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METHODE DE DETECTION DE L'ACTIVITE DE LA CALPAINE 3 DANS
UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE ET PEPTIDES POUR LA MISE EN
OUVRE DE LADITE METHODE
L'invention concerne une méthode de détection de l'activité de la calpaine 3
dans un
échantillon biologique constitué soit de cellules, soit de lignées
cellulaires, soit de
tissus. Elle se rapporte également aux peptides destinés à être utilisés dans
ladite
méthode. L'invention a également pour objet l'utilisation desdits peptides
pour le
diagnostic in vitro de la dystrophie des ceintures type 2A (LGMD 2A). Elle
concerne
1o par ailleurs une méthode d'analyse de l'efficacité du transfert du gène de
la calpaine 3
dans des cellules animales ou humaines in vitro mais également chez l'animal
in vivo.
Elle a aussi pour objet une méthode de criblage de substances inhibitrices ou
activatrices de la calpaine 3. La méthode de détection de l'activité de la
calpaine 3
constitue enfin un moyen d'étudier la fonction de la calpaine 3.
Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales
activables par
le calcium [Sorimachi, 1997]. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11
membres
dont 2 protéines ubiquitaires. Les fonctions physiologiques des calpaïnes
restent
encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles
doivent
2o vraisemblablement réguler des fonctions cellulaires importantes. En
particulier, les
calpaïnes ubiquitaires ont été impliquées dans l'apoptose [Squier, 1994], la
différenciation myogénique [Kwak, 1993], la division et la fusion cellulaires
[Yamaguchi, 1994]; [Schollmeyer, 1986]; [Balcerzak, 1995].
La calpaine 3, également connue sous la dénomination p94, est une enzyme à
cystéine
calcium dépendante appartenant à la famille des calpaines s'exprimant
spécifiquement
dans le muscle squelettique[Sorimachi, 1989]. Elle est impliquée dans une
maladie
génétique autosomique récessive appelée dystrophie des ceintures de type 2A
[Richard, 1995]. Cette myopathie est caractérisée par une atrophie et une
faiblesse
3o progressive des muscles des ceintures pelviennes et scapulaires et un
aspect de
nécrose regénération sur les biopsies musculaires [Fardeau, 1996]. Le gène
situé sur le
chromosome 15 chez l'homme code pour un transcrit de 3,Skb, lui-même codant
pour
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une protéine de 94kDa. Il a été démontré que la calpaïne 3 pouvait se lier à
la titine,
protéine élastique du sarcomère, par l'intermédiaire de la région ISZ et
qu'elle subissait
une dégradation autolytique immédatement après traduction lorsqu'elle elle est
exprimée dans les cellules Cos7 [Sorimachi, 1993] [Sorimachi, 1995]. Cette
région
comporte un signal de localisation nucléaire laissant supposer que la calpaine
peut être
localisée soit dans le cytoplasme, soit dans le noyau. Il a par ailleurs été
montré que la
calpaine 3 était sous-exprimée dans les souris transgéniques surexprimant
l'interleukine 6, ces souris présentant une atrophie musculaire. La calpaine 3
semble
aussi sous-exprimée dans différentes conditions comportant une composante
1o atrophique du muscle (cachexie, etc...).
Dans l'état actuel des connaissances, on sait donc que la LGMD2A est due à des
mutations apparaissant sur le gène de la calpaine 3, mutations conduisant à
une
inhibition de la protéolyse de la calpaine 3 présente dans le muscle
squelettique. Le
diagnostic clinique de la LGMD 2A est très difficile puisque les patients
présentent
des signes cliniques similaires à au moins une dizaine d'autres pathologies.
Le
diagnostic moléculaire peut, quant à lui, être réalisé selon différentes
méthodes.
La première possibilité est de procéder à une recherche de mutation sur le
gëne de la
2o calpaine. Cependant, une telle technique est très lourde dans la mesure où
le gène est
relativement grand, qu'il existe donc un grand nombre de mutations différentes
et
qu'il n'y a pas de mutation préférentielle.
Une autre technique consiste à détecter la présence de la protéine à l'aide
d'anticorps
spécifiques. Cependant, même si la calpaine 3 est présente dans l'échantillon,
cela ne
signifie pas pour autant que l'individu n'est pas malade dans la mesure où la
mutation
sur le gène de la calpaine peut faire que la protéine est présente mais que le
phénomène d'autolyse n'existe pas. Au contraire si la calpaine est absente ou
diminuée, il peut s'agir d'une calpainopathie secondaire due à des mutations
sur un
autre gène que celui de la calpaine.
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En d'autres termes, le problème que se propose de résoudre l'invention n'est
pas tant
de détecter la présence de la calpaine 3 dans un échantillon biologique mais
plutôt
celui de détecter son activité.
Guttman et al. décrivent dans le document Methods in molecular biology vol
144, ch
18, une méthode de mesure de l'activité de calpaine ubiquitaire consistant à
mettre
une calpaine purifiée au contact d'un peptide non spécifique fluorescent (Succ-
LLVY-
AMC), puis de mesurer la variation de fluorescence apparaissant lorsque la
molécule
est clivée. Dans une seconde méthode, on met en contact la calpaine avec la
protéine
1o TAU entière, puis on effectue un Western blot. En aucun cas ce document ne
concerne
spécifiquement la calpaine 3. De plus, les substrats sont, soit non
spécifiques (substrat
de la m-calpaine et la p-calpaine), soit des protéines entières.
Le problème que se propose de résoudre l'invention est de développer un
nouveau
substrat spécifique de la calpaine 3 qui puisse être utilisé pour détecter
l'activité de la
calpaine 3 dans un échantillon biologique.
Dès lors, l'invention concerne tout d'abord un peptide couplé à au moins une
molécule rapportrice fluorogénique ou colorogénique, ledit peptide se
caractérisant en
2o ce qu'il contient au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée
par la
calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Par "isoforme de la calpaine 3", on désigne toute protéine produite par le
gène de la
calpaine 3, résultant d'un événement alternatif du type promoteur alternatif
ou
épissage alternatif.
DariS tlll premier mode de réalisation et compte tenu des propriétés
autolytiques de la
calpaine 3, le peptide de l'invention contient avantageusement au moins un
site
d'autolyse de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3, dont le nombre
d'acides
3o aminés est inférieur à 10.
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Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression
"site d'autolyse", on désigne une séquence d'acides aminés contenue dans la
calpaine 3 ou un de ses isoformes susceptible d'être clivée par la calpaine 3
ou un de
ses isoformes en au moins deux peptides ainsi que toute séquence dérivée.
En pratique, la séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3
est
choisie parmi les séquences suivantes NMTYGTS (SEQ ID1), NMDNSLL
(SEQ ID2), PVQYETR (SEQ ID3) dénommées dans la suite de la description
respectivement site 1, site 2 et site 3. Ces sites sont identiques dans toutes
les espèces
1o pour lesquelles la séquence de la calpaine 3 est connue à ce jour (homme,
souris, rat, ).
La séquence d'acides aminés du site d'autolyse de la calpaine 3 peut être
également
choisie païllll les séquences humaines suivantes VAPRTA AEPRSP (SEQ ID4),
QSKATE AGGGNP (SEQ IDS), et les séquences mucines suivantes VAPRTG
AEPRSP (SEQ ID6), QGKTTE AGGGHP (SEQ ID7).
Dans le mode de réalisation selon lequel le peptide de l'invention contient au
moins un
site d'autolyse d'une isoforme de la calpaine 3, la séquence d'acides aminés
du site
d'autolyse provient d'une isoforme de la calpaine 3 dénommé Lp82 présent chez
le
rongeur, rat, souris et est choisi parmi les séquences d'acides aminés
suivantes
NPYLLPGFFC (SEQ ID8) et TISVDRPVP (SEQ ID9).
Dans un second mode de réalisation, la séquence d'acides aminés clivable par
la
calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3 provient d'une protéine substrat
du type
par exemple calpastatine, filamine, taline, calpaines ubiquitaires,
cristalline, heat
shock proteine, etc.
Avantageusement, les protéines substrat ont les séquences suivantes
;o REVTIPPKYRELL (SEQ ID10) (calpastatine humaine)
KEGTIPPEYRKLL (SEQ ID11) (calpastatine souris et rat)
PVSREEKPTSAPSS (SEQ ID12) (alpha-A-cristalline humaine)
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PVSREEKPSSAPSS (SEQ ID13) (alpha-A-cristalline souris et rat)
KSTVLQQQYNR (SEQ ID 14) (taline humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession XP 045856 (filamine 2 humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession P 10809 (heat shock proteine 60
5 humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession NP 004355 (c/EBPbeta humaine)
Séquence publiée sous le numéro d'accession P 17655 (m calpaine humaine)
Dans un troisième mode de réalisation, le peptide contenant une séquence
clivable par
1o la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3, est obtenu par criblage
d'une banque de
peptides par la calpaine 3 ou une isoforme de la calpaine 3.
Pour permettre de détecter ultérieurement l'activité de la calpaine par
colorimétrie ou
fluorimétrie, le peptide de l'invention, comme déjà dit, est couplé à une
molécule
rapportrice colorogénique ou fluorogénique.
Lorsque la molécule rapportrice est une molécule colorogénique, le clivage de
la
séquence d'acides aminés par la calpaine 3 sera détecté au spectrophotomètre
par
l'apparition d'un composé coloré. En pratique, le composé coloré utilisé est
le
2o paranitroanilide. Il peut également s'agir de thioesters.
Lorsque le peptide est couplé à un composé fluorogénique, la coupure est
détectée par
un chmgement de l'émission fluorescente. Dans ce cas, et en pratique le
composé
fluorogénique utilisé est le méthyl 4 coumarilamide 7 (MCA) ou le
naphtilamide. Le
naphtilamide et l'amino 7 fluorométhylcoumarylamide 3 peuvent être utilisés en
tant
que substrat colorogénique ou fluorogénique.
Dans un autre mode de réalisation, le peptide clivable par la calpaine 3 est
couplé à
ses deux extrémités par deux composés fluorogéniques, la coupure étant
détectée par
3o un changement de l'émission fluorescente d'un premier composé (molécule
donneuse)
dü à l'éloignement, secondairement à la coupure, d'un second composé (molécule
accepteuse) situé de l'autre côté du peptide et qui absorbe la fluorescence du
premier
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lorsque ceux-ci sont proches. Cette technique est bien connue sous le nom de
FRET
(Fluorescence Résonance Energy Transfer) (F~rster, 1948). Plus précisément, le
FRET est un phénomène physique qui peut intervenir entre deux molécules
fluorescentes dans certaines conditions : les deux molécules doivent être
suffisamment
proches l'une de l'autre (moins de 100 ~) et le spectre d'émission d'une des
molécules (la molécule donneuse) doit recouvrir le spectre d'excitation de la'
deuxième molécule (la molécule accepteuse). Ainsi, lorsque la molécule
donneuse est
excitée à sa longueur d'onde d'excitation, elle atteint un niveau d'énergie
plus élevé.
En quelques picosecondes, une partie de l'énergie est dispersée dans le milieu
sous
to différentes formes (chaleur ...). Si la molécule donneuse est dans une
orientation
optimale et à proximité d'une molécule accepteuse, son énergie peut être
transférée à
cette molécule accepteuse sans intervention d'un photon ni nécessité de
collision entre
les deux molécules. La molécule accepteuse est alors excitée et émet de la
lumière à sa
propre longueur d'onde d'émission. Lorsque le peptide est clivé, l'énergie
n'est plus
absorbéé et la moléculé donneuse émet de la fluorescence. L'augmentation de la
fluorescence correspond donc à une activité mesurable de clivage dü peptide.
La
molécule rapporteuse fluorogénique peut être une molécule synthétique obtenue
par
synthèse chimique ou une protéine permettant l'émission d'un signal
fluorescent.
2o Dans une première forme de réalisation, le peptide présente à chacune de
ses
extrémités une molécule rapporteuse fluorogénique synthétique respectivement
le
MCA (molécule donneuse) et le Dnp (molécule accepteuse).
Dans une seconde force de réalisation, le donneur est l'acide 5-[(2'
aminoéthyl)
amino] naphtalène sulfonique (EDANS) et l'accepteur est l'acide 4-[[4'-
(diméthyl
amino] phényl] azo] benzoïque (DABCYL).
Dans tous les cas qui précèdent, le peptide de l'invention couplé à la
molécule
colorogénique ou fluorogénique est obtenu par synthèse chimique.
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Comme déjà dit, la molécule rapporteuse peut être également une protéine
permettant
l'émission d'un signal de fluorescence. Dès lors et dans un mode de
réalisation
avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités une GFP mutée.
La GFP (« Green Fluorescent Protein ») est une protéine de 27 kDa qui est
synthétisée
par une méduse du Pacifique (Aeqzcora Victoria) et qui émet une fluorescence
verte
lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu
être
purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être
clonée en
phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde
ses
1o propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce
qui permet une
éhide aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est
liée,
comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une
protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines
mutations de
la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant
avec ce
fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de
fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999). En particulier, les
protéines
CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et
YFP,
pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été
isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène
de
2o FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission
de CFP (la
molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).
Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP
est
excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie
d'activation
à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 tun. Les séquences
correspondant
aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc
clonées
entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la
calpaine 3 en
produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP
sera
reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.
L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide
couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins
une
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séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3 ou une isofonne
de la
calpaine 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code
pour les
peptides suivants
CFP-site 1- YFP ;
CFP-site 2- YFP ;
CFP-site 3- YFP
L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et
un
promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une
cellule
1o hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le
Demandeur,
directement dérivé du plasmide décrit dans [Vanderklish 2000].Elle se rapporte
également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité
de la
calpaine 3 ou d'une isofonne de la calpaine 3 dans un échantillon biologique
selon
lequel
dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec
le
peptide précédemment décrit,
dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit
peptide
2o par la calpaine 3 ou une isofonne de la calpaine 3 par mesure de
l'intensité de la
réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est
effectuée
sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un
extrait
cellulaire, les cellules étant d'origine animale bu humaine, soit d'un tissu.
Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le
peptide peut
se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est
mis
directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des
propriétés de
3o perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du
peptide sera
déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second
mode
de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes
transfectées par
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un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de
l'invention,
les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant
l'émission
d'un signal fluorescent.
Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le
peptide est
simplement mis au contact dudit extrait.
La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement
sar coupes
de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par
exemple
l0 biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de
l'isopentane
refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à -80°C jusqu'à
utilisation. Des coupes de 5
à15 pm sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de
verre. Les
coupes sont conservées aussi à -80°C si elles ne sont pas utilisées
immédiatement. La
détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant
directement le
peptide sur la lame.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses
extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule
fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant
déterminée par
FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène
de FRET
se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et
le phénomène
de FRET est alors diminué.
La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la
calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de
la
LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la
méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.
L'invention concerne également une méthode de criblage de substances
inhibitrices ou
activatrices de la calpaine 3 ou d'une isofonne de la calpaine 3. Ladite
méthode peut
revêtir deux modes de réalisation différents.
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Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste
à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance,
- puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de
l'invention,
- et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou
5 fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une
substance
activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine
3.
L'échantillon biolôgique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits
cellulaires
ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le
peptide est
1o ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait
cellulaire ou
tissulaire) avec le peptide. En pratique, le peptide présente à chacune de ses
extrémités
respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule
fluorogénique
accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par
FRET.
Selon un second mode de réalisation, la méthode consiste
- à préparer un échantillon biologique contenant le peptide de l'invention,
- puis à mettre en contact ledit échantillon avec la substance à identifier,
- et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou
fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une
substance
2o activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la
calpaine 3.
Dans ce cas, l'échantillon biologique est constitué de cellules ou de lignées
cellulaires
transfectées avec un vecteur comprenant la séquence d'ADN codant pour le
peptide de
l'invention, dans l'hypothèse où la molécule rapporteuse est d'origine
protéique.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses
extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule
fluorogénique accepteuse et la méthode consiste à
a/ préparer un échantillon biologique contenant ledit peptide ,
3o b/ mesurer le taux de FRET en l'absence de la substance activatrice ou
inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3,
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c/ mettre en contact l'échantillon biologique contenant le peptide avec la
substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la
calpaine 3,
d/ mesurer le taux de FRET en présence de la substance activatrice ou
iWibitrice de la calpaine 3 ou d'une isoforme de la calpaine 3,
e/ conclure à la présence
d'une substance activatrice si le taux de FRET mesuré en b/ est supérieur au
taux de
FRET mesuré en d/
d'une substance inhibitrice si le taux de FRET mesuré en b/ est égal au taux
de FRET
1 o mesuré en d/
L'invention a également pour objet une méthode d'analyse de l'efficacité du
transfert
de gène de la calpaine 3 consistant
- tout d'abord à transfecter des cellules animales ou humaines avec un
plasmide
codant pour la calpaine 3,
- puis à mettre les cellules transfectées au contact du peptide de l'invention
soit in
vitro, soit in vivo,
- puis à mesurer l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorométrique.
2o Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de
ses
extrémités ,respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule
fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant
déterminée par
FRET.
Le gène de la calpaine 3 est parfaitement identifié et les techniques de
transfection
précisément décrites dans le document EP 717110 de sorte qu'ils ne seront pas
d'avantage détaillés.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples
de
réalisation suivants à l'appui des figures annexées.
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Figure 1 : Séquence partielle de la calpaïne 3; la position des sites
d'autolyse est
indiquée par les flèches ; les séquences utilisées dans les peptides sont
soulignées et
sont identiques chez toutes les espèces pour lesquelles la séquence de la
calpaïne 3 est
connue à ce jour (homme, souris, singe, rat, bbuf).
Figure 2 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides
correspondant au site d'autolyse 1, 2 et 3 de la .calpaïne 3 (courbes A, B et
C,
respectivement) par les calpaïnes 1 (colonne de gauche) et 2 (colonne de
droite)
recombinantes
Figure 3 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides
1o correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de
cellules C2C12
transfectées ou non avec un plasmide codant pour la calpaïne 3.
Figure 4 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage des peptides
correspondant aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de
myoblastes de
souris normales (+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-).
Figure 5 : Mesure au cours du temps de l'activité de clivage du peptide
correspondant
au site 3 d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myotubes de souris
normales
(+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-)
Figure 6 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides
correspondant
aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de myoblastes de souris
normales
(+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-)
Figure 7 : Mesure pendant 6 heures de l'activité de clivage des peptides
correspondant
aux sites d'autolyse de la calpaïne 3 par des extraits de quadriceps de souris
normales
(+/+) ou déficientes en calpaïne 3 (-/-)
Figure 8 : portion de séquence du plasmide pTOM. Les acides aminés en italique
font
partie de la séquence de EYFP. Les acides aminés en gras font partie de celle
de
ECFP. Le codon STOP de EYFP a été éliminé dans le vecteur pTOM. Les bases en
italique et en gras montrent les phases des séquences de EYFP et ECFP,
respectivement. Les bases en soulignées correspondent au fragment qui a été
éliminé
pour construire le vecteur pTOMp. Les séquences protéiques A et B
correspondent à
la traduction du vecteur pTOM à partir de l'ATG de la séquence codante de
EYFP,
respectivement avant et après élimination du fragment double-brin situé entre
les sites
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de restriction Ec1136II et SmaI. Dans la séquence A, les séquences codant pour
EYFP
et ECFP ne sont pas en phase. Elles le sont dans la séquence B.
Figure 9 : A : Migration sur gel d'agarose des produits de PCR sur colonies
repiquées
après transformation avec pTOMp. Les PCR ont été effectuées avec les
oligonucléotides midEYFP.a et midECFP.m. B : Migration de ces produits de PCR
après digestion par EcoRI ; Puits n°1 : échelle lkb ; n°2 : pTOM
; n°3 : pTOM après
digestion par EcoRI ; n°4 à n°9 : migration des produits de PCR
du gel A après
digestion par EcoRI ; leur taille est toujours de 800pb.
Figure 10: site de clonage sur le vecteur pTOM (10a) et séquence des
1o oligonucléotides codant pour les sites d'autolyse de la calpaïne 3 (10b,
10c, 10d).
Chaque couple d'oligonucléotides complémentaires est composé d'un
oligonucléotide
dont le nom se termine par « .a » et d'un oligonucléotide dont le nom se
termine par
« .m ».
Figure 11 : Migration sur gel d'agarose de produits de PCR sur colonies
repiquées
après transformation avec pTOM et l'insert codant pour le site 2 d'autolyse ;
la PCR a
été réalisée avec les oligonucléotides SGp94S2.a et midECFP.m.
Figure 12 : carte de restriction du plasmide pTOM
Figure 13 : carte de restriction du plasmide pTOMsl, pTOMs2, TOMs3
2o I/ TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAòNE 3 Ä PARTIR D'EXTRAITS
PROTEIQUES
Le clivage de peptides synthétiques correspondant aux sites d'autolyse de la
calpaïne
3 (Figure 1) permet la détection de son activité à l'aide d'une technique
faisant
intervenir le FRET.
A/ Matériel et méthode
1/ Fluorimètre : SpectraMax Gemini XS Microplate fluorometer (Molecular
Devices).
2/ Séquence des peptides fluorescents
Mca-NMTYGTS-Dnp (site 1)
Mca-NMDNSLL-Dnp (site 2)
3o Mca-PVQYETR-Dnp (site 3)
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3/ Références des enzymes commerciales ét des inhibiteurs utilisés
calpaïne 1: Human eryhtrocytes (Calbiochem)
calpaïne 2: Rat, recombinant, E.coli (Calbiochem)
caspase 3 : Hunan, recombinant, E.coli (Calbiochem)
4/ Conditions de réaction
Volume final de 200p1 ; calcium (CaCl2) lOmM final ; peptides fluorescents
l,9pM
final.
l0 S/ Détection de la fluorescence:
La réaction se fait à 37°C, soit sur une heure (avec dans ce cas une
mesure de
fluorescence toutes les 50 secondes) ou sur 6 heures (mesure toutes les 2
minutes).
Le milieu est agité entre chaque mesure. Les longueurs d'onde utilisées pour
la
détection de la fluorescence des peptides sont
- Longueur d'onde d'excitation de Mca : 325run.
- Longueur d'onde d'émission de Dnp : 392nm.
G/ Mise au point des tampons
Dans un premier temps, les conditions de réaction ont été mises au pôint, et
en
particulier la composition du tampon de réaction. Effectivement, la détection
de la
fluorescence s'est révélée y être très sensible. Les premiers tests ont
consisté à faire
varier les différents composants du tampon et leur concentration. Différentes
concentrations en NaCI ont été testées. L'importance d'une faible
concentration en
DMSO, dans lequel sont resuspendus les peptides, a été démontrée. Il a
également été
montré que la présence du CHAPS dans le milieu de réaction, ainsi que de la
BSA
permettait une détection optimale de la fluorescence. Pour être certain
d'activer la
calpaïne 3, les réactions se font à 37°C, en présence de lOmM de
calcium.
Effectivement, la calpaine 3 est active lorsqu'elle est en présence de
concentrations en
calcium de l'ordre du nanomolaire.
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Composition des tampons
Tampon de resuspension des calpaïnes commerciales : NaCI 100mM, EDTA SmM,
TrisHCl 50mM, Bmercaptoéthanol SmM, glycérol 40%, pH=7,8. Conservation à
température ambiante.
5 Tampon de resuspension des peptides fluorescents : Les peptides sont
resuspendus à
lmg/ml dans du DMSO 100%. Conservation à 4°C, à l'abri de la lumière.
Tampon de réaction : NaCI 100mM, HEPES SOmM, DTT IOmM, EDTA lmM,
glycérol 10%, CHAPS 0,1%, BSA 100ng/pl, pH=7,4, filtration. Conservation à
tempéraW re ambiante.
7/ Culture des cellules eucaryotes:
Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes marins;
Milieux utilisés
DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL)
MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL)
SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL)
Milieu utilisé pour C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la
ionomycine
(Calbiochem) à O,SpM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
8/ Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules
eucaryotes:
Matériel
L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree
(ref. 12362)
Plasmides utilisés : pECFP-Nl (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).
Méthodes
ler jOllr
Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de
façon à ce
que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain. .
~~re
2 jour
Dans un premier tube stérile en polystyrène (T 1 ), déposer 94 p l de milieu
sans sérum
de veau foetal.
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Ajouter à chaque tube T1 6 u1 de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim)
Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube
1 à 2 p.8
de plasmide EndoFree.
Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon
FUGENE 6
(T1)+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans
chaque puits,
l0 en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37°C / 7% COz.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec
le
FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les
cellules
auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du
FUGENE 6).
9/ Protocole de lyse cellulaire:
Principe : Les cellules animales, transfectées ou non, sont lysées dans le but
de
préparer des extraits protéiques les propriétés pourront être étudiées.
Méthode
Éliminer le milieu de culture des puits et laver les puits au PBS (Solution de
Dulbecco
tamponnée au phosphate (sa.ns calcium, ni magnésium, ni bicarbonate de sodium)
-
Gibco BRL)
Récolter les cellules et les centrifuger à 5008 pendant 10 min à
4°C.
Éliminer le surnageant et reprendre les cellules dans le tampon de lyse (50mM
HEPES, 1mM DTT, O,ImM EDTA, 0,1% CHAPS, pH=7,4) à raison de 700p.1 de
tampon de lyse par puits.
Laisser agir à 4°C pendant 5 minutes.
Centrifuger à 100008 / 10 minutes / 4°C.
Récupérer le surnageant et conserver à-20°C.
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10-Protocole de lyse tissulaire
Principe : Les muscles sont broyés dans le but de préparer des extraits
protéiques dont
on pourra ensuite étudier les propriétés.
Mc~téYiel : Quadriceps de souris normales et de souris déficientes en calpaïne
3.
Méthode
Broyer les muscles dans l'azote liquide.
Resuspendre dans le tampon de lyse (cf. composition dans le protocole de lyse
cellulaire plus haut) à raison de 19p1 de tampon de lyse par milligrant~ne de
tissu
broyé.
Laisser agir pendant 10 minutes dans la glace.
Centrifuger à 100008 pendant 10 minutes à 4°C.
Récupérer le surnageant et conserver à -20°C
B/ Test de la spécificité du clivage des peptides "sites d'autolyse" par la
calpaïne 3
Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à
ses sites
d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site l,
site 2, site 3)
ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les
calpaïnes
ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaïnes 1 et 2 n'ont pas d'activité de
clivage sur
chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles "peptide sans
enzyme" se
2o superposent aux courbes "peptide + enzyme" Des résultats analogues ont été
obtenus
avec une autre protéase, la caspase 3.
On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules
musculaires
en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne
3 pouvait
cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules
C2C12 en
transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Une
transfection
témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le
plasmide
codant pour la calpaïne 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est
inférieure à
10%. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les
sites
d'autolyse (Figure 3).
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Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non
transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de
fluorescence, ce
qui pouvait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne
3 est une
protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les
extraits de
cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut
être
détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et
2. En
revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les
cellules
transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible
pourcentage de cellules transfectées.
0
On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires
déficientes ou non
en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la
calpaïne 3
pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées
[Richard, 2000].
Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3
(cellules -l-)
peuvent donc être comparées à des extraits de culW res de cellules musculaires
normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des
cellules
lloll différenciées (myoblastes) (Figure 4).
Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage
pouvait être
détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et -/-
est cependant
2o très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2.
Une activité de
clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est
visible entre
cellules +/+ et cellules -/-.
Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante
entre des
extraits +/+ et des extraits -/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des
extraits de
cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est
en effet
théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes.
Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans
les extraits
de cellules -/- est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce
qui est
étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les
cellules
+/+ et les cellules -/-. Une diminution d'activité dans les cellules
déficientes en
calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.
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Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre
extraits
de cellules +/+ et de cellules -/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au
lieu de 1h
(Figure 6)
L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des
extraits de
cellules +/+ que dans des extraits de cellules -/-. L'augmentation d'activité
sur le site 3
est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus
important,. dans
des extraits de cellules -/- que dans des extraits de cellules +/+. Ces
expériences
permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité
de clivage
sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et -/-.
Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de
souris
déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats
de quadriceps
(Figure 7).
L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus
importante
que celle des extraits de tissus -/-. L'activité de clivage du site 3 par les
extraits de
tissus -/- est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces
expériences ont
permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires
sont
similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une
plus forte
activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente
est confirmée.
z0 Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont
l'activité
est activée en absence de calpaïne 3.
II/ TEST D'ACTIVITÉ DE LA CALPAINE 3 EN CELLULES
A/ Matériel et méthode
Clonage d 'oligonucléotides dans le vecteur d 'expression pTOM
Principe : Deux oligonucléotides complémentaires sont mis en présence de
manière à
former des séquences double-brin correspondant aux sites d'autolyse de la
calpaïne 3.
Les oligonucléotides sont choisis de telle façon que leur appariement forme à
chaque
extrémité des sites de restriction. Ces fragments sont clonés dans le vecteur
d'expression pTOM digéré au préalable par des enzymes de restriction.
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Matériel:
Oligonucléotides : site l, site 2, site 3
Enzymes de restriction: BamHl, BspEl, SmaI (BioLabs) ; Ec1136II (Fermentas).
Souches bactériemies utilisées: SCS110 : bactéries dam- StrR (Stratagene) ;
XLl-Blue
5 (Stratagene).
Vecteur plasmidique : pTOM (Généthon) (figure 12).
Méthodes
Hybridation des deux oligonucléotides complémentaires
Les oligonucléotides simple-brin complémentaires sont mis en présence l'un de
l'autre
1o à raison d'une concentration de 20ng/pl final chacun dans le tampon SYBR
Green
PCR Buffer (Applied Biosystems). L'hybridation se fait dans l'appareil ABI
Prism
7700 (Applied Biosystems) selon les conditions suivantes : 95°C/lmin ->
90°C/30sec
-> 85°C/30sec -> 80°C/30sec -> 75°C/30sec ->
70°C/30sec -> 65°C/30sec ->
60°C/30sec -> 55°C/30sec. L'évolution de l'appariement est
suivie au cours du temps
15 grâce au logiciel Sequence Detector 1.6.3.
Digestion du vecteur pTOM
Le vecteur pTOM est digéré par les deux enzymes BamHlet BspEl à 37°C
pendant 2h
pour chaque enzyme.
Ligation des oligonucléotides dans pTOM:
2o Dans le mélange de ligation, le rapport entre la quantité d'insert et la
quantité de
vecteur est de 3 (en moles). La réaction de ligation se fait en présence de la
T4 DNA
ligase (BioLabs) sur la nuit à 16°C.
Protocole de préparation des bactéries électrocompétentes:
Ensemencer lSml de LB+agent de sélection avec lOpl de bactéries conservées à -
80°C dans 20% de glycérol. Incuber 8 heures à 37°C sous
agitation (300tpm environ)
Ensemencer avec 2m1 de préculture 200m1 de LB+agent de sélection éventuel.
Laisser
pousser jusqu'à DO(600nm)=0,5.
Tout le matériel à utiliser doit avoir été refroidi à 4°C au
préalable.
Laisser reposer la culture dans la glace pendant 15 minutes puis la répartir à
raison de
25m1 par tube (8 tubes)
Centrifuger à 4000tpm pendant 20 minutes à 4°C.
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Éliminer les surnageants et reprendre doucement les culots dans 200 ml d'eau
glacée
(25m1 par W be- 8 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants et reprendre les culots dans 100 ml d'eau glacée (en
regroupant les tubes 2 à 2 ; 4 tubes), centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml
de
glycérol 10% (autoclavé et conservé à -20°C) et regrouper les 4 volumes
d'ans un seul
tube; centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 p1 de glycérol 10%,
Aliquoter par 40 p1 en eppendorf, congeler à -80°C.
1 o Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide
témoin selon
le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 108 colonies par
microgranune de vecteur transformé.
Prnt~p~nl~~jP trancfnrmatinm
Ajouter 1 p1 d'ADN ligué (~ 0,1 ng) à 40p.1 de bactéries électrocompétentes,
laisser en
contact pendant 4 min. dans la glace.
Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gene pulser cuvette; 0,2 cm)
Conditions d'électroporation: 2500 V, 200 ohm, 25 pF.
Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure
à
37°C pour permettre l'expression du gène de résistance à
l'antibiotique.
2o Étaler 201 et 200p1 sur des boîtes de Pétri LB + kanamycine l Op.g/ml final
Laisser pousser sur la nuit à 37°C.
nalvaP d~ç~nlnniecv
Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans 100p1 LB
+
lcanamycine à l Opg/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les
colonies.
une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP.a et
midECFP.m, soit le couple formé par un des oligos forward suivants:
Chaque oligonucléotide est
SGp94S1 . a CCGGAAGTGGCACGAACATG polir le site 1 spécifique d'un fragment
SGp94S2 . a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pour le site 2 double-brin cloné. Ils sont
centrés au niveau du site de
SGp94S3 . a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pour le site 3 restriction BspEI.
... et l'oligonucléotide reverse midECFP.m.
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Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0,8% + Bromure d'éthidium
0,5pg/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un
certain
nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquencés avec
l'oligonucléotide
midECFP.m.
2- Culture des cellules eucaryotes:
Lunées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins
Milieux utilisés
DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL)
MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL)
1o SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL)
Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10%SVF + 1 % MEM
Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10%SVF
Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la
ionomycine
(Calbiochem) à O,SpM final sont ajoutés dans le milieu de culhme.
3- Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules
eucaryotes:
Matériel
L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree
(ref. 12362)
Plasmides utilisés : pECFP-N1 (Clontech) ; pEYFP-C1 (Clontech).
Méthodes
le'~ jour
Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de
façon à ce
que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.
2~n~e jour
Dms un premier tube stérile en polystyrène (T1), déposer 94 p1 de milieu sans
sérum
de veau foetal.
Ajouter à chaque tube T1 6 p1 de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim)
Incuber 5 min. à température ambiante.
3o Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du
tube 1 à 2 pg
de plasmide EndoFree.
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Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon
FUGENE 6
(T1 )+milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Après les 30 min, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans
chaque puits,
en répartissant les gouttes sur toute la surface du puits.
Laisser pousser à 37°C / 7% COz.
Remarque : Pour chaque transfection, un puits n'ayant pas été en contact avec
le
FUGENE 6 est à prévoir (témoin cellulaire), ainsi qu'un puits dans lequel les
cellules
auront été en contact avec le FUGENE 6 uniquement (témoin de toxicité du
FUGENE 6).
R/ R r~cnltatc
Pour détecter l'activité protéolytique de la calpaïne 3 en cellules vivantes,
on étudie le
clivage de ses trois sites d'autolyse3 par phénomène de FRET.
Dans le but d'avoir un témoin « FRET positif », c'est-à-dire un plasmide
codant pour
une protéine chimère ECFP-EYFP ne pouvant pas être clivée par les calpaïnes et
au
sein de laquelle peut se produire un phénomène de FRET, on a dans un premier
temps
2o modifié le vecteur pTOM de façon à ce que les séquences codantes pour les
deux
protéines fluorescentes Enhanced-CFP (ECFP) et EWanced-YFP (EYFP) qui se
trouvent sur ce vecteur soient en phase. On a ensuite inséré entre ces
séquences des
fragments d'ADN codant pour les trois sites d'autolyse de la calpaïne 3. Nous
avons
ensuite vérifié que la protéine chimère produite pouvait réellement être
clivée in vitro
par les calpaines ubiquitaires. Enfin, ce clivage a été étudié en cellules par
l'analyse
d'images de fluorescence. Trois méthodes distinctes ont été utilisées pour
cette
analyse et, en particulier, pour celle du FRET.
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1- Clonage d'un vecteur témoin et des vecteurs portant les fragments d'ADN
codant
pour les sites de clivage
Construction d'un vecteur codant pour deux protéines fluorescentes en phase
La stratégie de construction du vecteur portant les deux séquences codant pour
ECFP
et EYFP en phase (appelé pTOMp) a consisté à digérer le plasmide pTOM par deux
enzymes de restriction aux sites uniques sur pTOM et générant des extrémités à
bouts
francs, Ec1136II et SmaI (Figure 8). Le vecteur linéarisé a été purifié et une
réaction
de ligation du vecteur sur lui-même a été réalisée. Après transformation et
repiquage
de colonies positives, une réaction de PCR a permis de confirmer la présence
du
1o plasmide dans ces colonies (Figure 9). Environ un tiers des colonies
repiquées ont pu
ainsi être amplifiées et devaient donc contenir le vecteur pTOMp. La digestion
de ces
produits de PCR par EcoRI, dont le site de restriction a disparu avec
l'élimination du
fragment Ec1136II-SmaI, a permis de confirmer que les colonies repiquées
contenaient
bien le plasmide pTOMp et non le plasmide d'origine. Le séquençage des
produits de
PCR a permis de vérifier que les deux séquences étaient bien en phase l'une
avec
l'autre.
2- Clonage d'oligonucléotides codant pour des sites de clivage par la calpaïne
3 dans
le vecteur d'expression pTOM:
2o Pour faciliter le phénomène de FRET entre les deux protéines EYFP et ECFP,
des
acides aminés glycine et sérine ont été ajoutés de part et d'autre du site de
clivage de
façon à faciliter le rapprochement des deux . protéines, les glycines
facilitant la
souplesse de la protéine chimère et les sérines augmentant sa solublité dans
un milieu
aqueux (Figure 10). La séquence des oligonucléotides est telle qu'ils forment
des sites
de restriction pour BspEl et BamHI à chaque extrémité lorsqu'ils sont
appariés.
Les bases marquées en gras souligné dans les séquences des oligonucléotides
sont des
bases qui ne modifient pas la séquence protéique mais qui sont différentes de
la
séquence génomique. Ces bases ont été modifiées de façon à limiter la
formation de
duplex de primers homologues, qui pourrait entraver la formation
d'oligonucléotides
double-brin. La modification des bases a également été faite en fonction de la
fréquence d'utilisation des codons chez la souris.
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Les sites de restriction utilisés pour le clonage sont des sites uniques.
L'enzyme
BspEl est inactive si le site de clonage est méthylé. Le clonage du vecteur
pTOM
destiné à recevoir les oligonucléotides double-brin a donc été fait dans des
bactéries
dont le gène codant pour la méthylase Dam est muté. Après digestion du vecteur
par
5 les enzymes BspE 1 et BamHI, ligation des oligonucléotides et
électroporation,
certaines colonies résistantes sont prélevées. La présence du plasmide est
vérifiée par
PCR avec midECFP.m et un oligonucléotide spécifique du site de restriction
(figure 11 ).
Le séquençage sur certains clones positifs obtenus en PCR a permis de vérifier
la
o présence des inserts dans pTOM, que ces inserts étaient bien en phase avec
les
séquences codant pour les protéines ECFP et EYFP et qu'il ne comportaient pas
de
mutations. Trois colonies contenant les trois plasmides clonés sont
conservées. Les
trois plasmides correspondent aux trois fragments d'ADN insérés : les trois
sites de
clivage de la calpaïne 3 (plasmides pTOMsI, pTOMs2 et pTOMs3) (figurel3).
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BIBLIOGRAPHIE
Sorimachi, H., Ishiura, S., Suzuki, K. (1997). "Structure and physiological
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calpains." Biochemistry Journal 328: 721-732.
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CNRS
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BI
OLOGIQUE ET PEPTIDES POUR LA MISE EN OEUVRE DE LA DITE METHODE
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