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WO 01/88019 PCT/FRO1/01496
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MATERIAU A BASE DE POLYMERES BIODEGRADABLES ET SON PROCEDE DE
PREPARATION.
La présente invention concerne de nouveaux matériaux à base de
polymères biodégradables et de polysaccharides, des vecteurs dérivant
de ces matériaux de préférence sous forme de particules, et leurs
utilisations à titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible
à totalement maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un
système approprié appelé vecteur.
1o Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales
sont â assurer
- Transporter la ou les matières actives dans les liquides
biologiques de l'organisme,
- Acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et
- Assurer la libération de ces matières actives.
Bien entendu, le principe général de la vectorisation est
également de rendre la distribution de la matière active aussi
indépendante que possible des propriétés de la substance active elle-
méme et de la soumettre à celle de vecteurs appropriés choisis en
2o fonction de l'objectif envisagé.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille,
ses caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés dé
surface qui déterminent les interactions avec les composants du milieu
vivant.
Parmi les différents vecteurs déjà existants, on peut distinguer
plusieurs catégories.
Les vecteurs de première génération sont des systèmes conçus
pour libérer un principe actif au sein de la cible visée. II est nécessaire
dans ce cas de faire appel à un mode d'administration particulier. Ces
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vecteurs de taille relativement élevée (supérieure à quelques dizaines de
microns) sont soit des systèmes pleins (microsphères), soit des systèmes
creux (microcapsules), contenant une substance active, par exemple
anticancéreuse, à l'état dissous ou dispersé dans le matériau constitutif
de ces systèmes. Les matériaux utilisables sont de nature variable (cire,
éthylcellulose, acide polylactique, copolymères des acides lactiques et '
glycolique) biodégradables ou non.
Les vecteurs de deuxième génération sont des vecteurs capables,
sans mode d'administration particulier, de véhiculer un principe actif
Zo jusqu'à la cible visée. Plus précisément, il s'agit de vecteurs dont la
taille
'est inférieure au micromètre et dont la distribution dans l'organisme est
totalement fonction de leurs uniques propriétés physico-chimiques.
A cette seconde catégorie, appartiennent notamment les vecteurs
vésiculaires de type liposomes qui sont des vecteurs constitués par une
OU plusieurs cavités internes contenant une phase aqueuse, les
nanocapsules qui sont des vecteurs vésiculaires formés d'une cavité
huileuse erïtourée d'une paroi de nature polymérique, ainsi que les
émulsions lipidiques. On distingue aussi les nanosphères qui sont
constituées d'une matrice en polymère pouvant encapsuler des principes
2 o actifs. Couramment, on regroupe sous le terme « nanoparticules » les
nanosphères ainsi que les nanocapsules. Les matières actives sont
généralement incorporëes au niveau des nanoparticules soit au cours du
processus de polymérisation des monomëres dont dérivent les
nanoparticules, soit par adsorption à la surFace des nanoparticules déjà
2 s formées, soit pendant la fabrication des particules à partir des polymères
préformés.
La présente invention concerne tout particulièrement le domaine
des vecteurs du type nano- et micro-particules et leurs applications.
3 o Différents types de nano- et micro-particules sont déjà proposés
dans la littérature. Conventionnellement, ils dérivent d'un matériau obtenu
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par polymérisation directe de monomères (par exemple cyanoacrylates),
par réticulation, ou encore ils sont élaborés à partir de polymères
préfiormés : polyacide lactique) (PLA), polyacide glycolique) (PGA),
poly(s-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères, comme par exemple le
polyacide lactique-co-acide glycolique) (PLGA), etc...
Plus récemment, un nouveau type de particules a été obtenu à
partir d'un matériau dérivant de la polymérisation catalytique de
monomères (comme par exemple lactide ou caprolactone), sur le
squelette d'un polysaccharide.
1o Ce type de matériau présente toutefois l'inconvénient principal de
ne pouvoir garantir une composition reproductible. En effet, toutes les
fionctions hydroxyles présentes sur le squelette du polysaccharide
considéré sont susceptibles d'amorcer la polymérisation des monomères.
il se forme ainsi sur le squelette un très grand nombre de chaînes de taille
variable dérivant du monomère, qui « masquent » ce squelette. Ceci est
un inconvénient majeur dans l'élaboration de vecteurs adaptés pour
certaines applications (bioadhésion, « fiurtivité », ciblage,...) ou l'on
recherche précisément à contrôler la nature du recouvrement des
particules. En conséquence, par ce type de polymérisation, il est
2 o impossible d'obtenir une bonne reproductibilité de la synthèse, des
échantillons homogènes, et de contrôler les degrés de polymérisation et
de substitution, d'autant plus que la polymérisation se fait généralement
en masse (en absence de solvant). En effet, lors de la synthèse du
matériau, le polysaccharide est souvent utilisé sous la forme de particules
dispersées dans le monomère fiondu et la polymérisation est
généralement conduite en présence d'un catalyseur. En absence de
catalyseur, les degrés de polymérisation sont très faibles.
Ont également été décrites dans le brevet US 6 007 845 des
particules dérivant d'un matériau obtenu par couplage covalent sur un
3o matériau multifonctionnel de type acide citrique ou tartarique, d'une ou
plusieurs molécules d'un polymère hydrophile comme le polyéthylène
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glycol et d'une ou plusieurs molécules d'un polymère hydrophobe comme
l'acide polylactique. Toutefois, la synthèse de ce matériau a pour
inconvénient majeur de nécessiter l'utilisation d'un composé annexe
jouant le rôle d'intercalaire entre les molécules des deux types de
polymëres.
La présente invention a pour premier objet un nouveau matériau
composite à structure contrôlée dérivant du couplage de chaînes de
polymère biodégradable directement sur le squelette de polysaccharides.
Son second objet concerne un vecteur à base de ce matériau, de
2 o préférence sous forme de particules, et plus préférentiellement sous la
'forme de nanoparticules.
L'invention vise également dans un troisième objet, l'utilisation de
ce vecteur, de préférence de particules, notamment à titre de véhicules
biologiques.
Plus précisément, le premier aspect de l'invention concerne un
matériau à structure chimique contrôlée composé d'au moins un polymère
biodégradable et d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou
réticulé, caractérisé en ce qu'il dérive de la fonctionnalisation contrôlée
d'au moins une molécule dudit polymère biodégradable ou d'un de ses
2 o dérivés par greffage covalent directement au niveau de sa structure
polymérique, d'au moins une molécule dudit polysaccharide.
Par opposition aux matériaux précédemment évoqués, le
matériau mis au point selon la présente invention a pour.premier avantage
d'avoir une structure chimique contrôlée et donc d'étre à ce titre
parfaitement reproductible. Sa composition chimique est clairement
identifiée.
Ainsi, le matériau revendiqué est de préférence constitué d'au
moins 90% en poids et plus préférentiellement en totalité d'un copolymère
dérivant de la fonctionna(isation contrôlée d'au moins une molécule d'un
3 o polymère biodégradable ou d'un de ses dérivés par greffage covalent
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directement au niveau de sa structure polymérique d'au moins une
molécule d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou rétïçulé.
Selon un mode préféré de l'invention, le matériau revendiqué ne
contient pas de molécule de départ, c'est-à-dire dudit polymère
5 biodégradable ou dudit polysaccharide.
En l'espèce, le matériau revendiqué est donc différent d'un
mélange de nature polymérique dans lequel serait présent le copolymère
attendu mais où demeureraient également, en des quantités très
variables, les polyméres de départ. Un te! mélange de nature polymérïque
2o ne peut étre utilisé tel quel pour préparer des nano- ou micro- particules.
En l'occurrence, le matériau revendiqué possède une
polydispersité inférieure ou égale à 2 et de préférence inférieure à 1,5.
Plus précisément, le matériau revendiqué est obtenu par couplage
directement au niveau de la molécule du polysaccharide, d'une ou
plusieurs molécules de polymère biodégradable, identiques ou différentes.
Cette liaison covalente entre les deux types de molécule peut être
de natures diverses.
Elle peut ainsi dériver de la rëaction entre un groupement acide
carboxylique avec soit une fonction amine pour former une liaison amide,
2o soit une fonction hydroxyle pour former une liaison ester.
Elle peut aussi rësulter de la réaction entre un groupement
isocyanate avec un groupement alcool pour former une liaison de type
uréthane.
Elle peut également dériver de la réaction d'une fonction thiol
avec un groupement carboxylique pour conduire à une liaison de type
thioester.
L'ensemble de ces réactions est bien connu de l'homme de l'art
et leurs réalisations relèvent de ses compétences.
Selon une variante préférée de l'invention, la liaison covalente
3 o établie entre les deux molécules est de type ester ou amide.
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Plus préférentiellement, elfe dérive de la réaction entre une
fonction carboxylique, le cas échéant activée, présente sur le polymère
biodégradable et une fonction hydroxyle ou amine présente sur le
polysaccharide. Les fonctions activées préférées de l'acide sont l'ester de
N-hydroxysuccinimide, le chlorure d'acide et l'imidazolide dérivé du
carbonyl dümidazole. Cette fonction réactive, de préférence carboxylique,
peut être soit naturellement présente sur le squelette du polymère
biodégradable ou y avoir été introduite au préalable au niveau de son
squelette, de manière à permettre son couplage ultérieur avec une
o molécule de polysaccharide.
Cette activation d'une fonction présente sur l'une des molécules,
de préfërence une fonction carboxylique sur le polymère biodégradable,
est notamment avantageuse lorsque l'on veut empécher la manifestation
d'une réaction secondaire parasite, comme par exemple une réaction
25 intramoléculaire. Ainsi, dans le cas particulier où le polysaccharide
possède au niveau de sa molécule deux fonctions susceptibles de réagir
l'une avec l'autre, par exemple une fonction hydroxyle et une fonction
carboxylique, on active préalablement la fonction carboxylique présente
sur le polymère biodégradable de manière à privilégier la cinétique de sa
2 o réaction de couplage avec la fonction hydroxyle du polysaccharide au
détriment de celle d'une réaction intramoléculaire au niveau de la
molécule du polysaccharide.
La reproductibilité et l'homogénéité du matériau correspondant
sont ainsi assurées.
25 Le matériau selon l'invention a également pour avantage de
posséder une biodégradabilité satisfaisante en raison de la nature des
polymères qui le constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation
« biodégradable » tout polymère qui se dissous ou se dégrâde en une
3 o période acceptable pour l'application à laquelle il est destiné,
habituellement en thérapie in vivo. Généralement, cette période doit être
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inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on
expose une solution physiologique correspondante avec un pH de 6 à 8 et
à une température comprise entre 25°C et 37°C.
Les chaînes de polymères biodégradables selon l'invention sont
ou dérivent de polymères biodégradables synthétiques ou naturels.
Classiquement, les polymères biodégradables synthétiques les
plus employés sont les polyesters : PLA, PGA, PCL, et leurs copolymères,
comme par exemple PLGA. En effet, leur biodégradabilité et
biocompatibilité ont été largement éfiablies. D'autres polymères
Zo synthétiques font également l'objet d'investigations. II s'agit des
polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters,
polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines,
polyméthylidènemalonate, polysiloxane, polyesters comme le
polyhydroxybutyrate ou le polyacide malique), ainsi que leurs
s5 copolymères et dérivés. Des polymères biodégradables naturels
(protéines comme l'albumine ou la gélatine, ou des polysaccharides
comme l'alginate, le dextrane ou le chitosane) peuvent également
convenir.
En l'espèce, les polymères synthétiques sont tout particulièrement
2o intéressants car leur bioérosion est observëe rapidement. Toutefois, ces
polymères ne sont pas toujours adaptés à être couplés avec un ou
plusieurs polysaccharides car ils ne possèdent quasiment pas de
'groupements réactifs, surtout dans le câs des polyesters biodégradables
(PLA, PCL, ...), etlou parce que ces groupements réactifs n'existent qu'en
25 extrémité de chaîne. En conséquence, le couplage de ces polymères
avec un polysaccharide implique une fonctionnalisation préalable de leurs
chaînes avec des groupements réactifs tout en contrôlant la nature des
groupements naturellement présents en extrémité de chaîne. Ce sont
notamment les composés ainsi obtenus que l'on entend désigner dans le
3 o cadre de la présente invention par le terme de dérivés de polymères
biodégradables.
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C'est ainsi que le polymère biodégradable répond de préférence à
la formule générale I
(R~) polymère biodégradable (R2)m
n
dans laquelle
- n et m représentent indépendamment l'un de l'autre, soit 0,
soit 1,
- R~ reprësente un groupement alkyle en C~-CZO, un polymère
l o différent du polymère biodégradable [par exemple polyéthylène glycol)
(PEG), ou un copolymère contenant des blocs de PEG ou des unités
d'oxyde d'ëthylène, comme par exemple un polymère Pluronic~], une
fonction réactive protégée prësente sur le polymère (ex. BOC-NH-), une
fonction carboxylique activée ou non, ou une fonction hydroxyle, et
- R~ représente une fonction hydroxyle ou une fonction
carboxylique activée ou non.
Sont notamment préférés comme polymères biodégradables
selon l'invention, les polyesters : polyacide lactique) (PLA), polyacide
glycolique) (PGA), poly(s-caprolactone) (PCL), et leurs copolymères,
2 o comme par exemple le polyacide lactique-co-acide glycolique) (PLGA),
les polymères synthétiques tels les polyanhydrides,
poly(alkylcyanoacrylates), poiyorkhoesters, polyphosphazénes,
polyamides (ex. polycaprolactame), polyaminoacides, polyamidoamines,
polyméthylidène malonate, poly(alkylène d-tartrate), polycarbonates,
polysiloxane, polyesters comme le polyhydroxybutyrate ou
polyhydroxyvalérate, ou le polyacide malique), ainsi que les copolymères
de ces matériaux et leurs dérivés.
II s'agit plus préférentiellement d'un polyester de poids
moléculaire inférieur à 50 000 g/mole et notamment d' un
3 o polycaprolactone.
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Outre un aspect avantageux en terme de biodégradabilité, le
matériau selon l'invention est particulièrement intéressant en terme de
propriétés de bioadhésion et de ciblage pour les particules qui en dérivent
au niveau d'organes etlou de cellules. C'est en particulier à travers le
choix du polysaccharide associé, et notamment sa composition et son
organisation structurelle au niveau des particules, que ce second aspect
est plus précisément atteint.
Le ou les polysaccharides mis en oeuvre selon l'invention sont des
polysaccharides de structure linéaire, ramifiiée ou réticulée, modifiée ou
2 o non.
Sous cette définition, on entend exclure du domaine de
l'invention, les polysaccharides possédant une structure cyclique à
l'image des cyclodextrines.
On entend par polysaccharide modifié tout polysaccharide ayant
subi un changement au niveau de son squelette, comme par exemple
l'introduction de fonctions réactives, le greffage d'entités chimiques
(molécules, chaînons aliphatiques, chaînes de PEG, etc...). Bien sur,
cette modification doit concerner peu des groupements hydroxyle ou
amine présents sur le squelette, de manière à laisser la grande majorité
2o d'entre eux libres pour permettre ensuite le couplage des polymères
biodégradables. Ainsi, il existe dans le commerce des polysaccharides
modifiiés par greffage de la biotine, de composés fluorescents, etc...
D'autres polysaccharides greffés avec des chaînes hydrophiles (ex. PEG)
ont été décrites dans la littërature.
Sous le terme réticulé, il est fait référence à des polymères
formant un réseau tridimensionnel par opposition à des polymères
linéaires simplifiés. Dans le réseau tridimensionnel, les chaînes sont
connectées entre elles par des liaisons covalentes ou ioniques et les
matériaux deviennent ainsi insolubles.
3o Les polysaccharides convenant tout particulièrement à l'invention
sont ou dérivent de la D-glucose (cellulose, amidon, dextrane),
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D-galactose, D-mannose, D-fructose (galactosane, manane, fructosane).
La majorité de ces polysaccharides contiennent les éléments carbone,
oxygène et hydrogène. Les polysaccharides conformes à l'invention
peuvent contenir aussi du soufre etlou de l'azote. Ainsi, l'acide
5 hyaluronique (composé d'unités N-acëtyle glucosamine et acide
glucuronique), le chitosane, la chitine, l'hëparine ou l'ovomucoïde
contiennent de l'azote, tandis que la gélose, polysaccharide extrait
d'algues marines, contient du soufre sous la forme de sulfate acide (>CH
O-S03H). L'acide chondroitin-sulfurique contient simultanément du soufre
1 o et de l' azote.
L'ensemble de ces polysaccharides peut être fonctionnalisé avec
des polymères biodégradables selon l'invention, dans la mesure où ils
possèdent naturellement des fonctions amine et/ou alcool libres.
Selon une variante préférée de l'invention, le polysaccharide
possède un poids moléculaire supérieur ou égal à 6000 g/mole.
Dans le cas particulier du dextrane et de l'amitose (C6H,oO5)n, n
varie entre 10 et 620 et de préfërence entre 33 et 220. Dans le cas de
l'acide hyaluronique, la masse molaire varie entre 5 103 et 5 106 g/mole,
de préférence entre 5 104 et 2 106 g/mole. Dans le cas du chitosane, la
2 o masse molaire varie entre 6 103 et 6 105 g/mole, de préférence entre 6
103 et 15 104 g/mole glmole.
A titre illustratif des polysaccharides convenant plus
particulièrement à l' invention, on peut citer les polydextroses comme le
dextrane, le chitosane, le pullulane, l'amidon, l'amitose, l'acide
hyaluronique, l'héparine, l'amilopectine, la cellulose, la pectine,
l'alginate,
le curdlan, le fucane, le succinoglycane, la chitine, le xylane, la xanthane,
l'arabinane, la carragheenane, l'acide polyguluronique, l'acide
polymannuronique, et leurs dérivés (comme par exemple le sulfate de
dextrane, les esters de familose, l'acétate de cellulose, etc).
3o Sont plus particulièrement préférés le dextrane, l'amitose, le
chitosane et l'acide hyaluronique, et leurs dérivés.
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Le matériau selon l'invention, sous forme de copolymëre, peut
inclure le polymère biodégradable et le polysaccharide dans un rapport
massique variant de 1 :20 à 20 :1 et de préférence de 2 :9 à 2 :1.
A titre illustratif des matériaux revendiqués, on peut plus
particulièrement citer ceux composés d'un copolymère dextrane
potycaprolactone, amitose-polycaprolactone, acide hyaluronique
polycaprolactone ou chitosane-polycaprolactone.
Les copolymères constituant le matériau revendiqué peuvent se
présenter sous la forme de copolymères di-blocs, posséder une structure
Zo peigne ou encore une structure réticulée.
La nature préférée du squelette est un polysaccharide, et la
nature préférée des greffons est un polymère biodégradable.
Des copolymères di-blocs ou peigne peuvent étre obtenus en
jouant sur le rapport molaire polysaccharide : polymère biodégradable
lors de la synthèse. Les copolymères à structure réticulée peuvent être
obtenus à partir de polymères biodégradables comportant au moins deux
fonctions réactives:
Le second aspect de la présente invention concerne un procédé
2 o de préparation du matériau revendiqué.
Plus précisément, ce procédé comprend la mise en prësence d'au
moins une molécule d'un polymère biodëgradable ou un de ses dérivës
portant au moins une fonction réactive F1 avec au moins une molécule
d'un polysaccharide à squelette linéaire, ramifié ou réticulé et portant au
moins une fonction réactive F2 capable de réagir avec la fonction F1,
dans des conditions propices à la réaction entre les fonctions F1 et F2
pour établir une liaison covalente entre lesdites molécules et en ce que
l'on récupère ledit matériau.
Dans le cas où le polymère biodégradable est le
3 o polycaprolactone, le procédé de préparation revendiqué ne requiert pas
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ia
l'utilisation d'un catalyseur comme les procédés conventionnels. Cette
spécificité du procédé revendiqué est donc particulièrement avantageuse
en terme d'innocuité et biodégradabilité au niveau du matériau résultant.
Avantageusement, il s'agit d'une réaction quantitative, c'est-à-dire
au moins une fonction F1 présente sur les molécules de polysaccharides
réagit avec une fonction F2 présente sur une molécule de polymère
biodégradable.
A ces fins, la réaction est réalisée dans des conditions telles
qu'est prévenue la manifestation d'une quelconque réaction parasitaire,
Zo notamment l'implication de l'une des fonctions F1 ou F2 dans une autre
réaction que la réaction de couplage attendue. On entend ainsi éviter les
réactions intramoléculaires évoquées précédemment.
Selon une variante préférée de l'invention, fa fonction réactive
présente sur le polymère biodégradable est une fonction acide ou une
~5 fonction acide activée et la fonction réactive sur le polysaccharide est
une
fonction hydroxyle ôu amine. De préférence, le polysaccharide et le
polymère biodégradable ou dérivé sont mis en présence dans un rapport
massique variant de 1 :20 à 20 :1.
Dans le cas particulier ou la fonction réactive présente sur le
2 o polymère biodégradable est une fonction acide, la réaction de couplage
peut être réalisée par activation par exemple avec la
dicyclohexylcarbodümide (DCC) ou le carbonyldümidazole (DCI). Cette
réaction d'estérification relève des compétences de l'homme de l'art.
Plus préférentiellement, les polysaccharides et polymères
25 biodégradables répondent aux définitions proposées précédemment. En
particulier, ils peuvent dériver de molécules de polysaccharides ou
polymères biodégradables, naturelles et qui ont été modifiées de manière
à étre fonctionnalisées conformément à la présente invention.
3o Un troisième aspect de l'invention concerne des vecteurs
constitués d'un matériau conforme à l'invention.
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Ces vecteurs sont de préférence des particules possédant une
taille comprise entre 50 nm et 500 ~m et de prëférence entre 80 nm et
100 gym.
En fait, selon le protocole de préparation retenu pour préparer les
particules à partir du matériau revendiqué, on peut fixer la taille de celles
ci.
Selon un mode préféré de l'invention, les particules ont une taille
comprise entre 1 et 1000 nm et sont alors dénommées nanoparticules.
Les particules de taille variant de 1 à plusieurs milliers de microns font
1o référence à des microparticules.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent étre
préparées selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, comme
par exemple la technique d'émulsion/évaporation du solvant [R. Gurny et
al. « Development of biodegradable and injectable lafices for controlled
release of potent drugs » Drug Dev. Ind. Pharm., vol 7, p. 1-25 1981 )] ; la
technique de nanoprécipitation à l'aide d'un solvant miscible à l'eau (FR 2
608 988 et EP 274 691 ). II existe également des variantes de ces
procédés. Par exemple, la technique dite de « double-émulsion »,
intéressante pour l'encapsulation de principes actifs hydrophiles, consiste
2o à dissoudre ceux-ci dans une phase aqueuse, à former une émulsion de
type eaulhuile avec une phase organique contenant le polymère, puis à
former une émulsion de type eaulhuileleau à l'aide d'une nouvelle phase
aqueuse contenanfi un agent tensioactif. Après évaporation du solvant
organique, on récupère des nano-ou des micro-sphères.
2s Dans le cadre de la présente invention, il a également été mis au
point par les inventeurs une nouvelle méthode particulièrement
avantageuse qui comprend
- l' introduction d' un matériau conforme à f' invention, en mélange
le cas échéant avec un autre composé et/ou une matiére
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active, dans un liquide, de préférence l'eau, à une
concentration inférieure ou égale à 50 mglml,
- le chauffage de l'ensemble sous agitation jusqu'à une
tempërature propice à ia fonte ou au ramollissement dudit
matériau de manière à obtenir sa mise en dispersion sous
forme de gouttelettes,
- le refroidissement de l'ensemble de manière à figer la
strucfiure ainsi obtenue, et
- la récupération des partïcules.
20 ' II est à noter que ce procédé est plus particulièrement avantageux
lorsque les polymères et copolymères constituant le matériau revendiqué
comprennent à titre de polymère biodégradable un dérivé de
polycaprolactone, et plus préférentiellement un dérivé de
polycaprolactone de poids moléculaïre inférieur à 5000 g/mole.
Le matëriau selon la présente invention a l'avantage majeur de
posséder des propriétés tensioactives, de par sa nature amphiphile. Ces
propriétés peuvent donc étre exploitées avantageusement lors de la
préparation de particules, par exemple, de manière à éviter l'utilisation
d'agents tensioactifs, systématiquement utilisés dans les procédés
2o susmentionnés. En effet, ces derniers ne sont pas toujours
biocompatibles et sont difficiles à éliminer en fin de procédé.
Un autre avantage du matériau selon la présente invention est
d'offrir la possibilité de moduler les propriétés qui interviennent dans le
procédé de fabrication de particules à travers le choix
2s - .du rapport massique polymère biodégradable polysaccharide
et/ou
- des masses molaires des polymères biodégradables et des
polysaccharides considérés.
II est ainsi possible d'obtenir des copolymères hydrosolubles ou
3 o insolubles dans l'eau, ayant des balances hydrophile-lipophile pouvant
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varier entre 2 et 18 (permettant donc de stabiliser des émulsions eaulhuile
ou huileleau).
Par ailleurs, il est possible de tirer avantage, lors de la fabrication
de particules, des propriétés particulières de certains polysaccharides
5 composant ledit matériau. Par exemple, il est connu que les alginates, les
pectines ayant un degré d'estérification faible, et la gomme xanthane
peuvent former des gels en présence d' ions Ca2+. On peut donc envisager
de former des gels ou des particules à l'aide des matériaux
polysaccharide-polymère biodégradable dans des conditions analogues.
1o Ces particules posséderont l'avantage, par rapport à celles ëlaborées
uniquement à partir de polysaccharides, de comporter des chatnes
hydrophobes dans leur matrice, permettant un contrôle de la dégradation
et une meilleure encapsulation en principes actifs de nature hydrophobe
ou comportant des domaines hydrophobes comme certaines protéines.
15 De méme, on peut envisager la formation de particules à partir de
deux types de matériaux selon la présente invention, comme par exemple
à partir de copolymëres alginate-polymère biodégradable et chitosane-
polymère biodégradable.
A titre représentatif des particules selon f' invention, on peut plus
2o particulièrement citer celles consfiituées d'un matériau dérivant d'au
moins
une molécule de polyester üée par une liaison de type ester ou amide à
au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi le dextrane, le
chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose. De préférence, il s'agit de
particules composées d'un matériau dérivant d'un bloc de
polycaprolactone ou de polyacide lactique) lié par une liaison de type
ester ou amide à au moins une molécule de polysaccharide choisie parmi
le dextrane, le chitosane, l'acide hyaluronique et l'amitose.
En ce qui concerne les structures de particules pouvant être
obtenues à partir du matériau selon l'invention et les procédés
susmentionnés, elles peuvent être variables. On distingue ainsi
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- une structure de type coeur hydrophobe en polymère
biodégradable (pouvant encapsuler des principes actifs)-
couronne hydrophile en polysaccharide, obtenues soit à l'aide
de l'un des procédés sus-mentionnés, soit par adsorption du
matériau selon l'invention sur des particules préformées ;
- une structure des particules selon laquelle la matrice en
polymère biodégradable contient des inclusions aqueuses qui
peuvent être obtenues par un procédé de « double émulsion »
et adaptées à l'encapsulation des principes actifs hydrophiles.
1o Selon le mode opératoire choisi et la balance hydrophile-
lipophile du matériau, le polysaccharide peut se disposer soit
exclusivement au niveau des inclusions aqueuses, soit au
niveau de ces inclusions et de la surface des particules. II peut
également protéger les principes actifs encapsulés (protëines,
25 peptides, ...) vis-à-vis des interactions, souvent dénaturantes,
avec le polymère biodégradable hydrophobe et le solvant
organique ;
- une structure de type coeur hydrophile (polysaccharide)
couronne hydrophobe (polymère biodégradable), lorsque les
2o particules sont élaborées à partir d'une émulsion huile dans
huile (par exemple, huile silicone-acétone) ou eau dans huile
dans huile ;
- une structure micellaire, obtenue grâce à l'autoassociation
d'un matériau conforme à l'invention en phase aqueuse, et
25 - une structure dite gel formée par réticulation des
polysaccharides avec des polymères biodégradables
comportant au moins deux fonctions réactives.
Dans le cas de la présente invention, les particules se dégradent
de préférence en une période s'étendant entre une heure et plusieurs
3 o semaines.
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Les particules selon l'invention peuvent contenir une substance
active qui peut être de nature hydrophile, hydrophobe ou amphiphile et
biologiquement active.
Comme matières actives biologiques, on peut plus
particulièrement citer les peptides, les protéines, les carbohydrates, les
acides nucléiques, les lipides, les polysaccharides ou leurs mélanges. II
peut également s'agir de molëcules organiques ou inorganiques
synthétiques qui, administrées in vivo à un animal ou à un patient, sont
susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité
Zo thérapeutique. II peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de
récepteurs, de peptides, de vitamines, de minéraux et/ou de stéroïdes.
A titre représentatif des médicaments susceptibles d'être
incorporés dans ces particules, on peut citer les composés anti-
inflammatoires, les anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les
z5 immunotoxines, les agents immunosuppresseurs, les stéroïdes, les
antïbiotiques, (es antiviraux, les antifongiques, les antiparasitaires, les
substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les analgésiques.
De même, on peut envisager d'associer à ces matières actives
des composés destinés à intervenir au niveau de leur profil de libération.
2 o Par exemple, on peut ajouter dans la composition des particules, des
chaînes de PEG, ou de polyester (modifiés ou non), et obtenir ainsi des
particules dites composites. Comme déjà évoqué précédemment, on peut
également mélanger plusieurs types de matériaux selon la présente
invention, pour obtenir des particules mixtes, dans le but d'intervenir au
2s niveau du profil de libération des matières encapsulées et d'obtenir des
propriétés de surface des particules adaptées aux applications
envisagées.
Enfin, on peut également incorporer dans les particules, des
composés à finalité de diagnostic. II peut ainsi s'agir de substances
3 o détectables par rayons X, fluorescence, ultrasons, résonance magnétique
nucléaire ou radioactivité. Les particules peuvent ainsi inclure des
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particules magnétiques, des matériaux radio-opaques (comme par
exemple l'air ou le barium) ou des composés fluorescents. Par exemple,
les composés fluorescents comme la rhodamine ou le rouge de Nile
peuvent être englobés dans des particules à coaur hydrophobe.
Alternativement, des émetteurs gamma (par exemple Indium ou
Technetium) peuvent y être incorporés. Des composés fluorescents
hydrophiles peuvent également être encapsulés dans les particules, mais
avec un rendement moindre comparativement aux composés
hydrophobes, du fait de la moindre affinité avec la matrice.
o Des particules magnétiques commercialisées ayant des propriétés
~de surface contrôlées peuvent être également incorporées dans la matrice
des particules ou attachées de manière covalente à l'un de leurs
constituants. .
La matière active peut être incorporée dans ces particules lors de
leur processus de formation ou au contraire être chargée au niveau des
particules une fois que celles-ci sont obtenues.
Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre
jusqu'à 95% en poids d'une matière active.
La matiére active peut ainsi être présente en une quantité variant
2o de 0,001 à 990 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mglg.
II est à noter que dans le cas de l'encapsulation de certains composés
macromoléculaires (ADN, oligonucléotides, protéines, peptides, etc) des
charges encore plus faibles peuvent être suffisantes.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de
différentes façons, par exemple par voies orale, parentérale, oculaire,
pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée, buccale, etc... La voie orale, non
invasive, est une voie de choix.
De manière générale, les particules administrées par voie orale
peuvent subir différents processus : translocation (capture puis passage
3 o de l'ëpithélium digestif par les particules intactes), bioadhésion
(immobilisation des particules à la surface de la muqueuse par un
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mécanisme d'adhésion) et transit. Pour ces deux premiers phénomènes,
les propriétés de surFace jouent un rôle majeur.
Le fait que les particules selon l' invention possèdent en surface
de nombreuses fonctions hydroxyles, s'avëre particulièrement avantageux
pour y lier une molécule biologiquement active, une molécule à vocation
de ciblage ou pouvant être dëtectée. On peut ainsi envisager de
fonctionnaliser la surface de ces particules de manière à en modifier les
propriëtés de surface et/ou les cibler plus spécifiquement vers certains
tissus ou organes. Eventuellement, les particules ainsi fonctionnalisées
1o peuvent être maintenues au niveau de la cible par l'utilisation d'un champ
magnétique, pendant l'imagerie médicale ou pendant qu'un composé actif
est libéré. De même, des ligands de type molécules de ciblage comme
des récepteurs, lectines, anticorps ou fragments de ceux-ci peuvent être
fixés à la surface des particules. Ce type de fonctionnalisation relève des
compétences de l'homme de l'art.
Le couplage de ces ligands ou molécules à la surface des
particules peut être exécuté de différentes manières. II peut être réalisé de
manière covalente en attachant le ligand au polysaccharide recouvrant les
particules ou de façon non covalente c'est à dire par affinité. Ainsi,
2 o certaines lectines ont pu être attachées par affinité spécifique aux
polysaccharides situés à la surface de particules selon la présente
invention, en exaltant ainsi les propriétés de reconnaissance cellulaire de
ces particules. II peut également être avantageux de greffer le ligand par
l'intermédiaire d'un bras espaceur, pour lui permettre d'atteindre sa cible
dans une conformation optimale. Alternativement, le ligand peut être porté
par un autre polymère entrant dans la composition des particules.
L'invention concerne également l'utilisation des vecteurs et de
préférence des particules obtenues selon l'invention pour encapsuler une
3 0 ou plusieurs matières actives telles que définies précédemment.
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Un autre aspect de l'invention concerne également les
compositions pharmaceutiques ou de diagnostic comprenant des vecteurs
et de préférence des particules selon l' invention, le cas échéant associées
à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et compatible.
5 Par exemple, les particules peuvent étre administrées dans des capsules
gastro-résistantes, ou incorporées dans des gels, implants ou tablettes.
Elles peuvent aussi être préparées directement dans ûne huile (comme le
Migliol~) et cette suspension administrée dans une capsule ou injectëe au
niveau d'un site précis (par exemple tumeur).
1o Ces particules sont en particulier utiles à titre de vecteurs furtifs,
c'est-à-dire capables d'échapper au système de défense immunitaire de
l'organisme ei/ou comme vecteurs bioadhésifs.
Les exemples et figures figurant ci-après sont présentés à titre
15 illustratif et non limitatif de la présente invention.
Figures
Figure 1 : Représentation à l'aide d'un microscope optique de
2 o particules R-PCL-COOH fabriquées selon l'exemple 13 (polymère
synthétisé selon l'exemple 1 ).
Figure 2: Distribution de diamètres hydrodynamiques de
particules R-PCL-COOH.
EXEMPLE 1
R-PCL-COOH
Des polymères PCL monofoncfiionnalisés de faible masse molaire
(2 à 4000 g/mole) du type R-PCL-..CO~H (R= C9H,g) sont obtenus à partir
de 5,2 g de monomère (s-caprolactone fraichement distillé) et 0,3 g
3 o d'acide caprique (C9H~9C02H) de haute pureté. L'acide et le
E-caprolactone ont été introduits dans un ballon surmonté d'un réfrigérant
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az
ascendant. Après une purge des réactifs, le ballon a été introduit dans un
bain d'huile thermostaté à 225°C. La réaction s'est poursuivie pendant
3h30 sous atmosphère inerte (argon). Elle a été stoppée par immersion
du ballon dans un bain de glace. Le solide obtenu à été dissout à chaud
dans 15 ml THF, puis a été précipité à température ambiante avec du
méthanol froid.
Après trois reprécipitations, le rendement en poids de la réaction
est 60-70%. Les masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids
(Mw) ont été déterminées par chromatographie d'exclusion stérique (CES)
1o (éluant THF 1ml/min, calibration universelle réalisée avec des standards
'de polystyrène). Mn est égale à 3420 g/mole et Mw à 4890 g/mole ;
l'indice de polydispersité est donc égal à 1,4.
Une masse molaire moyenne en nombre égale à 3200 g/mole a
été déterminée par titration avec une solution KOH/EtOH 10-2 M des
échantillons de polymères d'environ 100 mg dissous dans un mélange
acétone-eau.
D'autres polymères avec des R différents ont été obtenus par la
méme méthode, par exemple à partir de l'acide caproïque (R=C6H,3).
EXEMPLE 2.
HOOC-PCL-COOH
Le polymère bifonctionnalisé HOOC-PCL-COOH a été synthétisé
d'après le mode opératoire de l'exemple 1.
L'acide succinique (99,9%, Aldrich) utilisé comme amorceur a été
2s séché sous vide à 110°C pendant 24h. Le monomère (a-caprolactone) a
été purifié par distillation sur hydrure de calcium.
La polymérisation à partir de 0,2 g d'acide succinique et de 4 g de
s-caprolactone a permis d'obtenir après 3h de réaction 3,2 g de polymère
(rendement en poids 76% après quatre précipitations successives).
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Le dosage des groupements COOH terminaux par KOHIEtOH
10-2 M a permis de déterminer une acidité correspondant à une masse
molaire de 3500 g/mole.
Par CES, Mn est égale à 4060 g/mole et Mw à 4810 g/mole,
s l'indice de polydispersité est de 1,2.
D'autres polymères de masse variable sont obtenus en changeant
le rapport molaire acide : monomère.
EXEMPLE 3.
o R-PLA-COOH (R=C9H,9~
Le monomère (D,L-lactide) a été purifië par deux recristallisations
dans l'acétate d'éthyle suivies de sublimation. Le catalyseur (octanoate
d'étain) a été purifié par distillation sous vide très poussé. L'acide
caprique utilisé comme amorceur a été purifié par recristallisation dans
z5 ('acétate d'éthyle, puis anhydrisé par distillation azéotropique avec du
benzène.
L'acide caprique (0,12 g) et le D,L-lactide (3,5 g) ont été introduits
dans un bicot muni d'un refrigérant ascendant connecté à une rampe à
videlargon. Le ballon de réaction a été inerté, puis 7 ml de toluène
2 o anhydre ont été rajoutés à travers le septum. Après dissolution, 0,284 g
de catalyseur ont été introduits et la réaction a été immédiatement
démarrée par immersion du ballon dans un bain d'huile à 120°C. Après 4
heures, la réaction a été stoppée, le toluène a été évaporé, et le polymère
appelé R-PLA-COOH a été dissout dans du dichlorométhane et précipité
25 avec de l'éthanol. Après quatre précipitations successives, il a été obtenu
une acidité constante dans le polymère, qui a été ensuite séché.
La masse molaire Mw déterminée par CES est 22 Kg/mole. Le
dosage des groupements terminaux par KOH/EtOH 102 M a permis de
déterminer une acidité correspondant à une masse molaire de 21
3 o Kg/mole.
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En variant le rapport molaire monomère/amorceur et le temps de
réaction, il a été possible d'obtenir des polymères ayant des masses
molaires comprises entre 10 et 50 Kg/mole.
EXEMPLE 4.
R-PCL-OH et R-PLA-OH (R= alk
Des polymères PCL ou PLA monofonctionnalisés en bout de
chaine par un groupement alcool (R-PCL-OH ou R-PLA-OH) ont été
synthétisés selon le protocole de l'exemple 3, mais en substituant à
1o l'amorceur acide, un amorceur alcool, par exemple C7H,50H.
5g de caprolactone et 0,29 g d'alcool heptilique ont été chauffés
dans du toluène au reflux pendant 2h sous atmosphère inerte et en
présence d'octanoate d'étain en quantité équimolaire avec l'amorceur.
Après deux précipitations, le rendement massique de la réaction est 54%.
La masse molaire Mw est de 2100 g/mole.
Le test avec KOH/EtOH n'a pas permis de détecter des traces
d'acidité libre.
EXEMPLE 5.
2 o R-PEG-PLA-COOH (R=OMe)
L'amorceur acide, le polyéthylène glycol) comportant à un bout
de chaine un groupement méthoxy et à l'autre un groupement acide
carboxylique (Me0-PEG-COOH) (Shearwater Polymers, 5000g/mole) a
été séché préalablement à la réaction. Le lactide a été purifié par deux
recristallisations (acétate d'éthyle) et par sublimation. Le rapport massique
des réactifs Me0-PEG-COOH :lactide a été 1 :9 et le rapport molaire
Me0-PEG-COOH :catalyseur a été 1 :1. La polymérisation s'est
poursuivie pendant 2h sous atmosphère inerte au reflux du toluène
(solvant). Après évaporation du toluëne, le copolymère est purifié par
3 o deux précipitations successives. La masse Mv~i déterminée par CES est
de 42Kg/mole.
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EXEMPLE 6.
R-PCL-ester de NHSI~R=alkylel
La fonction acide des polymères R-PCL-COOH (exemple1 ) est
transformée dans l'ester activé en la faisant réagir avec la N-hydroxy
succinimide (NHSI), en présence de dicyclohéxyl carbodümide (DCC),
dans un mélange DMF :CH2C12 1 :2 (v :v). La DCC a étë rajouté en léger
excès molaire {1,1) par rapport aux chaînes de R-PCL-COOH et la NHSI
en excès par rapport aux fonctions -COOH. Les réactifs ont été solubilisés
dans un volume minimal de solvant, avec un lëger chauffage. La réaction
1 o a lieu à 50°C pendant 24h sous atmosphère inerte. Après filtration
de
I'urëe formée (DCU), les solvants sont évaporés et le DMF est entraîné
avec de l'éther. Le polymère est lavé à l'eau et séché. D'après la masse
de DCU pesée à chaque synthèse de ce type, le rendement de la réaction
est quantitatif. L'ester ainsi obtenu est soluble dans THF, acétone,
s5 solvants chlorés, etc...
EXEMPLE 7
PCL-DEX
Le polymère R-PCL-ester NHSI (R=C9H,9) possédant la fonction
2 o ester activée (exemple 6) est dissout dans du DMSO, puis une quantité
égale de dextran (Pharmacie, masse molaire 40 000 g/mole) est
introduite. La réaction de couplage a lieu pendant 144 heures à 70°C
sous argon. La réaction de transestérification a lieu avec libération de
NHSI. Après évaporation des solvants, le produit final est lavé à l'eau
25 pour enlever le NHSI et des copolymëres hydrosolubles, puis avec du
dichlorométhane pour extraire des traces de polyester non réagi.
On obtient avec un rendement de 40% un copolymère Dex-PCL,
de type peigne, comportant un squelette de dextrane (Dex) (masse
molaire 40000 g/mole) et des chaînons latéraux de PCL liés par des ponts
3 o ester. Le copolymère est purifié en fin de réaction. Sa composition
globale
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est déterminée par microanalyse élémentaire et par RMN. Le copolymère
contient 33% en poids de PCL.
Le même protocole a été utilisé pour un dextrane de masse
molaire plus faible, 6000g/mole (Fluka).
5
EXEMPLE 8
Dex-PCL
3g de R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont anhydrisés par distillation
azéotropique, puis séchés sous vide à 40-50°C, pendant une nuit,
Zo directement dans le ballon'de réaction de 50 ml surmonté d'un réfrigérant
ascendant et connecté à une rampe vide/argon. On rajoute ensuite dans
le ballon 5 ml de THF sec. Après dissolution de l'acide, on rajoute dans le
ballon 0,243 g de carbonyle dümidazole (CDI) qui se dissout rapidement.
Le mélange inerte est porté au reflux du THF. On observe un dégagement
15 de C02. Après 3 heures, le THF est évaporé.
1,29 g de dextrane (Fluka, masse molaire 6000 glmole)
préalablement anhydrisé sont dissous à chaud dans 7 ml de DMSO
anhydre, puis rajoutés dans le ballon de réaction contenant l'intermédiaire
imidazolide de l'acide R-PCL-COOH. On chauffie le mélange de réaction à
2 0 130°C pendant 3 heures. La solution devient brunâtre. On évapore le
DMSO puis on dissout le produit de rëaction dans du chloroforme et on
l'introduit dans une ampoule à décanter. On l'extrait avec de l'eau
distillée. La phase aqueuse se présente comme une émulsion abondante
stable. Après ëvaporation du solvant, on ne retrouve pratiquement pas de
25 résidu dans la phase organique. On évapore la phase aqueuse et on
obtient ainsi un précipité qu'on sépare. On lave le polymère ainsi obtenu
avec de l'éther puis on le sèche. La masse molaire déterminée par CES
(tableau 1 ) est de 11000 g/mole. Cette méthode avec rendement élevé (>
80 %), rapide et sélective, est préférée par la suite.
3 o En variant le rapport massique dextrane : R-PCL-COOH dans la
synthèse du Dex-PCL, il est possible d'obtenir par cette méthode une
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série de copolymères Dex-PCL contenant des taux massiques de Dex
variables. Ces copolymères ont été caractérisés par chromatographie de
perméation sur gel (détecteurs réfractomètre et viscosimètre, à 70°C),
à
l'aide d'une colonne ViscoGel (GMHHR-H, Viscotek, GB), étalonnée avec
des standards de Pullulane. Les copolymères Dex-PCL ont été dissous
dans du diméthyle acétamide (DMAC) à des concentrations de 5 mg/ml.
Les volumes injectés ont été 100 ~,I. L'éluant a été DMAC contenant 0,4%
LiBr, à un débit de 0,5 ml/min. Les masses molaires ont été déterminées
par la méthode de la calibration universelle. Quelques exemples figurent
2o dans le tableau 1.
Dex-PCL Dex-PCL Dex-PCL
CopolymreDextrane7 chanons PCL 5 chanons PCL 3 chanons PCL
par par par
chane de Dextranechane de Dexranechane de Dextrane
Mw 4985 19060 16000 10870
4670 13510 11650 9878
pd 1,06 1,41 1,37 1,10
(dl/g) 0,087 0,098 0,12 0,12
IV n
I2gw (nm)2,47 3,92 4,07 3,57
Di~/dc 0,147 0,052 0,084 0,088
(ml/g)
Le Dex-PCL7 dérive de la mise en présence de dextrane à raison
de 5% et de PCL à raison de 95%.
Le Dex-PCLS dérive de la mise en présence de dextrane à raison
de 20% et de PCL à raison de 80%.
Le Dex-PCL3 dérive de la mise en présence de dextrane à raison
de 33% et de PCL à raison de 67%.
2 o Tableau 1. Caractéristiques du dextrane de départ et de trois
copolymères Dex-PCL comportant respectivement 7, 5 ou 3 chaînons de
PCL greffés au niveau du squelette de dextrane, synthétisés en utilisant
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dans le mélange réactionnel 5, 20 ou 33 % en poids de dextrane (par
rapport au poids total de RPCL-COOH et de dextrane)
Mw : masse molaire moyenne en poids
Mn : masse molaire moyenne en nombre
Pd : polydispersité (=Mw/Mn)
Ivw : viscosité intrinséque moyenne en poids
Rgw : rayon de giration moyen en poids
dn/dc : variation de l'indice de réfiraction spécifique avec la
concentration.
1o Les trois copolymères présentent une faible polydispersité et des
masses molaires moyennes en poids comprises entre 11000 et 19000
glmole.
EXEMPLE 9
15 amitose-PCL
0,2g amitose (Fluka, extraite de pommes de terre) sont dissous
dans 8m1 DMSO. II résulte une solution trouble, à laquelle on rajoute 0,2 g
de R-PCL-ester de NHSI (exemple 6) dissout dans 3 ml DMSO. Ce
mélange est incubé à 70°C pendant 144h. Après évaporation des
2 o solvants, le solide est repris avec 200 ml eau et 200 ml chloroforme dans
une ampoule à décanter. La phase intermédiaire contenant le polymère
amphiphile est récupérée et extraite encore une fois, puis séchée. Ce
traitement est une variante de la méthode de purifiication de l'exemple 7.
Le rendement en poids après la deuxième extraction est de 38%
2 5 (pds).
Les résultats de la microanalyse permettent de déterminer la
composition globale du copolymère amphiphile obtenu, qui contient 32%
en poids de PCL.
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EXEMPLE 10.
Chitosane-PCL
Le copolymère chitosane-polycaprolactone est obtenu selon le
protocole de l'exemple 9. La synthèse a été effectuée à partir du
s chitosane brut (Fluka, 150000 glmole) et le rendement d'obtention du
copolymère a été 22% en~poids. D'après la microanalyse élémentaire, le
copolymère contient 67% en poids de PCL. II est de type peigne, avec un
squelette de chitosane et des chainons latéraux de PCL liés
majoritairement par des liaisons amides.
EXEMPLE 11
HA-PCL
L'acide hyaluronique (Accros, masse molaire supérieure à 106
g/mole) sous la forme de carboxylate de sodium est dissous dans l'eau
MiIIiQ, et converti sous la forme acide libre à l'aide d'une résine
superéchangeuse de cation, et lyophilisé. Le produit ainsi obtenu est
assez soluble dans le DMSO et permet de réaliser le couplage avec
l'ester NHSI du R-PCL-COOH, d'après le protocole des exemples 7 et 9.
Le copolymère de type peigne acide hyaluronique-PCL est
2 o récupéré dans la phase aqueuse. II n'y a pas de phase intermédiaire.
' D'après la microanalyse, ce copolymère contient 18% en poids de PCL.
EXEMPLE 12
Nanoparticules R-PCL-COOH
Une masse bien définie de R-PCL-COOH synthétisé selon
l'exemple 1 esfi dissoute dans l'acétone pour obtenir une concentration de
20mg/ml. Un volume d'eau égal au double du volume d'acétone est versé
goutte-à-goutte. Spontanément, le polymère forme des nanosphères d'un
diamètre moyen de 210 nm (mesuré après l'évaporation du solvant), en
3 o absence d'agent tensioactif.
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EXEMPLE 13
Nano~arkicules Dex-PCL
Une masse bien définie de copolymère Dex-PCL synthétisé selon
l'exemple 7 est introduite dans le dichlorométhane pour obtenir une
concentration de 10 mg/ml. Le polymère est dispersé et gonflé par le
solvant, mais il ne se dissout pas. Un volume d'eau deux à vingt fois
supérieur au volume de dichlorométhane est rajouté. Une émulsion
grossière est d'abord formée, puis affinée grâce aux ultrasons. Le
copolymère amphiphile stabilise !'émulsion, en évitant ainsi la nécessité
Zo de rajouter des agents tensioactifs. Aprës évaporation du solvant
organique, on obtient des nanoparticules.
Le diamètre moyen des particules est déterminé par diffusion de
la lumière (PCS). La taille des particules, généralement inférieure à 300
nm par ce procédë, dépend de la concentration, du rapport des volumes
des deux phases aqueuse et organique, du temps et de la puissance de
sonication.
EXEMPLE 14.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont introduits dans 10 ml eau
2 o MiIIiQ et chauffés à 80°C sous agitation magnétique. Suite à la
fusion du
polymère à cette température, des particules sphériques ont été formées
(Fig. 1 ). Le refroidissement du récipient a permis ensuite de figer les
structures ainsi formées. Les particules ont pu étre récupérées ensuite par
sédimentation.
II a été observé que le rajout de l'éthanol en faible quantité
permettait d'améliorer la fabrication en évitant la formation de films à la
surface de l'eau.
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EXEMPLE 15.
Des particules ont été formées selon le protocole de l'exempte 14,
sauf qu'à la place de l'eau, une solution tampon acétate pH4,8 saturée en
chitosane a été utilisé. Des particules sphériques ont été ainsi obtenues.
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EXEMPLE 16.
22 mg R-PCL-COOH (exemple 1 ) sont introduits dans 10 ml eau
MiIIiQ et chauffës à 80°C. Une sonde à ultrasons a été plongée
ensuite
dans le rëcipient et des ultrasons ont été appliqués (20W, 20sec). Ceci a
Zo permis d'obtenir des microsphères d'un diamètre hydrodynamique moyen
de 1,1 ~,m (déterminé par PCS) et ayant une faible polydispersité (fig. 2).
If a été noté que l'utilisation d'un ultraturax pouvait remplacer la
sonication pour la formation des nanoparticules.
II a été observé que le copolymère Dex-PCL (exemple 7) et le
15 copolymère chitosane-PCL (exemple 9) formaient également des
particules par ce procédé.
II a été noté qu'il était également possible de former des particules
par ce procédé en remplaçant l'eau par une huile (par exemple Migliol~)
ou par un polymère (comme le PEG de masse molaire 200 glmole). Ces
2 o essais ont été réalisés avec 25 mg de polymëre dans 5 ml de liquide.
EXEMPLE 17.
bioadhésion
L'interaction des particules selon l'invention avec des cellules
25 Caco2 en culture, utilisées comme modèle d'interaction pour les particules
destinées pour la voie orale a été étudiée. Le PLA tritié a été encapsulé
comme marqueur radioactif dans des nanoparticules Dex-PCL (exemple
7) pour permettre de déterminer avec précision la localisation des
particules (à l'intérieur ou à la surface des cellules ou dans le milieu de
3 o culture). Ce marquage s'est révélé parfaitement stable dans le milieu de
culture, autorisant donc ces études. Des cellules Caco2 ont été cultivées
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dans des plaques à 24 puits, avec changement du milieu (1,5 mllpuits
DMEM 4,5 g/1 glucose, 15% sérum de veeu foetal) tous les 1 ou 2 jours
jusqu'à confluence. Après environ 4 jours, lorsque les cellules sont
arrivées à confluence, le milieu est retiré, on rajoute 1,5 ml de milieu
Hank's, on attend 2h puis on rajoute les suspensions de nanosphères
contenant des quantifiés bien définies de particules (dans un volume total
de 100 ~,I). L'activité par puits dans le milieu de culture a été fixée à 0,1
p,Ci. Après trois heures d'incubation à 37°C dans un incubateur à C02,
le
surnageant a été retiré, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS,
1o puis lysées pendant 1 h avec 1 ml de NaOH 0,1 M. La radioactivité a ëté
.comptée dans le surnageant, les eaux de lavage et le lysat cellulaire.
Ainsi, il a été possible de déterminer avec prëcision la quantité de
nanoparticules effectivement associée aux cellules.
La quantité des nanoparticules Dex-PCL associée aux cellules
Caco2 est double par rapport à celles en polyester (PLA, Phusis, Mw
40000 g/mole) fabriquées par la technique de la nanoprécipitation
(exemple 10) en présence de Pluronic~. Ainsi, 2,5% et 1,1%
respectivement des nanoparticules sont associées aux cellules.
2 o EXEMPLE 18
couplage de lectines par affinité. ciblaae
Une suspension de nanoparticules radiomarquées, fabriquées à
partir de Dex-PCL (exemple 7), est mise en contact avec une solution de
lectine de pois (Lens culinaris) en excès par rapport aux particules, de
2 s manière à saturer la surface de celles-ci en lectine adsorbée par
affinité.
L'interaction des nanoparticules ainsi recouvertes de lectine avec des
cellules Caco2 en culture est étudiée selon le protocole précédent
(exemple 16).
La quantité des nanoparticules associée aux cellules Caco2 est
3 o significativement augmentée par rapport à celles non recouvertes de
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lectine. Ainsi, 3,5% des nanoparticules introduites en chaque puits sont
associées aux cellules, par rapport à 2,5% en absence de lectine.
EXEMPLE 19
Furtivité
La capacité de nanoparticules recouvertes de dextrane
(fabriquées à partir de Dex-PCL, exemple 7) à éviter la capture par des
cellules phagocytes (J774) a étë comparée à celles de même taille
(environ 200 nm) et recouvertes de PEG 5000 g/mole (fabriquées à partir
zo de PEG-PLA synthétisé selon l'exemple 4, à partir de Me=O-PEG-OH
5000 glmole et de lactide, avec une masse molaire du bloc de PLA de
50000 glmole). Les cellules J774 ont été cultivées dans des plaques à 24
puits, dans un milieu DMEM contenant 4,5 gll glucose et 10% sérum de
voeu foetal. Préalablement aux expériences, le surnageant des cellules a
1s été renouvelë et on a attendu 4h avant de rajouter fes suspensions de
nanoparticules radiomarquées dans les puits. La capture des
nanoparticules Dex-PCL et des nanoparticules de référence de même
taille recouvertes par du PEG a été pratiquement la même (1 à 2%),
malgré ia capacité bien connue de ce type de ceilufes à phagocyter des
2 o nanoparticules. Ceci est une indication concernant le caractère « furtif »
des nanoparticules recouvertes de dextrane, similaire à celui des
particules recouvertes de PEG, bien connues dans la littérature.
