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WO 01/37832 PCT/FR00/03272
ASSOCIATION DE RILUZOLE ET DE GABAPENTINE
ET SON UTILISATION COMME MEDICAMENT
La présente invention concerne l'association de riluzole et de gabapentine ou
un de
leurs sels pharmaceutiquement acceptables et son utilisation comme médicament
utile notamment pour la prévention et/ou le traitement des maladies
motoneuronales.
Les maladies motoneuronales incluent notamment la sclérose latérale
amyotrophique,
l'amyotrophie spinale progressive, l'amyotrophie spinale infantile et la
sclérose
latérale primaire. Elles résultent d'une perte progressive des motoneurones
dans la
moelle épinière.
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) également connue sous le nom de
maladie
de CHARCOT et maladie de LOU GEHRIG a été décrite pour la première fois par
CHARCOT en 1865. Elle est la maladie motoneuronale la plus importante. La SLA
est une maladie mortelle résultant de la dégénérescence des motoneurones. La
maladie s'accompagne d'une paralysie progressive, conduisant à la perte des
fonctions
motrices et respiratoires puis à la mort dans un délai de deux à huit ans
après
l'apparition des premiers symptômes.
A ce jour, seul le riluzole (2-amino-6-trifluorométhoxybenzothiazole) est
commercialisé sous le nom de RILUTEKR pour le traitement de la sclérose
latérale
amyotrophique. Le riluzole permet principalement de ralentir la progression de
la
maladie.
La gabapentine a également été préconisée pour le traitement des maladies
neurodégénératives et notamment de la sclérose latérale amyotrophique (brevet
US5084479). La gabapentine est actuellement commercialisée sous le nom de
NEURONTINR pour le traitement des épilepsies.
Il a maintenant été trouvé que l'association de riluzole et de gabapentine ou
un de
leurs sels pharmaceutiquement acceptables permet d'augmenter la survie des
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motoneurones d'une manière plus importante que le riluzole seul ou la
gabapentine
seule.
L'effet de l'association a été étudié sur la mort cellulaire de motoneurones
purifiés de
rat induite par des sérums de patients atteints de sclérose latérale
amyotrophique.
Des motoneurones purifiés préparés à partir de moelle épinière d'embryons de
rat de
14 jours de gestation sont cultivés en présence de concentrations optimales de
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) recombinant, un des principaux
facteurs neurotrophique de survie des motoneurones. 22 heures après, le
riluzole et la
gabapentine sont ajoutés aux motoneurones soit seuls soit en association.
Après
encore 2 heures, des dilutions de sérums dialysés de patients atteints de SLA
sont
ajoutés. Le jour suivant le nombre de motoneurones survivants est évalué par
comptage direct au microscope à contraste de phase.
Méthodes
Composés
La solution mère de riluzole utilisée dans ce test est préparée de la manière
suivante :
5 mg de riluzole sont ajoutés à 0,105 ml d'une solution d'acide chlorhydrique
(1 M).
La solution est agitée puis on ajoute 2,1 ml d'eau bidistillée.
La solution mère de gabapentine est préparée directement par dissolution de
17,1 mg
de gabapentine dans 1 ml d'eau bidistillée.
Les solutions ainsi obtenues peuvent être conservées à 4 C pendant 24 heures
maximum.
Toutes les dilutions sont préparées extemporanément dans le milieu de culture
complet, immédiatement avant le traitement des cellules.
Purification des motoneurones
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Des embryons de rats de 14 jours de gestation (Charles River, France) sont
récupérés
après sacrification de la mère, sous anesthésie au CO2, par élongation
cervicale. Ces
embryons sont placés en tampon phosphate ( phosphate-buffered saline , PBS)
exempt de calcium et de magnésium (Life Technologies).
Une population homogène de motoneurones purifiés est obtenue en utilisant les
méthodes décrites par HENDERSON et coll [Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E.,
and Camu, W. (1995). Purified embryonic motoneurons. In Nerve cell culture :
a
practical approach (J. Cohen and G. Wilkin, Eds.), pp. 69-81. Oxford
University
Press, London.] et ARCE et coll. [Arce, V., Garcès, A., de Bovis, B., Filippi,
P.,
t0 Henderson, C., Pettmann, B., and deLapeyrière, O. (1999). Cardiotrophin-1
requires
LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel
technique. J
Neatrosci Res 55, 119-126]. Sauf mention contraire, la composition des milieux
utilisés est identique à celle indiqué dans ces références. Des moelles
épinières
d'embryons de rat de 14 jours de gestation sont disséqués dans du PBS stérile
et les
moitiés ventrales de chaque moelle contenant les motoneurones sont sous-
disséquées.
Elles sont ensuite coupées en petits morceaux à l'aide d'un scalpel et
traitées avec de
la trypsine (0,25%, poids/volume) dans un milieu F10 exempt de calcium et de
magnésium (Life Technologies). Après 15 minutes, la trypsine est remplacée par
un
milieu de culture complet L15 sans bicarbonate (commercialisé par Life
Technologies, Inc.) et les neurones spinaux sont dissociés par une série de
triturations
de plus en plus fortes. La trypsine et les débris cellulaires sont séparés par
centrifugation à travers une couche d'albumine sérique de boeuf ( bovine
serum
albumin , BSA) à 4%. La première étape de purification s'effectue sur un
gradient de
6,8% de métrizamide. La fraction de faible densité contenant les motoneurones
est
centrifugée sur une couche de BSA et ensuite repurifiée par immuno-sélection à
l'aide d'une colonne magnétique (Miltenyi Biotech Inc). A cette fin, les
cellules sont
remises en suspension dans 50 l de PBS + 0,5 % de BSA mélangé à 50 l de
l'anticorps 192 qui reconnaît le récepteur neurotrophine de faible affinité
p75NTR
spécifiquement exprimé par les motoneurones à ce stade de développement. Après
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incubation à 4 C pendant 10 minutes, les motoneurones sont centrifugés sur
BSA.
Les cellules sont mises à nouveau en suspension dans 80 l de PBS + 0,5 % de
BSA
et 20 l de perles magnétiques greffées en surface avec des anticorps de lapin
anti-
souris, puis incubées à 4 C pendant 15 minutes. Les cellules sont ensuite
recentrifugées sur BSA et passées dans une colonne magnétique. Les cellules
éluées
sont de gros neurones; 80 à 90% de ceux-ci pouvant être montrés par
immunomarquage comme exprimant la protéine Islet-l, un marqueur spécifique des
motoneurones.
Culture des motoneurones
Les motoneurones purifiés sont ensemencés à une densité de 1000 motoneurones
par
puits dans des puits de 16 mm préalablement enduits de polyornithine-laminine.
Le
milieu de culture est le milieu Neurobasal complémenté avec le complément B27
(Life Technologies) et 2 % de sérum de cheval mais sans antibiotique, le
volume total
étant de 0,5 ml. Les motoneurones sont ensemencés en présence de facteur
neurotrophique BDNF (ing/ml; Sigma) et laissés en sédimentation pendant 22
heures
pendant lesquelles elles s'attachent au support et développement des neurites.
Le
riluzole (3.10 5M) et la gabapentine (10'M) sont ajoutés soit séparément soit
en
association dans des séries de 4 puits. Deux heures plus tard, un sérum
dialysé de
patient atteints de SLA est ajouté aux puits. Les motoneurones sont ensuite
cultivés
pendant 1 jour à 37,2 C avant évaluation de leur survie.
Quantification de la survie des motoneurones
Les plaques de culture sont retirées de l'incubateur. Les puits contenant les
motoneurones sont remplis complètement avec du milieu L 15 (Life Technologies)
tiède. Leur couvercle est ensuite remis en place de manière à former un
ménisque
horizontal permettant l'observation de la surface entière du milieu de culture
sous
optiques à contraste de phase. Pour chaque puits, le nombre total de
motoneurones est
compté le long de 2 diamètres orthogonaux (x et y) du champ du microscope.
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Compte-tenu du fait que la présence de sérum humain change la morphologie des
motoneurones mêmes survivants, toutes les cellules portant des neurites et
attachées
au support de culture sont considérées comme étant en vie.
Analyse des données
5 Les valeurs de survie (c'est à dire le nombre de motoneurones par diamètre
de puit)
sont calculées comme la moyenne t SEM de 8 mesures pour 4 puits indépendants
dans chaque expérience.
Les analyses statistiques sont effectuées en utilisant le test de Student (t-
test).
Les résultats obtenus sont mentionnés dans le tableau suivant :
Sérum SLA 0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
Riluzole
(M) 0 0 3.15 5 0 3.15"5
Gabapentine s s
(M) 0 0 0 10 10"
Nombre de motoneurones
(par expérience et par 13 3 7 6 12
diamètre de puits) 26 4 9 5 19
19 0 4 5 18
36 4 9 9 17
33 2 11 2 18
33 4 7 9 14
25 5 6 1 23
32 2 7 3 21
Moyenne 27,1 3,0 7,5 5,0 17,8
( SEM) 2,8 0,6 :L0,8* 1,1* 1,3**
* p=0,0003
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**p<00001
Le BDNF (ing/ml) est ajouté dans toutes les expériences comme mentionné dans
la
technique générale.
Ces résultats démontrent que
a - le sérum de malade atteint de SLA induit la mort de 89% des motoneurones
même
en présence de support neurotrophique, laissant donc 11 % de neurones
survivants.
b - lorsque le milieu est traité avec du riluzole seul, la survie des
motoneurones est de
19%
c - lorsque le milieu est traité avec la gabapentine seule, la survie des
motoneurones
est de 8%
d - lorsque le milieu est traité avec l'association de riluzole et de
gabapentine, la
survie des motoneurones est de 61 %, mettant ainsi en évidence une synergie
entre les
deux molècules.
Le riluzole peut être préparé selon la méthode décrite dans le brevet
US4370338.
La gabapentine peut être préparée selon la méthode décrite dans les brevets
FR2294697 et US4024175.
Comme sels pharmaceutiquement acceptables du riluzole et de la gabapentine,
peuvent être notamment cités les sels d'addition avec les acides minéraux tels
que
chlorhydrate, sulfate, nitrate, phosphate ou organiques tels que acétate,
propionate,
succinate, oxalate, benzoate, fumarate, maléate, méthanesulfonate,
iséthionate,
théophilline-acétate, salicylate, phénolphtalinate, méthylène-bis-l3-
oxynaphtoate ou
des dérivés de substitution de ces dérivés.
L'association peut être employée par voie orale, parentérale ou rectale soit
simultanément soit séparément soit de manière étalée dans le temps.
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La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques
comprenant l'association de riluzole et de gabapentine ou un de leurs sels
pharmaceutiquement acceptables à l'état pur ou sous forme d'une association
avec un
ou plusieurs diluants et/ou adjuvants compatibles et pharmaceutiquement
acceptables
et/ou éventuellement en association avec un autre produit pharmaceutiquement
compatible et physiologiquement actif.
Comme compositions solides pour administration orale, peuvent être utilisés
des
comprimés, des pilules, des poudres (capsules de gélatine, cachets) ou des
granulés.
Dans ces compositions, les principes actifs sont mélangés à un ou plusieurs
diluants
inertes, tels que amidon, cellulose, saccharose, lactose ou silice, sous
courant d'argon.
Ces compositions peuvent également comprendre des substances autres que les
diluants, par exemple un ou plusieurs lubrifiants tels que le stéarate de
magnésium ou
le talc, un colorant, un enrobage (dragées) ou un vernis.
Comme compositions liquides pour administration orale, on peut utiliser des
solutions, des suspensions, des émulsions, des sirops et des élixirs
pharmaceutiquement acceptables contenant des diluants inertes tels que l'eau,
l'éthanol, le glycérol, les huiles végétales ou l'huile de paraffine. Ces
compositions
peuvent comprendre des substances autres que les diluants, par exemple des
produits
mouillants, édulcorants, épaississants, aromatisants ou stabilisants.
Les compositions stériles pour administration parentérale, peuvent être de
préférence
des solutions aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des émulsions.
Comme
solvant ou véhicule, on peut employer l'eau, le propylèneglycol, un
polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive, des
esters
organiques injectables, par exemple l'oléate d'éthyle ou d'autres solvants
organiques
convenables. Ces compositions peuvent également contenir des adjuvants, en
particulier des agents mouillants, isotonisants, émulsifiants, dispersants et
stabilisants. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple
par
filtration aseptisante, en incorporant à la composition des agents
stérilisants, par
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irradiation ou par chauffage. Elles peuvent également être préparées sous
forme de
compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi
dans
de l'eau stérile ou tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont les suppositoires ou les
capsules
rectales qui contiennent, outre le produit actif, des excipients tels que le
beurre de
cacao, des glycérides semisynthétiques ou des polyéthylèneglycols.
La présente invention concerne également l'utilisation de l'association de
riluzole et
de gabapentine ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables pour la
préparation d'un médicament utile pour la prévention et/ou le traitement des
maladies
1o motoneuronales et, notamment, de la sclérose latérale amyotrophique, de
l'amyotrophie spinale progressive, de l'amyotrophie spinale infantile ou de la
sclérose
latérale primaire.
La présente invention concerne également la méthode de prévention et/ou de
traitement des patients atteints de maladies motoneuronales et, notamment, de
la
sclérose latérale amyotrophique, de l'amyotrophie spinale progressive, de
l'amyotrophie spinale infantile ou de la sclérose latérale primaire qui
consiste à
administrer au patient une association de riluzole et de gabapentine ou un de
leurs
sels pharmaceutiquement acceptables soit simultanément soit séparément soit de
manière étalée dans le temps.
Les doses dépendent de l'effet recherché, de la durée du traitement et de la
voie
d'administration utilisée; elles sont généralement de 10 à 400 mg par jour par
voie
orale pour un adulte avec des doses unitaires allant de 10 à 200 mg de
riluzole et de
100 à 2400 mg par jour par voie orale pour un adulte avec des doses unitaires
de 100
à 400 mg de gabapentine.
D'une façon générale, le médecin déterminera la posologie appropriée en
fonction de
l'âge, du poids et de tous les autres facteurs propres au sujet à traiter.
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La présente invention concerne également une association dans laquelle on
utilise 10
à 400 parties en poids de riluzole pour 300 à 2400 parties en poids de
gabapentine.
