1) - Protocole
a) Préparation des composés 30F et 31F.
Le composé 30F a été préparé selon un protocole opératoire
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consistant
~ dans un premier temps, à synthétiser un tripeptide de séquence (S1) dans des
conditions analogues à celles décrites au ~ 1.2 de (exemple 1 ci-avant pour la
préparation du composé 1 ;
. puis, après clivage de ce tripeptide, par traitement de la résine par 25 ml
d'un
mélange TFA/H20/MeZS (95:2,5:2,5) à la température ambiante pendant 2 heures,
à coupler 1 molécule dudit tripeptide avec 2 molécules de D-galactonolactone,
en
faisant réagir 160 mg (0,90 mmoles) de D-galactonolactone avec une solution
contenant 140 mg (0,22 mmoles) de tripeptide et 0,79 mmoles de DIEA dans 5 ml
de méthanol porté à reflux pendant 24 heures, puis en ajoutant à ce mélange
réactionnel 80 mg (0,45 mmoles) de D-galactonolactone supplémentaires et
maintenant le reflux pendant encore 24 heures ; et
~ e~n, en couplant, dans des conditions identiques à celles décrites dans
l'exemple 2 ci-avant, la N",N~ di-[(2R,3R,4S,SR)-2,3,4,5-tétrahydroxy-1-hexane-
carbox-1-yl]-L-lysyl-{S-(tert-butylthio)J-L-cystéyl-glycine ainsi obtenue avec
un
composé 14 ayant préalablement réagi avec du FITC.
Le composé 31F a été, quant à lui, préparé en traitant, un composé
15 par du 2-thioéthyl-oc,D-mannopyranoside, puis en faisant réagir le composé
résultant avec du FITC.
b) Obtention des cellules dendritigues.
Les cellules dendritiques ont été obtenues par différenciation de
monocytes, eux-mêmes isolés à partir de cellules mononuclées de sang
périphérique
humain, selon un protocole dérivé de celui décrit par AVRAMEAS et al. (Eur. J.
Immunol., 1996, 26, 394-400).
Pour ce faire, les cellules mononuclées présentes dans des
prélèvements de sang périphérique humain (fournis par fEtablissement de
Transfusion
Sanguine du Nord-Pas de Calais, FRANCE) ont été séparées des autres éléments
du
sang par centrifugation en gradient de densité Ficoll/Pâque (Société
PHARMACIA),
puis lavées 3 fois, par centrifugation, avec du milieu RPMI 1640 (Société
GIBCO)
contenant 3 mM d'EDTA.
Les cellules mononuclées ainsi isolées ont été mises en suspension, à
37°C et sous une atmosphère à 5% de COZ, dans un milieu de culture
comprenant du
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milieu RPMI 1640 supplémenté par 5.10-5 M de (i-mercaptoéthanol (Société
MERCK), 2 mM de L-glutamine (Société MERCK), 1 mM de pyruvate de sodium
(Société GIBCO), 10% de sérum foetal de veau inactivé par la chaleur (Société
GIBCO), 100 LJI/ml de pénicilline et par 100 ~g/ml de streptomycine (toutes
deux
provenant de la Société SPECIA).
Puis, la suspension résultante a été répartie sur des boîtes de Pétri de
cm de diamètre, à raison de 8 à 12.10' cellules par disque. L'enrichissement
en
monocytes a été obtenu en laissant adhérer ces cellules aux boîtes, à
37°C et dans un
incubateur à COZ (5%) humidifié, pendant 3 à 4 heures.
10 Après élimination des cellules non-adhérentes, les cellules
adhérentes ont été remises en culture dans le milieu décrit ci-avant, mais
comprenant
de plus , 800 U/ml de facteur de croissance des lignées granulocytaires et
macrophagiques humain recombinant (Société PEPRO TECH) et 1000 U/ml
d'interleukine-4 humaine recombinante (Société PEPRO TECH), à raison de 106
cellules par ml de milieu. Elles ont été alors mises en culture, dans des
plaques de
culture cellulaire de 24 puits et dans les mêmes conditions de température et
d'atmosphère que précédemment, pendant 6 à 8 jours au cours desquels il y a
différentiation des monocytes vers les cellules dendritiques (ces dernières
étant
faiblement adhérentes).
c) Analyse par cytométrie de flux des cellules non-adhérentes
recueillies.
Afm de vérifier que les cellules non-adhérentes recueillies à (étape
b) ci-avant présentent bien les antigènes de surface caractéristiques des
cellules
dendritiques, une partie de ces cellules ont été lavées 2 fois avec du tampon
PBS
contenant 0,03 mg/ml de sérum albumine bovine, puis mises à incuber, sur de la
glace
et pendant 30 minutes, avec un anticorps monoclonal de souris dirigé contre le
récepteur du mannose humain et conjugé à de la phycoérythrine (Société BECTON
DICKINSON) et
~ soit un anticorps monoclonal de souris dirigé contre (antigène CDIa humain,
qui représente l'un des principaux antigènes de surface des cellules
dendritiques,
~ soit un anticorps monoclonal de souris dirigé contre (antigène CD14 humain,
qui représente, lui, l'un des antigènes de surface propres aux monocytes et
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macrophages,
ces deux derniers anticorps étant marqués par du FITC (Société BECTON
DICKINSON).
A (issue de ces incubations, les cellules ont été lavées avec du
tampon PBS et remises en suspension dans ce même tampon. La fluorescence leur
étant associée a alors été analysée par cytofluorométrie, au moyen d'un
cytomètre
EPICS XL-MCL (Société COLTLTER CORPORATION).
d) Test d'inhibition de l'internalisation du composé 31F par le
méthvl-quinate.
Afin de montrer que le méthyl-quinate est un mime du mannose
dans l'internalisation avec le récepteur du mannose des cellules dendritiques,
la
compétition entre le méthyl-quinate, ou le méthyl-a-D-mannopyranoside (servant
de
témoin d'inhibition), et le composé 31F est étudiée selon le protocole
suivant: les
cellules dendritiques sont récupérées, lavées avec du tampon PBS, préincubées
à
37°C, puis incubées pendant 20 minutes, à 37°C, avec des
solutions de concentrations
croissantes en méthyl-quinate et le composé 31F (en concentration finale de
SpM).
Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde
à 1%,
puis analysées par cytofluorométrie de flux, comme décrit en c) ci-dessus.
e) Internalisation des ligands conformes à (Invention par les cellules
dendritiques.
Les tests visant à apprécier fintemalisation des ligands 23F et 24F
ont été réalisés selon le protocole suivant : des cellules non-adhérentes
recueillies à
(étape b) ci-avant ont été lavées 2 fois avec du tampon PBS contenant 1 mM de
chlorure de calcium. A la suite de quoi, ces cellules ont été préincubées, à
37°C et
pendant 10 minutes, puis mises à incuber, à 37°C et pendant 20 minutes,
avec
différentes solutions contenant chacune (un des composés à tester, à une
concentration comprise entre 1 et 10 pM. Les cellules ont ensuite été lavées 3
fois
avec du tampon PBS froid et fixées pendant 20 minutes dans du paraformaldéhyde
à
2%.
La fluorescence associée à ces cellules a été alors appréciée par une
analyse FACScan au moyen du cytomètre précité.
Par ailleurs, afin de vérifier que l'internalisation des ligands 23F et
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24F par les cellules dendritiques est bien liée à une reconnaissance de ces
ligands par
le récepteur du mannose et non à un autre mécanisme, ces tests ont été
reconduits en
préincubant les cellules en présence de solutions de mannane extrait de
Saccharomyces cerevisiae (Société SIGMA), le mannane étant, en effet, connu
pour
être internalisé de manière sélective via le récepteur du mannose. Dans ce
but, les
cellules dendritiques sont récupérées, lavées avec du tampon PBS, incubées à
37°C,
puis préincubées pendant 20 minutes, à 37°C, en présence de solutions
de mannane
extrait de Saccharomyces cerevisiae de concentrations comprises entre 10'~ et
mg/ml. Ensuite, les ligands 23F et 24F (en concentration finale de SpM) sont
10 ajoutés (incubation : 20 minutes à 37°C). Les cellules sont lavées
au PBS, fixées dans
du paraformaldéhyde à 1% et analysées par cytofluorométrie de flux, comme
décrit en
c) ci-dessus.
f) Influence du nombre de mimes du mannose~ortés nar les ligands
conformes à l'Invention sur l'internalisation de ces ligands.
Afin d'étudier quelle est la construction optimale, c'est-à-dire quel
est le ligand comportant le nombre de mimes du mannose le plus réduit (pour
faciliter
la synthèse chimique du ligand) qui est internalisé de façon spécifique par
les
récepteurs du mannose, les cellules dendritiques sont incubées pendant 20
minutes à
37°C avec 10 pM de ligands comprenant 2, 4 ou 8 résidus du mannose, de
l'acide
quinique ou de l'acide shikimique (ligands di-, tétra- ou octavalents). Après
fixation
dans du paraformaldéhyde, les cellules sont analysées par cytofluorométrie de
flux,
comme décrit en c) ci-dessus.
Pour ces expériences, les ligands suivants ont été utilisés
. ligands porteurs de résidus d'acide shikimique : 34F (ligand
divalent), 21F (ligand tétravalent) et 23F (ligand octavalent),
ligands porteurs de résidus d'acide quinique : 33F (ligand
divalent), 22F (ligand tétravalent) et 24F (ligand octavalent).
2) - Résultats
a) Test d'inhibition de l'internalisation du composé 31F par le
méthyl-quinate.
La Figure 12 illustre la capacité du méthyl-quinate à inhiber
l'internalisation du composé 31F. En ordonnées figurent les pourcentages
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d'inhibition, calculés par la formule
inhibition = (MnX 31F - MnX mqui) / MnX 31F
où
« MnX » représente la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence,
. « MnX 31F » représente le signal dû à l'internalisation du composé 31F seul,
. « MnX mqui » représente le signal dû à l'internalisation du composé 31F en
présence de différentes concentrations (exprimées en mM) de méthyl-quinate,
indiquées en abscisses.
La courbe signalée par les symboles -~- représente l'inhibition de
l'internalisation du composé 31F par le méthyl-quinate, et la courbe signalée
par les
symboles -o- représente l'inhibition de l'internalisation du composé 31F par
le
méthyl-a-D-mannopyranoside, composé servant de témoin d'inhibition.
En présence de méthyl-quinate, on remarque une inhibition efficace
à 75% de l'internalisation spécifique par le récepteur du mannose, comparable
à celle
du ligand de référence, le méthyl-a-D-mannopyranoside.
b) Internalisation des ligands conformes à (Invention par les cellules
dendritiaues.
La Figure 13 illustre, sous la forme de courbes, les valeurs
moyennes des intensités de fluorescence présentées par les cellules
dendritiques après
une incubation en présence de solutions comprenant respectivement de 1 à 10 pM
de
ligand 23F (-.-), de ligand 24F (-~-), de composé 30F (-o-) et de composé 31F
(-o-).
Sont exprimées, en ordonnées, les valeurs moyennes des intensités de
fluorescence
(UA) et, en abscisses, les concentrations des solutions.
La Figure 13 montre qu'une incubation des cellules dendritiques,
d'une durée de 20 minutes et réalisée en présence d'une solution dosée à 1 p,M
de
ligand 23F ou de ligand 24F est suffisante pour obtenir une internalisation de
ces
ligands par ces cellules. Elle montre également que cette internalisation est
spécifique
puisque le composé 30F (porteur de chaînes polyhydroxylées) ne pénètre
pratiquement pas dans les cellules dendritiques, et ce quelle que soit la dose
de ce
composé utilisée pour (incubation de ces cellules, alors que le composé 31F
(porteur
de restes D-mannose) se retrouve très largement dans lesdites cellules
dendritiques.
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Par ailleurs, la Figure 14 illustre, sous la forme de courbes, les
valeurs moyennes des intensités de fluorescence présentées par les cellules
dendritiques lorsque celles-ci ont été soumises successivement à une
préincubation en
présence de solutions de mannane de concentrations comprises entre 10~ et 10
mg/ml,
S puis à une incubation avec des solutions comprenant 5 p.M de ligand 23F (-.-
), de
ligand 24F (-~-), de composé 30F (-o-) ou de composé 31F (-o-). Sont
exprimées, en
ordonnées, les valeurs moyennes de fluorescence (UA) et, en abscisses, les
concentrations des solutions de mannane.
La Figure 14 montre que l'internalisation, par les cellules
dendritiques, des ligands 23F et 24F, ainsi que celle du composé 31F diminue
drastiquement au fur et à mesure que la concentration en mannane augmente.
Ceci
signe (existence d'une forte compétition entre ces ligands et le mannane vis-à-
vis du
récepteur du mannose et vient confirmer que l'internalisation des ligands
conformes à
l'Invention par les cellules dendritiques s'effectue bien par l'intermédiaire
du récepteur
du mannose.
c) Influence du nombre de mimes du mannose portés nar les ligands
conformes à l'Invention sur l'internalisation de ces lisands.
La Figure 15 représente, en ordonnées, Ie pourcentage
d'internalisation spécifique des ligands di-, tétra- ou octavalents
(abscisses) par le
récepteur du mannose. Les ligands tétra- ou octavalents sont internalisés de
façon
préférentielle par le récepteur du mannose, par rapport aux ligands divalents.
On peut
donc considérer que les structures optimales recherchées sont celles
comprenant 4
mimes du mannose, qui sont plus facilement synthétiser que celles comprenant 8
mimes du mannose. Par opposition au ligand naturel (ligand portant des résidus
du
mannose), dont l'internalisation est optimale pour une structure octavalente,
on
constate que les ligands portant des résidus d'acide quinique ou shikimique
sont
internalisés de façon optimale lorsqu'ils sont trétravalents.
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EXEMPLE 9 : SPECIFICITE DE L'INTERNALISATION DES LIGANDS
CONFORMES A L'INVENTION DANS LES CELLULES DENDRITIQUES
VIA LES RECEPTEURS DU MANNOSE
1) Analyse nar microscopie confocale.
L'internalisation et la distribution des ligands conformes à
l'Invention dans les cellules dendriques est analysée par microscopie
confocale avec
double et triple marquage du récepteur du mannose et du noyau des cellules.
Les cellules dendritiques, différenciées à partir de cellules
mononuclées en présence d'IL-4 et du facteur de croissance GM-CSF, sont
utilisées à
J+5. Elles sont incubées pendant 45 minutes à 4°C avec 10 p,g d'ami-
mannose
récepteur humain (PHARMIGEI~ et 5 ~.M de l'une des constructions suivantes
. 61F (Figure 16) : dendrimère constitué de 4 résidus L-lysine
portant 4 restes de D-mannose, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC).
La
construction 61F a été préparée comme le composé 31F (cf. exemple 8,
paragraphe
1.a), mais en faisant réagir 'du 2-thioéthyl-a,D-mannopyrannoside avec un
composé
14 (cf. exemple l, paragraphe 1.l) ;
. 21F, 22F et 64F : constructions portant respectivement des restes
d'acide shikimique, d'acide quinique et des chaînes polyhydroxylées de
configuration
galacto (provenant de molécules de galactonolactones). La construction 64F a
été
préparée comme le composé 30F (cf. exemple 8, paragraphe 1.a), mais en
utilisant un
composé 13 pour le couplage (cf. exemple 1, paragraphe 1.1). La préparation
des
ligands 21F et 22F est décrite dans l'exemple 2 ci-avant.
La structure 61 F sert de témoin positif, tandis que la structure 64F
sert de témoin négatif. Les structures 21F et 22F représentent des ligands
conformes à
la présente invention.
Les cellules sont placées à 37°C pendant 5 minutes. Après
incubation, elles sont fixées pendant 45 minutes à 4°C par une solution
de
composition suivante : PBS (0.1 mM MgClz, O.ImM Ca2), paraformaldéhyde à 4%,
sucrose. La réaction de fixation est arrêtée au moyen d.'une solution de
chlorure
d'ammonium (SOmM), pendant 10 minutes et à température ambiante. Les cellules
sont lavées 3 fois par du PBS, puis déposées sur des lames de poly-L-lysine.
Le signal
de la fluorescéine est amplifié par incubation à 37°C, pendant 30
minutes, avec un
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IgG anti-FITC de lapin couplé à l'Alexa Fluor 488 (dilution : 1/200é'"~
(MOLECULAR PROBES) en même temps que l'incubation avec le second anticorps
de chèvre, IgG anti-souris couplé à l'Alexa Fluor 568 (dilution : 1/SOOeme)
(MOLECULAR PROBES), permettant la détection de l'anti-mannose récepteur.
L'incubation avec les seconds anticorps est réalisée en milieu PBS, BSA
(lmg/ml),
saponine (0.05%).
Les cellules sont lavées par du PBS contenant lmg/ml de BSA et
0,05% de saponine, puis par du PBS/BSA et enfin par du PBS, puis montées entre
lame et lamelle en milieu de montage VECTASHIELD. L'observation des lames est
réalisée par microscopie confocale sur un appareil LEICA TCS NT possédant un
laser
Krypton/Argon (excitation 488, 468 et 647}. L'acquisition des deux longueurs
d'onde
(à savoir, l'acquisition de la fluorescence émise par l'Alexa 568,
correspondant au
récepteur du mannose, et l'acquisition de la fluorescence émise par l'Alexa
488,
correspondant aux structures testées) est effectuée simultanément et la
superposition
des deux images permet de visualiser les deux marqueurs en même temps, sur la
même coupe de cellule, effectuée selon l'axe z de la cellule.
On remarque une co-localisation des deux marqueurs, et donc une
co-localisation des ligands 61F, 21F et 22F marqués a la fluorescéine avec le
récepteur du mannose, permettant d'affirmer que les ligands conformes à
l'invention
sont bien internalisés dans les cellules dendritiques via le récepteur du
mannose.
2) Analyse au moyen de cellules Cos transfectées par le
récepteur du mannose.
Des cellules Cos-1, n'exprimant pas, à l'état natif, le récepteur du
mannose, sont transfectées par le plasmide CD8 contenant une séquence codante
pour
le récepteur du mannose (MR). 48 heures après la transfection, les cellules
sont
collectées : 10 à 15% d'entre elles expriment le transgène. Dans ce qui suit,
ces
cellules sont dénommées « Cos MR ».
Des tests d'internalisation sont réalisées à partir de ces cellules, en
utilisant les composés suivantes
22F : dendrimère constitué de 4 résidus L-lysine portant 4 restes
d'acide quinique, ainsi qu'une molécule de fluorescéine (FITC). Il s'agit d'un
ligand
conforme à la présente Invention.
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64F : construction portant des chaînes polyhydroxylées de
configuration galacto (témoin négatif.
Les tests d'internalisation consistent à incuber les cellules, pendant
20 minutes et à 37°C, en présence de 10 p,moles des composés 22F ou
64F, puis à
laver les cellules avec du PBS froid et à les fixer par du paraformaldéhyde à
1%, avant
d'effectuer l'analyse FACScan au moyen du cytomètre décrit dans l'exemple 8.
La
Figure 17 représente le pourcentages de cellules positives détectées (en
abscisses)
pour les quatre tests suivants, indiqués sur l'axe des ordonnées
. test a) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 64F,
. test b) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 22F, en
présence d'une solution de mannane (5 mg/ml) telle que décrite dans l'exemple
8, le
mannane. entrant en compétition avec le composé 22F vis-à-vis du récepteur du
mannose,
. test c) : incubation des cellules Cos MR avec le composé 22F,
. test d) : incubation des cellules Cos-1 (non transfectées) avec le
composé 22F.
D'après la Figure 17, les cellules Cos-1 non transfectées (test d) ne
donnent, bien entendu, pas lieu à une internalisation du composé 22F : le
signal
détecté est assimilable au bruit de fond de l'appareil. Il en va de même pour
les
cellules Cos MR incubées avec le composé 64F, non spécifique du récepteur du
mannose (test a). Le test b) traduit l'inhibition de l'internalisation du
composé 22F par
le mannane. Quant à la construction 22F, elle est bien internalisée de manière
spécifique par les cellules transfectées par le récepteur MR (test c).
