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PROCöDÉ POUR MAINTENIR LA DIVERSITÉ ET LA PLASTICITÉ
CELLULAIRE DE CELLULES SOUCHES ADULTES DE MAMMIF~RE ISSUES
DE BIOPSIE TISSULAIRE POUR LA THÉRAPIE CELLULAIRE
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la
réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus parüculièrement, la
présente
1o invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui
préserve
la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise
également
l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé
dans
des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont éte
les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques
ont
connu un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, Ie transfert de
cellules
2 0 neuronaies foetales est étudié comme approche thérapeutique dans les
pathologies
neurodégénératives comme (a maladie de Parkinson et plus récemment dans la
chorée de Huntington. Les résultats cliniques sont cohérents et montrent une
netté
amélioration. La limitation majeure de cette dernière approche est la source
de
cellules transplantées. En effet; le recours à des cellules neuronales
foetales rend
difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes
de
kératinocytes corrstituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures
graves. Un avantage de ce systëme: la capacité des kératinocytes, principales
cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée,
des
cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés
en
culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très
expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le
foie.
Ces données, encore trop astreintes; démontrent le potentiel de la médecine
régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à l'extension de ces
approches
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sont de plusieurs natures.. Pour être capable de suppléer aux défaillances
d'un tissu
par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux
caractéristiques vivantes
- les cellules doivent être facile à prélever;
- elles doivent survivre aux sites d'injection;
elles doivent présenter une borane capacité de prolifération et de
colonisation;
- elles doivent être capable de e différencier pour obtenir un résultat
fonctionnel
II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permettant d'obtenir des
cellules souches aptes à être utilisées; enfire autres, dans le cadre de la
régénération
et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention porte sur la mise au point d'un procédé de préparation
cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules
souches de
vertébrés provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure
dans le
cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation des
cellules
obtenues par le procédé de l'invention à un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini particuliérement utile
lors
de la mise en oeuvre du procédé-de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules
souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vi e également l'usage de ces cellules souches
obtenues par le. :procédé de préparation proposé dans des applications
thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La prësente invention vise au si une composition cellulaire comprenant des .
cellules souches humaines ou animales obtenues elon le procédé de préparation
de l'invention.
La présente invention porte également sur un procédé de préparation de
cellules souches capables de réparer ou de régénérer in vivo des tissus ou des
organes d'un vertébré,
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La présente invention porte aussi sur une méthode de traitement caractérisé
par l'implar+tation de cellules souches animales autologues ou hétérologues
obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement
aux
procédés de préparation cellulaire utilisés ' dans le domaine, le procédé de
prépâration de la présente invention permet
- d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale
d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue
sanitaire ;
20 - de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-
oxydantes et anti-apoptotiques;
- de préserver la diversité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire;
- de maintenir le potentiel de différenciation; et
- d' améliorer' l'implantation, la colonisation et la différenciation des
cellules
greffées.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article
de
Pouzet et al. (2000. Circulation: 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction
selon un
procédé enzymatique: Alternativement; le tissu musculaire est haché. De plus,
il n'y
a pas d'étape de préparation. de cellules telle qu'entendue au sens de la
présente
invention.
La récupération fonctionnelle teNe que discutée dans l'article de Pouzet et
al:
dépend du nombre de cellules alors que dans le procédé selon l'invention, le
mode
de préparation des- cellules conduit avantageusement à une colonisation Près
importante ainsi qu'à une récupération fonctionnelle rapide de l'organe
traitë.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures ~, 2 et 3 sont des microphotographies illustrant la mise en
évidence de cellules de muscle greffées dans le coeur de brebis. Les cellules
ont été
obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique
puis
directement implantées dans le myocarde de la méme brebis (greffe autologue).
La
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présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide: de
.l'anticorps MY32
qui reconnaît spécifiquement fa myosine de muscle squelettique. La Figure 1
illustre
la présence de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) à faible
agrandissement (barre d'échelle, 250 microns). La Figure 2 montre des cellules
colorées par (anticorps MY32 généralement alignées avec le réseau de
cardiocytes.
Ces cellules peuvent être intensément marquées ou faiblement marquées; les
cardiocytes ne sont pas marqués (Barre d'échelle,500 microns). La Figure
3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires
etformant des
sarcorn'eres organisés (Barre d'échelle; 25 microns).
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION
PRÉFÉRÉS DE L'INVENTION
La présente invention porte donc sur la m9se au: point d'un procédé de
préparation de cellules souches animale qui préserve la diversité et la
plasticité de
ces cellules provenant d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation
ultérieure dans le
cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par trânsplantation des
cellules
ainsi préparées chez un animal.
2 o i) Définitions
Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont 'a la fois la capacité
de
s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de
précurseurs
cellulaires:
Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui
sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine
tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules
souches
embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissulaire, par exemple,
les
cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticitë des cellules souches », on entend la capacitë pour ces
3o cellules de traverser les frontières de lignée; par exemple la capacité des
cellules
hématopo'iétiques à se différentier en hépatocytes:
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Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à reformer un tissu
soit
par activation des cellules prvgénitrices du fiissu (par exemple tissu de la
peau, du
foie, du coeur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation de ces
cellules
progënitrices. Plus particulièrement; il s'agit alors d'une néoformation
tissulaire.
5 Par « réparation tissulaire »; on entend une opération qui permet de pallier
un
déficit sans avoir recours à un: processus derégénération. La réparation
tissulaire
se traduit par un apport e~cogène de cellules qui peuvent être différentes des
cellules
du tissu receveur.
Par « transplantation cellulaire » ï on entend une opération qui se
caractérise
1o par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être
effectuée, par
exemple, par injection directement dans le (issu ou dans la circulation
affërente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut être sujet à une
transplantation cellulaire, et ceci lnelut les êtres vertébrés tels que
notamment fes
êtres humains; les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux.
ü) Procédé de préparation de cellules souches
Un premier aspect de la présente invention vise un procédé de préparation
de cellules souches de mammifère. Ce procédé comprend en général, les étapes
suivantes:
2o a) l'extraction cellulaire;
b) la dissociation mécanique;
c) la'dissociation enzymatique; et
d) le' maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de
préserver la diversité.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une
biopsie pour fournir un fragment tissulaire; tel un fragment de muscle, de
foie ou de
peau. Par exemple; une biopsie musculaire est réalisèe sous anesthésie locale
suite
à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est
ensuite
humidifié dans un milieu défini, tel le DMEI2Q2 en présence de facteurs
protecteurs
3o et de facteurs inhibant ia difFérenciation cellulaire (Pinset et
Montarras), (1994) Celi
Biology : A laboratory Handbook. Academic Press).
Préférablement-, le milieu défini' est un milieu ci-après nommé DPM
(Diversity,
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Protecfing MediUm) et comprend au moins:
- un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou
indépendants de la concentration en C02: Les milieux utilisés sont, dans la
plupart des casa constitués d'un mélange dans un rapport 1 :1 de milieu de
type DME efi de type F12. Parmi ceux-ci on peut cités en exemple le mélange
DME/ F12 et DMEIMCDB 202;
un facteur protecteur, tel:
~ des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine)
D des anti-caspases (Dose : environ 0.1 mU à 10 mU)
~ des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine)
des facteurs protecteurs des métaux (Transf~rrine) (Dose : environ 0.1
pglml à 100 pglml)
- des hormones tels Gtucocorticoïdes, insuürae; acide rétinoïque, hormone
thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques
Z 5 allant préférentiellement de 10'~ à 10'9 M.
- des facteurs inhibant la différenciation, tels:
D les FGF (Fibroblasf Growth Facfors). Parmi les facfieurs de Ia famille
FGf, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un rôle
similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la
2 0 famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement
de 0.1 à 100 pg/ml.
D fEGF (Epidermal Growih Factor) (Dose : environ 0.1 ~rglml à 100 pglml)
D le LiF (Leukemia inhibifory Factor) (Dose : environ 0.1 pg/ml à 100
pglml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
25 D le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut
être utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %.
Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de pr'eparation
cellulaire:
L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme fe sérum par exemple,
permet de garantir une meilteure sécurité infectieuse contre des virus,
prions, etc.
30 et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les
prélèvements
provenant de biopsies sont maintenus soit à température ambiante, soit
conservés,
préférablement, entre 4 et 6 °C dans le DPM pendant une période
n'excédant
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préférablement pas 48 heures. il est clair que-la composition précise du DPM
pourra
varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu
DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homagénat cellulaire. Ceci est
préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre
outif
semblable peut être utilisé. Par la suite, (extrait tissulaire homogéne ou -
fhomogénat
tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des
adipocytes
grâce à une, étape de lavage et de centrifugation par sédimentation douce de 1
à
g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Academic
10 Press).
Ä l'étape c) du procédé, fhomogénat tissulaire obtenu à l'étape b) est soumis
à une digestion enzymatique pour optimiser la dissociation cellulaire: Lors de
cette
étape du procédé de l'invention, des 'enzymes protéolytiques d'origine
bactérienne,,
comme la collagénase etlou la pronase, sont préférablement utilisées.
Toutefois;
pour des raisons de sécurité sanitaire, on peut envisager l'utilisation de
trypsine
produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes
peuvent ëtre utilisées seules ou en. combinaison à des concentrations variant,
préférablement, de' 0.1 à 0.5%.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise
en
2 0 oeuvre de l'étape c) du procédé
le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du
milieu
DPM additionné de collagénase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml.
La
digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs
fois. La
température de la réacfron enzymatique se situe préférablement entre
20°C et 37°C
2 5 avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en
plusieurs
étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. Ä chaque étape, les fragments et les
cellules sont
séparés par centrifugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors
resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis
à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant
sont
30 récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On
aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules
extraites des
différentes étapes de digestion: La suspension cellulaire est ensuite filtrée
sur filtre
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de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns,
pour
éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente
invention, i! est possible, par exemple, de préparer de maniére sûre et
reproductible,
une suspension cellulaire issue d'une biopsie,:rnusculaire qui maintient son
potentiel
de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de
tissu, il
est possible de préparer de 1 x 1 Q6 à 2 x 106 cellules: l:'efficacité des
procédés: pour
(e maintien de (a diversité et de la plasticité cellulaire est évalué par de
tests in vivo
et de tests ex vivo: Dans les premiers; les suspensions cellulaires obtenues
soni
réintroduites dans l'animal aprés un marquage. A titre d'exemple une molécule
fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage
cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans
l'organisme,
d'analyser leurs participations aux différents tissus et la différenciation
des cellules
injectées. Dans les conditions où l'on maintient la diversité.et la
plasticité, les cellules
injectées participent à .ia néoformation de différents tissus comme le muscle
squelettique et cardiaque, les vaisseaux; les tendons, le cartilage, l'os; le
tissu
hématopoïétique. Cette diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante
du site
d'injection soulignanf l'importance de l'environnement dans le devenir
cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer fa diversité
cellulaire et ia plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse
clonale et sur la
réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi ceux-ci on peut
citer
des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, Ies,TGFs, les BMPs;
le VEGF;
r des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoique, les hormones
thyroïdiennes, les glucocortico:~-des;
r des facteurs de ia matrice extracellulaire;
~~ des vitamines et agents: permettant la minéralisation;
r les composants de la matrice extracellulaire;
L'identification cellulaire est faite par des analyses immunologiques à l'aide
de
coloration spécifique et d'anticorps pécifiques qui permettent à la fois
(identification
et la quantification et par l'analyse transcriptomique.,
Les approches' complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la
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diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitativement et
d'ainsi valider
les conditions permettant le maintien de la diversité cellulaire et de la
plasticité
cellulaire.
Les cellules ainsi préparées 'sonf une source de cellules adéquates pour la
thérapie cellulaire et peuvent être soit réimplantées directement dans un
organisme,
soit conservées pbur réimplantation ultérieure:
Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle,
soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les
avantages suivants
~~ conservation des prélèvements issulaires;
dissociation entre la préparation de 1a biopsie et la réimplantation
cellulaire;
r caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplantation cellulaire.
Ä titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette
étape
de congélation
10~ à 2 x 1 Os cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence
de
milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la
concentration utilisée est préférablement de 10%. Dans ces conditions, les
cellules
sont maintenues à 20°C pour une période d,e 10 minutes puis !a
température est
amenée lentement! en quelques heures; à moins 80°C. Finalement, les
cellules sont
transférées dans l'azote liquide. il est important de noter que ces conditions
de
conservation ont J'avantage de ne pas modifier les caractéristiques
cellulaires:
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures
applications cliniques; il peut être préférable de caractérisée Ia suspension
cellulaire
obtenue par le procédé selon la présente invention. Cette caractérisation peut
e"tee
entreprise au niveau protéique gr"ace à l'utilisation de marqueurs cellulaires
tels que ;
- P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales
- N-Cam comme marqueur de cei~ule neuronales et musculaires
- Smooth muscle actin comme marqueurs de cellules du muscle lisse;
- GFAP comme marqueur de cellules güales;
- Myf5, Pax3,; Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules
musculaires;
- Sca1+, C-Kit, CD45 et Cd34 comme.marqueurs de cellules souches.
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Cette caractérisation peut également être entreprise au niveau de la
transcription
par l'utilisation de biopuces contenant des oligonucléotides codant pour des
gènes
cellulaires -(par exemple; facteurs de transcription spécifiques et facteurs
de la
machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier (es Cellules de la
suspension
cellulaire.
iii) Utilisations thérapeutiques
Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension
cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé de (invention dans
des
applications thérapeutiques, dont la thérapie génique; suite à une
transplantation de
ces cellules chez un être humain, par exemple. Plus particulièrement, la
présente
invention propose d'utiliser les cellules préparées parle procédé de
l'invention dans
le cadre d'une réparation et/ou régénération tissulaire par transplantation
cellulaire.
Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en
thérapie
génique.
Par exemple; ' les cellules souches adultes obtenues par le procédé de
préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de
tissu
osseux. Dans le cas présent; if s'agit de transpl nter les cellules sur un
site de
réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou
2 0 certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi
participer à la
réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut ëgalement
fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être
utilisée lors d'une restauration du potentiel hématopo'iétique. En effet, la
capacité
des cellules souches de biopsie musculaire à coloniser la moelle osseuse de
souris
irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoiétiques, oblige à
considérer
le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par
exemple,
de leucémies
D'autre part, il est connu que les greffes; de cellules musculaires cultivées,
dans
le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des
cellules
réimplantées dans les heures qui suivent' leur injection. II est par
conséquent
proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention
peut
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contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la
suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des
fonctions ou réparer le tissu musculaire.
EXEMPLE
L'exemple qui suif sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente
invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent
y étre
effectuées sans que l'on échappe à l'esprit-età la portée de l'invention. Bien
que l'on
1o puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que l'on
retrouve ci-
dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les
méthodes
préférés sont décrits.
Exemule 1 : Réparation du tissu cardiague
Introduction
A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne posséde pas à
l'état adulte de cellule souche capable de réparer ce tissu après une lésion.
De ce
fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de
2 o contraction qui si importante conduit à l'insuffisance cardiaque.
L'objectif de la
thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de
contraction.
Des expériences dans ce sens ont été conduites chez l'Homme avec comme source
de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première
démarche montre la faisabilité de l'approche, mais aussi; certaines
limitations de la
25 stratégie adoptée. L'amplification d'un grand nombre de cellules
musculaires dans
des milieux comprenant des fluides animaux tel le sérum de veau foetal, et
leur
transplantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois
lourdes et
non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux; prions, etc.). La
limitation
essentielle de ce procédé réside dans le fait que Les cellules ainsi injectées
ont une
30 plasticité restreinte; qui ne donnent que des cellules musculaires
squelettiques. Le
procédé de préparation de cellules souches de la présente invention évite
l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
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Description de la transplantation cardiaque chez ia brebis
Protocole anesthésigue . prémédication avec du midaxofam, induction à l'aide
d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de
l'isof(urane dans 100°f° d'oxygène. La surveillance est assurée
par:
électrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie. Analgésie '
postopératoire avec de la bupivaca'ine (bloc intercostal lors de
thoracotomie),
morphine et de la flunixine méglumine.
Biopsie du muscle QUelettigue : Une biopsie du muscle squelettique
(approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps
fémoraux
gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est maintenu dans du DMEM
(SIGMA) à température de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique:
La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle: Les animaux
récupèrent
pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules
sont
prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les expiants de muscle squelettique sont
pesés puis lavés dans du DMEM. Le tissu adipeux et fascia sont retires et le
muscle
est émincé aux ciseaux jusqu'à (obtention d'un homogenat tissulaire. Les
fragments
2o de muscle ont ensuite sédirnentés dans du DMEM à 300 rpm pendant 2 minutes
puis débarrassés du surnageant.
Afin de Iibéref les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés
à
37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM additionnée de 0;4% (PN) de
collagénase (Type IA, SIGMA) brute: Après 20 minutes les fragments sont
centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé dans du DMEM à
20 % (VN) de sérum de veau foetal. Le culot subit jusqu'à quatre digestions
supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D. Cell ~ystems for Ex-vivo Studies
of
Myogenesis ': A 'Protocol for the Isoration of Stable muscle eell populations
from
newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handboak ; deuxième
édition
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e. J. F. Celis, Academic Press; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores
de 250 p;m
de diamètre (Polylabo SA).
MarGmage des cellules : Afin le marquer leurs noyaux, les cellules .sont
resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 ~glmL de 4'-6-
diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes. Les cellules sont
rincées quatre fais dans du DMEM afin d-'enlever le DAPI. Les cellules
mononucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie
1 o à fluorescence. La préparation cellulaire est. ensuite resuspendue dans
1.2 mL de
DMEM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation.
Greffe cellulaire : Les brebis pPéalablement anesthésiées selon la méthode
décrite
ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche
sur
le Sème espace intercostal. Après péricardiotomie et suspension du péricarde,
les
cellules dans du DMEM sont injectées (0.1 mL par site) à l'aide d'une seringue
à
insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une
cartographie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites
d'injection
dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réalisés
2 o pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de là manière
habituelle et les
animaux récupèrent sous régime analgésiqc~e (morphine à 0.5 mg/kg IM BiD;
flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusyement.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules
précurseurs
du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 ~.L de la
suspension
cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM avec
sérum de veau foetal. Les,cellules sont maintenues à titre de témoin dans une
atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les
cellules
servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO)
3o telle que décrite par Mon#arras, D. et al. (Culturel AllyfS Hull and MyoD
Null Muscle
Precursor Ceils Display Distinct Growth Defects. Bioi Ceil 2000;92 :565-72).
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iQ
Rés u ltats
La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux.
Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors
de l'injection
des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée. Le dénombrement
des
cellules permet de déterminer l'injection de 1:7 +/- 0.3 x 1 n' cellules
mononucléées
marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est
détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux ur 8; ce qui confirme
la
survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De
larges
1o surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont
observés
à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1). Des cellules isolées sont
aussi
observées dans le tissu adipeux du péricarde. Ä !'intérieur de la paroi du
myocarde;
les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec
des
cardiocytes natifs. Certaines de ces fibres ont fortement marquées à
l'anticorps
dirigé contre MY32alors-que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure
2):
Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les
cardiocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la
connexine-
43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organisés et présentent
2 o soit une morphologie allongée'caractéristique de myotubeà multinucléés
fusionnés,
soit une morphologïe qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du
muscle
squelettique possèdent des noyaux observés en périphérie ou au centre. Une
fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de
la réponse inflammatoire sont aussi ob ervées.
2 5 Aucun marquage au DAPI n'est observé dans. les cours explantés. Ceci peut
être dû à une division cellulaire active entraïnant une dilution du DAPI. En
effet,
dans les cultures cellulaires servant de témoins, Ie DAPI devient indétectable
après
6 à 8 doublements de population cellulaire:
Les boîtes d;e culture servant de témoins sont obseivées quotidiennement.
3 o L'immunodétection du facteur de régulation spécifique du muscle
squelettique MyoD
montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules
précurseurs du muscle squelettique: Quand on permet aux cellules de fusionner,
CA 02391638 2002-06-28
toutes les cellules montrent de nombreux myotubes .une semaine suivant
l'ensemencement.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits
en'
détails ci-dessus et illustrés-dans les dessins annexës, l'invention n'est pas
(imitée
5 à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications
peuvent
y "etre effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de
l'esprit de,
l'invention.
