Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
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WO 01/53347
PCT/FR01/00188
1
Gène NPHS2 impliqué dans le syndrome néphrotique cortico-résistant, protéine
codée par ce gène et utilisations diagnostiques et thérapeutiques
La présente invention a trait à un nouveau gène, appelé NPHS2,
qui code pour une protéine impliquée dans le syndrome néphrotique cortico-
résistant.
Le syndrome néphrotique idiopathique est une pathologie qui
apparaît principalement chez l'enfant, et qui se caractérise par 'une
protéinurie
massive, et des changement histologiques non spécifiques du rein incluant
parfois une sclérose glomérulaire segmentaire et focale (FSGS). Ces
caractéristiques sont associées avec un effacement diffus des pédicelles des
podocytes observé en microscopie électronique (Broyer et al., 1998),
révélateur
des syndromes néphrotiques quelle que soit leur cause. La plupart des cas
répondent à une thérapie à base de stéroïdes et ont un bon pronostic, mais
environ 20% sont résistants aux stéroïdes et évoluent vers l'insuffisance
rénale
terminale, conduisant à une sclérose glomérulaire complète. On parle alors de
syndrome néphrotique cortico-résistant.
L'ultrafiltration des macromolécules du plasma durant la formation
de l'urine primaire dans le glomérule est l'une des fonctions centrales du
rein
humain. La paroi capillaire structurellement complexe qui est responsable de
cette fonction est composée d'une membrane basale recouverte d'un
endothélium fenestré sur sa surface interne et par des cellules épithéliales
spécialisées (podocytes) qui forment des pédicelles sur la surface externe. On
observe dans un grand nombre de maladies acquises ou héréditaires un
dysfonctionnement du filtre glomérulaire résultant en une perte excessive des
protéines plasmatiques, menant à un syndrome néphrotique, puis éventuellement
à une insuffisance rénale terminale.
L'étude des maladies génétiques affectant la barrière de filtration
fournit des modèles utiles pour comprendre la physiopathologie du processus de
filtration glomérulaire. Plusieurs de ces affections héréditaires avec
protéinurie et
syndrome néphrotique ont été décrites. Le plus sévère est le syndrome
néphrotique congénital de type finlandais (CNF), qui est une maladie récessive
-
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2
autosomique avec une forte protéinurie in utero, un syndrome néphrotique à la
naissance conduisant habituellement à une insuffisance rénale terminale durant
les deux premières années de la vie. Le CNF est provoqué par des mutations
dans le gène NPHS1 (Kestilâ, 1998). Par ailleurs, des cas de protéinurie
familiale
ou de syndrome néphrotique avec des lésions histologiques de sclérose
glomérulaire segmentaire ou focale (FSGS) ont été décrits chez des patients
plus
âgés, en particulier à l'âge adulte. Deux 'locus génétiques pour la FSGS
dominante autosomique ont été cartographiés respectivement sur le locus 19q13
proche du locus du gène NPHS1 (Mathis et al., 1998) et sur le locus 11q21-q22
(Winn et ai., 1999).
En 1995, une nouvelle entité de syndrome néphrotique
corticorésistant de transmission autosomique récessive a été caractérisée
selon
les critères suivants : début précoce entre trois mois et cinq ans, résistance
à une
thérapie à base de stéroïdes, évolution vers l'insuffisance rénale terminale
avant
l'âge de dix ans, absence de récidive après transplantation rénale et absence
de
quelconque désordre extra-rénal. Histologiquement, on n'observe que des
modifications minimes dans les biopsies précoces mais une FSGS est
généralement présente à des stades ultérieurs. Un locus génétique impliqué
dans ce syndrome néphrotique corticorésistant, a été cartographié dans la
région
1q25-q31 entre les marqueurs D1S452 et D1S466, cette région s'étendant sur
environ 12 cM (Fuchshuber, 1995). Cette localisation a été confirmée par une
autre équipe (Lench et al., 1998) et plus récemment, une liaison à cette
région a
également été démontrée dans une famille présentant une FSGS débutant à
l'âge adulte (Tsukaguchi et al., 1999).
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un acide nucléique isolé, dont la séquence
est
choisie parmi SEQ 1D No 3 à SEQ 1D No 10.
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2a
La présente invention concerne aussi un polypeptide isolé, dénommé
podocine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique isolé comprenant
la séquence différant de la séquence SEQ ID n 1 seulement par la présence
d'une
ou plusieurs des mutations correspondant aux positions des nucléotides 481,
173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607, 940, 1033, 529, 622, 774-782,
154, 422, 442, 571, 572, 583, 783, 794 et 848 de SEQ ID n 1.
La présente invention invention concerne concerne aussi un acide nucléique
isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1, ou une séquence codant pour le
polypeptide selon "invention.
La présente invention concerne également des vecteurs de clonage et/ou
d'expression contenant un acide nucléique selon l'invention, et des cellules
hôtes
transfectées par un tel vecteur.
La présente invention concerne aussi un acide nucléique constitué d'une
séquence choisie parmi les séquences SEQ ID n 11 à SEQ ID n 27.
La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un
polypeptide podocine recombinant, dans lequel un vecteur contenant un acide
nucléique selon l'invention est transféré dans une cellule hôte, qui est mise
en
culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide selon
l'invention.
La présente invention concerne aussi un anticorps dirigé spécifiquement
contre le polypeptide selon l'invention, et de son utilisation pour la
détection ou la
purification d'un polypeptide dans un échantillon biologique.
La présente invention concerne aussi l'utilisation d'au moins un acide
nucléique selon l'invention, pour la détection d'une anomalie dans le gène
NPHS2,
défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention, ou
dans un transcrit dudit gène NPHS2.
La présente invention concerne également un procédé de diagnostic in vitro
d'un syndrome néphrotique cortico-résistant, comprenant les étapes consistant
à:
= CA 02398083 2013-01-07
2b
al) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ADN avec
des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie
du
gène NPHS2, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique selon
l'invention;
bl) amplifier ledit ADN;
cl) détecter les produits d'amplification;
dl) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un
échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie
dans
ledit gène NPHS2, indicatrice d'un syndrome néphrotique cortico-résistant,
ladite
éventuelle anomalie étant une ou plusieurs mutations correspondant aux
positions
des nucléotides 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607, 940,
1033,
529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583, 783, 794 et 848 de SEQ ID n
1;
ou, selon une alternative,
a2) mettre en présence un échantillon biologique contenant de l'ARN avec
des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout ou partie
du
transcrit du gène NPHS2, défini comme comprenant une séquence d'acide
nucléique selon l'invention;
b2) amplifier ledit ARN;
c2) détecter les produits d'amplification;
d2) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus avec un
échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle anomalie
dans
ledit transcrit du gène NPHS2, indicatrice d'un syndrome néphrotique cortico-
résistant, ladite éventuelle anomalie étant une ou plusieurs mutations
correspondant aux positions des nucléotides 481, 173/174, 488, 924/925, 128,
343,
482, 548, 607, 940, 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583,
783,
794 et 848 de SEQ ID n 1.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique
comprenant un polypeptide selon l'invention ou un acide nucléique codant pour
ledit polypeptide, en association avec un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
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2c
La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un polypeptide de
l'invention ou d'un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, pour la
fabrication
d'un médicament destiné au traitement de maladies rénales.
La présente invention concerne aussi l'utilisation d'un polypeptide de
l'invention, ou d'un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, pour le
traitement
d'un syndrome néphrotique cortico-résistant.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic de la
présence ou de l'absence du syndrome néphrotique cortico-résistant chez un
humain, le syndrome étant associé avec la présence d'une mutation dans le gène
NPHS2 codant pour la séquence SEQ ID n 2, ledit procédé comprenant la
détection de la présence ou de l'absence d'une ou plusieurs mutations dans le
gène NPHS2 codant pour la séquence SEQ ID n 2 dans un échantillon biologique
obtenu auprès de l'humain, et la mutation étant une ou plusieurs mutations
localisées dans la séquence SEQ ID n 1 aux positions 481, 173/174, 488,
924/925,
128, 343, 482, 548, 607, 940, 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 571, 572,
583,
794, ou 848.
La présente invention concerne aussi un procédé pour le diagnostic de la
présence ou de l'absence du syndrome néphrotique cortico-résistant chez un
humain, le syndrome étant associé avec la présence d'une mutation dans le gène
NPHS2 codant pour la séquence SEQ ID n 2, ledit procédé comprenant la
détection de la présence ou de l'absence d'une ou plusieurs mutations dans le
gène NPHS2 codant pour la séquence SEQ ID n 2 dans un échantillon biologique
obtenu auprès de l'humain, et la mutation étant une ou plusieurs mutations
localisées dans la séquence SEQ ID N 1 aux positions 481, 173/174, 488,
924/925,
128, 343, 482, 548, 607, 940, 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571,
583,
794, ou 848;
ledit procédé dans lequel la détection de la présence ou de l'absence d'une ou
plusieurs mutations dans le gène NPHS2 comprend :
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2d
a) l'amplification spécifique de l'ADN de l'échantillon biologique obtenu
auprès de l'humain, obtenant ainsi des produit d'amplification ; et
b) la comparaison des produits d'amplification obtenus à l'étape a) et des
produits d'amplification obtenus chez un échantillon contrôle comprenant un
gène
NPHS2 sauvage, étant entendu que si les produits d'amplification obtenus de
l'échantillon sont différents des produits d'identification du contrôle, alors
une ou
plusieurs mutations dans le gène NPHS2 dans l'échantillon biologique ont été
détectées.
La présente invention concerne un procédé pour détecter la présence ou
l'absence d'une mutation dans un gène NPHS2, comprenant les étapes consistant
à:
a) analyser un échantillon test d'acide nucléique contenant le gène NPHS2 à la
recherche d'au moins une mutation,
b) comparer les résultats de l'analyse de l'échantillon test à l'étape a) avec
les
résultats de l'analyse d'un échantillon contrôle, l'échantillon contrôle
comprenant un
gène NPHS2 sans mutation; et
c) déterminer la présence ou l'absence d'au moins une mutation dans
l'échantillon
test.
La présente invention concerne un procédé pour déterminer si un être
humain est un sujet à risque vis-à-vis d'un syndrome néphrotique cortico-
résistant,
le syndrome étant associé avec la présence d'une mutation dans un gène NPHS2
codant pour la séquence SEQ ID n 2, ledit procédé comprenant la détection de
la
présence ou de l'absence d'une ou plusieurs mutations dans le gène NPHS2
codant pour la séquence SEQ ID n 2 dans un échantillon biologique obtenu chez
l'être humain et la mutation étant une ou plusieurs mutations localisées dans
SEQ
ID n 1 aux positions 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607, 940,
1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583, 794, ou 848.
=
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2e
La présente invention concerne une amorce comprenant une séquence
d'acide nucléique choisie parmi SEQ ID N 12-27.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à
identifier de manière précise un nouveau gène impliqué dans l'entité de
syndrome néphrotique cortico-résistant décrite ci-dessus. Ce gène a d'abord
été
appelé SRN1 puis a été renommé NPHS2.
En annexe se trouve une liste de séquences, dans laquelle la
séquence SEQ ID n 1 représente le fragment d'ADNc du gène NPHS2 chez
l'homme correspondant au cadre de lecture ouvert (ORF). Cet ORF contient
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3
1149 bases et code pour une protéine de 383 acides aminés, dénommée
podocine, dont la séquence est présentée SEQ ID n 2.
Les séquences SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10 représentent des
fragments de l'ADN génomique du gène NPHS2 humain incluant respectivement
8 exons (en caractères gras dans le listing annexé), comme suit :
SEQ ID n 3 :
Il y a 683 paires de bases avant l'ATG. Les clones d'ADNc obtenus
par criblage d'une banque d'ADNc de rein foetal humain (banque Clontech clonée
dans le phage gt11) commencent généralement entre les bases 615 et 619. Il y
a 274 paires de bases de l'ATG au site d'épissage (exon 1), puis 147 paires de
bases de séquences introniques.
=
SEQ ID n 4 :
Il y a 151 paires de bases d'intron, puis 104 paires de bases de
codant (exon 2), puis 123 paires de bases d'intron.
SEQ ID n 5:
Il y a 336 paires de bases d'intron, puis 73 paires de bases de
codant (exon 3), puis 291 paires de bases d'intron.
SEQ ID n 6:
Il y a 187 paires de bases d'intron, puis 83 paires de bases de
codant (exon 4), puis 90 pb d'intron.
SEQ ID n 7:
Il y a 250 paires de bases d'intron, puis 204 paires de bases de
codant (exon 5), puis 195 paires de bases d'intron.
SEQ ID n 8:
Il y a 367 paires de bases d'intron, puis 56 paires de bases de
codant (exon 6), puis 169 paires de bases d'intron.
SEQ ID n 9:
* (marque de commerce)
!VA ________________________________________________________________
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4 =
Il y a 327 p13 d'intron, puis 79 paires de bases de codant (exon 7),
puis 310 paires de bases d'intron.
SEQ ID n 10:
Il y a 285 paires de bases d'intron, puis 911 paires de bases de
séquence d'ADNc jusqu'au site de polyadénylation utilisé (exon 8). Le codon
stop
est en position 562, puis 109 paires de bases de séquences génomiques
supplémentaires couvrant les autres sites potentiels de polyadénylation.
La -séquence SEQ ID n 11 couvre une partie de l'exon 5, les exons
6 et 7 et une grande partie de l'exon 8 (de la base 1792 de l'ADNc).
Les séquences SEQ ID n 12 à n 27 sont des amorces utiles pour
l'amplification des séquences humaines.
La séquence SEQ ID n 28 est la séquence d'ADNc de podocine de
rat, la séquence SEQ ID n 29 étant la séquence d'acides aminés
correspondante.
La présente invention a donc pour objet un acide nucléique isolé,
dont la séquence est choisie parmi SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10, ou une
séquence homologue, définie comme
I) une séquence identique à au moins 70% de la séquence
SEQ ID n 3 à SEQ ID n 10 ; ou
ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 3 à
SEQ ID n 10 ou leurs séquences complémentaires, dans des conditions
stringentes d'hybridation.
La présente invention a également pour objet un acide nucléique
isolé, comprenant la séquence SEQ ID n 1 ou 28, ou une séquence homologue,
définie comme
i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence
SEQ ID n 1 ; ou
ii) une séquence hybridant avec la séquence SEQ ID n 1 ou sa
séquence complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation, ou
iii) une séquence codant pour le polypeptide, dénommé
podocine, tel que défini précédemment.
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De préférence, une séquence nucléotidique homologue selon
l'invention est identique à au moins 75 % des séquences SEQ ID n 1 ou SEQ ID
n 3 à 10 et 28, de préférence encore au moins 85 %, ou au moins 90 %.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique
5 homologue hybride spécifiquement aux séquences complémentaires des
séquences SEQ ID n 1, 3 à 10, et 28 dans des conditions stringentes. Les
paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la
température
à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie
io par la relation : Tm=81,5+0,41(%G+C)+16,6Log(concentration en cations) ¨
0,63(%formamide) ¨(600/nombre de bases) (Sambrook et al., 1989).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est
définie par la relation : Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les
séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est
approximativement de 5 à 30 C, de préférence de 5 à 10 C en dessous de Tm,
et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de
force
ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Une séquence nucléotidique homologue à l'ORF représentée à la
SEQ ID n 1 ou 28 inclut toute séquence nucléotidique qui diffère de la
séquence
SEQ ID n 1 ou 28 par mutation, insertion, délétion ou substitution d'une ou
plusieurs bases, ou par la dégénérescence du code génétique, pour autant
qu'elle code pour un polypeptide présentant l'activité biologique de la
podocine,
comme définie plus bas.
Parmi de telles séquences homologues, sont comprises les
séquences des gènes de mammifères autres que l'homme, codant pour la
podicine, de préférence d'un primate, d'un bovin, ovin ou porc, ou encore d'un
rongeur, ainsi que les variants alléliques, ou séquences polymorphiques.
Le tableau ci-après présente un certain nombre de polymorphismes
identifiés dans le gène NPHS2 :
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Polymorphismes identifiés dans le gène NPHS2
Exon Polymorphisme Position sur les
séquences listées
1 -51/ATG T>G +19 sur SEQ ID n 1
nt 102 (G>A) = G34G +171 sur SEQ ID n 1
2 nt 288 (G>T) = S96S +357 sur SEQ ID n 1
5 nt 686 (G>A) = R229Q +755 sur SEQ ID n 1
7 873 +7 A>G +413 sur SEQ ID n 9
8 nt 954 (T>C) = A318A +1023 sur SEQ ID n 1
nt 1038 (A>G) = L346L +1107 sur SEQ ID n 1
____________________________________________
La présente invention a également pour objet un polypeptide isolé,
dénommé podocine, comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID n 2 ou
29, ou une séquence homologue, définie comme
i) une séquence identique à au moins 70% de la séquence SEQ ID
n 2 ou 29 ; ou
ii) une séquence codée par une séquence d'acide nucléique
homologue telle que définie dans la revendication 2 ii), c'est-à-dire une
séquence
d'acide nucléique hybridant avec la séquence SEQ ID n 2 ou 29 ou sa séquence
complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
Plus généralement, par séquence d'acides aminés homologue ,
on entend toute séquence d'acides aminés qui diffère de la séquence SEQ ID
n 2 ou 29 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un
nombre réduit d'acides aminés, notamment par substitution d'acides aminés
naturels par des acides aminés non naturels ou pseudoacides aminés à des
positions telles que ces modifications ne portent pas significativement
atteinte à
l'activité biologique de la podocine.
Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions
conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe,
telles que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non
chargées
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(tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la
tyrosine),
d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine,
l'arginine, et
l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide
aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales
apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine,
l'isoleucine, la proline,
la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est
identique à au moins 85 % de la séquence SEQ ID n 2 ou 29, de préférence au
moins 95 `)/0.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel
d'analyse de séquence (par exemple, Sequence Analysis Software Package of
the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center,
1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés
similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e.
identité). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière
artificielle des
espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le
degré d'homologie (Le. identité) est établi par enregistrement de toutes les
positions pour lesquelles les acidesaminés des deux séquences comparées sont
identiques, par rapport au nombre total de positions.
"L'activité biologique de la podocine" se réfère au maintien de
l'intégrité du filtre glomérulaire. L'absence ou l'altération de la podocine
provoque
la fuite de protéines au niveau du glomérule et par conséquent l'apparition
d'une
protéinurie.
Le polypeptide de la présente invention peut être synthétisé par
toutes les méthodes bien connues de l'homme du métier. Le polypeptide de
l'invention peut par exemple être synthétisé par les techniques de la chimie
de
synthèse, telles que la synthèse de type Merrifield qui est avantageuse pour
des
raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits
secondaires
non désirés et pour sa facilité de production.
Une podocine recombinante peut également être produite par un
procédé, dans lequel un vecteur contenant un acide nucléique comprenant la
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séquence SEQ ID n 1 ou n 28 ou une séquence homologue est transféré dans
une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant
l'expression du polypeptide correspondant.
La podocine produite peut ensuite être récupérée et purifiée.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du
métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats
et .
extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes
utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement,
les
méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anti-
corps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
La séquence d'acide nucléique d'intérêt, codant pour la podocine,
peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de
manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression,
tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de
transcription.
Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques
(promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en
fonction
de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon
l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au
sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels
vecteurs
seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier,
et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par
des
méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la
précipitation au
phosphate de calcium.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits ci-
dessus, contenant une des séquences nucléotidiques définies selon l'invention
font également partie de la présente invention.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière
transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent
être
obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou
eucaryotes,
d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus,
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puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la
réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules de
mammifères, telles que les cellules COS-7, 293, MDCK, des cellules d'insectes
telles que les cellules SF9, des bactéries telles que E. col/ et des souches
de
levures telles que YRG2.
Les différentes séquences nucléotidiques de l'invention peuvent
être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences d'ADN ou
d'ARN,
obtenues par criblage de banques de séquences au Moyen de sondes élaborées
sur la base des séquences SEQ ID n 1 ou 28 et 3 à 10. De telles banques
peuvent être préparées par des techniques classiques de biologie moléculaire,
connues de l'homme de l'art.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent également
être préparées par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes
incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par
criblage des banques.
Ces séquences nucléotidiques permettent la réalisation de sondes
ou amorces, hybridant spécifiquement avec une séquence SEQ ID n 1 ou 28, ou
3 à 10, selon l'invention, ou son brin complémentaire. Les conditions
d'hybridation appropriées correspondent aux conditions de température et de
force ionique usuellement utilisées par l'homme du métier, de préférence dans
des conditions stringentes telles que définies précédemment. Ces sondes
peuvent être utilisées comme outil de diagnostic in vitro pour la détection,
par des
expériences d'hybridation, notamment d'hybridation "in situ", de transcrits
spécifiques du polypeptide de l'invention dans des échantillons biologiques ou
pour la mise en évidence de synthèses aberrantes ou d'anomalies génétiques
résultant d'un polymorphisme, de mutations ou d'un mauvais épissage.
Les acides nucléiques de l'invention utiles comme sondes
comportent au minimum 10 nucléotides, préférentiellement au moins 20
nucléotides, préférentiellement encore au moins 100 nucléotides. Les acides
nucléiques utiles comme amorces comportent au minimum 10 nucléotides, de
préférence au moins 14 nucléotides, et préférentiellement moins de 40
nucléotides.
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Plus précisément, la présente invention a pour objet un acide
nucléique ayant au moins 10 nucléotides, qui hybride spécifiquement avec l'une
des séquences d'acide nucléique SEQ ID n 1 ou 28, ou 3 à 10 ou son
complémentaire, dans des conditions stringentes d'hybridation.
5 De
manière avantageuse, on peut utiliser comme sonde l'acide
nucléique constitué de la séquence SEQ ID n 11, qui couvre une partie de
l'exon
5, les exons 6 et 7 et une grande partie de l'exon 8 (de la base 728 à la base
1792 de l'ADNc).
On peut par ailleurs utiliser comme amorce, pour une amplification
10 (par
exemple par PCR), les acides nucléiques constitués des séquences SEQ ID
n 12 à SEQ ID n 27.
Préférentiellement, les sondes ou amorces de l'invention sont
marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques
sont à
la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent,
radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces
oligonucléotides sont mis en oeuvre pour la détection de mutations ou de
remaniements génomiques, au niveau du gène NPHS2, sont incluses dans la
présente invention.
L'homme du métier connaît bien les méthodes standard pour
analyser l'ADN contenu dans un échantillon biologique et pour diagnostiquer un
désordre génétique. De nombreuses stratégies d'analyse génotypique sont
disponibles (Antonarakis et aL, 1989; Cooper et aL, 1991).
De préférence, on peut utiliser la méthode DGGE (Electrophorèse
sur gel de gradient dénaturant), la méthode SSCP (Polymorphisme de
conformation simple brin) ou la méthode DHPLC (Chromatographie liquide haute
performance dénaturante ; Kuklin et al., 1997; Huber et al., 1995) pour
détecter
une anomalie dans le gène NPHS2. De telles méthodes sont de préférence
suivies par un séquençage direct. Le procédé de RT-PCR peut être
avantageusement mis en oeuvre pour détecter des anomalies dans le transcript
de NPHS2, car il permet de visualiser les conséquences d'une mutation
d'épissage provoquant la perte d'un ou plusieurs exons au niveau du transcrit,
ou
un épissage aberrant dû à l'activation d'un site cryptique. Ce procédé est
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également de préférence suivi d'un séquençage direct. Les procédés plus
récemment développés utilisant des puces à ADN peuvent également être mis en
oeuvre pour détecter une anomalie dans le gène NPHS2 (Belli.s et al., 1997).
= Le clonage du gène NPHS2 ainsi que l'identification de diverses
mutations responsables du syndrome néphrotique cortico-résistant permettent
d'envisager des diagnostics directs. La spécificité et la fiabilité de telles
méthodes -
de diagnostic sont particulièrement appréciables pour un diagnostic prénatal.
Les
séquences d'acides nucléiques de la présente invention représentent donc un
outil particulièrement intéressant pour le conseil génétique.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'au moins un
acide nucléique tel que défini précédemment, pour la détection d'une anomalie
dans le gène NPHS2, défini comme comprenant une séquence d'acide nucléique
SEQ ID n 3 à 10 ou, dans son transcrit, défini comme comprenant une séquence
d'acide nucléique complémentaire de la séquence SEQ ID n 1.
L'invention a, par suite, pour objet un procédé de diagnostic in vitro
d'un syndrome néphrotique cortico-résistant lié à une mutation du gène NPHS2,
comprenant les étapes consistant à :
ai) mettre en présence un échantillon biologique contenant de
l'ADN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout
ou
partie du gène NPHS2, défini comme comprenant une séquence d'acide
nucléique choisie parmi SEQ ID n 3 à 10 ou une séquence homologue ;
bl ) amplifier ledit ADN ;
cl) détecter les produits d'amplification ;
dl) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus
avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle
anomalie dans ledit gène NPHS2, indicatrice d'un syndrome néphrotique cortico-
résistant lié à une mutation du gène NPHS2;
ou, selon une alternative,
a2) mettre en présence un échantillon biologique contenant de
l'ARN avec des oligonucléotides spécifiques permettant l'amplification de tout
ou
partie du transcrit du gène NPHS2, défini comme comprenant une séquence
d'acide nucléique complémentaire de la séquence SEQ ID n 1 ou une séquence
homologue ;
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b2) amplifier ledit ADN;
c2) détecter les produits d'amplification ;
d2) comparer les produits d'amplification obtenus à ceux obtenus
avec un échantillon contrôle, et détecter de cette manière une éventuelle
anomalie dans ledit transcrit du gène NPHS2, indicatrice d'un syndrome
néphrotique cortico-résistant lié à une mutation du gène NPHS2.
Font également partie de l'invention les acides nucléiques isolés,
comprenant une séquence différant de la séquence SEQ ID n 1 par une
mutation, insertion ou délétion, notamment dans l'une au moins des positions
des
nucléotides 481, 173/174, 488, 924/925, 128, 343, 482, 548, 607 et 940, ou
encore 1033, 529, 622, 774-782, 154, 422, 442, 571, 572, 583, 783, 794 et 848.
Parmi les mutations déjà identifiées, on relève notamment les
suivantes, présentées dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 1: Mutations dans le gène NPHS2
0
ID
Type de mutation' Changement de Effet sur la séquence Exon n
d'identification de Statut de la mutation' Position sur SEQ ID
c,à
nucléotide codante la famille
concernée n 1 c,à
.1-
Non-sens C--->T à 412 R138X 3 8
H 481 --.1
Délétion/Insertion Insertion de G à 104/5 Décalage 1 14
h 173/174
Délétion de G à 419 Décalage 3 14
he 488
Délétion de AA à 855/6 Décalage 7 9
h ' 924/925
C-->T à 59 P2OL . 1 15
H 128
Faux-sens G--->T à 274 G92C 1 3
hc,d 343 n
G--->A à 413 R138Q 3 4
ha 482
6
H 1.9
teà
to
7
H co
0
11
H m
ui
12
h 1.)
0
13
H 0
1.)
A--->G à 479 D160G 4 16
H 548 i
0
-.1
G-->A à 538 V180M 5 10
H 607 i
H
12
h 940 u)
C-->T à 871 R291W 7 2
he
a : la position des mutations est indiquée en prenant pour base 1, le A du
codon ATG et selon la nomenclature de Antonarakis et al
b : H ¨ mutation homozygote ; h = mutation hétérozygote
c : uniquement la mutation paternelle détectée
,-o
d : implique le dernier nucléotide de l'exon 1 et donc probablement altère
aussi l'épissage .
n
,-q
Les mutations n'ont pas été retrouvées chez 40 contrôles
;-=1--
-a
ID
Ge
Ge
0
Tableau 2 : Autres mutations dans le gène NPHS2
ID
,-,
)-,
c,à
Type de Mutation Changement de Effet sur la Séquence Codante Exon
Nombre de Statut de la Position sur c,à
.1-
-,1
Nucléotide a
familles
Mutation b
SEQ ID n 1
Non-sens C-->T à 964 R322X 8
1 h 1033
Délétion/Insertion Insertion T à 460 Décalage 4
1 h 529 n
Déletion T 553 Décalage 5
1 h 622 0
Délétion 9pb à 705-713 Délétion TER 236-238 5
1 H 774-782 1.)
ui
u)
co
0
co
.P.
Faux-sens G->A à 85 A29T 1
1 h 154 1.)
0
C->T à 353 P118L 2
1 h 422 0
1.)
i
G-->A à 373 A1251 2
1 h 442 0
-..]
C->A à 502 R168S 4
1 h 571 i
H
li)
C-.-->T à 502 R168C 4
1 h 571
G->A à 503 R168H 4
1 h 572
C->G à 514 L172V 4
, 1 h 583
G-->T à 714 R238S 5
1 h 783
C->T à 725 A242V 5
2 h 794
T-->A à 779 V260E 6
2 H 848
so
n
a la position des mutations est indiquée en prenant pour base 1, le A du codon
ATG et selon la nomenclature de Antonarakis et al. ol
b H = mutation homozygote; h = mutation hétérozygote.
ô
ô
ID
,-,
Les mutations n'ont pas été retrouvées chez 40 contrôles.
oc,
Ge
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= Ces tests peuvent être notamment mis à profit dans les familles qui
ont déjà un enfant atteint, pour le diagnostic présynnptomatique (en
particulier,
diagnostic prénatal).
Dans les cas sporadiques, la détection d'une mutation du gène
5
NPHS2 permet de modifier le traitement (et en particulier d'éviter des
traitements
immunosuppresseurs qui seront inefficaces) et de prédire l'absence de récidive
=
après transplantation rénale.
Ce test diagnostic peut également servir à rechercher l'association
de certains variants polymorphes de la podocine dans d'autres pathologies
10 impliquant secondairement des anomalies du filtre glonnérulaire
(néphropathie
diabétique, néphropathie du SIDA, réduction néphronique, hypertension
artérielle). Ces variants pourraient représenter des facteurs de
susceptibilité au
déclenchement ou à la progression de la néphropathie dans ces maladies.
15
L'invention a également pour objet des anticorps dirigés contre le
polypeptide podocine tel que défini précédemment.
Il peut s'agir d'anticorps poly- ou monoclonaux ou de leurs
fragments, d'anticorps chimériques, notamment humanisés
ou
immunoconjugués.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus à partir du sérum
d'un animal immunisé contre un polypeptide selon les modes opératoires usuels.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on peut utiliser comme
antigène un fragment peptidique approprié, pouvant être couplé par
l'intermédiaire d'un résidu réactif à une protéine ou un autre peptide. Des
lapins
sont immunisés avec l'équivalent de 1mg de l'antigène peptidique selon la
procédure décrite par Benoit et al. (1982). A des intervalles de quatre
semaines,
les animaux sont traités par des injections de 200 pg d'antigène et saignés 10
à
14 jours plus tard. Après la troisième injection, l'anti-sérum est examiné
pour
déterminer sa capacité à se lier au peptide antigène radiomarqué à l'iode,
préparé par la méthode chloramine-T et est ensuite purifié par une
chromatographie sur colonne échangeuse d'ion carboxyméthyl cellulose (CMC).
Les molécules d'anticorps sont ensuite recueillies dans les mammifères et
isolées jusqu'à la concentration souhaitée par les méthodes bien connues de
. -
,fi=
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16
l'homme de l'art, par exemple, en utilisant DEAE Sephadex pour obtenir la
fraction IgG.
Afin d'augmenter la spécificité du sérum polyclonal, les anticorps
peuvent être purifiés par une chromatographie d'immuno-affinité en utilisant
des
polypeptides immunisant en phase solide. L'anticorps est mis en contact avec
le
polypeptide immunisant en phase solide pendant une durée suffisante de façon à
faire immuno-réagir le polypeptide avec la molécule d'anticorps afin de former
un
complexe immunologique en phase solide.
A titre d'exemple, des anticorps polyclonaux chez le lapin ont été
produits contre deux protéines recombinantes comprenant les fragments des
acides aminés 15 à 89 et 135 à 383 de la podocine, couplés à six résidus
histidine du côté N-terminal, les ADNc ayant été sous-clonés dans le vecteur
PQ
E32 (Quiagen),et exprimés dans E. coll.
Des anticorps monoclonaux peuvent être obtenus selon la méthode
classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (1975).
Les anticorps ou fragments d'anticorps de l'invention peuvent être
par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des
fragments Fab et F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme
d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués.
Les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps
monoclonaux, peuvent notamment être utilisés pour l'analyse par
immunohistochimie de la podocine sur des coupes de tissus spécifiques, par
exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoperoxydase...
Les anticorps ainsi produits peuvent être avantageusement mis en
oeuvre dans toute situation où l'expression de la podocine doit être observée.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un
anticorps ainsi produit pour la détection ou la purification d'un polypeptide
tel que
défini précédemment dans un échantillon biologique.
Plus précisément, l'invention concerne une méthode in vitro pour la
détection ou la mesure du taux d'expression de la podocine dans un prélèvement
biologique comprenant la mise en contact d'au moins un anticorps tel que
défini
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précédemment avec ledit prélèvement biologique dans des conditions permettant
la formation éventuelle de complexes immunologiques spécifiques entre la
podocine et le ou lesdits anticorps et la détection des complexes
immunologiques
spécifiques éventuellement formés. La mise au point d'un tel test (de type.
ELISA
par exemple) pourrait être en particulier utile pour rechercher le
développement
d'anticorps anti-podocine après transplantation rénale, dans certaines
maladies
rénales auto-immunes, voire dans le syndrome néphrotique cortico-sensible.
L'invention a également pour objet un kit pour la mise en oeuvre de
cette méthode comprenant :
- au moins un anticorps spécifique de la podocine, éventuellement
fixé sur un support ;
- des moyens de révélation de la formation de complexes
antigènes/anticorps spécifiques entre la podocine et ledit anticorps et/ou des
moyens de quantification de ces complexes.
L'invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant un polypeptide podocine tel que défini
précédemment ou un acide nucléique codant pour ledit polypeptide, en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les modes d'administration, les posologies et les formes
galéniques des compositions pharmaceutiques selon l'invention, contenant au
moins un polypeptide, peuvent être déterminées de manière usuelle par l'homme
du métier, notamment selon les critères généralement pris en compte pour
l'établissement d'un traitement thérapeutique adapté à un patient, comme par
exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général,
la
tolérance au traitement, et les effets secondaires constatés, etc.
De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou
prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 pg à environ 1 mg peut être
administrée à des adultes humains.
L'invention a également pour objet une composition
pharmaceutique comprenant un acide nucléique tel que défini précédemment,
codant pour un polypeptide à activité de podocine et un véhicule
pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être
utilisée
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en thérapie génique. L'acide nucléique de préférence inséré dans un vecteur
généralement viral (tels que les adénovirus et les rétrovirus) peut être
administré
sous forme nue, exempt dé tout véhicule favorisant le transfert à la cellule
cible,
tels que des liposomes anioniques, des lipides cationiques, des
microparticules,
par exemple des microparticules d'or, des agents de précipitation, par exemple
du phosphate de calcium, ou tout autre agent facilitant la transfection. Dans
ce
cas', le polynucléotide peut être simplement dilué dans une solution
physiologiquement acceptable, telle qu'une solution stérile ou une solution
stérile
tampon, en présence ou en l'absence d'un véhicule.
De manière alternative, un acide nucléique de l'invention peut être
associé à des agents qui facilitent la transfection. Il peut être, entre
autres , (i)
associé à un agent chimique qui modifie la perméabilité cellulaire tel que la
bupivacaïne ; (ii) encapsulé dans des liposomes, éventuellement en présence de
substances supplémentaires facilitant la transfection ; ou (iii) associé à des
lipides cationiques ou des microparticules de silice, d'or ou de tungstène.
Lorsque les constructions d'acide nucléique de l'invention
recouvrent des microparticules, celles-ci peuvent être injectées par voie
intradermique ou intraépidermique par la technique du canon à gènes, "gene
gun" (VVO 94/24263).
La quantité à utiliser comme médicament dépend notamment de la
construction d'acide nucléique elle-même, de l'individu auquel cet acide
nucléique est administré, du mode d'administration et du type de formulation,
et
de la pathologie. De manière générale, une quantité thérapeutiquement ou
prophylactiquement efficace variant d'environ 0,1 pg à environ 1 mg, de
préférence d'environ 1 pg à environ 800 pg et, de manière préférentielle
d'environ
25 pg à environ 250 pg, peut être administrée à des adultes humains.
Les constructions d'acides nucléiques de l'invention peuvent être
administrées par toute voie d'administration conventionnelle telle que
notamment
par voie parentérale. Le choix de la voie d'administration dépend en
particulier de
la formulation choisie. Une administration ciblée au tissu rénal, en
particulier aux
glomérules, peut être particulièrement avantageuse.
Le polypeptide de l'invention ou l'acide nucléique codant pour ce
polypeptide sont utiles à titre de médicament, notamment pour le traitement
d'une
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maladie rénale, en particulier pour le traitement d'un syndrome néphrotique
cortico-résistant lié à une mutation du gène NPHS2 ou survenant dans le cadre
d'une maladie générale (SIDA, diabète...).
L'invention a donc enfin pour objet une méthode de traitement
thérapeutique, dans laquelle on administre à un patient nécessitant un tel
traitement, une quantité efficace d'un polypeptide podocine tel que défini
précédemment ou un acide nucléique codant pour ce polypeptide.
Le patient visé est généralement un être humain, mais l'application
peut également être étendue à tout mammifère le cas échéant.
Les exemples suivants ainsi que la figure annexée illustrent
l'invention sans en limiter sa portée.
LEGENDE DE LA FIGURE
La figure annexée est une carte de la région NPHS2. La région
candidate de 2,5 Mb est délimitée par les marqueurs D1S1640 et 183f10-CA. La
position sur la carte des marqueurs polymorphes et des séquences STS (en
caractères gras et italiques) et des séquences EST uniques et des clusters
UniGene de EST (en caractère normal) est indiquée. Les YAC, PAC et cosmides
sont représentés par des lignes. Les gènes sont indiqués par des cadres
hachurés. NGAP est représenté par deux cadres séparés par une ligne
horizontale qui symbolise la présence des exons épissés de manière alternative
en position 5' probablement due à un promoteur alternatif. RPS14P, un
pseudogène de la protéine ribosomale S14, est localisé à l'intérieur de
l'intron de
NGAP.
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EXEMPLES
EXEMPLE 1 Identification du gène NPHS2
5 L'approche utilisée par les auteurs de la présente invention pour
identifier le gène NPHS2, a été de définir l'intervalle génétique minimal .où
se,
situait le gène, puis d'établir la carte physique de la région en construisant
un
contig de PAC couvrant la région, de faire l'inventaire des gènes connus et
des
EST de la région et de caractériser les EST (par RACE-PCR et criblage de
10 banque d'ADNc de rein foetal).
I. Cartographie physique de la région candidate et localisation
du gène NPHS2:
Une analyse de liaison à l'aide de marqueurs nnicrosatellite (Dib et
15 al., 1996) ainsi que de nouvelles familles de patients, a permis de
localiser le
locus NPHS2 entre les marqueurs D1S480 et D1S2883. Un contig de YAC (20
clones) couvrant la région entre ces deux marqueurs a été construit. Un contig
de chromosomes artificiels P1 (PAC) a également été construit pour couvrir
cette
région estimée à environ 3 Mb. D'autres marqueurs microsatellites ont alors pu
20 être caractérisés dans ce contig. Deux familles présentant des
événements de
recombinaison ont permis de localiser précisément le locus de la maladie entre
D1S1640 et 183F1OCA, nouveau marqueur microsatellite identifié par
séquençage de sous-clones de la région. Le contig de 35 PAC entre ces deux
marqueurs couvre environ 2 à 2,5 Mb, mais contient 5 trous partiellement
remplis
par 14 cosmides.
Les auteurs de l'invention ont alors localisé sur ce contig, en
recherchant dans les banques de données les séquences potentiellement
localisées dans la région et en séquençant les extrémités des YAC, des PAC et
des cosmides ainsi que des sous-clones de différents PAC contenant
potentiellement des îlots CpG, des gènes déjà connus, des clusters d'EST
(UniGene) et des EST indépendants.
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2. Identification du gène NPHS2
En consultant la base de données du Sanger Centre, il a été trouvé
que le -PAC 545A16 contenait le marqueur D1S215 localisé près de la borne ,
télomérique de la région d'intérêt, ainsi que l'EST AA398634, qui provenait
d'une
banque de testicule et contenait de courtes séquences faiblement homologues
au gène de la stomatine, mais curieusement a priori dans le sens opposé à
l'EST. Les auteurs de l'invention ont alors localisé cet EST sur le cosmide
28e17
et sur le PAC 302d13 et montré par RT-PCR qu'il était exprimé dans le rein.
De multiples essais de RACE-PCR ont ensuite été nécessaires pour
lo obtenir un ADNc à partir de cet EST. En effet, les produits obtenus
correspondaient, dans la plupart des expériences, à des ADN génomiques qui
paraissaient non épissés. Toutefois, l'un des produits obtenu correspondait à
un
transcrit contenant une courte phase ouverte de lecture et homologue à six EST
(cluster Unigene Hs. 192657), provenant tous d'une banque de rein humain, mais
qui n'avaient pas été localisés sur le génome. Il s'avère en fait que les EST
du
cluster Unigene Hs. 254975 auquel appartient l'EST AA398634 semblent
appartenir à un autre gène ou pseudogène dont le sens de la transcription est
opposé à NPHS2 et qui chevauche partiellement la séquence 3' de NPHS2, ce
qui explique les données fournies par les banques de données concernant l'EST
AA398634. En utilisant ce produit de RACE-PCR décrit ci-dessus comme sonde
pour hybrider un Northem blot contenant des ARN de différents tissus, il a été
montré que ce- transcrit d'environ 2 kb était exprimé seulement dans le rein.
Ces
résultats ont été confirmés en hybridant un dot blot contenant des ARN de 50
tissus différents (Clontech). Un fort signal a été obtenu seulement avec le
rein
adulte et le rein foetal. La localisation de ce gène sur le contig et son
expression
quasi-exclusive dans le rein faisaient de ce gène un excellent gène candidat,
hypothèse renforcée par la quasi-absence de produit d'amplification par RT-
PCR,
en utilisant des amorces situées à la fois dans la partie 5' et dans la partie
3' de
l'ADNc, avec l'ARN extrait du rein terminal d'un patient. L'ADNc complet du
gène
NPHS2 a été cloné par criblage d'une banque d'ADNc de rein foetal humain avec
la sonde utilisée pour hybrider le Northern Blot (séquence ID n 11).
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22
Les jonctions introns-exons et les séquences génomiques en amont
de l'exon 1 ont été obtenues par séquençage direct du PAC 302d13 et du
cosmide 28e17.
EXEMPLE 2 : Identification de Mutations chez des familles de
patients
Les auteurs de l'invention ayant caractérisé la structure intron-exon
du gène, ils ont ensuite recherché par SSCP ("Single Strand Conformation
Polymorphism") des mutations chez 16 patients non apparentés présentant un
syndrome néphrotique cortico-résistant familial tel que décrit précédemment
(début précoce, évolution rapide vers l'insuffisance rénale terminale, pas de
récidive après transplantation et lésions de sclérose glomérulaire segmentaire
et
focale sur les biopsies rénales) et appartenant à des familles dans lesquelles
l'étude des haplotypes était compatible avec une liaison au locus NPHS2.
Pour cette analyse SSCP, les exons ont été amplifiées par PCR en
utilisant des amorces introniques flanquantes. Les conditions de PCR et les
amorces ont été choisies en utilisant le programme Oligo 5.0 (NBI) et étaient
les
suivantes :
exon 1, .5'-GCA GCG ACT CCA CAG GGA CT-3' (SEQ ID n 12) et 5'-TCA GTG
GGT CTC GTG GGG AT-3' (SEQ ID n 13) ;
exon 2, 5'-AGG CAG TGA ATA CAG TGA AG-3' (SEQ !D n 14) et 5'-GGC CTC
AGG MA TTA CCT A-3' (SEQ ID n 15) ;
exon 3, 5'-TTC TGG GAG TGA TTT GAA AG-3' (SEQ ID n 16) et 5'-TGA AGA
AAT TGG CM GTC AG-3' (SEQ ID n 17) ;
exon 4, 5'- MG GTG MA CCC MA CAG C -3' (SEQ ID n 18) et 5'-CGG TAG
GTA GAC CAT GGA M-3' (SEQ ID n 19) ;
exon 5, 5'-CAT AGG W GGA GCC CM GA-3' (SEQ ID n 20) et 5'-TTT CAG
CAT AU GGC CAT TA-3' (SEQ ID n 21) ;
exon 6, 5'-CTC CCA CTG ACA TCT GA-3' (SEQ ID n 22) et 5'-MT TTA W
TGA AAC CAG AA-3' (SEQ ID n 23) ;
* (marque de commerce)
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exon 7, 5'-CTA AAT CAT GGC TGC ACA CC-3' (SEQ ID n 24) et 5'-CTT CCT
AAA GGG CAG TCT GG-3' (SEQ ID n 25) ;
exon 8, 5'-GGT GAA GCC TTC AGG GAA TG-3' (SEQ ID n 26) et 5'-TTC TAT
GGC AGG CCC CTT TA-3' (SEQ ID n 27);
à des températures d'hybridation de 50 C (exon 6), 55 C (exons 2, 3, 4 et 5),
60 C (exons 1, 7 et 8). En raison de la forte teneur en GC de l'exon 1, la PCR
a
été effectuée en utilisant la Taq polymérase de Qiagen et la solution -Q selon
les
instructions du fabricant. De plus, à cause de sa taille, le produit de PCR de
l'exon 1 a dû être digéré par l'enzyme Smal en deux fragments avant
l'électrophorèse sur gel. La migration a été menée pendant deux heures à 600
V,
25 mA et 15 W avec le Genephor Electrophoresis Unie en utilisant le kit
GeneGel
Excel*12.5/24 (Pharmacia). La coloration a été réalisée avec un colOrateur
"GeneStain Automated Gel Stainer" en utilisant le kit PlusOne SiiveP Staining
(Pharmacia).
Résultats
Dix mutations différentes ont été observées. Certaines aboutissent
à un décalage du cadre de lecture ou à l'apparition d'un codon stop prématuré
et
sont donc des mutations inactivatrices, ce qui prouve que le gène identifié
est
bien le gène NPHS2. D'autres sont des mutations faux-sens survenant dans des
régions très conservées de la protéine, ségregeant dans les familles avec la
maladie, et non retrouvées dans 80 chromosomes témoins, ce qui suggère
fortement que ces mutations sont bien responsables du phénotype chez les
enfants atteints.
Une des mutations faux-sens (R138Q) a été retrouvée chez six
individus non apparentés mais provenant de. la même partie de l'Europe,
suggérant la possibilité d'un effet fondateur pour cette mutation.
* (marque de commerce)
. .õ
n vm=-=
. .
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EXEMPLE 3 - Etude de l'expression du gène NPHS2 dans le
rein par hybridation in situ
Méthode
Des sections de rein de 6 lm recouvertes de paraffine ont été
débarrassées de leur paraffine et réhydratées puis traitées aux micro-ondes
dans
du tampon de citrate de sodium (0,01 M, pH 6) pour augmenter le signal
d'hybridation. Les ribosondes de NPHS2 ont été synthétisées à partir du
produit
de PCR de 1065 paires de bases (position 728 à 1792 de l'ADNc de NPHS2,
SEQ ID n 1) sous-cloné dans le vecteur PGEM-Teasy*. La sonde antisens a été
synthétisée après digestion avec Sali en utilisant la polymérase T7 et la
sonde
sens après digestion avec Sacll en utilisant la polymérase Sp6. Les ribosondes
ont été marquées avec soit de la digoxigénine-11-UTP (Boehringer Mannheim)
selon les instructions du fabricant ou avec la [35SJUTP comme décrit dans
Sibony
et al, 1995. Des expériences d'hybridation in situ ont été réalisées comme
décrit
dans Kalatzis et aL (1998) et Heidet et al. (1997) pour des sondes de
digoxigénine-11-UTP et [35S]UTP, respectivement.
Résultats
Ces expériences d'hybridation in situ ont permis de montrer que le
gène NPHS2 était exprimé uniquement au niveau des podocytes dans le rein
mature. Dans les reins foetaux, aucun signal n'a été observé aux stades
précoces
du développement du néphron. En revanche, des signaux intenses ont été
détectés dans le segment inférieur du corps en S, dans la région correspondant
aux futurs podocytes. Cette expression persiste dans les glomérules immatures
et dans les glomérules matures du cortex profond. Ces résultats qui montrent
l'expression exclusive du gène NPHS2 dans les podocytes, à la fois précocement
au cours du développement et dans les glomérules matures, sont tout à fait en
accord avec la pathologie observée et justifient la dénomination de "podocine"
pour la protéine codée par le gène NPHS2.
* (marque de commerce)
4,..Yebér=
= ____________________ el>
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