Canadian Patents Database / Patent 2431399 Summary

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Claims and Abstract availability

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  • At the time the application is open to public inspection;
  • At the time of issue of the patent (grant).
(12) Patent: (11) CA 2431399
(54) English Title: METHOD FOR CHARACTERISING A SURFACE, AND DEVICE THEREFOR
(54) French Title: PROCEDE DE CARACTERISATION D'UNE SURFACE, ET DISPOSITIF POUR SA MISE EN OEUVRE
(51) International Patent Classification (IPC):
  • G01N 21/55 (2014.01)
  • G01N 21/77 (2006.01)
  • G01N 33/53 (2006.01)
  • G01N 33/543 (2006.01)
(72) Inventors :
  • GUEDON, PHILIPPE (France)
  • LEVY, YVES (France)
(73) Owners :
  • GENOPTICS (Not Available)
(71) Applicants :
  • INSTITUT D'OPTIQUE THEORIQUE ET APPLIQUEE (France)
(74) Agent: ROBIC
(74) Associate agent:
(45) Issued: 2009-04-28
(86) PCT Filing Date: 2001-12-13
(87) Open to Public Inspection: 2002-06-20
Examination requested: 2005-09-16
(30) Availability of licence: N/A
(30) Language of filing: French

(30) Application Priority Data:
Application No. Country/Territory Date
00/16247 France 2000-12-13
00/16248 France 2000-12-13

English Abstract

The invention concerns a method for characterising the surface of a sensitive layer deposited on the base of an optical prism, said surface comprising active zones whereof the optical thickness is capable of varying with time, said method using a technique based on analysis of the reflective variation of the prism-sensitive layer interface. The method consists in causing: a collimated light beam with an angle of incidence enabling total reflection on the prism base to penetrate into the prism, said beam illuminating a fixed part of the interface corresponding to the part to be characterised; scanning at an angle so as to locate an incidence whereon the reflectivity of the active zones is minimal; determining an angle of incidence optimal for sensitivity of detection of the active zones; adjusting the incidence to the optimal value; and measuring the reflectivity with an imaging system. The invention also concerns a device for implementing said method.


French Abstract




Procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible déposée sur la
base d'un prisme optique, ladite surface comportant des zones actives dont
l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ledit procédé
utilisant une technique fondée sur l'analyse de la variation de la
réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel on fait
entrer dans le prisme un faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence
permettant la réflexion totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant
une partie fixe de l'interface correspondant à une partie à caractériser, on
effectue un balayage en angle de façon à repérer une incidence pour laquelle
la réflectivité des zones actives est minimum, on détermine un angle
d'incidence optimal pour la sensibilité de détection des zones actives, on
règle l'incidence à la valeur optimale, et on mesure la réflectivité à l'aide
d'un système d'imagerie; et dispositif pour mettre en oeuvre ce procédé.


Note: Claims are shown in the official language in which they were submitted.


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REVENDICATIONS

1. Dispositif d'imagerie, permettant de mettre en oeuvre un
procédé de caractérisation de la surface d'une couche sensible, ladite surface
comportant des zones actives dont l'épaisseur optique est susceptible de
varier
avec le temps, ladite couche sensible étant déposée sur la base d'un prisme
optique, ledit procédé utilisant une technique fondée sur l'analyse de la
variation
de la réflectivité de l'interface prisme - couche sensible, dans lequel:
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un
faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion
totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de
l'interface
correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite
surface,
et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la face de sortie
du
prisme,
b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en
faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une
incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la
totalité, des
zones actives, est minimum,
c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la
sensibilité de détection des zones actives est maximale,
d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à
l'étape précédente,
e) et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie
et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du
faisceau
émergent provenant de la partie utile,
le dispositif comprenant:
- un prisme (14) optique ayant une face d'entrée, une face de sortie et
une base munie d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son
angle au sommet et par l'indice de réfraction du matériau qui le constitue,
- un premier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté


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de la face d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au
prisme,
est orienté de façon qu'un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant
traversé
se dirige vers ladite face d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme
où il
subit une réflexion totale et ressort après réfraction sur la face de sortie
en
formant un faisceau émergent, ledit premier système de conjugaison ayant une
orientation et une ouverture telles que ledit faisceau incident réfracté sur
la face
d'entrée vienne éclairer la totalité d'au moins une partie dite utile de
ladite
couche sensible, et y subir une réflexion totale lorsque la direction du
faisceau
incident varie, de part et d'autre dudit axe optique, sur une plage angulaire
d'au
moins 100 au total, ladite partie utile contenant des zones actives dont
l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps,
- un second système afocal de conjugaison optique (15) disposé du
côté de la face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au
prisme, est orienté de façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique
du
premier système de conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe
optique du second système de conjugaison,
- un système de détection ayant une surface sensible plane qui est
apte à recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système
de
conjugaison, et qui est perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci,
dans lequel:
(i) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle
qu'il est traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile
lorsque la
direction du faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second
système de conjugaison est tel que la totalité de la lumière provenant de la
zone
utile éclaire la surface sensible du système de détection, et
(ii) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque
la direction du faisceau incident est parallèle à l'axe optique du premier
système
de conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de
sortie
du prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est
perpendiculaire à l'axe optique de celui-ci.



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2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel, l'angle au
sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la direction du faisceau
incident varie sur ladite plage angulaire, le débattement angulaire de l'image

intermédiaire de la zone utile formée à travers la face de sortie ne dépasse
pas
les limites de la profondeur de champ du second système de conjugaison.

3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2,
dans lequel ladite plage angulaire est d'au moins 12°, ou d'au moins
14°, ou
d'au moins 16°.

4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 3,
dans lequel le grandissement du second système de conjugaison est tel que la
totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la totalité de la
surface
sensible du système de détection.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4,
dans lequel ledit second système afocal comprend un premier système
dioptrique, par lequel le faisceau émergent entre, et un second système
dioptrique par lequel la lumière ressort pour se diriger vers la surface
sensible
du système de détection, et dans lequel ladite image intermédiaire à travers
la
face de sortie du prisme est dans le plan objet dudit premier système
dioptrique.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,
dans lequel ledit système optique déflecteur comprend un miroir plan tournant
(7) apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisme, ledit
miroir
étant le seul élément mobile du dispositif.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6,
dans lequel le dispositif de détection est apte à analyser la lumière de façon
à
mesurer et/ou comparer la réflectivité de toute région ponctuelle de la partie

utile.



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8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7,
dans lequel le dispositif de détection comprend une matrice CCD ou C-MOS.

9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8,
dans lequel la couche mince métallique comporte, sur les zones actives, au
moins une population de ligands immobilisés.

Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.


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Procédé de caractérisation d'une surface, et dispositif pour sa mise en oruvre
La présente invention se rapporte à un procédé de caractérisation d'une
surface, et à un dispositif permettant de mettre en oeuvre ce procédé. Ce
procédé permet
notamment une mesure qualitative et/ou quantitative d'interactions qui peuvent
être
physiques, chimiques, biochimiques ou biologiques.
La plupart des procédés existants, dans ce domaine, utilisent des marqueurs
fluorescents pour révéler les interactions moléculaires et nécessitent de
travailler dans
des conditions spécifiques. Ces conditions spécifiques ne permettent pas
d'analyser
plusieurs types d'interaction simultanément. Au contraire, le procédé de
l'invention
permet notamment de suivre en temps réel, et sans marqueurs, jusqu'à plusieurs
centaines d'interactions moléculaires, à la fois qualitativement et
quantitativement.
Le procédé de l'invention permet la caractérisation de la surface d'une
couche sensible, déposée sur la base d'un prisme optique, selon une technique
fondée
sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme -
couche sensible.
Cette réflectivité est susceptible de varier avec-l'angle d'incidence d'un
faisceau
lumineux se dirigeant dans le prisme vers une partie de l'interface
correspondant à une
partie à caractériser de ladite surface. Cette réflectivité varie également en
fonction de
l'épaisseur optique de la couche sensible, de sorte que le procédé de
l'invention permet
notamment de caractériser l'évolution de zones de la couche sensible dont
l'épaisseur
optique est susceptible de varier avec le temps. La partie de l'interface
correspondant à la partie à caractériser est bien entendu la partie qui est
en regard de
la partie de la surface à caractériser.
Le procédé de l'invention peut être utilisé notamment soit dans les
techniques fondées sur la résonance des plasmons de surface, soit dans les
techniques
fondées sur l'interférométrie et utilisant le couplage entre un prisme et un
guide
d'ondes.
L'invention a notamment pour objet un procédé de caractérisation de la
surface d'une couche sensible, ladite surface comportant des zones actives
dont
l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps, ladite couche
sensible étant
déposée sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique
fondée
sur l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme -
couche sensible,
dans lequel :
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un faisceau lumineux


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collirnaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion totale sur la
base du prisme,
ledit faisceau éclairant une partie fixe de l'interface correspondant à une
partie à
caractériser, appelée partie utile, de ladite surface, et le faisceau réfléchi
ressortant en
faisceau émergent par la face de sortie du prisme,
b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en faisant varier
l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une incidence pour
laquelle la
réflectivité d'au moins ime partie, ou de la totalité, des zones actives, 'est
niinimum,
c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la sensibilité de
détection des zones actives est maximale,
d) on règle l'incidence à la valeur optimale détenninée à l'étape
précédente,
et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'irnagerie et de détection
ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du faisceau émergent
provenant de
la partie utile.
Un faisceau collimaté est un faisceau dont tous les rayons sont parallèles.
Le prisme est utilisé, dans le procédé et le dispositif de l'invention, conune
un prisme de couplage, qui utilise le phénomène de réflexion totale sur une
interface.
La surface à caractériser de la couche sensible est celle de la face externe
de
la couche sensible, en contact avec le milieu extérieur.
En pratique, la couche mince sensible peut être déposée soit sur la base du
prisme, soit sur une lame transparente plane à faces parallèles, ayant le même
indice ou
un indice voisin de celui du prisme, et fixée, ou apte à être fixée, sur la
base du prisme,
avec la couche sensible déposée sur la face externe, qui n'est pas en contact
avec la base
du prisme. Cette face externe peut être considérée comme la véritable base du
prisme
dans un tel cas, lorsqu'elle est fixée au prisme.
La couche sensible peut être une couche mi.nce métallique, et dans ce cas le
procédé de l'invention utilise le phénomène de résonance des plasmons de
surface.
Parmi les métaux utilisés, on peut citer notarnment l'or et l'argent. On peut
utiliser tine
couche mince métallique intermédiaire, par exemple de chrome, pour améliorer
l'accrochage de la couche d'or sur le verre du prisme. On peut aussi déposer
sur le
prisme une couche d'argent elle-même recouverte d'une couche d'or, ce qui
permet. de
protéger l'argent contre I'oxydation.

La couche sensible métallique peut être déposée sur la base du prisme, ou


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sur une couche mince, déposée sur la base du prisme, d'un diélectrique de
fàible indice
(indice égal ou voisin de celui du prisine).

La couche sensible peut aussi être une couche mince, traiisparente, d'un
diélectrique d'indice élevé capable de servir de guide d'onde. Dans ce cas, on
dépose
stir la base du prisme deux couches minces de diélectriques, d'abord une
couche mince
(par exemple de silice) servant de milieu espaceur, d'iiidice intermédiaire
entre celui du
prisme et celui de la couche guidante, puis la couche guidante, d'indice
élevé. La
couche guidante peur être réalisée par exemple avec des oxydes de titane ou
d'osmium,
stoechiométriques ou non stoecliiométriques. La couche guidante peut elle-même
être
recouverte d'une couche mince métalliqùe.
Lorsque la couche sensible est une couche de diélectrique seivant de guide
d'onde, le procédé de l'invention permet notamment d'utiliser le guide d'onde
comme
un système à miroir résonant qui, nécessite une source lumineuse cohérente. Le
principe
et les applications du miroir résonant sont connus ; voir pâr exemple R. Cush
et al.,
Biosensors & Bioelectronics 8, 347-353 (1993) ; P. E. Buckle et al.,
Biosensors &
Bioelectronics 8, 355-363 (1993) ; S. F Bier, Sensors & Actuators B, 29, 37-50
(1995) ;
C. Stamm et al., Sensors & Actuators B, 31, 203-207 (1996) ; A. Bernard et
al., Eur. J.
Biochem., 230, 416-423 (1995).

Les couches minces utilisées dans la mise en ceuvre du procédé de
l'invention peuvent être déposées selon les méthodes connues, par exemple par
évaporation sous vide, pulvérisation cathodique, CVD, MOCVD, etc.
Dans. ce qui sûit, on fera le plus souvent référence au phénomène de
résonance des plasmons de surface, pour simplifier la description, mais les
spécialistes
comprendront aisément que le prôcédé de l'invention peut s'appliquer sans
difficultés à
un dispositif utilisant un système à miroir résonant.
Conune indiqué ci-dessus, le procédé de l'invention peut être utilisé
notamment en exploitant le phénomène connu de résonance des plasmons de
surface
(RPS). Ce phénomène est observé lorsqu'tu-- faisceau lumineux subit une
réflexion à
l'interface verre-métal d'tme couche m.i.ncé métallique, déposée stir la base
du prisme.
Lorsqu'un ligand pour un analyte d'intérêt est fixé sur la face externe 'de la
couclte
métallique, et lorsque la couche métallique est nlise en contact avec un
milieu, liquide


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ou gazeux, susceptible de contenir l'analyte, celui-ci, s'il est présent, va
se fixer, par
affinité, sur le ligand et il en résulte une modification de l'épaisseur des
couches
nloléculaires fixées sur la surface nzétallique, et donc de l'épaisseur
optique, ce qui se
traduit, notanunent en raison du phénomène RPS, par une variation de la
réflectivité de
l'interface.
Le phénomène optique de résonance des plasmons de surface a été
découyert il y a une trentaine d'année (E. KRETSCFFVIANN & H. RAETHER ;
Z.Natiirfor=sclT., 23a (1968), 615-617) et a été utilisé en premier lieu pour
la
caractérisation quantitative de couches minces non-organiques (W. P. CHEN & J.
M.
CHEN, J.Opt.Soc.Anz, 71 (1981), 189-191). Le principe optique repose sur
l'accès à la
variation de l'épaisseur optique (produit de l'indice de réfraction par
l'épaisseur
géométrique) via la mesure de la variation de réflectivité sur une interface
métaltdiélectrique engendrée par la fixation de matière sur la face externe
d'une couche
métallique. Depuis les années 80, le phénomène de résonance des plasmons de
surface
est utilisé dans les applications biologiques, notanunent dans la
caractérisation
quantitative d'interactions biologiques. Ainsi, il est possible, au travers de
la
connaissance de la variation d'indice de réfraction, de remonter jusqu'au
nombre de
molécules biologiques ayant interagi (J. A. DE FEIJTER et al., Biopolytners,
17 (1978),
1759-1772; A. BERNARD et al., Eur. J Biochem. , 230 (1995), 416-423; J.
PIEHLER et al., J. of Immzinol. hlethods, 201 (1997), 199-206 ; P. GUEDON et
al.,
Anal. Chem., (2000) 6003-6009), à leur concentration ainsi qu'aux cinétiques
en temps
réel caractérisant l'interaction d'analytes avec des ligands préalablement
immobilisés
sur une couche mince métallique.
Un intérêt du procédé et du dispositif de l'invention réside dans le fai:t
qu'il
est possible de déposer localement des ligands différents, de façon régulière,
sur.la
couche sensible, selon un système ordonné (par exemple, matriciel ou bien
hexagonal)
dans lequel chaque dépôt cantonné sur une faible surface, ou spot, est
repérable
spatialement (ligands dits adressés ).
On sait que la variation de la réflectivité liée au phénomène de RPS dépend
de l'angle d'incidence du faisceau lum.ineux subissant la réflexion totale. Le
phénomène
de réfleYion totale sur une interface a lieu lorsqu'une onde lumineuse
traversant un
milieu d'indice de réfraction ni rencontre un milieu d'indice de réfraction n--
)
(avec n2 < nl) avec une incidence a telle que a> cx,~ =


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Arcsin(n2/ni). Lorsque l'épaisseur de la couche sensible augmente (notamment
lorsqu'un analyte vient se fixer sur des ligands immobilisés sur la couche
métallique),
l'intensité de la lumière réfléchie décroît, puis passe par un minimum, puis
croît à
nouveau, ce phénomène étant observé pour une variation de l'angle d'incidence
de
5 plusieurs degrés. Il est donc souhaitable de repérer, préalablement à la
mise en contact
avec l'analyte, l'angle d'incidence pour lequel l'intensité de la liunière
réfléchie est
minimum sur les spots, ce qui se traduit par un contraste notable entre les
spots et les
zones nues du substrat. La connaissance précise de cet angle pour chaque spot
permet la
caractérisation de leur état de surface. Il en résulte que, en fonction de la
masse molaire
de l'analyte ou des analytes, on peut déterminer un angle optimisant la
sensibilité de
détection pour chaque spot sur lequel un analyte s'est fixé (ou s'est fixé en
plus grande
quantité).
Lorsque l'épaisseur optique de la couche sensible augmente, par exemple
lorsqu'un analyte vient se fixer sur les spots contenant des ligands
immobilisés, cela
provoque un déplacement du pic de résonance (minimum de réflectivité) vers les
angles
d'incidence externe décroissants (on appelle ici angle d'incidence externe
l'angle
d'incidence du faisceau lumineux dans le milieu extérieur, avant l'entrée dans
le
prisme). En choisissant un angle d'incidence externe voisin de l'angle
d'incidence
initial du pic, mais légèrement supérieur (correspondant à une réflectivité
proche du
minimum), ce déplacement du pic va entraîner, pour l'angle d'incidence ainsi
choisi,
une augmentation de la réflectivité, ce qui se traduira sur l'image par
l'apparition d'une
tache plus lumineuse (ou par la variation du niveau de gris vers les gris plus
clairs)
tandis que les spots dont l'épaisseur optique n'a pas varié resteront sombres.
On peut
donc aisément déterminer l'angle d'incidence optimal utilisé conformément au
procédé
de l'invention, pour lequel la sensibilité de détection est maximale pour
l'ensemble des
spots dont l'épaisseur optique est susceptible de varier. En effet, à l'état
initial, ces spots
ont la plupart du temps des pics de résonance très voisins. En outre, comme le
balayage
angulaire a permis de repérer avec précision l'angle d'incidence du pic de
résonance
.pour chaque spot, à l'état initial, il est possible de déterminer, pour
chaque spot, par des
moyens informatiques, la valeur exacte du déplacement du pic pôur ce spot, et
donc de
normaliser les résultats recueillis par le détecteur du système d'imagerie qui
détecte le
flux de photons provenant de chacun des spots.
Dans des modes de réalisation particuliers, le procédé de l'invention peut


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encore présenter les caractéristiques décrites, prises isolément ou, le cas
échéant, en combinaison.

Pour pouvoir caractériser l'évolution des zones actives de la partie utile, on
mesure la réflectivité en fonction du temps, soit de façon continue, soit à
des intervalles
prédétemiinés.

La variation de réflectivité est proportionnelle au nombre de molécules qui
se fixent sur les plots, cette fixation correspondant à une augmentation de
l'épaisseur
sur le plot considéré.

On peut fixer sur la partie utile de la couche sensible, par exemple
- des antigènes (pour la recherche d'anticorps spécifiques),
- des peptides aléatoires, pour la recherche de mimotopes spécifiques d'un
anticorps donné,
- des anticorps anti-tumeurs, pour la recherche d'antigènes tumoraux dans
des broyats de cellule,
- tous les ligands spécifiques de cellules particulières, pour le tri
cellulaire.
Le procédé de l'invention peut également être utilisé pour étudier toutes
interactions entre les molécules immobilisées et les analytes, y compris des
cellules.
On peut également utiliser le procédé de l'invention pour le criblage de
petites molécules qu'on irninobilise sur la couche active (par exemple des
oligosaccharides) pouvant inbiber le rôle signalétique ou enzymatique d'une
protéine
(l'analyte est alors la protéine). On sélectionne les petites molécules par
l'affnlité
biologique ou biochimique pour des protéines ou des cellules.
L'invention a également pour objet un dispositif d'imagerie permettant de
mettre en oruvre le procédé de l'invention. Ce dispositif peut être utilisé
notamment
pour l'imagerie de la surfâce d'une couche sensible portant de multiples
capteurs
organiques, c'est-à-dire une surface sur laquelle irnmobilisées une ou
plusieurs
populations de ligands. Ces capteurs peuvent être déposés sur la couche
sensible sous la
forme de plots (ou spots) formant une matrice de ligands adressés. Ces spots
peuvent
être formés soit par dépôts sur la surface de la couche sensible, soit par
remplissage de
puits réalisés sur la surface de la couche seiisible (par exemple par abrasion
laser).

Le dispositif de l'invention comprend un dispositif d'imagerie, permettant


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de mettre en oeuvre un procédé de caractérisation de la surface d'une couche
sensible, ladite surface comportant des zones actives dont l'épaisseur optique
est susceptible de varier avec le temps, ladite couche sensible étant déposée
sur la base d'un prisme optique, ledit procédé utilisant une technique fondée
sur
l'analyse de la variation de la réflectivité de l'interface prisme - couche
sensible,
dans lequel:
a) on fait entrer dans le prisme, par une face d'entrée, un
faisceau lumineux collimaté avec un angle d'incidence permettant la réflexion
totale sur la base du prisme, ledit faisceau éclairant une partie fixe de
l'interface
correspondant à une partie à caractériser, appelée partie utile, de ladite
surface,
et le faisceau réfléchi ressortant en faisceau émergent par la face de sortie
du
prisme,
b) on effectue un balayage en angle de la partie utile, en
faisant varier l'angle d'incidence dudit faisceau, de façon à repérer une
incidence pour laquelle la réflectivité d'au moins une partie, ou de la
totalité, des
zones actives, est minimum,
c) on détermine un angle d'incidence optimal, pour lequel la
sensibilité de détection des zones actives est maximale,
d) on règle l'incidence à la valeur optimale déterminée à
l'étape précédente,
e) et on mesure la réflectivité à l'aide d'un système d'imagerie
et de détection ayant une surface sensible apte à recevoir la totalité du
faisceau
émergent provenant de la partie utile,
le dispositif comprenant:


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- un prisme optique ayant une face d'entrée, tme face de sortie et une base
munie
d'une couche sensible, ledit prisme étant caractérisé par son angle au sommet
et par
l'indice de réfraction du matériau qui le constitue,

- un preinier système afocal de conjugaison optique, disposé du côté de la
face
d'entrée du prisme, et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme, est
orienté de façon
qû un faisceau lumineux incident collimaté l'ayant traversé se dirige vers
ladite face
d'entrée, se réfracte puis frappe la base du prisme où il subit une réflexion
totale et
ressort après réfraction sur la face de sortie en fonnant un faisceau
émergent, ledit
premier système de conjugaison ayant une orientation et une ouverture telles
que ledit
faisceau incident réfracté sur la face d'entrée vienne éclairer la totalité
d'au moins une
partie dite utile de ladite couche sensible, et y subir tme réflexion totale
lorsque la
direction du faisceau incident varie, de part et d'autre dudit axe optique,
sur une plage
angulaire d'au moins 10 au total, ladite partie utile contenant des zones
actives dont
l'épaisseur optique est susceptible de varier avec le temps,
- un second système afocal de conjugaison optique disposé du côté de la
face de sortie du prisme et dont l'axe optique, fixe par rapport au prisme,
est orienté de
façon qu'un faisceau incident parallèle à l'axe optique du premier système de
conjugaison donne un faisceau émergent parallèle à l'axe optique du second
système de
conjugaison,
- un système de détection ayant une surface sensible plane qui est apte à
recevoir et à analyser la lumière ayant traversé ledit second système de
conjugaison, et
qui est perpendiculaire à l'axe optique de ceiui-ci,

dans lequel :
(i) ledit second système de conjugaison a une ouverture telle qu'il est
traversé par la totalité de la lumière provenant de la zone utile lorsque la
direction du
faisceau incident varie sur ladite plage angulaire, et le second système de
conjugaison
est tel que la totalité de la lumière provenant de la zone utile éclaire la
surface sensible
du sy~tème de détection, et
(ii) l'angle au sommet et l'indice du prisme sont tels que lorsque la
direction du faisceaû incident est parallèle à l'axe optique du premier
système de
conjugaison, l'image intermédiaire de la partie utile, à travers la face de
sortie du
prisme, qui constitue l'objet pour le second système de détection, est
perpendiculaire à


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ô
l'axe optique de celui-ci.
Le balayage angulaire qu'il faut effectuer pour pouvoir observer la
résonaiice en divers points de la zone active, et son déplacement lors de
l'évolution du
système dans le tenips, varie en fonction notanu-nent du métal, du verre, de
la longueur
d'onde, etc. Il est généraleinent d'au moins 10 environ.
L'étude de la réflectivité, en fonction de l'angle d'incidence externe, d'une
interface métal-diélectrique, nécessite un balayage angulaire généralement
compris
entre 4 et 10 degrés, environ, suivant la Iongueur d'onde utilisée et la
nature du
diélectrique et du métal. Par exemple, avec une interface verre-métal à la
base d'un
prisme d'angle au soinmet 30,6 degrés, d'indice 1,776 et d'une couche mince
d'or de 45
nm d'épaisseur, et une source lumineuse de longueur d'onde 660 nm, il faut,
pour
décrire totalement la résonance des plasmons de surface, balayer une plage de
8 degrés
environ.
En outre, dans le cas où la couche mince métallique est munie d'une
pluralité de plots constitués, par exémple, de polymères portant des espèces
biologiques
immobilisées, la résonance pour l'or est brisée, sur toutes les parties de la
couche
sensible portant un plot, et la résonance se décale alors vers les angles
d'incidence
.e;cternes décroissants. Par exemple, pour un plot de 3 nm d'épaisseur et
d'indice 1,7 à
660 nm, la résonance se décale de 2 degrés environ. Si on met alors en contact
la couche
sensible avec un fluide contenant des analytes capables d'interagir avec les
espèces
biologiques immobilisées sur les plots, on observera un nouveau décalage de la
résonance pouvant aller jusqu'à 4 degrés environ.
La somme des étendues angulaire.s à parcourir si l'on veut observer les
résonances de l'or, des plots de polymères portant des espèces biologiques, et
de
certains de ces plots après qu'ils ont interagi avec les analytes, nécessite
alors un
balayage anb ilaire total de 14 degrés. Il est souhaitë de pouvoir utiliser un
balayage
angulaire de 16 degrés, afm de pouvoir travailler avec un certain confort et
de pouvoir
modifier à loisir les matériaux précités, notamment en termes d'indice et
d'épaisseur.
Dans certaines applications et avec certains matériaux et certaines longueurs
d'onde, la
possibilité d'utiliser un balayage angulaire de 10 peut suffire. Mais.lé
dispositif de
l'invention permet d'utiliser un balayage angulaire pouvant aller jusqu'à 16 .
La source lumineuse est une source cohérente ou nôn 'cohérente. Elle est
nécessairement côhérente datls le cas d'un dispositif à guide d'onde.


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9
Le système de collimation peut être tout système optique classique
permettant de transformer un faisceau luniine x divergent en faisceau
parallèle.
Le système optique déflecteur comprend par exemple un miroir plan
totnnant, qui peut être monté sur tm moteur pas-à-pas ou un moteur à courant
continu.
On peut également utiliser un miroir de type galvanométrique. On sait que
lorsqu'un

miroir tournant tourne d'un angle donné, le rayon réfléchi issu d'un rayon
incident fixe
est dévié d'un angle double dudit angle donné. Le miroir plan tournant peut
être
notan7ment apte à pivoter autour d'un axe parallèle à une arête du prisnie. On
appelle
arête du prisme la droite d'intersection des deux plans contenant
respectivement les
faces d'entrée et de sortie du prisme.
Le dispositif de l'invention peut comprendre un système polarisant, disposé
par exemple entre le système de collimation et le miroir tournant, et
permettant de
polariser la lumière parallèlement à l'arête du prisme. Le système polarisant
est par
exemple composé d'un simple polariseur ou d'un cube séparateur de
polarisation. Dans
le cas du système à miroir résonant, un second polariseur est bien entendu
nécessaire à
la suite du prisme.
Dans des modes de réalisation particuliers, le dispositif de l'invention peut
encore présenter les caractéristiques décrites, prises isolément ou,
lecas échéant, en combinaison.

Dans la présente invention, on désigne par système dioptriqûe une
lentille ou un doublet.
Le dispositif de l'invention permet d'effectuer la détection au meilleur
angle d'incidence de la variation d'épaisseur optique (produit de l'épaisseur
géométrique par l'indice de réfraction du matériau) sur l'interface métal-
milieu
extérietu, sans avoir à modifier la position des éléments du dispositif qui
sont tous fixes
les uns par rapport aux autres, à l'exception du miroir tournant. Il est ainsi
très facile de
faire varier l'angle d'incidence lors d'une étude préliminaire, en actionnant
le seul miroir
tournant, pour déterminer pour chaque angle d'incidence la réflectivité de la
zone
sensible, et on peut ensuite effectuer les mesures proprenient dites en
immobilisant le

miroir tournant sur la - position correspondant à cet angle d'incidence
optimal
prédéterminé.
En effet, selon un mode de réalisation particulier, le dispositif optique
d'imagerie de l'invention est tel que l'image de la zone utile de la couche
mince


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métallique occupe une surface maximale de la matrice de détection CCD, de
sorte que
c'est l'enseinble de la surface de la zone utile de la couche métallique qui
peut être
analysée simultanément grâce à la matrice CCD.

Une caractéristique importante pour que le dispositif de détection puisse
5 recevoir tous les rayons lumineux provenant de l'image de la surface utile
de la couche
mince métallique, bien que le système d'imagerie et le système de détection
soient fixes
par rapport au prisme, est que le dispositif de l'invention comprend un
système de
conjugaison optique tel que le faisceau qui, après entrée dans le prisme,
vient frapper la
couche inince métallique, éclaire la totalité de la surface utile de la
matrice CCD, et cela
10 quel que soit l'angle d'incidence dudit faisceau sur ladite plage angulaire
pouvant
atteindre jusqu'au moins 16 environ. Un tel système de conjugaison optique
peut être
mis au point, par exemple, de façon connue, en utilisant un dispositif dont le
nombre
d'ouverture, c'est-à-dire le rapport de la focale sur le diamètre utile de
l'optique, est
inférieur à N= 1/(2*sin(16 /2)) = 3,6 pour accepter tous les faisceaux
réfléchis par la
zone sensible sur la plage angulaire d'au moins 16 . Le système de conjugaison
peut
par exemple être constitué d'une première lentille de focale 80 mm et de
diamètre 31,5
mm et d'ime deuxième lentille de focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble
présentant une ouverture de 2,6), lesdites lentilles étant disposées de telle
façon que
l'image de la partie utile par la face de sortie du prisme soit à peu près
dans le plan focal
objet de la première lentille, que le plan focal image de la première lentille
soit
confondu avec le plan focai_ objet de la deuxième lentille et enfin que la
matrice CCD se
situe dans le plan focal image de la deuxième lentille ; de cette manière, on
a constitué
un dispositif afocal qui conjugue. On peut aussi par exemple utiliser une
troisième
lentille, com.mt.mément appelée "lentille de champ" qui permet de ramener les
faisceauY
vers l'axe optique, augmentant ainsi l'ouverture du système par rapport à tm
système
afocal à deux lentilles (voir M. BORN & E. WOLF, Principles of Optics, Chapter
VI,
Pergamon Press, 1959).
Une autre caractéristique importante d'un mode de réalisation particulier du
dispositif de l'invention, qui pennet une analyse de chaque spot de la partie
utile avec
une sensibilité satisfaisante, est que l'angle au sommet et l'indice du prisme
sont choisis
de façon que l'image intermédiaire de la zone utile formée dans le prisme
(c'est-à-dire
l'iinage de la surface utile à travers le dioptre plan formé par la face de
sortie du prisme,
et qui constitue l'objet pour le système optique d'imagerie recevant le
faisceau


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émergent) fournit dans le système optique d'imagerie une image coïncidant avec
le plan
focal du système de détection (matrice CCD), ou une image très voisine de ce
plan et
parallèle à celui-ci, ou ayant par rapport à ce plan une inclinaison
suffisamment faible
pour éviter, sur la totalité de la surface, le flou de l'image.
On sait que tout système optique d'imagerie présente une certaine
profondeur de champ, c'est-à-dire une plage longitudinale, suivant l'axe
optique défini
par le détecteur (cet axe optique étant perpendiculaire au plan du détecteur)
pour
laquelle l'image apparaîtra nette sur le détecteur. La profondeur de champ
dépend
directement de la focale du système optique et de son ouverture. Ainsi, pour
une focale
donnée, la profondeur de champ augmente avec le nombre d'ouverture (rapport de
la
focale au diamètre d'une optique). Mais il faut par ailleurs que le nombre
d'ouverture
soit le plus faible possible pour laisser passer un maximum de rayons à
travers le
système, et permettre ainsi une acceptance angulaire importante. Ces deux
conditions
étant contradictoires, il est nécessaire de trouver un compromis.
Pour obtenir une image nette sur le détecteur, il faut que l'inclinaison de
l'image de la zone utile par la face de sortie du prisme par rapport à un plan
perpendiculaire à l'axe optique soit suffisamment faible pour qu'il ne soit
pas en dehors
de la profondeur de champ définie par le système de détection. Or,
l'inclinaison du
faisceau incident dans ce système rend nécessaire un redressement de l'image
par un
dispositif optique approprié, ce qui peut se réaliser soit en inclinant
l'optique du
système d'imagerie, soit en inclinant le système de détection (caméra CCD)
afin d'avoir
l'image de toute la surface nette sur le détecteur CCD.
Le problème de l'inclinaison de l'optique implique que ladite optique soit
très ouverte pour laisser passer tous les rayons à travers cette optique, car
les angles mis
en jeu peuvent être relativement importants ; par exemple, pour un prisme
isocèle
d'indice 1,515 et d'angle au sommet 60 , cela impose un nombre d'ouverture du
système de détection de 0,55, ce qui est rédhibitoire car un tel système
présente
beaucoup d'aberrations et une profondeur de champ très faible. De manière
similaire,
l'inclinaison de la caméra engendrerait une perte de netteté due au fait que
le système ne
travaillerait plus dans de bonnes conditions d'imagerie, car on ne peut plus
parler alors
d' aplanétisme.
L'originalité du prisme et des optiques utilisés dans un mode de réalisation
du dispositif de la présente demande - réside dans le fait que, quel que soit
l'angle


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d'incidence du faisceau au niveau de l'interface prisme/couche sensible (dans
les limites
de variation indiquées pour l'angle d'incidence sur la face d'entrée du
prisme),
l'inclinaison de l'image intermédiaire par la face de sortie du prisme varie
peu et reste
quasiment perpendiculaire à l'axe optique du système de détection. Ainsi, un
rayon
totalement réfléchi partant du centre de la zone utile présentera à la sortie
du prisme un
angle faible par rapport à l'axe optique du système d'imagerie, tandis que le
point image
correspondant sur le détecteur restera à peu près dans les limites de la
profondeur de
champ définie par ce système.
Un intérêt majeur du dispositif de l'invention est que la totalité des
éléments
optiques sont fixes (à l'exception du miroir tournant) et les optiques sont
peu ouvertes
(elles présentent de ce fait moins d'aberrations et autorisent une profondeur
de champ
importante), et cela sans altérer les performances de mise au point et
d'acceptance
angulaire, pouvant aller notamment jusqu'à 16 , du système.
D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la
description suivante en référence aux dessins annexés donnés à titre d'exemple
non
limitatif, dans lesquels :
- la figure 1 représente un schéma du dispositif selon l'invention,
- la figure 2 représente un schéma de la cellule de réaction selon
l'invention.
Le dispositif selon l'invention comprend :
-- une source lumineuse 1,
- un premier système de collimation 2 du faisceau lumineux incident émis
par la source lumineuse,
- une cellule de réaction 3 comprenant au moins un prisme 4,
- un système d'imagerie et de détection 5 du faisceau réfléchi par la base
du prisme.
La source lumineuse 1, non cohérente, est par exemple une diode
électroluminescente de largeur spectrale étroite. Il peut s'agir par exemple
d'une diode
électroluminescente de longueur d'onde 660 nanomètres et de largeur spectrale
30
nanomètres.
Le faisceau émis par la source lumineuse 1 est collimaté par un système de
collimation 2. Ce système de collimation 2 est par exemple un système de deux
objectifs de microscope permettant de rendre le faisceau lumineux parallèle.


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La lumière est ensuite polarisée par un polarisateur 6 afin de pouvoir exciter
le plasmon de surface.
Cette lumière polarisée éclaire la face d'entrée d'un prisme en verre 4 de la
cellule de réaction 3.
Dans un mode de réalisation, la lumière polarisée est réfléchie par un miroir
galvanométrique oscillant 7 vers la face d'entrée du prisme 4 tel que
représenté sur la
figure 1. Le miroir oscillant 7 est conjugué sur la base du prisme à l'aide de
deux
lentilles 8 et 9. On peut ainsi faire varier l'angle d'incidence du faisceau
sur le prisme
par la rotation du miroir oscillant 7 autour d'un axe 7a perpendiculaire au
plan du
dessin. Le miroir oscillant 7 subit une rotation partielle, contrôlée par
exemple par un
générateur basse fréquence.
Le mouvement de rotation du dispositif de rotation du miroir oscillant 7
peut être discrétisé à l'aide d'une composante continue afin de pouvoir fixer
l'angle
auquel on souhaite réaliser les expériences.
Le diamètre du miroir 7 est tel qu'il permet de réfléchir la totalité du
faisceau incident sur le prisme 4.
Dans le mode de réalisation considéré, le diamètre est au moins de 10 mm.
La course totale du miroir 7 est de 16 pour une fréquence de 300 mégahertz.
Lors de sa
rotation, le miroir oscillant 7 a une course continue à fréquence fixe.
Les lentilles 8, 9 u:tilisées pour conjuguer le miroir 7 avec le prisme 4
peuvent être par exemple des lentilles de focale F' = 75 mm avec un diamètre
de 35 mm
pour une excursion de 19 , ou des lentilles de focale F' = 50 mm avec un
diamètre de 25
mm pour une excursion de 17 .
Dans la figure 1, on a représenté en traits pleins les limites du faisceau
lumineux pour la position du miroir 7 représentée, et en traits interrompus
les limites
extrêmes de ce faisceau lorsque le miroir 7 occupe les positions extrêmes de
sa course
angulaire.
L'angle d'incidence du faisceau réfléchi par le miroir 7 sur le prisme 4 peut
être déterminé de deux manières différentes.
Dans un premier mode de réalisation, la partie du faisceau réfléchie par la
face d'entrée du prisme est recueillie par une barrette de circuits à couplage
de châ.rge
CCD 10 de longueur suffisante.
Cette barrette CCD 10 permet de détecter l'incidence du faisceau.


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14
Le faisceau ainsi réfléchi par la face d'entrée du prisme est focalisé stir la
barrette CCD 10 à l'aide d'une lentille 11 dont la focale est choisie de façon
à utiliser
toute la surface de la barrette 10.
Pour tme barrette CCD 10 de longueur L= 12,7 mm coniposée de 512
pixels, on peut par exemple utiliser une lentille 11 de focale F' = 48 nun et
de diamètre
30mm.
Dans un autre mode de réalisation, non représenté, la rotation du miroir
oscillant 7 est assurée par un moteur permettant de déterminer la position
d'incidence
pour chaque position du miroir. On peut par exemple utiliser un moteur à pas
variable.
La cellule de réaction 3 comprend au moins un prisme 4 en verre dont la
géonlétrie et l'indice sont tels que l'image intermédiaire du plan objet dans
le prisme 4
est quasiment parallèle au plan de détection du système d'imagerie et de
détection 5.
Dans un mode de réalisation, le prisme est en verre d'indice 1,8 et a pour
caractéristique un angle au sommet de 40 , une base de 10 mm de largeur et 25
mm de
hauteur. La distance entre les deux faces parallèles du prisme est de 8 mm.
Une lame de verre 12 de même indice que le prisme 4 est fixée sur la
base du prisme au moyen d'une huile d'adaptation d'indice.
Sur cette lame de verre 12, sont déposées successivement une couche mince
de chrome 13, une couche mince d'or 14, et une couche à caractériser 15.
La couche de chrome 13 permét d'assurer l'adhésion de la couche d'or 14
sur la lame de verre 12 en présence d'un milieu aqueux. L'épaisseur de la
couche mince
de chrome 13 est comprise par exemple entre 1,5 et 2 nanomètres.
L'épaisseur de la couche mince d'or 14 est par exemple comprise entre 40 et
50 nanomètres et de préférence de l'ordre de 45 nanomètres.
Potir une application à une mesure qualitative et quantitative d'interactions
moléculaires, la couche à caractériser est, par exemple, une couche organique
15.
La couche organique 15 peut être déposée sous forme d'une couche
continue ou sous forme de spots ou plots, comme indiqué ci-dessus. Dans le cas
d'une
couche continue, contenant tme seule sorte de ligand (par exemple un
anticorps), il

convient de déposer ponctuellement des solutions d'analytes (par exemple
peptides pour
la recherche de nmimotopes) sous forme de spots, puis on rince pour élinliner
les analytes
non fixés spécifiquement.
Dans le cas d'une couche organique sous fornle de spôts, on peut mettre la


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coucllc sunsible cii contact avec un fluicle contenant uii analyte à étuclicr.

Les llüallds sont illlmobillses sllr la cotlC.lle d'or cle façon conlltlC.

Par exemple, pour l'étucle d'intcractions cntre des olibonticléotides et des
fragnZents Cl'A.I~I\T slnlple-brin à étudier, la cotlelle orgZnlClile 15
tlt(lisec potlr la fl\Iltion
5 d'oliboinicléotides sur la couche ci'or 14 est un polymère tel que par
exemple le polypyrrole, les oligonucléoticles étant crcffés sur Ic
polypyrrole. Ce
polynière présent:: l'avantage cl'être très stable, ce qui permet cle
réutiliser plusieurs fois
la couclle orbanique 15 comprenant lcs sottclcs (oligonucléotidcs
inlluobilisés). La
réalisation et le dépôt d'une telle couclie de polypyrrole Dreffé sur une
couche d'or sollt
10 par e~emple décrits dails les brcvets EI' 0 691 978 et FR 2 789 401.
Une fois la laine de verre 12 fixée sur la base du prisnle 4, elle est
recouverte hermztiquement d'une cuve 16.
Cette cuve 16 est par exenlple en Téflon et permet dc faire passer des
solutions d' analytcs à I'aide d'tin ou pltisictrrs tuyaux 17. Une ponipe
péristaltique 19 à
15 débit variable p4tit alors être utilisée pour faire circuler ces solutions.
Alin d'optimiser l'introduc.tioli des solutions, la ponlpe péristaltiqtte 18
répond atLx critères suivants :
- être cornrnandabl:, à distance ;

- être capable de générer des débits coinpris entre quelques micro litres
par miiiute et quelques centaines de uiicro litres par rninute (de l'ordre de
300 à 400
micro litreslniiri) ;
- permettrc tine coiniziande entrée!sortie de la vitesse de rotation clu
débtit
et de la fin de l'injection.
L'ensenible de la celltile cle réaction 3(prisnie 4 et cuve 16) peut être
enCernté dans une enceiute adiabatique 19 représentée fi~ure 2, afin de
contrôler et de
fixer la tenlpérattire du systèrne et des produits injectés.

La tenlpérature scra par e.lenlple inaintenue à 37`C afin de perntettre la
détectiou dc tout type dc illolc:cUles biolo~~T,iClt.Ies.

L'enccLnte 1diablticlue 19 coinprZn(1 de préférc.nce une otiverture (non
représetltée) hernlettant d'accéder facilcineilt à la cellttle de détection 3.

Llle pcut comporter notantntent tm socle 20 chauffiult, tel qtte par etiemple
tinc résistance etl cuivre, sur l:iquelle sera fixée la c.uve de réaction en
Téflon 16. Cc
socle 20 est rccouvert cl'tin couvercle 21 englobant l'ensemble cle la cellule
cle détection


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3.
Des hublots latéraux 22, 23 sont prévus dans le couvercle 21 afin de laisser
passer les faisceaux lumineux de part et d'autre du prisme. Ils sont par
exemple en verre
ou tout autre matériau laissant passer les faisceaux lumineux sans les
perturber.
Un bobinage non représenté enroulé autour du tuyau 17 de la cuve 16
permet de maintenir les produits injectés à la température de la cellule.
Un système d'imagerie et de détection 5 est disposé du côté de la face de
sortie du prisme 4 afin de récupérer le faisceau réfléchi par la base de ce
dernier.
Ce système comprend un système afocal de conjugaison et de
grandissement 24 et une caméra CCD 25.
Le système afocal de grandissement 24 permet ici d'agrandir l'image de la
zone utile de la lame d'or 14 sur l'ensemble de la caméra CCD 25.
La zone utile de la lame d'or 14 est par exemple de l'ordre de 25 mm2
environ.
Dans le mode de réalisation représenté, un agrandissement G=1,6 est réalisé
et un système d'ouverture numérique O.N. = 1,6 est utilisé pour conjuguer
l'image sur
le plan de la caméra CCD 25.
Le système afoca124 peut par exemple comprendre une lentillé 26de focale
F' = 50mm et de diamètre 35 mm, puis une autre lentille 27 de focale F' = 80
mm et de
diamètre 40 mm.
La lentille 26 est disposée de façon telle que l'image de la partie utile de
la
couche active après réfraction sur la face de sortie du prisme est située dans
le plan focal
objet de 26. Il en résulte que l'image se forme dans le plan focal image de la
lentille 27.
Le système de conjugaison peut aussi être constitué par exemple d'une
première lentille de focale 80 mm et de diamètre 31,5 mm, et d'une seconde
lentille de
focale 65 mm et de diamètre 25 mm (l'ensemble présentant une ouverture de
2,6). Pour
concevoir ce système optique, on peut utiliser des logiciels de calculs
optiques
commerciaux tels que CODE V (Optical Research Associates).
La caméra CCD 25 (ou simplement une matrice CCD) peut par exemple
présenter une surface sensible de 6,4mm x 5,8mm composée de 768 x 576 pixels.
Le détecteur CCD peut également être par exemple une caméra à tête
déportée de format 1,5 pouce, de surface sensible 6,4 x 4,8 mm2, comprenant
751 x 582
pixels actifs, avec un signal échantillonné sur 8 bits, ou bien une caméra
compacte de


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format 2/3 pouce, de surface sensible 8,57 x 6,86 mm2, comprenant 1280 x 1024
pixels
actifs avec un signal échantillonné sur 12 bits. Il s'agit de caméras
commerciales.
Tous les éléments du dispositif selon l'invention sont contrôlés
automatiquement au moyen d'une chaîne informatique non représentée.
Le procédé d'utilisation dudit dispositif comprend les étapes suivantes :
- balayage en angle de la surface de la lame de verre 12 recouverte de la
couche d'or 14 et de la couche à caractériser 15 ;
- détermination de l'angle d'incidence pour lequel la sensibilité du
système d'imagerie et de détection 5 est maximale pour l'ensemble de la lame
12 ;
- positionnement du miroir oscillant 7 pour obtenir cet angle d'incidence ;
- mesure de la réflectivité par le système d'imagerie et de détection 5 en
fonction du temps.
Le dispositif est alors utilisé pour caractériser la surface des zones actives
à
caractériser de la couche 15.
Le dispositif peut être appliqué à l'étude d'interactions moléculaires.
Afin de mesurer les interactions entre la couche organique 15 et des
analytes, l'étape de mesure de la réflectivité est réalisée simultanément à
l'introduction
dans la cellule de réaction 3 d'analytes (non marqués) dont les interactions
avec les
ligands de la couche organique 15 sont à analyser.
On mesure ainsi l'évolution des interactions entre la couche organique 15 et
les analytes introduits.
Ces mesures peuvent être réalisées dans des conditions non sélectives, de
sorte que toutes les interactions peuvent se produire et être étudiées.
Le système d'imagerie et de détection 5 permet de mesurer l'épaisseur
optique, produit de l'épaisseur géométrique et de l'indice de réfraction du
milieu, en
tout point de la partie utile de la couche d'or 14.
Il est ainsi possible de visualiser topologiquement les zones d'égale
épaisseur optique et de caractériser la surface.
Ainsi, lors du balayage en angle de la surface de la lame de verre 12
couverte de la couche d'or 14, le système 5 permet de déterminer l'épaisseur
géométrique de chaque point de la couche 14 et donc de vérifier l'état de
surface de
celle-ci.
Le contraste mesuré lors du balayage sert par ailleurs de niveau de référence


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pour la mesure en temps réel.
Lors de la mesure en temps réel, le système d'imagerie et de détection 5
mesure la variation de la réflectivité par rapport au niveau de référence
enregistré lors
du balayage angulaire.
Cette mesure de la variation de la réflectivité est réalisée en tout point de
la
partie utile de la couche d'or 14.
La réflectivité variant en fonction des espèces moléculaires présentes en
surface, cette mesure permet une analyse qualitative en déterminant les
différentes
interactions entre la côuche organique 15, la couche d'or 14 et les molécules
introduites.
Ainsi, lorsque l'on se place à l'angle optimisant la sensibilité du
dispositif,
une variation positive de la réflectivité signifie la présence d'analytes en
interaction
avec les ligands de la couche organique 15, une variation nulle signifiant
l'absence
d'analyte interagissant.
Une variation négative représente alors au contraire une perte de matière,
c'est-à-dire une dégradation de la couche 15.
La mesure de l'amplitude de la variation de la réflectivité en temps réel
permet quant à elle d'accéder au nombre de molécules d'analytes par unité de
surface et
donc à la concentration en chaque point (sur chaque spot) de la couche d'or 14
des
molécules d'analyte introduites.
Le dispositif selon l'invention permel donc également une analyse
quantitative des molécules ayant interagi avec les ligands de la couche 15.
Selon la force de la liaison entre la couche 15 et la couche d'or 14 et la
nature des interactions étudiées, il sera possible en fin de mesure de
régénérer la couche
organique 15 en éliminant toutes les molécules d'analyte ayant réagi avec
elle.
Il est alors possible de réutiliser la couche 15 pour étudier des interactions
avec de nouvelles molécules d'analytes.
Afm d'optimiser la sensibilité de la mesure, on peut également optimiser la
répartition des spots fixés sur la couche 15. Il est en effet nécessaire que
le nombre de
sondes (ligands) par spot soit suffisamment élevé pour se distinguer du bruit
de fond du
signal mesuré, sans pour autant que les sondes soient trop proches les uns des
autres. En
effet, un nombre important de sondes entraîne un encombrement stérique
important et
gêne l'interaction de molécules avec des sondes voisines. Dans le cadre de
l'étude
d'interactions entre oligonucléotides et des fragments d'ADN simple-brin à
étudier le


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procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Les interactions
sont
étudiées dans des conditions d'hybridation non sélectives, par exemple à une
température de l'ordre de 37 C, de sorte que toutes les interactions entre les
réactifs
pourront être observées simultanément.
Le dispositif permet de suivre en même temps et sans marqueurs plusieurs
centaines d'interactions moléculaires à la fois. Il est capable notamment de
discriminer
la présence d'une mutation ponctuelle au sein d'un fragment d'ADN.
La technique de discrimination repose sur le fait que l'association
moléculaire peut être soit totale si la séquence de l'ADN est strictement
complémentaire
de celle de l'oligonucléotide, soit partielle si la séquence d'ADN possède une
base
mutée.
La thermodynamique appliquée à l'ADN montre que suivant le type de
mutation, pour une localisation fixe dans la séquence, l'épaisseur optique
varie. Il
s'ensuit que le dispositif peut déterminer précisément le type de mutation.
Dans des conditions non sélectives, si une séquence normale et les trois
séquences portant la mutation d'une des bases de ladite séquence, c'est-à-dire
les quatre
séquences dont l'une des bases a été mutée, sont déposées sous forme de quatre
plots
différents sur la couche d'or 14, le dispositif peut mesurer un signal
différent pour
chacune des séquences immobilisées.
En effet, quelle que soit la séquence du fragment à analyser, le dispositif
mesure une interaction totale et trois interactions partielles.
En fonction des séquences immobilisées, il suffit alors de se reporter aux
tables existant donnant la force d'interaction entre bases pour remonter à la
nature
exacte de la séquence d'ADN.
Dès lors, si le système de détection est calibré, par exemple par rapport à la
valeur d'un signal totalement complémentaire, il n'est plus nécessaire
d'immobiliser la
séquence normale et les trois séquences mutées : l'immobilisation d'une seule
séquence
est suffisante.
La capacité d'adresser des séquences d'ADN sur un substrat solide est donc
multipliée par quatre.
Le dispositif selon l'invention suivant en temps réel et directement les
interactions moléculaires, il n'est pas nécessaire de réalisér la mesure à une
température
favorisant une seule interaction comme dans le cas des méthodes utilisant des


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marqueurs fluorescents.
En effet, ces niétliodes ne permettent de révéler qu'une seule interaction
visible à une température donnée. Si ces méthodes étaient employées à
température
ambiante, tous les marqueurs émettraient de la fluorescence en même temps et
ne
5 pourraient donc être différenciés.
Les exemples suivaiits illustrent l'invention.
Exemples de configuration de prismes

1) Données pour un verre d'indice n=1,776 :
10 - Matériau : SF11 (fournisseur : SCHOTT).
- Angle au sommet optimal : 30,6 .
- Coefficient d'anamorpliose : 0,479.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 4,17 %.
15 2) Données pour un verre d'indice n=2,20 :
- Matériau : niobate de lithiuni LiNbO3 (fournisseur : CRYSTAL
TECHNOLGY, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 77,4 .
- Coefficient d'anamorphose : 0,7.
20 - Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image: 1,57 %.
3) Données pour un verre d'indice n=3,33 :
- Matériau : GaAs (fournisseur : AXT, Inc., Palo Alto CA).
- Angle au sommet optimal : 123,7 .
- Coefficient d'anamorphose : 0,89.
- Rapport entre la taille des aberrations et la taille de l'image : 0,5 %.
Le dimensionnement des prismes a été réalisé à l'aide du logiciel MATLAB
(société MATH WORKS), qui permet d'établir des algorithmes appropriés, selon
des
méthodes connues. Pour un indice n donné, il existe au moins un angle au
sommet
permettant que l'image intermédiaire de la base du prisme à travers de la face
de sortie
soit perpendiculaire à l'axe optique du second système afocal de conjugaison.
On
recherche ensuite de la mêmé façon les couples (indice - angle au sommet) qui
donnent
un débattement angulaire mininltmi pour cette image intermédiaire.


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Les prismes peuvent être également réalisés à l'aide de monocristatuc tels
que le tantalate de litliiuin (LiTaO3), le niobate de lithium (LiNbO3).

Il s'agit de matériaux biréfringents, c'est-à-dire qu'ils peuvent présenter un
indice différent suivant l'état de polarisation de la lumière. Cet
inconvénient peut être
surmonté par exemple en orientant les axes du cristal de façon que l'indice de
réfraction

effectif, en polarisation transverse magnétique, soit le même quel que soit
l'angle
d'incidence du faisceau sur la zone utile.
Une autre solution est d'utiliser des matériaux semi-conducteurs tels que
l'arséniure de gallitun, le germanitun (indice de l'ordre de 4) ou encore le
silicium
(indice d'environ 3,9).
Tous ces matériaux présentent une bonne transmission dans l'infrarouge, ce
qui est favorable compte tenu des caractéristiques intéressantes des plasm.ons
de surface
à des longueurs d'onde élevées.

Exemples d'applications :

1) Discriminations de mutations ponctuelles
On dispose d'une zone sensible munie de quatre séquences d'ADN de 25
bases de long, une séquence normale ou native (WT) du gène K-ras, tme séquence
test
(CP) qui servira de témoin négatif et deux séquences mutées, M1 et M5 qui ne
diffèrent
de la séquence native que d'une seule base sur le même codon.
On sait que les mutations du gène K-ras engendrent presque
systématiquement un cancer, d'où la nécessité d'identifier les ir.dividus
pbssédant u.ne
mutation.
Ces quatre séquences ont été immobilisées, sous la forme de quatre plots, de
façon covalente, par tul procédé électrochim.ique décrit dans les demandes de
brevet
WO 94/22889 et WO 00/47317.
La première étape consiste à étudier la réflectivité de la zone sensible en
fonction de l'incidence externe, pour déterminer l'angle où se placer pour
observer les
hybridations avec un maximtun de sensibilité. Ensuite, on injecte la séquence
complémentaire de CP, dans un tampon d'hybridation à 22 C (BPS, NaCI 137 mM),
afm de démontrer que seul le plot CP réagit, ce qui est le cas. L'expérience
ayant garanti
par l'étape précédente que le' système est sélectif, on injecte ensuite, après
avoir


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régénéré le système avec une solution d'hydroxyde de sodium 50 mM, la séquence
complémentaire de WT, qui réagit très bien avec le plot WT, peu avec les deux
plots
correspondants aux séquences mutées et pas du tout avec le plot CP. Puis on
régénère et
on injecte la séquence complémentaire de Ml, qui réagit très bien avec le plot
Ml, peu
avec WT et M5 et pas du tout avec CP. La dernière injection donne les
résultats
attendus : le complémentaire de M5 réagit très bien avec M5, peu avec WT et M1
et pas
avec CP.
On peut mesurer les affmités pour chacune de ces hybridations et affirmer
que suivant le nombre de molécules ayant interagi sur les plots natifs ou
mutés, et
suivant la valeur de l'affinité, on peut discriminer de cette manière une
mutation
ponctuelle et même identifier le type de mutation.
Après établissement des courbes de réflectivité étalons, en fonction du
temps, pour les quatre types d'hybridation, on peut détecter, par comparaison,
une
mutation ponctuelle avec seulement deux sondes, comme indiqué dans la
description.
2) Analyse d'interactions protéine-protéine
On dispose d'une zone sensible munie de quatre plots dont trois portent des
anticorps. Deux anticorps sont dirigés contre l'hCG, hormone de grossesse
humaine qui,
quand elle est détectée chez l'homme, est très souvent indicatrice d'un cancer
des
testicules. Le troisième anticorps est un anticorps anti-lapin, qui ne croise
pas avec
l'homme. Il a été simplement absorbé sur un plot de polymère. Le dernier plot
ne
contient que du polymère, sans anticorps.
On injecte d'abord de l'albumine sérique bovine, qui limite l'adsorption
passive de molécules non spécifiquement reconnues, jusqu'à saturation. On
injecte
ensuite l'hCG dans un tampon PBS. Le plot ne portant que du polymère a une
cinétique
nulle (aucune évolution de la réflectivité en fonction du temps). Le plot
portant
l'anticorps anti-lapin a une cinétique qui décroît ; cela signifie que les
anticorps,
faiblement liés aux polymères, sont désorbés et évacués de la cuve de
réaction. Les deux
autres plots ont chacun une cinétique de forme exponentielle, signe de la
reconnaissance
de l'hCG par les anticorps. Toutefois, les deux anticorps anti-hCG étant
différents, on
note une différence de la pente à l'origine des cinétiques d'interaction. En
effet, leur
affinité pour l'hCG n'est pas la même . Pour l'un des anticorps, on a déduit
des résultats
de réflectivité que l'affinité est de 8.10-10, soit la même valeur que celle
mesurée


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indépendamment par une technique ELISA.
L'invention a également pour objet l'application du procédé décrit
ci-dessus à la mesure qualitative et quantitative d'interactions moléculaires
telles
que décrites dans la présente demande.

A single figure which represents the drawing illustrating the invention.

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Admin Status

Title Date
Forecasted Issue Date 2009-04-28
(86) PCT Filing Date 2001-12-13
(87) PCT Publication Date 2002-06-20
(85) National Entry 2003-06-11
Examination Requested 2005-09-16
(45) Issued 2009-04-28

Abandonment History

There is no abandonment history.

Maintenance Fee

Description Date Amount
Last Payment 2018-09-05 $450.00
Next Payment if small entity fee 2019-12-13 $225.00
Next Payment if standard fee 2019-12-13 $450.00

Note : If the full payment has not been received on or before the date indicated, a further fee may be required which may be one of the following

  • the reinstatement fee set out in Item 7 of Schedule II of the Patent Rules;
  • the late payment fee set out in Item 22.1 of Schedule II of the Patent Rules; or
  • the additional fee for late payment set out in Items 31 and 32 of Schedule II of the Patent Rules.

Payment History

Fee Type Anniversary Year Due Date Amount Paid Paid Date
Filing $300.00 2003-06-11
Maintenance Fee - Application - New Act 2 2003-12-15 $100.00 2003-12-10
Registration of Documents $100.00 2004-02-13
Maintenance Fee - Application - New Act 3 2004-12-13 $100.00 2004-11-08
Request for Examination $800.00 2005-09-16
Maintenance Fee - Application - New Act 4 2005-12-13 $100.00 2005-11-23
Maintenance Fee - Application - New Act 5 2006-12-13 $200.00 2006-12-08
Maintenance Fee - Application - New Act 6 2007-12-13 $200.00 2007-11-20
Maintenance Fee - Application - New Act 7 2008-12-15 $200.00 2008-10-30
Final Fee $300.00 2009-02-09
Maintenance Fee - Patent - New Act 8 2009-12-14 $200.00 2009-11-13
Maintenance Fee - Patent - New Act 9 2010-12-13 $200.00 2010-10-29
Registration of Documents $100.00 2011-03-01
Maintenance Fee - Patent - New Act 10 2011-12-13 $250.00 2011-10-19
Maintenance Fee - Patent - New Act 11 2012-12-13 $250.00 2012-10-25
Maintenance Fee - Patent - New Act 12 2013-12-13 $250.00 2013-09-05
Maintenance Fee - Patent - New Act 13 2014-12-15 $250.00 2014-09-05
Maintenance Fee - Patent - New Act 14 2015-12-14 $250.00 2015-09-11
Maintenance Fee - Patent - New Act 15 2016-12-13 $450.00 2016-09-08
Maintenance Fee - Patent - New Act 16 2017-12-13 $450.00 2017-09-06
Maintenance Fee - Patent - New Act 17 2018-12-13 $450.00 2018-09-05
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Description
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(yyyy-mm-dd)
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Abstract 2003-06-11 2 93
Claims 2003-06-11 4 198
Drawings 2003-06-11 2 27
Description 2003-06-11 23 1,328
Representative Drawing 2003-06-11 1 15
Cover Page 2003-08-13 1 46
Claims 2008-06-19 4 143
Description 2008-06-19 24 1,288
Representative Drawing 2009-04-14 1 10
Cover Page 2009-04-14 2 51
Correspondence 2011-04-11 1 22
PCT 2003-06-11 6 215
Assignment 2003-06-11 5 148
Correspondence 2003-08-06 1 28
Fees 2005-11-23 1 29
PCT 2003-06-11 1 58
Assignment 2004-02-13 2 77
PCT 2003-06-12 2 63
Fees 2003-12-10 1 33
Correspondence 2004-02-13 1 40
Fees 2004-11-08 1 33
Prosecution-Amendment 2005-09-16 1 32
Correspondence 2006-08-28 2 42
Fees 2008-10-30 1 58
Correspondence 2006-10-18 1 15
Correspondence 2006-12-08 1 49
Prosecution-Amendment 2008-01-14 5 178
Fees 2007-11-20 1 47
Prosecution-Amendment 2008-06-19 25 1,060
Correspondence 2009-02-09 2 59
Fees 2009-11-13 1 36
Correspondence 2010-08-10 1 47
Fees 2010-10-29 1 37
Assignment 2011-03-01 12 502
Fees 2011-10-19 1 37
Fees 2012-10-25 1 42