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1
Utilisation d'un isothiocyanate, d'un thiocyanate ou de leur
mélange en tant que dépigmentant
La présente invention concerne les dépigmentants et en particulier
l'utilisation d'isothiocyanates ôu de thiocyanates en tant que dépigmentant.
La pigmentation de la peau chez les humains provient d'une série
complexe de processus cellulaires qui s'effectue dans une unique population de
cellules appelées mélanocytes. Les mélanocytes sont situés dans la partie
inférieure de l'épiderme, et leur fonction est de synthétiser un pigment brun,
la
mélanine, qui protège le corps des effets dommageables des radiations ultra
violettes. La mélanine est déposée dans les mélanosomes, vésicules présentes à
l'intérieur des mélanocytes. Les mélanosomes sont expulsés des mélanocytes et
véhiculés vers la surface de la peau par les kératinocytes, qui assimilent la
mélanine contenue dans les mélanosomes. La teinte foncée de la peau est
proportioimelle à la quantité de mélanine synthétisée par les mélanocytes et
transférée aux kératinocytes. Dans certains cas, il est préférable de réduire
ou
d'inhiber la mélanogénèse, par exemple, pour éclaircir la peau, pour éliminer
les
taches de vieillesse ou pour réduire l'hyperactivité des mélanocytes.
Pendant longtemps, les compositions cosmétiques contenant un péroxyde
tel que le péroxyde d'hydrogène ou le péroxyde de zinc ont été utilisées dans
le
but d'enlever les taches, telles que les taches de rousseur, qui apparaissent
sur la
peau. Toutefois, les péroxydes sont extrêmement instables et, en conséquence,
leur stockage est problématique. De plus, l'incorporation stable de ces
peroxydes
dans des bases cosmétiques est difficile et les péroxydes eux-mêmes n'ont pas
un
effet suffisamment blanchissant.
D'un autre côté, des préparations cosmétiques comprenant de la vitamine
C, de la cistéine ou du soufre colloïdal ont commencé à être utilisées dans le
but
de blanchir la peau. Toutefois, les effets de ces substances ne sont pas
satisfaisants.
Pendant longtemps, l'hydroquinone a été la molécule dépigmentante de
référence et employée dans de nombreuses préparations de dermo-cosmétique.
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Toutefois, ce produit n'est pas sans danger et présente une cytotoxicité
importante
pour les mélanocytes susceptibles de provoquer des dépigmentations
irréversibles.
Récemment, l'acide kojique a été utilisé efficacement en tant que
substance inhibant la formation de la mélanine dans la peau humaine. En
conséquence, différentes préparations cosmétiques destinées à dépigmenter la
peau et contenant de l'acide kojique (publication de brevet japonais
n°56-18569)
ou un ester de l'acide kojique avec un acide carboxylique aromatique telle que
l'acide cinnamique ou l'acide benzoïque (publication de brevet japonais
N°
60/100005) ou des diester de l'acide lcojique (publications des brevets
japonais
N°61-60801 et 60-17961) ont été décrites. Ces acides kojiques et esters
d'acide
lcojique sont donc connus comme étant des substances capables d'inhiber la
mélanogénèse. Toutefois, l'acide kojique présente une efficacité variable
selon les
individus et en moyenne insuffisante.
En conséquence, la recherche d'autres produits dépigmentants est toujours
d' actualité.
De façon surprenante, les déposants ont découvert que certaines molécules
appartenant à la famille des thiocyanates et des isothiocyanates avaient un
effet
inhibiteur très net sur la tyrosinase in vitro.
Les isothiocyanates peuvent être extraites de différentes crucifères, dont le
brocoli, Lepidium dabra et les radis, comme le sulforaphane et le
sulforaphène.
Le sulforaphane et certains de ses analogues de synthèse sont connus
comme protecteur contre l'effet mutagène de substances chimiques comme celles
contenues dans la fumée de tabac par exemple. Cet effet passe par l'induction
de
systèmes enzymatiques impliqués dans l'évacuation des molécules mutagènes
hors de l'organisme. Il semblerait également que ces molécules agissent aussi
directement sur le mécanisme de la mutagenèse (W0 94/19948, CaYCinogenesis,
8, 12, 1987, pages 1971-1973 ; Catacef° Research, 51, 13, 1991, pages
2063-
2068).
Toutefois, l'action de ces substances en tant que dépigmentant n'a jamais
été décrite.
La présente invention concerne donc l'utilisation d'un isothiocyanate de
formule générale I suivante
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Rl-N=C=S
I
dans laquelle Rl représente un groupe alkyle, alcényle, alcynyle, aryle,
acétyle,
alkylcarbonyle, alkoxy, cycloallcyle, aryloxy, arylcarbonyle, acide
carboxylique,
ester carboxylique ou un groupe -(CH2)"R3 dans lequel n représente un nombre
entier allant de 1 à 5 et R3 représente un groupe fonctionnel polaire,
avantageusement un atome d'halogène, un groupe sulfoxyde, carbonyle, nitro,
thioester, thioéther, sulfonyle, sulfmyle, nitrile, acide carboxylique, ester
carboxylique, alkylthio ou hydroxyle,
d'un thiocyanate de formule générale II suivante
Ra-S=C=N
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dans laquelle RZ représente un groupe alkyle, alcényle, alcynyle, aryle,
acétyle,
alkylcarbonyle, alkoxy, cycloalkyle, aryloxy, arylcarbonyle, acide
carboxylique,
ester carboxylique ou un groupe -(CHZ)"R3 dans lequel n représente un nombre
entier allant de 1 à 5 et R3 représente un groupe fonctionnel polaire,
avantageusement un atome d'halogène, un groupe sulfoxyde, carbonyle, nitro,
thioester, thioéther, sulfonyle, sulfinyle, nitrite, acide carboxylique, ester
carboxylique, alkylthio ou hydroxyle,
ou de leur mélanges pour la fabrication d'un médicament ou d'une composition
cosmétique destinée à inhiber la tyrosinase.
Par le terme « groupe alkyle », on entend au sens de la présente invention
tout groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifié substitué
ou
non, en particulier, le groupe CH3.
Par le terme « groupe alcényle », on entend au sens de la présente
invention tout groupe alcényle de 2 à 10 atomes de carbones, linéaire ou
ramifié,
substitué ou non, en particulier, le groupe vinyle.
Par le terme « groupe alcynyle», on entend au sens de la présente invention
tout groupe alcynyle de 2 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifié,
substitué
ou non, en particulier, le groupe éthynyle.
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Par le terme « groupe alkylcarbonyle», on entend au sens de la présente
invention tout groupe alkyle tel que défini ci-dessus lié par l'intermédiaire
d'un
groupe carbonyle. Un exemple de groupe alkylcarbonyle est le groupe acétyle.
Par le terme « groupe allcoxy », on entend au sens de la présente invention
tout groupe alkoxy de 1 à 10 atomes de carbones, linéaire ou ramifié substitué
ou
non, en particulier, le groupe OCH3.
Par le terme « groupe cycloalkyle », on entend au sens de la présente
invention tout cycle composé de groupe alkyle de 1 à 10 atomes de carbones,
substitué ou non, en particulier, le groupe cyclohéxyle.
Par le terme « groupe aryle », on entend au sens de la présente invention
un ou plusieurs cycles aromatiques ayant 5 à 8 atomes de carbones, pouvant
être
accolés ou fusionnés, substitués ou non. En particulier, les groupes aryles
peuvent
être des groupes phényle ou naphthyle et les substituants des atomes
d'halogène,
des groupes alkoxy tels que définis ci-dessus, des groupes alkyle tels que
définis
ci-dessus ou le groupe nitro.
Par le terme « groupe aryloxy », on entend au sens de la présente invention
tout groupe aryle tel que défini ci-dessus, lié par l'intermédiaire d'un
groupe
alkoxy tel que défini ci-dessus.
Par le terme « groupe aralkyle », on entend au sens de la présente
invention tout groupe aryle tel que défini ci-dessus, lié par l'intermédiaire
d'un
groupe alkyle tel que défini ci-dessus. En particulier un groupe aralkyle est
un
groupe benzyle.
Par le terme « groupe arylcarbonyle», on entend au sens de la présente
invention tout groupe aryle tel que défini ci-dessus, lié par l'intermédiaire
d'un
groupe carbonyle. Un exemple de groupe arylcarbonyle est le groupe benzoyle.
Par le terme « acide carboxylique », on entend au sens de la présente
invention tout groupe allcyle tel que défini ci-dessus auquel est lié un
groupe
carboxy (-COOH).
Par le terme « groupe sulfonyle», on entend au sens de la présente
invention tout groupe alkyle, cycloalkyle ou aryle tels que définis ci-dessus,
lié
par l'intermédiaire d'un groupe 502.
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Par le terme « groupe sulfinyle», on entend au sens de la présente
invention tout groupe alkyle, cycloalkyle ou aryle tels que définis ci-dessus,
lié
par l'intermédiaire d'un groupe SO.
Par le terme « groupe alkylthio», on entend au sens de la présente
5 invention tout groupe alkyle tels que définis ci-dessus lié par
l'intermédiaire d'un
atome de soufre.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un isothiocyanate
de formule générale I, d'un thiocyanate de formule générale II ou de leur
mélanges pour la fabrication d'un médicament ou d'une composition cosmétique
destinée à éclaircir ou dépigmenter l' épiderme ou à éliminer les taches de
vieillesse.
Avantageusement le thiocyanate est un thiocyanate de formule générale II
dans laquelle RZ représente le groupe aralkyle, de façon encore plus
avantageuse,
il s'agit du benzylthiocyanate.
Avantageusement le thiocyanate de formule générale II est sous la forme
d'un sel, de façon encore plus avantageuse de sodium ou de potassium.
Les thiocyanates peuvent être obtenus parallèlement aux isothiocyanates
lors de la dégradation des glucosinolates des crucifères par la myrosinase
(Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Médicinales, Bruneton, ed . Lavoisier,
Paris, 1993, p. 177). Certains sont de synthèse et disponibles commercialement
comme le benzylthiocyanate, chez la société Fluka (réf. 13929).
Dans un mode de réalisation particulier, l'isothiocyanate de formule
générale I est un isothiocyanate de synthèse, en particulier dans lequel Rl
représente un groupe, aryle, acétyle, alkylcarbonyle, cycloalkyle,
arylcarbonyle ou
arylalkyle. Avantageusement l'isothiocyanate est choisi dans le groupe
constitué
par le cyclohéxylisothiocyanate, le benzylisothiocyanate,
l'acétylisothiocyanate et
le benzoylisothiocyanate.
Les isothiocyanates de synthèse sont disponibles commercialement. Ainsi
le cyclohéxylisothiocyanate, le benzylisothiocyanate et le
benzoylisothiocyanate
sont disponibles auprès de la société Aldrich (ref.ClO-540-6 ; 25,249-2 et
26,165-
3 respectivement) et l'acétylisothiocyanate auprès de la société Fluka (re~
01230).
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Les autres isothiocyanates peuvent être synthétisés suivant la méthode et les
exemples indiqués dans le brevet US 5,411,986.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'isothiocyanate de formule
générale I est obtenu par extraction d'une crucifère, avantageusement choisi
dans
le groupe constitué du brocoli, du Lépidium dabra et du radis. De façon encore
plus avantageuse il est choisi dans le groupe constitué par le sulforaphane ou
le
sulforaphène.
En particulier, le procédé d'extraction des crucifères comprend les étapes
suivantes
- Traitement de la crucifère, avantageusement lyophilisée, par un solvant
miscible à l'eau ou un mélange eau-solvant, avantageusement de
l'acëtone,
- Concentration de la solution obtenue, avantageusement sous pression
réduite,
- Filtration du produit obtenu,
- Traitement avec du nitrate d'argent à 0°C,
- Filtration du précipité complexe argentique ainsi formé,
- Déplacement de ce complexe par le thiosulfate de sodium,
- Extraction de la suspension obtenue avec un solvant organique non
miscible à l'eau, avantageusement choisi dans le groupe constitué par le
chloroforme, l'éther, l'acétate d'éthyle ou leur mélange, de façon encore
plus avantageuse un mélange éther éthylique-chloroforme,
- Séchage de la phase organique,
- Eventuellement purification du produit obtenu, en particulier par
chromatographie sur plaque.
Les exemples suivant de préparation du sulphoraphane et sulphoraphène par
extraction de crucifères sont donnés à titre indicatif non limitatif.
Exemule 1 :Préparation du sulforaphane
On traite 90 g de brocoli lyophilisé (Brassica oleracea italica) par trois
décoctions à reflux dans de l'acétone à 75 %.
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Les solutions extractives sont réunies et concentrées sous pression réduite
jusqu'à 100 g. On filtre sur papier. Le filtrat est placé à 0°C et on
ajoute 100 ml
d'une solution aqueuse à 60 % de nitrate d'argent. On le filtre le précipité
sur
verre fritté et on rince par trois fois 100 ml d'eau distillée. On traite
ensuite le
précipité par 100 ml d'une solution aqueuse à 60 % de thiosulfate de sodium et
on
laisse agir à 0°C en agitant pendant deux heures.
La suspension obtenue est ensuite extraite dans une ampoule à décanter
par six fois 50 ml d'un mélange éther éthylique-chloroforme (8/2 v/v). La
phase
organique est séchée sur sulfate de sodium puis évaporée sous pression
réduite.
On obtient 32 mg de sulforaphane brut. On dépose le résidu sur une plaque de
chromatographie préparative de gel de silice et on élue par un mélange
d'isopropanol et de méthanol (7/3 v /v).
La plaque est révélée par du nitrate d'argent ammoniacal sur une petite partie
afin
de déterminer la zone de migration du sulforaphane. On gratte cette zone et on
extrait le sulforaphane de la silice par du chloroforme. On évapore le
chloroforme
et on obtient 9 mg de sulforaphane. Le sulforaphane est identifié par
chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse.
Exemple 2 : préparation du sulforaphène
On opère de la même façon que sur le brocoli mais en utilisant des graines
de radis (raphanus sativus).
On obtient 7 mg de sulforaphène après purification par chromatographie sur
plaque.
Exemple 3 : synthèse du (D,L)-sulforaphane
On dissout 40 g de 4-chlorobutyronitrile (réf. Aldrich C 3,000-0) dans 800 ml
d'alcool éthylique absolu préalablement distillé sur sodium.
On ajoute ensuite 27 g de méthane thioate (réf. Fluka 71742) et on laisse sous
agitation à 25°C pendant 15 heures. La suspension est filtrée sur
papier et
évaporée sous pression réduite. On reprend par 400 ml d'éther éthylique. On
filtre
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à nouveau sur papier. On obtient une solution éthérée contenant 32 g de 4-
méthylthiobutyronitrile brut.
On prépare une suspension de 25 g d'hydrure de lithimn-alumïnium dans 400 ml
d' éther éthylique.
On ajoute progressivement la solution de 4-méthylthiobutyronitrile à la
suspension d'hydrure de lithium-aluminium, puis on porte à reflux pendant 2 h
30.
La suspension est ensuite neutralisée en ajoutant lentement et sous reflux 80
ml
d'eau distillée. Quand l'ébullition cesse, on ajoute ensuite 120 ml d'eau
distillée
pour achever la neutralisation de l'hydrure restant. On filtre sur verre
fritté.
L'insoluble est lavé sur le filtre par 200 ml d'éther éthylique. Les fractions
éthérées sont réunies et évaporées à sec. On obtient 26,9 g de
méthylthiobutylamine. On reprend le produit obtenu par 80 ml d'acétone à
laquelle on ajoute petit à petit 23 ml de peroxyde d'hydrogéne à 35 %. On
place
une nuit au bain-marie à 50°C.
On ajoute ensuite un peu de charbon actif, on filtre et on ajoute lentement
200 ml
de chloroforme contenant 20 ml de thiophosgène, puis 300 ml d'une solution
aqueuse d'hydroxyde de sodium à 5 %. On laisse agir 30 min.
On extrait ensuite le mélange à contre-courant par 8 fois 200 ml de
dichlorométhane. La phase organique est recueillie, séchées sur sulfate de
sodium
et évaporée.
Le résidu est ensuite rectifié à 135 °C sous 7.10-Z Torr. On obtient
12,5 g de D,L-
sulforaphane dont l'identité est vérifiée par spectrométrie de masse.
Les exemples suivant de mesure du pouvoir inhibiteur de la tyrosinase sont
donnés à titre indicatif non limitatif.
Mesure du pouvoir inhibiteur de la tyrosinase
On utilise Ia réaction suivante : la L Dopa (L-3,4-dihydroxyphenylalanine,
obtenue chez la société Sigma (ref D-9628)) incolore est oxydée en dopachrome
colorée absorbant à 475 nm. Cette réaction est catalysée par de la tyrosinase
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fongique (EC 1.14.18.1, obtenue chez la société Sigma (réf T-7755)). La
cinëtique
de la réaction est enregistrée par la mesure de la densité optique (DØ) en
fonction du temps à 30° C.
Les compositions des différentes solutions utilisées sont les suivantes
Tampon nH 6,5
Phosphate monopotassique 0,70 g
Phosphate disodique 0,69 g
Eau distillée q.s .100 ml
IO
Solution de substrat
L Dopa à 0,35 % (p/v) dans la solution tampon pH 6,5
Solutions d'inhibiteurs
Les molécules inhibitrices sont dissoutes directement dans le tampon pH 6,5,
dans
le méthanol à 50 % (méthanol-eau distillée) ou dans le méthanol pur selon leur
solubilité.
Les concentrations en poids par volume des différentes solutions d'inhibiteurs
sont : 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,025 %, 0,0125 %, 0,00625 % et 0,00312 %.
Solution d'enz, rne
Tyrosinase à 0,010 % (p / v) dans la solution tampon pH 6,5.
Les quantités de ces différentes solutions utilisées lors des essais sont
présentées dans les tableaux 1 et 2 pour chaque réaction étudiée
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Tableau 1 :Réaction enzyme-substrat
Blanc Essai
Tampon 1,8 ml 1,3 ml
Substrat 1 ml 1 ml
Enzyme 0 ml 0,5 ml
Solvant de l'inhibiteur0,2 ml 0,2 ml
Inhibiteur 0 ml 0 ml
Tableau 2 :Réaction enzyme-substrat-inhibiteur
5
Blanc Essai
Tampon 1,8 ml 1,3 ml
Substrat 1 ml 1 ml
Enzyme 0 ml 0,5 ml
Solvant de l'inhibiteur0,2 ml 0 ml
Inhibiteur diffrentes0 ml 0,2 ml
concentration
L'action de la tyrosinase est évaluée par la vitesse initiale de la réaction
mesurée sur les enregistrement de D.O.
On porte sur une courbe les vitesses initiales des réactions sans inhibiteurs
10 (concentration 0) et les vitesses aux diverses concentrations testées.
Le pouvoir inhibiteur d'une molécule est défini comme la concentration
qui réduit de 50 % l'action de la tyrosinase.
Les molécules testées en tant qu'inhibiteur ont été acquises auprès des
sociétés Aldrich ou Fluka selon les produits, à l'exception du sulforaphane et
du
sulforaphène préparés de la façon indiquée dans les exemple 1 et 2.
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Les résultats obtenus sur les molécules testées sont rassemblés dans le
tableau suivant
Molcule Concentration inhibant 50
l'activit enzymatique de
la tyrosinase
en % (poids/volume)
Hydroquinone (Aldrich ref.24,012-5)0,154
(molcule de rfrence)
Cyclohexylisothiocyanate 0,104
(Aldrich ref.ClO-540-6)
Benzylisothiocyanate 0,0980
(Aldrich ref. 25,249-2)
Sulforaphane 0,103
Sulforaphne 0,112
Actylisothiocyanate (Fluka ref. 0,055
01230)
Benzoylisothiocyanate 0,0063
(Aldrich ref.26,165-3)
Thiocyanate de Potassium 0,20
Benzylthiocyanate (Fluka rf 13929)0,25
Le sulforaphane inhibe la tyrosinase environ 1,5 fois plus que l'hydroquinone.
On constate donc que tous les isothiocyanates utilisés dans le tableau sont
supérieurs à l'hydroquinone et que le plus actif d'entre eux, le
benzoylisothiocyanate est environ 24 fois plus actif que l'hydroquinone.
Les thiocyanates ont quant à eux une activité analogue à celle de
l'hydroquinone.
Essai du pouvoir dépi~mentant du benzoylisothiocyanate et du sulforaphane
comparativement à l'acide koligue et à l'hydroauinone chez le cobaye
pigmenté.
Des cobayes à peau pigmentée préalablement tondus, ont reçu deux fois par
jour,
5 jours sur 7, des applications de crème à base de glycérine contenant 5%
d'acide
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kojique (réf.Aldrich 22,046-9) ou 5% d'hydroquinone (réf.Aldrich H 1,790-2) ou
5% de benzoylisothiocyanate (réf. Aldrich 30,818-8) ou 5% de sulforaphane de
synthèse préparé selon l'exemple 3 au cours de 1 à 2 mois de traitement. Ces
applications ont été réalisées sur des zones circulaires de 2 cm de diamètre
repérées par marquage indélébile à l'encre jaune.
Après 4 semaines de traitement et après une période de
desquamation de la peau au niveau des spots hydroquinone et
benzoylisothiocyanate, on note un blanchiment important de la peau pour tous
les
produits sauf pour l'acide kojique qui n'a aucun effet.
Essai du pouvoir d'inhibition de la synthèse de la mélanine sur des
mélanocytes en culture par le sulforaphane comparativement à l'acide
ko'lique
L'hydroquinone ne peut pas être utilisée comme produit de référence dans ce
test
à cause de sa trop grande cytotoxicité. Ces tests ont été réalisés sur des
lots de
cellules différents au cours d'expériences indépendantes et répétées (8 fois).
La synthèse de mélanine en cinétique ou après 6 jours de traitement (une fois
par
jour) a été testée ; la viabilité des cellules est vérifiée en MTT et/ou en
coloration
au cristal violet .
Les résultats sont exprimés en mg/ml de mélanine dans la mesure où les
cellules
sont ensemencées à la même concentration.
A la concentration de 0,00035 %, l'hydroquinone et le sulforaphane inhibent la
synthèse de mélanine alors que l'acide kojique et le benzoylisothiocyanate
n'ont
plus d' effet. Sur l' ensemble des tests (8 tests indépendants), nous avons
obtenu à
la concentration de 0,00035 % pour tous les produits
26,22 % d'inhibition pour le sulforaphane, 1 % pour l'acide kojique, 9,5 %
pour le
benzoylisothiocyanate et 42 % pour l'hydroquinone.
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Essai du pouvoir d'inhibition de la synthèse de mélanine sur des peaux
humaines pimentées reconstituée en culture
Des épidermes pigmentés type 6 (correspondant à de la peau noire), à raison de
trois échantillons par test ont été traités quotidiennement pendant 5 jours
avec une
crème témoin de composition (en % en poids) suivante
alcool ctostarylique 7
sulfate ctostarylique de sodium 0,7
acide starique 3
glycrine 20
mlange de nipa esters dans du phnoxythanol0,5
trithanolamine 0,2
eau distille 68
de l'acide kojique à une concentration de 3,5.10-5 (p/p) et du sulforaphane à
une
concentration de 3,5.10-6 (p/p) dans la même crème servant d'excipient.
A la fin du traitement, on laisse les peaux en culture pendant encore deux
jours et
on procède à l'extraction de la mélanine à partir des peaux traitées et des
peaux
témoins par un mélange de solvants et d'hydroxyde de sodium (Solvable ~ de
Packa>"d Biosciezzce B. Y.) et on quantifie la mélanine extraite par
colorimétrie
selon une méthode décrite précédemment (Clzezrzical Characterizatiozz of Hair
Melazzins izz hariozzs Coat-Color Mutants of Mice ; Hiroyuki Ozeki et al., J.
Invest. Derzzzatol.105, 3,1995, 361-36~.
On constate que l'acide kojique inhibe la synthèse de la mélatonine de 8 % et
le
sulforaphane de 30 % bien que sa concentration soit dix fois inférieure à
celle de
l'acide kojique.
