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DÉRIVÉS LIPIDIQUES DE POLYTHIOURÉE
La présente invention est relative à de nouveaux composés qui permettent le
transfert d'acides nucléiques dans des cellules. Plus précisément, ces
nouveaux
composés sont des dérivés lipidiques de polythiourée. Ils sont utiles pour la
transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'acides nucléiques dans différents
types
cellulaires.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer
efficacement des acides nucléiques dans les cellules est devenue une
nécessité. Il peut
s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules in vitro, par
exemple pour la
production de protéines recombinantes, ou au laboratoire, pour l'étude de la
régulation
de l'expression de gènes, le clonage de gènes, ou toute autre manipulation
impliquant
l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des
cellules in
vivo, par exemple pour la création d'animaux transgéniques, la réalisation de
vaccins,
des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut
encore
s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ex vivo, dans des
approches de
greffes de moelle osseuse, d'immunothérapie ou d'autres méthodes impliquant le
transfert de gènes dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur
réadministration ultérieure.
Aujourd'hui, plusieurs méthodes sont proposées pour la délivrance
intracellulaire de matériel génétique exogène. L'une d'entre elles, en
particulier,
repose sur l'emploi de vecteurs non-viraux qui constitue une alternative très
avantageuse aux méthodes virales qui ne sont pas complètement dénuées de
risques.
Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales : complexer et
compacter
l'acide nucléique à transfecter, et promouvoir son passage à travers la
membrane
plasmique et éventuellement à travers l'enveloppe nucléaire.
Plusieurs familles de vecteurs synthétiques ont ainsi été développées, comme
par exemple les polymères ou encore les vecteurs biochimiques (constitués
d'une
protéine cationique associée à un ligand de récepteur cellulaire), mais un
progrès
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important a surtout été accompli avec le développement des lipofectants, et
plus
particulièrement des lipides cationiques. Il a ainsi été mis en évidence que
les lipides
cationiques, du fait de leur charge globale positive, interféraient
spontanément avec
l'ADN globalement négatif, formant des complexes nucléolipidiques capables à
la
fois de protéger l'ADN vis-à-vis des nucléases et de se fixer sur les
membranes
cellulaires pour une libération intracellulaire de l'ADN.
Différentes sortes de lipides cationiques ont été synthétisées à ce jour : des
lipides comportant un groupement ammonium quaternaire (par exemple le DOTMA,
DOTAP, DMRIE, DLRIE...), des lipopolyamines comme par exemple le DOGS, le
DC-Chol ou encore les lipopolyamines divulguées dans la demande de brevet
WO 97/18185, des lipides associant à la fois un groupement ammonium
quaternaire
et une polyamine comme le DOSPA, ou encore des lipides comportant diverses
autres
entités cationiques, notamment des groupes amidinium (par exemple l'ADPDE,
ADODE ou les lipides de la demande de brevet WO 97/31935).
Toutefois, l'emploi de ces lipides cationiques en tant qu'agent de
transfection
pose encore de nombreux problèmes, et leur efficacité reste à améliorer.
Notamment,
il a été observé que pour obtenir des complexes nucléolipidiques efficaces et
stables,
il est en général nécessaire que ces complexes soient fortement cationiques.
Cependant, il serait souhaitable de pouvoir disposer de vecteurs qui ne soient
pas
cationiques de façon à former avec l'acide nucléique des particules
globalement
neutres ou négatives. En effet, il a été observé que les complexes globalement
cationiques formés entre l'acide nucléique et les lipides cationiques ont
tendance à
être captés par le système réticulo-endothélial ce qui induit leur
élimination. En outre,
les protéines du plasma ont tendance à s'adsorber à leur surface du fait de la
charge
globale positive des complexes formés, et il en résulte une perte du pouvoir
de
transfection. De plus, dans un contexte d'injection locale, la présence d'une
charge
globale positive importante empêche la diffusion des complexes d'acides
nucléiques
en dehors du site d'administration, car les complexes s'adsorbent sur les
matrices
extracellulaires ; les complexes ne peuvent donc plus atteindre les cellules
cibles, ce
qui, par voie de conséquence, entraîne une diminution de l'efficacité de
transfert par
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rapport à la quantité de complexes injectée. Enfin, il a également été
constaté à de
nombreuses reprises que les lipides cationiques ont tui effet inflammatoire.
La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux
composés transfectants, originaux de par leur fonction polythiourée, et qui
sont
susceptibles d'être utilisés efficacement pour la transfection in vitro, ex
vivo ou in vivo
d'acides nucléiques. Ces nouveaux composés sont particulièrement intéressants
car :
- l'absence de charges positives dans leur structure permet de résoudre les
nombreux problèmes soulevés par l'emploi de vecteurs cationiques discutés ci-
avant,
- tout comme les lipides cationiques, ils sont capables de complexer et
compacter les acides nucléiques et de promouvoir leur transfection.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
La présente invention a ainsi pour premier objet des composés transfectants
caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'une partie polythiourée reliée à
un lipide
par l'intermédiaire d'un espaceur.
En particulier, la présente invention a pour objet des composés transfectants
de fonnule générale (I) :
X 1 - N ]YL I
H H (IHM 1 ()
R R
dans laquelle :
= -1 est un entier choisi parmi 0 et 1
= n est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6,
= ni est un entier choisi parmi 2, 3 et 4, ni pouvant prendre des valeurs
différentes au
sein des différents groupements -[NH-CS-NH-(CH(R))m]-,
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= R' représente un groupe de formule générale (II) :
S
4 CH N 'j~ N X (II)
( z)p H H
q
dans laquelle q est un entier choisi parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, et p est un
entier choisi
parmi 2, 3 et 4, p pouvant prendre des valeurs différentes au sein des
différents
groupements -[(CH2)p NH-CS-NH]-,
= R représente soit un atome d'hydrogène soit un groupe de formule générale
(II) telle
que définie ci-avant, étant entendu que lorsque n vaut 1 et -e vaut 0, alors
au moins un
groupe R est de formule (II)
= X, dans les formules (I) et (II), représente un groupe aliphatique linéaire
ou
cyclique, saturé ou insaturé, et comprenant 1 à 8 atomes de carbone, un groupe
mercaptométhyle (-CH2SH), ou bien une chaîne hydrophile choisie parmi les
groupes :
-(CH2)X (CHOH)ù H avec x un entier compris entre 0 et 10, et u un entier
choisi
parmi 1, 2, 3, 4, 5 et 6, ou
-(OCH2CH2O),-H avec v un entier choisi parmi 1, 2 et 3,
étant entendu que pas plus d'un substituant X, à la fois dans les formules*(I)
et (II), ne
représente une chaîne hydrophile,
= Y représente un espaceur
= et L représente :
- soit un groupement -N(RI)R2 avec RI et R2 qui représentent,
indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une
chaîne aliphatique grasse, ou bien un groupe de formule -(CH2)t-OZ avec
t représentant un entier choisi parmi 11, 12, 13, 14 ou 15 et Z représente
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un sucre, un polyol ou un PEG, étant entendu que l'un au moins de R1
et de R2 est différent de l'hydrogène,
- soit un groupement -OR3, avec R3 qui représente un dérivé stéroidien,
le cas échéant sous leurs formes isomères ou leurs mélanges.
La présente invention a aussi pour objet des compositions caractérisées en ce
qu'elles comprennent un composé transfectant telles que décrites plus haut, et
un
acide nucléique.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de transfert d'acides
nucléiques dans les cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes
suivantes:
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant tel
que
décrit plus haut, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
La présente invention porte aussi sur l'utilisation d'un composé transfectant
tel
que décrit dans la présente demande pour le traitement ou la prévention
d'infections
virales ou bactériennes, ou des états cancéreux.
La présente invention porte aussi sur une méthode de transfert d'acides
nucléiques dans des cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes
suivantes:
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant tel
que
décrit dans la présente demande, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules in vitro avec le complexe formé en (1).
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Selon la présente invention, on entend par espaceur tout groupe chimique
permettant à la fois d'assurer la liaison entre la partie polythiourée et la
partie
lipidique de la molécule, et d'éloigner ces deux parties afin d'atténuer toute
interaction non-désirée entre elles. Des espaceurs préférés peuvent par
exemple être
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constitués d'une ou plusieurs fonctions chimiques choisies parmi les alkyles
ayant 1 à
6 atomes de carbone, les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine,
carbamate,
thiocarbamate, le glycérol, l'tirée, la thiourée, ou encore les cycles
aromatiques. Par
exemple, l'espaceur Y peut être choisi parmi les groupes de formule :
-NH-C(O)-CH2-CH2-
ou : -(CH2-),-W-(CH2)j-
dans laquelle i et j sont des entiers choisis entre 1 et 6 inclus et W est un
groupe
choisi parmi les fonctions cétone, ester, éther, amide, amidine, carbamate,
thiocarbamate, le glycérol, l'urée, la thiourée, ou encore les cycles
aromatiques,
Au sens de la présente invention, on entend par chaînes aliphatiques
grasses des groupes alkyle contenant 10 à 22 atomes de carbone, saturés ou
insaturés et contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes, pourvu que
lesdites chaînes aliphatiques grasses présentent des propriétés lipidiques. De
préférence, il s'agit de groupes alkyles linéaires ou ramifiés contenant 10 à
22 atomes
de carbone et 1, 2 ou 3 insaturations. De préférence, lesdits groupes alkyles
comprennent 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou 22 atomes de carbone. On peut citer plus
particulièrement les groupements aliphatiques -(CH2)1 1 CH3, -(CH2)13 CH3,
(CH2)15CH3 et -(CH2)17CH3.
On entend au sens de l'invention par "sucre", toute molécule constituée d'un
ou plusieurs saccharides. On peut citer à titre d'exemple des sucres tels que
les
pyranoses et les furanoses, par exemple le glucose, le mannose, le rhamnose,
le
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galactose, le fructose, ou encore le maltose, le lactose, le saccharose, le
sucrose, le
fucose, le cellobiose, l'allose, le laminarabiose, le gentiobiose, le
sophorose, le
mélibiose etc... De préférence, le ou les sucres sont choisis parmi le
glucose, le
mannose, le rhamnose, le galactose, le fructose, le lactose, le saccharose et
le
cellobiose. De plus, il peut également s'agir de sucres dits complexes ,
c'est-à-dire
de plusieurs sucres couplés covalemment les uns aux autres, chaque sucre étant
de
préférence choisi dans la liste citée précédemment. A titre de polysaccharides
convenables, on peut citer le dextran, l'a-amylose, l'amylopectine, les
fructans, les
mannans, les xylans et les arabinans. Certains sucres préférés peuvent en
outre
interagir avec des récepteurs cellulaires, comine par exemple certains types
de
lectines.
Selon l'invention, on entend également par polyol toute molécule
hydrocarbonée
linéaire, ramifiée ou cyclique comprenant au moins deux fonctions hydroxy. On
peut
citer à titre d'exemple le glycérol, l'éthylène glycol, le propylène glycol,
les tétritols,
les pentitols, les pentitols cycliques (ou quercitols), les hexitols comme le
mannitol, le
sorbitol, les dulcitols, les hexitols cycliques ou inositols etc...(Stanek et
al., The
Monosaccharides Academic Press, pp. 621-655 et pp. 778-855). Selon un aspect
préféré, les polyols sont choisis parmi les alcools de formule générale :
HO s OH
OH
pour lesquels s est choisi parmi 2, 3, 4, 5 et 6.
Lorsque les composés de formule générale (I) selon l'invention contiennent un
groupe polyéthylène glycol (PEG), celui-ci comprend en général entre 2 et 120
motifs
-OCH2CH2O-, et de préférence entre 2 et 80 motifs -OCH2CH2O-. Il peut s'agir
de
PEG simples, c'est-à-dire dont l'extrémité de la chaîne est terminée par un
groupe
hydroxyle, ou bien de PEG dont le groupe terminal est choisi parmi les
alkyles, par
exemple le méthyle.
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Au sens de la présente invention, on entend par dérivés stéroïdiens les
composés polycycliques de type cholestane. Ces composés peuvent être naturels
ou
non et sont plus préférentiellement choisis parmi le cholestérol, le
cholestanol, le 3-a-
5-cyclo-5-a-cholestan-6-(3-ol, l'acide cholique, le cholestérylformiate, le
chotestanylformiate, le 3a,5-cyclo-5a-cholestan-6p-yl formiate, la
cholestérylamine,
la 6-(1,5-diméthylhexyl)-3a,5a-
diméthylhexadécahydrocyclopenta[a]cyclopropa[2,3]-
cyclopenta[ 1,2-f]naphta-lèn-10-ylamine, ou la cholestanylamine.
Selon une variante préférée de l'invention, les composés transfectants ont
pour
formule générale (III) :
S 0
X R1
N N- CH Y 'j~ N ~ H H ( 2n R (III)
2
dans laquelle X, m, n, et Y sont tels que définis précédemment dans la formule
générale (I), à l'exception de n qui est différent de 1, et RI et R2
représentent,
indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne
aliphatique grasse, étant entendu que l'un au moins de RI et R2 est différent
de
l'hydrogène.
Encore plus préférentiellement, les composés transfectants de l'invention ont
pour formule générale (IV) :
S 0
H3C R
(IV)
NÅN-(2 CH Y N 1 H H mn R2
dans laquelle m, n, et Y sont tels que définis précédemment dans la formule
générale
(I), à l'exception de n qui est différent de 1, et RI et R2 représentent,
indépendamment
l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou bien une chaîne aliphatique grasse,
étant
entendu que l'un au moins de RI et R2 est différent de l'hydrogène.
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Il est entendu que la présente invention concerne également les isomères des
produits de formule générale (I) lorsqu'ils existent, ainsi que leurs
mélanges.
La préparation des composés de formule générale (I) selon la présente
invention s'effectue en mettant en oeuvre les étapes suivantes, dans l'ordre
présenté ou
selon toute autre variante connue et également adaptée, en utilisant les
techniques de
synthèse organique classique, en solution ou sur des supports solides, bien
connues de
l'homme du métier :
1) Obtention de la partie lipidique L
Lorsque la partie lipidique L des composés de formule générale (I) est
représentée par un groupement N(Rl)R2 avec RI et/ou R2 qui représentent une
chaîne aliphatique grasse, on forme tout d'abord l'amine de formule HN(Rl)R2.
Ladite amine peut être obtenue par condensation d'un acide carboxylique et
d'une
amine contenant l'un le substituant RI et l'autre le substituant R2 pour
former l'amide
correspondant, suivie de la réduction de dudit amide ainsi obtenu.
La formation de l'amide est avantageusement effectuée par mélange des
constituants et fusion par chauffage à une température supérieure à la
température de
fusion des substances impliquées, en général entre 20 C et 200 C, puis
élimination de
l'eau produite par déshydratation du milieu; ou plus avantageusement en
présence
d'un agent dessicant tel que par exemple le pentoxyde de phosphore ou toute
autre
substance pouvant absorber l'eau. La formation de cet amide intermédiaire peut
également se faire en employant une variante de cette méthode ou toute autre
méthode de formation d'amide (tel que par exemple le couplage de type
peptidique)
impliquant les acides carboxyliques ou leurs dérivés, des conditions et des
réactifs
variés [R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Editeurs] et
bien connues de l'homme de l'art.
La réduction de l'amide précédemment obtenu en amine de formule
HN(Rl)R2 peut être effectuée par exemple en utilisant un réducteur tel que
l'hydrure
double de lithium et d'aluminium, ou tout autre hydrure ou réducteur efficace
dans ce
cas. On opère alors de préférence dans un solvant non protique (par exemple le
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tétrahydrofurane ou encore les éthers), à température inférieure à la
température
d'ébullition du solvant et sous atmosphère sèche et/ou inerte.
Selon une autre variante, la partie lipidique désignée comme HN(Rn)R2 peut
être disponible commercialement.
Lorsque Rn et/ou R2 représente(nt) un groupe de formule -(CH2)t-OZ, on
procède comme décrit ci-avant pour former la partie alkyle, puis on effectue
un
simple couplage avec un sucre, un polyol ou un PEG commercial selon les
techniques
classiques connues de l'homme du métier.
Lorsque la partie lipidique L des composés de formule générale (I) est
représentée par un groupement -OR3, celle-ci est de préférence choisie parmi
les
produits disponibles dans le commerce.
2) Greffage de l'espaceur Y
L'espaceur Y est ensuite fixé à la partie lipidique L obtenue à l'étape
précédente selon les techniques classiques connue de l'homme de l'art. Selon
une
variante préférée, une liaison amide est réalisée par N-acylation de la partie
lipidique
L dans un solvant approprié tel que le dichlorométhane, le chloroforme, le
tétrahydrofurane, ou tout autre éther, à température inférieure à la
température
d'ébullition du solvant, et sous atmosphère sèche et/ou inerte. Cette réaction
se
déroule de préférence en présence d'une base aminée comme la N,N-
diméthylaminopyridine, ou en présence de cette base mélangée avec des bases
aminées non-nucléophiles comme la triéthylamine ou encore
l'éthyldiisopropylamine.
La pyridine peut également être employée, seule ou en mélange avec une autre
base,
diluée par un des solvants cités ou utilisée elle-même comme solvant.
3) Formation de la chaîne polythiourée
La troisième partie de la synthèse des composés de formule générale (I)
consiste en l'introduction successive des motifs thiourées. Celle-ci sera
réalisée en
une suite de réactions pouvant être répétées autant de fois que nécessaire
pour obtenir
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la partie polythiourée désirée. Selon une méthode préférée, on opère de la
façon
suivante :
A) On greffe tout d'abord au groupement Y-C(O)-L obtenu à l'étape
précédente, la première partie du motif sous la forme d'un chaînon -HN-
(CHR),,,-.
5 Pour cela, on opère avantageusement à partir d'un chaînon diaminé de formule
H2N-
(CHR)m NH2 en présence d'un agent de couplage, par exemple
l'hexafluorophosphore
de 1 -benzotriazolyloxytris(pyrrolidino)phosphonium (PyBOP), l'hexafluoro-
phosphore de 1-benzotriazolyloxytris(diméthylamino)phosphonium (BOP), les
hexafluorophosphore ou tétrafluoroborate de O-(1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-
10 tétraméthyluronium (HBTU ou TBTU), le dicyclohexylcarbodiimide (DCC), le
chlorhydrate de 1-(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide (EDC), ou encore
l'iodure de 1-(3-triméthylaminoniopropyl)-3-éthylcarbodiimide, supportées ou
non.
Ce couplage est effectué dans un solvant convenable, par exemple le
dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou tout autre éther, à
température inférieure à la température d'ébullition du solvant, et sous
atmosphère
sèche et/ou inerte. On procède également en présence d'une base aminée non
nucléophile, par exemple l'éthyldiisopropylamine, la triéthylamine ou encore
la
triisopropylamine. Si la nature de la partie lipidique et de l'espaceur est
compatible,
une séquence de type SCN-(CHR)m, ou un précurseur, peut être greffée,
permettant
ainsi de poursuivre la synthèse par une étape telle que celle décrite ci-après
en C),
B) Le produit obtenu à l'étape précédente est ensuite transformé, selon une
technique préférée, en isothiocyanate par traitement par du sulfure de carbone
(CS2),
ou par tout autre réactif connu de l'homme du métier pour obtenir une telle
fonctionnalité [H. Ulrich, Chemistry and Technology of Isocyanates, Wiley
(1996).
The Chemistry of Cyanates and their Thio Derivatives, S. Patai Ed., Wiley
(1977). S.
Ozaki, Recent Advances in Isocyanate Chemistry, Chem. Rev. 72, 457 (1972).].
La
réaction est avantageusement effectuée dans un solvant tel que par exemple le
tétrahydrofurane, ou tout autre solvant éthéré compatible, à une température
variant
entre celle des mélanges réfrigérants et environ 20 C. On opère également en
présence d'un agent capable de promouvoir la réaction et/ou de piéger
l'hydrogène
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sulfuré libéré an cours de la réaction, par exemple le
dicyclohexylcarbodiimide
(DCC).
C) Puis on forme le motif thiourée à partir de l'isothiocyanate obtenu à
l'étape
précédente de façon à permettre le cas échéant l'introduction d'un autre
segment de
formule -(CHR)m . Avantageusement, une diamine de formule H2N-(CHR)m-NH2 ,
éventuellement protégée, est mise à réagir, sous sa forme neutre ou sous forme
de sel
d'acide, avec l'isothiocyanate obtenu à l'étape précédente. Cette réaction est
effectuée
éventuellement en présence d'une base aminée non-nucléophile, par exemple la
triéthylamine, l'éthyldiisopropylarine, la triisopropylamine ou encore le 1,8-
diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU). On opère de préférence dans un solvant
convenant tel que le dichlorométhane, le chloroforme, le tétrahydrofurane, ou
tout
autre éther ou solvant compatible, à une température qui peut se situer entre
celle des
mélanges réfrigérants et la température de reflux du solvant.
Puis on répète séquentiellement et dans l'ordre requis les étapes B) et C)
décrites ci-avant, jusqu'à obtention de la structure visée, de manière à
introduire le
motif désiré en n exemplaires. Pour obtenir des structures branchées, on
procède de
façon analogue en introduisant au moment opportun la ou les molécule(s)
requise (s)
pour obtenir une substitution R telle que décrite par la formule (II).
4) Terminaison de la partie polythiourée par introduction du substituant X
La dernière étape permettant la terminaison de la ou des chaîne(s) de type
polythiourée consiste en l'introduction du substituant X. Pour cela, on
utilise les
méthodes classiques de greffage connues de l'homme de l'art choisies en
fonction de
la nature du substituant X. Par exemple, lorsque X représente un alkyle, on
opère en
faisant réagir un alkylisothiocyanate, en présence lorsque cela est
nécessaire, d'une
base aminée non-nucléophile comme par exemple la triéthylamine,
l'éthyldiisopropylamine, la triisopropylamine ou encore le 1,8-
diazabicyclo[5.4.0]undéc-7-ène (DBU). La réaction est conduite dans un solvant
convenable, par exemple le dichlorométhane, le chloroforme, le
tétrahydrofurane, ou
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tout autre éther compatible, à une température se situant entre la température
des
mélanges réfrigérants et la température de reflux du solvant.
Naturellement, lorsque les différents substituants peuvent interférer avec la
réaction, il est préférable de les protéger préalablement avec des radicaux
compatibles
et pouvant être mis en place et éliminés sans toucher au reste de la molécule.
On
opère pour cela selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier, et
notamment selon les méthodes décrites dans T. W. Greene, Protective Croups in
Organic Synthesis, Wiley-Interscience, dans McOmie, Protective Groups in
Organic
Chernistry, Plenum Press, ou dans P. J. Kocienski, Protecting Groups, Thieme.
Par ailleurs, chaque étape du procédé de préparation peut être suivie, le cas
échéant, des étapes de séparation et de purification du composé obtenu selon
toute
méthode connue de l'homme du métier.
Les composés préférés selon la présente invention sont
- le 3-(2-~ 3-[2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl
thiouréido)éthyl] thiouréido ~éthyl)-1-méthylthiourée ou DT-3TU, qui comprend
trois
thiourées et répond à la formule (I) dans laquelle laquelle X est un -CH3, m
est égal à
2, n est égal 3, R est un hydrogène, f est égal à 0, L = -N(R1)R2 où R1= R2 =
C14H29,
et Y = NH-CO-CH2-CH2.
- le 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl]propionylamino}-
éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-thiouréido}-éthyl)-1-
méthylthiourée ou DT-4TU qui contient quatre groupements thiourées et répond à
la
formule générale (I), dans laquelle X est un -CH3, m est égal à 2, n est égal
4, R est
un hydrogène, f est égal à 0, L = -N(R1)R2 où R1= R2 = C14H29, et Y = NH-CO-
CH2-
CH2.
- Le composé 2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl ~-
thiouréido)éthyl]-propane-1,2-diol ou DT-2TU diol répond à la formule générale
(I)
dans laquelle X = HO OH
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m = 2; R = H; n= 2; C = 0; L = -N(R1)R2 où R1= R2 = C14H29, et Y = NH-CO-CH2-
CH2.
_ Le composé 2-(3-{2-[3-(2-{3-[2-(3-(ditétradécyl-
carbamoyl)propionylamino}éthyl]-
thioui ido}-éthyl}thioureido]-éthyl} thiouréido)-éthyl]-propane-1,2-diol ou DT-
3TU diol
répond à la formule (I) dans laquelle X = HO OH
m2;
R=H;
n= 3;
-e=0;
L = -N(RI)R2 où R1= R2 = C14H29, et
Y = NH-CO-CH2-CH2.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un
composé transfectant selon l'invention et un acide nucléique. Les quantités
respectives de chaque composant peuvent être ajustées aisément par l'homme du
métier en fonction du composé transfectant utilisé, de l'acide nucléique, et
des
applications recherchées (notamment du type de cellules à transfecter).
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide
désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences
naturelles
ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire
(ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique
(ARNr), de séquences hybrides telles que des chiméroplastes ADN/ARN ou de
séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou
non.
Ces acides nucléiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale,
bactérienne,
virale, etc... Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme
du
métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore
par
des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de
séquences
obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement. En
général, ils contiennent au moins 10, 20, 50 ou 100 nucléotides consécutifs,
et de
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préférence au moins 200 nucléotides consécutifs. Encore plus
préférentiellement, ils
contiennent au moins 500 nucléotides consécutifs.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent
être simple ou double brin, de même que des oligonucléotides courts ou des
séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiques sont
avantageusement
constitués par des plasmides, des vecteurs, des épisomes, des cassettes
d'expression,
etc... Ces acides désoxyribonucléiques peuvent porter une origine de
réplication
procaryote ou eucaryote fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou
plusieurs
gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la
réplication,
des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non,
des
régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc...
De préférence, l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt
thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou
plusieurs
promoteurs et un tenninateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment
tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le
produit
protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce
produit
protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule
cible,
c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible
lorsque
celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une
protéine
permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou
l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une
modification,
ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut
aussi
coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue,
une activité
modifiée, etc... Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-
vis de la
cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter
ou
apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter
contre une
pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
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Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut
citer
plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les
lymphokines
et cytokines ainsi que leurs inhibiteurs ou leurs antagonistes: interleukines,
interférons,
TNF, les antagonistes de l'interleukine 1, les récepteurs solubles de
l'interleukine 1 ou du
TNFa, etc., les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs
précurseurs ou
enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF,
bFGF, VEGF-B, NT3, NT5, HARP/ pléiotrophine, etc...) les apolipoprotéines
(ApoAl,
ApoAIV, ApoE, etc.), la dystrophine ou une minidystrophine, la protéine CFTR
associée à
la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (p53, Rb, RaplA, DCC, k-
rev,
etc...), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation
(Facteurs VII,
VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes
suicides (thymidine
kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres
transporteurs
protéiques, les enzymes du métabolisme, catabolisme etc...
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou Lure
séquence antisens ou un ADN codant pour un ARN à fonction de ribozyme, dont
l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes
ou la
transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple,
être
transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et
bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le
brevet EP
140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant
pour
des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP
321
201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou
plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez
l'homme
ou l'animal une réponse imnnmitaire. Dans ce mode particulier de mise en
oeuvre,
l'invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements
immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment pour traiter
ou
prévenir des infections, par exemples virales ou bactériennes, ou des états
cancéreux.
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Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus
d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus
de la
pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides
antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide nucléique comprend également des séquences
permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant
pour le
peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des
séquences qui
sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces
séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut
également
s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression
d'autres
protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences
promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de
séquences
promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même,
il peut
s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on
peut
citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV, etc... En
outre,
ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences
d'activation, de régulation, etc... Il peut aussi s'agir de promoteur,
inductible ou
répressible.
Par ailleurs, l'acide nucléique peut également comporter, en particulier en
amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le
produit
thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
Cette séquence
signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais
il peut
également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une
séquence
signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence
signal
dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier
de la
cellule.
Les compositions selon l'invention peuvent en outre comporter un ou plusieurs
adjuvants capables de s'associer aux complexes composé transfectant/acide
nucléique
et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en
oeuvre, la
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présente invention concerne donc des compositions comprenant un acide
nucléique,
un composé transfectant tel que défini ci-avant et au moins un adjuvant
capable de
s'associer aux complexes composé transfectant/acide nucléique et d'en
améliorer le
pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides,
protéines
ou polymères par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le
pouvoir
transfectant des composés. Dans cette optique, les compositions de l'invention
peuvent comprendre à titre d'adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres, qui
possèdent
notamment la propriété de former des agrégats lipidiques. Le terme agrégat
lipidique est un terme générique qui inclus les liposomes de tous types (à
la fois
unilamellaires et multilamellaires) ainsi que les micelles ou encore des
agrégats plus
amorphes.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la
présente
invention sont des lipides à deux chaînes grasses. De manière particulièrement
avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques
ou
dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques. Il peuvent
être
choisis plus particulièrement parmi la dioléoylphosphatidyléthanolamine
(DOPE),
l'oléoylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les distéaroyl, -palmitoyl,
-mirystoylphosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3
fois, les
phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les
cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides
(tels
que notamment les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides (tels que
notamment les asialoGM1 et GM2). De façon avantageuse, les adjuvants
lipidiques
utilisés dans le cadre de la présente invention sont choisis parmi DOPE, DOPC
ou le
cholestérol.
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par
extraction à partir d'organes (par exemple le cerveau) ou d'oeufs, par des
techniques
classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des
lipides
naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également
Lehninger, Biochemistry).
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Préférentiellement, les compositions de l'invention comprennent de 0,01 à 20
équivalents d'adjuvant pour un équivalent d'acide nucléique en mol/mol et,
plus
préférentiellement, de 0,5 à 5 équivalents molaires.
Selon une autre alternative, les adjuvants cités ci-avant permettant
d'améliorer
le pouvoir transfectant des compositions selon la présente invention,
notamment les
peptides, les protéines ou certains polymères tels que le polyéthylène glycol,
peuvent
être conjugués aux composés transfectants selon l'invention, et non pas
simplement
mélangés. Dans ce cas, ils sont covalemment liés soit au substituant X dans la
formule générale (I), soit à l'extrémité de la (des) chaîne(s) alkyle(s) Ri
et/ou R2
lorsque celles-ci sont des chaînes aliphatiques grasses. Il est également
avantageux
d'utiliser en tant qu'adjuvant, le polyéthylène glycol lié de manière
covalente au
cholestérol (chol-PEG). En effet, lorsque ce dernier est conjugué aux composés
transfectants selon la présente invention, il permet d'obtenir des particules
de tailles
réduites, et ainsi d'éviter leur aggrégation et d'augmenter le temps de demi-
vie des
particules dans la circulation sanguine. La quantité de transfectant par
exemple DT-
3TU utilisé selon la présente invention est telle que les particules ont des
tailles
inférieures à 500nm. De préférence, la quantité de transfectant, tel que le DT-
3TU
utilisé est d'au moins 40nmol de lipides DT-3TU/ g d'ADN (voir Exemples 11,
13, et
14, ci-après).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les compositions
selon la présente invention comprennent en outre un élément de ciblage
permettant
d'orienter le transfert de l'acide nucléique. Cet élément de ciblage peut être
un
élément de ciblage extracellulaire permettant d'orienter le transfert de
l'acide
nucléique vers certains types cellulaires ou certains tissus souhaités
(cellules
tumorales, cellules hépatiques, cellules hématopoïétiques...). Il peut
également s'agir
d'un élément de ciblage intracellulaire permettant d'orienter le transfert de
l'acide
nucléique vers certains compartiments cellulaires privilégiés (mitochondries,
noyau
etc...). L'élément de ciblage peut être mélangé aux composés transfectants
selon
l'invention et aux acides nucléiques, et dans ce cas l'élément de ciblage est
de
préférence lié covalemment à une chaîne alkyle grasse (au moins 10 atomes de
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carbone) ou à un polyéthylène glycol. Selon une autre alternative, l'élément
de
ciblage est lié covalemment au composé transfectant selon l'invention, soit au
niveau
du substituant X, soit sur l'espaceur Y, soit encore à l'extrémité de Rl et/ou
R2
lorsque ceux-ci représentent des chaînes aliphatiques grasses. Enfin,
l'élément de
ciblage peut également être lié à l'acide nucléique comme cela a été précisé
précédemment.
Parmi les éléments de ciblage utilisables dans le cadre de l'invention, on
peut
citer les sucres, les peptides, les protéines, les oligonucléotides, les
lipides, les
neuromédiateurs, les hormones, les vitamines ou leurs dérivés.
Préférentiellement, il
s'agit de sucres, de peptides, de vitamines ou de protéines tels que par
exemple des
anticorps ou des fragments d'anticorps, des ligands de récepteurs cellulaires
ou des
fragments de ceux-ci, des récepteurs ou encore des fragments de récepteurs.
Par
exemple, il peut s'agir de ligands de récepteurs de facteurs de croissance, de
récepteurs de cytokines, de récepteurs de type lectines cellulaires, de
récepteurs au
folate, ou de ligands à séquence RGD avec une affinité pour les récepteurs de
protéines d'adhésion comme les intégrines. On peut également citer les
récepteurs de
la transferrine, des HDL et des LDL, ou le transporteur du folate. L'élément
de
ciblage peut également être un sucre permettant de cibler des lectines tels
que les
récepteurs aux asialoglycoprotéines ou aux syalydés tel que le Sialyl Lewis X,
ou
encore un fragment Fab d'anticorps, ou un anticorps simple chaîne (ScFv).
L'invention a également pour objet l'utilisation des composés transfectants
tels
que définis ci-avant pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules
in vitro, in
vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente invention a pour objet
l'utilisation des
composés transfectants selon l'invention pour la préparation d'un médicament
destiné
à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une
déficience en un
produit protéique ou nucléique. Le polynucléotide contenu dans ledit
médicament
code ledit produit protéique ou nucléique, ou constitue ledit produit
nucléique, apte à
corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo.
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Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la
régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les
compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations
par
voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale,
intraveineuse,
5 intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale,
intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions de l'invention
contiennent un
véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable,
notamment
pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une
administration par
voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de
solutions
10 stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées,
qui, par
addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent
la
constitution de solutés injectables. Les doses d'acides nucléiques utilisées
pour
l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en
fonction de
différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration
utilisé, de
15 la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du
traitement
recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration,
il peut
s'agir soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des
tumeurs,
soit d'une injection dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de
cellules en
culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe. Les
tissus
20 concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les
muscles, la
peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus,
le coeur,
la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie,
l'estomac, les
intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les
yeux, les
glandes, les tissus conjonctifs, etc...
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de transfert
d'acides nucléiques dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant selon
la
présente invention, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules avec le complexe formé en (1).
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L'invention concerne en outre une méthode de traitement du corps humain ou
animal comprenant les étapes suivantes :
(1) la mise en contact de l'acide nucléique avec un composé transfectant selon
la
présente invention, pour former un complexe, et
(2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec le complexe
formé
en (1).
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par
incubation des cellules avec ledit complexe (pour des utilisations in vitro ou
ex vivo),
ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in
vivo). D'une
manière générale, la quantité d'acide nucléique destinée à être administrée
dépend de
très nombreux facteurs tels que par exemple la maladie à traiter ou à
prévenir, la
nature même de l'acide nucléique, la force du promoteur, l'activité biologique
du
produit exprimé par l'acide nucléique, de la condition physique de l'individu
ou de
l'animal (poids, âge ...), du mode d'administration et du type de formulation.
En
général, l'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de
0,01 à
1000 g d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo,
des
doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 50 mg peuvent par exemple être
utilisées.
L'administration peut être effectuée en dose unique ou répétée par intervalle.
Dans le cas où les compositions de l'invention contiennent en outre un ou
plusieurs adjuvants tels que définis précédemment, le ou les adjuvants sont
préalablement mélangés au composé transfectant selon l'invention et/ou à
l'acide
nucléique. Alternativement, le ou les adjuvants peuvent être administrés
préalablement à `administration des complexes nucléolipidiques.
Selon une autre alternative avantageuse, les tissus peuvent être soumis à un
traitement chimique ou bien physique destiné à améliorer la transfection. Dans
le cas
du traitement physique, celui-ci peut utiliser des impulsions électriques
comme dans
le cas de l'électrotransfert, ou bien des foces mécaniques comme dans le cas
de la
sodoporation.
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La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse
pour le transfert d'acides nucléiques in vivo, notamment pour le traitement de
maladies, comprenant l'administration in vivo ou in vitro d'un acide nucléique
codant
pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à
corriger ladite
maladie, ledit acide nucléique étant associé à un composé transfectant selon
l'invention dans les conditions définies ci-avant.
Les composés transfectants de l'invention sont particulièrement utiles pour le
transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées
établies. Il
peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones,
astrocytes,
cellules gliales), hépatiques, hématopoïétiques (lymphocytes, CD34,
dendritiques,
etc...), épithéliales etc..., sous forme différenciée ou pluripotente
(précurseurs).
Un autre objet de la présente invention concerne également les kits de
transfection qui comprennent un ou plusieurs composés transfectants selon
l'invention
et/ou leurs mélanges. De tels kits peuvent se présenter sous forme d'un
emballage
compartimenté de façon à recevoir différents récipients tels que par exemple
des
ampoules ou des tubes. Chacun de ces récipients comprend les différents
éléments
nécessaires pour effectuer la transfection, individuellement ou mélangés : par
exemple
un ou des composé(s) transfectant(s) selon l'invention, un ou des acide(s)
nucléique(s), un ou des adjuvant(s), des cellules, etc...
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également
d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et
figures qui
suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en
limiter la
portée. Notamment, la demanderesse propose à titre non-limitatif un protocole
opératoire ainsi que des intermédiaires réactionnels susceptibles d'être mis
en oeuvre
pour préparer les composés transfectant selon l'invention. Bien entendu, il
est à la
portée de l'homme du métier de s'inspirer de ce protocole ou produits
intermédiaires
pour mettre au point des procédés analogues en vue de conduire à ces mêmes
composés.
ABBREVIATIONS UTILISEES
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BET : bromure d' éthidium
DCC : dicyclohexylcarbodiimide
DPPC : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DTTU : 3-(2-~ 3-[2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl ~thio-
uréido)éthyl]thiouréido ~éthyl)- 1 -méthylthiourée.
Dans le cas où la molecule de DTTU comporte 3 thiourées, elle sera désignée DT-
3TU, 4 thiourées DT-4TU, et ainsi de suite.
EPC : L-a-phosphatidylcholine 95% (oeuf)
PyBOP : hexafluorophosphate de benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphonium
TBE : tris-borate-EDTA
TFA : acide trifluoroacétique
THF : tétrahydrofui ane
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Evolution du taux de fluorescence (en %) en fonction de la quantité
de
mélange EPC/DT-3TU (en nmoles) par g d'acide nucléique et en fonction de la
quantité d'EPC seul (en nmoles) par g d'acide nucléique (mélange témoin).
Figure 2 : Evolution du taux de fluorescence (en %) en fonction de la quantité
de
mélange DPPC/DT-3TU (en nmoles) par g d'acide nucléique et en fonction de la
quantité de DPPC seul (en nmoles) par gg d'acide nucléique (mélange témoin).
Figure 3 : Gel d'agarose (0,8 %/TBE) montrant la compaction du plasmide
pXL3031
( g) en fonction de la quantité de liposome EPC/DT-3TU (en nmoles) utilisée.
Figure 4: Potentiel Zéta (en mV) correspondant au potentiel de surface des
liposomes
DPPC/DT-3TU-ADN en fonction de la quantité de lipide (nmoles) par g d'acide
nucléique.
Figure 5 : Efficacité de transfection in vitro de cellules HeLa par des
complexes
formés entre l'ADN et des liposomes DT-3TU/DPPC (1:2), à différents rapports
lipide/ADN en nmoles/ g, avec ou sans sérum.
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L'axe des ordonnées représente l'expression de la luciférase en RLU/ g de
protéine.
L'axe des abscisses indique la quantité de DT-3TU (en mnoles) par g d'ADN.
Figure 6 : Niveau de protéines (en absorbance) de cellules HeLa non traitées
ou
traitées avec des liposomes EPC+DT-3TU/ADN à différents rapports lipide/ADN en
n voles/ g.
Figure 7: Gel d'agarose (0,8%/TBE) montrant la compaction du plasmide pXL3031
(pg) en fonction de la quantité de nanoémulsion DT-3TU/DPPC (en nmoles)
utilisée.
Figure 8: Gel d'agarose (0,8%/TBE) montrant la compaction du plasmide pXL3031
(pg) en fonction de la quantité de nanoémulsion DT-3TU/DPPC/Chol-PEG (en
nmoles) utilisée.
Figure 9: Evolution du pourcentage d'ADN compacté en fonction de la quantité
de
mélange DT-4TU/DPPC (en nmoles) par g d'acide nucléique en comparaison avec
différentes quantités du mélange DT-3TU/DPPC (en nmoles) par pg d'acide
nucléique.
Figure 10: Gel d'agarose (0,8%/TBE) montrant la protection du plasmide pXL3031
(pg) par le mélange de lipides DT-3TU/DPPC vis-à-vis de DNases. L'ADN témoin
en
présence de DNases a été déposé dans le puits 2, l'ADN en présence de 30, 40
nmol de lipide/pg d'ADN et 40nmol/pg + 6% chol-PEG traités par la DNase ont
été
déposés dans les puits 3,4 et 5 respectivement.
Figure 11: Gel d'agarose (0,8%/TBE) montrant la protection du plasmide pXL3031
(pg) par le mélange de lipides DT-3TU/DPPC vis-à-vis du sérum. Le puits 1
correspond à l'ADN seul, les puits 2, et 3 à l'ADN seul et en présence de
40nmol/. g
de nanoémulsions de DT-3TU/DPPC dans l50mM NaCI puis dans 20% serum (puits
4 et 5) et dans 100% sérum (puits 6 et 7).
Figure 12: Efficacité de transfection in vivo dans le muscle par des complexes
formés
entre l'ADN et des liposomes DT-3TU/DPPC, à différents rapports lipide/ADN en
nmoles/pg avec et sans électrotransfert (e-/e+).
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Figure 13: Biodistribution in vivo chez la souris de complexes DT3TU/DPPC/DOPE-
Rh/ADN au bout de 30 min, 1 h et 6h dans le sang, les poumons et le système
RES.
Cette figure montre le caractère furtif de ces particules : 50% de complexes
ont été
retrouvés après 30 minutes dans la circulation sanguine.
EXEMPLES
Les réactifs et catalyseurs usuels tels que la triéthylamine, l'acide
trifluoroacétique, l'acide p-toluène sulfonique, l'hexafluorophosphate de
benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphoniwn (PyBOP),
dicylclohexylcarbodiimide
10 (DCC), le disulfure de carbone, la tétradécylamine, le di-ter-t-butyl
dicarbonate, la 4-
diméthylarninopyridine, ou encore la diisopropyléthylamine sont disponibles
commercialement.
Les spectres de Résonance Magnétique Nucléaire du Proton (RMN 1H) ont été
enregistrés sur des spectromètres Bruker 300, 400 et 600 MHz. Les déplacements
chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et les multiplicités par
les
abréviations usuelles.
Dans toute la suite, l'acide nucléique utilisé est le plasmide pXL3031 décrit
20 dans la publication Gene Therapy (1999) 6, pp. 1482-1488, qui contient le
gène lue
codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du
cytomégalovirus.
Ce plasmide est représenté à la figure 7. Sa taille est de 3671 bp. La
solution de
plasmide utilisée est dilué à 1,262 g/l dans de l'eau pour préparation
injectable.
EXEMPLE 1 : Synthèse de la DT-3TU
Le 3-(2-~ 3-[2-(3-{ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylaminojéthyl ithio-
uréido)éthyl] thiouréido ~éthyl)-1-méthylthiourée ou DT-3TU est selon la
formule
générale (I), dans laquelle:
X = -CH3;
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m=2;
RH;
n= 3;
.e = 0;
Y = NH-CO-CH2-CH2, et
L = -N(RI)R2 où R1= R2 = C14H29=
a) Synthèse de la ditétradécylamide (1)
Dans un ballon équipé d'un agitateur magnétique relié à un ballon récepteur
contenant un agent desséchant (P205), sont mélangés 131,6 mmol d'acide
tétradécanoïque (30 g) et 140,5 nnnol de tétradécylamine (30 g). Le mélange
réactionnel est alors chauffé pendant 4 heures à 170 C sous pression réduite
(50 min
Hg). Le brut est ensuite solubilisé dans du THF (700 ml ; chauffer légèrement
pour
aider à solubiliser) puis on ajoute 4 équivalents de résine Amberlyst-15TM (8
g)
pour fixer l'excès d'amine. Après 20 minutes d'agitation, la solution est
filtrée puis
le filtrat est concentré pour obtenir 55,11 g d'un solide blanc (rendement:
99%).
'H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,5 Hz, -CH3), 1,25 (ni, 42 H, -CH2-),
1,47 (m, 2H, CO-CH2-CH2), 1,60 (m, 2H, N-CH2-CH2), 2,15 (t, 2H, J=7,5 Hz, CO-
CH1), 3,23 (dt, 2H, J=7 Hz, N-CH2), 5,50 (s, 1H, NH).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 14,09 (C14+C'13), 22,71 (C13+C'12), 25,90 (C'2),
26,99(
C3), 29,69 (-CH2-), 31,96 (C12+C'11), 36,97 (C'1), 39,56 (C1), 160 (CO).
b) Synthèse de la ditétradécylamine (2)
Dans un ballon équipé d'un réfrigérant et d'un tube desséchant, on dissout
47 mmol de ditétradécylamide (20 g) dans 700 ml de THF anhydre, sous azote. On
refroidit le mélange à 0 C puis on ajoute 89 mmol d'hydrure de lithium
aluminium
LiAIH4 (3,4 g). Après addition, le mélange est ensuite chauffé au reflux
pendant 5
heures sous une agitation vigoureuse. La réaction terminée, le mélange est
refroidi à
0 C pour réaliser l'hydrolyse par addition successive de 3,4 ml d'eau, 6,8 ml
d'hydroxyde de sodium 2N et 3,4 ml d'eau. Après une heure d'agitation à
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température ambiante, le brut réactionnel est filtré sur BüchnerTM et le
filtrat est
concentré. Le produit obtenu est ensuite purifié sur 1,5 équivalents de résine
A-15
(15 g) dans 300 ml de THF, sous agitation pendant 30 minutes. La résine est
filtrée
pour être remise en solution dans 300 ml de THF avec ajout de 2 équivalents de
triéthylamine (19,2m1). Après 30 minutes d'agitation, la solution est filtrée
et le filtrat
est concentré pour obtenir 17,72 g d'un solide blanc (rendement: 92 %).
1H RMN (CDC13) : S (ppm) 0,87 (t, 6H, J=6,5 Hz, -CH3), 1,25 (m, 44 H, -CII2-),
1,46 (in, 4H, N-CH2-CH2), 2,58 (t, 4H, J=7 Hz, N-CH2).
13C RMN (CDC13): 8 (ppm) 14,06 (C14), 22,69 (C13), 27,48 (C3), 28,29 (C2),
29,69
(C4-C1i), 31,96 (C12), 50,15 (C1).
c) Synthèse de l'acide N,N-ditétradécylsuccinamique (3)
Dans un ballon sont ajoutés successivement dans 125 ml de dichlorométhane,
12,65 mmol d'anhydride succinique (1,266 g), 12,65 nunol de 4-diméthyl-
aminopyridine (1,546 g) et 10,75 nunol de ditétradécylamine (4,407 g). Le
mélange
réactionnel est agité pendant 18 heures à température ambiante. La réaction
achevée,
on effectue une extraction avec du dichlorométhane et de l'acide chlorhydrique
(1N).
Puis la phase organique est lavée avec de la saumure et séchée sur sulfate de
magnésium, filtrée puis concentrée pour obtenir 4,21 g de produit (3)
(rendement :
66 %).
'H RNIN (CDC13) : S (ppm) 0,85 (t, 6H, J=6,3 Hz, -CH3), 1,23 (m, 44 H, -CH2-),
1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,64 (s, 4H, CO-CH2-CH2-CO), 3,22 (ni, 4H, N-CH2).
13C RMN (CDC13) : 8 (pprn) 14,08 (C14), 22,69 (C13), 27,74 (C3)1 28,10 (CO-CH2-
CH2-CO), 28,92 (C2), 29,67 (C4-C11), 30,07 (CO-CH2-CH2-CO), 31,95 (C12), 46,21
et 47,98 (C1), 4171,46 (CO-NH(C14H29)2), 173,14 (NH-CO).
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d) Synthèse de l'ester tert-butylique de l'acide 2-aminoéthylcarbamique (4)
On ajoute goutte à goutte 18,6 nu-nol de dicarbonate de di-tert-butyle (4 g) à
102,83 mmol d'éthylène diamine (6,17 g) en solution dans du chloroforme (20
ml),
sous azote. Le mélange réactionnel est ensuite agité pendant 18 heures à
température
i
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ambiante. Une fois la réaction achevée, la solution est concentrée. L'huile
résultante
dissoute dans du dichlorométhane est lavée avec une solution aqueuse saturée
en
carbonate de sodium. Puis la phase organique est séchée sur sulfate de
magnésium,
filtrée et concentrée. Le produit brut est purifié par chromatographie éclair
(dichlorométhane / méthanol 9 :1). On obtient ainsi 2,38 g de produit (4)
(rendement :
80 %).
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 1,40 (s, 9H, (CH3)3), 1,52 (s, 2H, NH2), 2,59 (t, 2H,
J=5,9 Hz, N-CH2), 3,12 (q, 2H, 4J=5,4 Hz, NHBoc-CH2), 5,1 (s, 1 H, NHBoc)
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 28,15 (CH3)3, 41,67 (CH2-NHBoc), 43,46 (CH2-NH2),
78,31 (C-(CH3)3, 156,21 (C=O).
e) Synthèse de l'ester tert-butylique de l'acide 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)-
propionylamino]éthylcarbamique (5)
On ajoute successivement 8,841nmol de PyBOP (4,601 g), 9,72 mmol de
l'amine (4) obtenue à l'étape précédente (1,558 g) et 24,31 mmol de
diisopropyléthylamine (4,24 ml) à une solution de 8,84 mmol de l'acide (3)
obtenu
précédemment (4,5 g) dans 88 ml de dichlorométhane. La solution est alors
agitée
pendant 4 heures à température ambiante. En fin de réaction, le mélange
réactionnel
est filtré puis le produit est purifié par chromatographie éclair
(heptane/acétate
d'éthyle 5 :5 puis heptane/acétate d'éthyle 2 :8). On obtient ainsi 3,79 g de
l'ester (5)
(rendement : 66 %).
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,87 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,25 (m, 44H, -CH2-),
1,43 (s, 9H, (CH3)3) 1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,56 (t, 2H, J= 6,7 Hz, CH23),
2,69
(t, 2H, J= 6,2 Hz, CH24), 3,28 (m, 4H, N-CH2), 3,3 (m, 4H, CH21+ CH22).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 14,07 (C"14), 22,56 (C"13), 26,99 ((CH3)3), 27,73
(C"3), 28,29 (C'2), 28,59 (C"2), 29,27 (C"4-C"11), 29,55 (C'3), 31,41 (C"12),
39,85
(C2), 40,39 (Ci), 46,21 et 47,98 (C"1), 78,77 (C(IV)-Boc), 156,33 (CO-Boc),
171,46
(CO-NH(C14H29)2), 173,14 (C'1).
f) Synthèse du 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthylamine (6)
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A 2,44 mmol de l'ester (5) obtenu à l'étape précédente (1,59 g) est ajouté
12,2 mmol de TFA distillé (0,94 ml). Au bout de deux heures, la réaction est
totale.
Le produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à
froid.
Le rendement est quantitatif.
'H RMN (CDC13) : S (ppm) 0,91 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,29 (m, 44 H, -CH2-),
1,51 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,59 (t, 2H, J= 6,7 Hz, H'3), 2,71 (t, 2H, J= 6,2 Hz,
H'3),
3,29 (m, 4H, N-CH2), 3,31 (m, 4H, H1, H2).
13C RMN (CDC13) :: S (ppm) 14,00 (C"14), 22,67 (C"13), 27,35 (C"3), 27,95
(C'2),
28,53 (C2), 29,65 (C"4-C"11), 30,70 (C'3), 31,94 (C"12), 37,83 (C2), 40,08
(C2),
47,85 et 49,42 (C"1), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,26 (C'1).
g) Synthèse du ((1,1-diméthyléthoxycarbonyl)amino)éthylisothiocyanate (7)
Dans un ballon, on ajoute successivement 43,69 minol de DCC (9,015 g),
297,9 mmol de disulfure de carbone (17,9 ml) dans 27,5 ml de THF. Le mélange
est
refroidi à -7 C avec un bain de glace et de chlorure d'ammonium NH4C1 (4/1).
On
ajoute ensuite goutte à goutte 43,69 mmol l'amine (4) précédemment obtenue (7
g)
dissout dans 20,5 ml de THF anhydre, pendant 30 minutes. On laisse le mélange
revenir à température ambiante et on laisse agiter pendant 21 heures. Après
évaporation, on additionne du diéthyl éther pour précipiter la
dicyclohexylurée
formée. La solution est filtrée, le filtrat est concentré puis purifié par
chromatographie
éclair (heptane/acétate d'éthyle 80 : 20) pour obtenir 6,357 g de produit (7)
souhaité
(rendement : 72 %).
1H RMN (CDC13) : S (ppm) 1,38 (s, 9H, (CH3)3), 3,31 (q, 2H, 4J= 5,8 Hz, NHBoc-
CH2), 3,59 (t, 2H, J= 5,6 Hz, S=C N-CH2), 5,16 (s, 1H, NHBoc)
13C RMN (CDC13) :: 8 (ppm) 28,54 ((CH3)3), 41,03 (CH2-NHBoc), 45,53 (CH2-
N=C=S), 79,71 (C-(CH3)3, 132,72 (C=S), 156,21 (C=O).
h) Synthèse de l'ester tert-butylique de l'acide 2-(3-~ 2-[3-(ditétradécyl-
carbamoyl)propionylamino]éthyl 4hiouréido)éthyl carbamique (8)
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A 2,44 mmol de l'amine (6) précédemment obtenue (1,62 g) on ajoute
directement 9,76 mmol de triéthylamine (1,36 ml) et on laisse agiter pendant
15
minutes. On additionne ensuite 24,4 ml de dichlorométhane et 2,92 mnnol de
l'isothiocyanate (7) obtenu à l'étape précédente (0,59 g). Le mélange
réactionnel est
5 agité à température ambiante pendant 12 heures. Le mélange est ensuite
évaporé puis
purifié par chromatographie éclair (acétate d'éthyle/heptane 6 :4 puis 100 %
d'acétate
d'éthyle). On obtient ainsi 1,343 g de l'ester (8) souhaité (rendement : 73
%).
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,67 (t, 6H, J=6,4 Hz, -CH3), 1,05 (m, 44 H, -CH2-),
1,26 (s, 9H, CH3)3), 1,35 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,31 (m, 2H, H3'3), 2,49 (m, 2H,
10 H3'3), 3,06 (m, 4H, N-CH2), 3,11 (m, 4H, H1, H"2), 3,47 (m, 4H, H2, H"1),
7,14 (2H,
H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 13,95 (C4' 14), 22,57 (C4' 13), 26,92 ((CH3)3),
27,07
(4'C3), 27,78 (C3'2), 28,39 (C4'2), 28,82 (C3'3), 29,55 (C4'4-C4' 11), 31,83
(C4' 12),
39,45 (C"2), 43,63 (C2 et C"1), 46,39 et 48,16 (C4'1), 79,24 (C(IV)-Boc),
156,53
15 (CO-Boc), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,71 (C3'1), 182,97 (C=S).
i) Synthèse de la 2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]éthyl ~-
thiouréido)éthyl amine (9)
A 1,98 mmol du produit (8) obtenu à l'étape précédente (1,5 g) est ajouté
9,86 mmol de TFA distillé (0,76 ml). Au bout de 3 heures, la réaction est
totale. Le
20 produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à
froid. Le
rendement est quantitatif.
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,67 (t, 6H, J=6,4 Hz, -CH3), 1,05 (m, 44 H, -CH2-),
1,26 (s, 9H, CH3)3), 1,31 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,31 (m, 2H, H3'3), 2,49 (m, 2H,
H3'3), 3,06 (m, 4H, N-CH2), 3,11 (m, 4H, H1, H"2), 3,44 (m, 4H, H2, H"1),
7,10,
25 (2H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 13,85 (C4'14), 22,49 (C4'13), 27,01 (C4'3), 27,72
(C3'2),
28,29 (C4'2), 28,79 (C3'3), 29,49 (C4'4-C4'11), 31,77 (C4'12), 39,42 (C"2),
43,75 (C2 et
C" 1), 46,29 et 48,09 (C4' 1), 171,72 (CO-NH(C14H29)2), 173,71 (C3' 1), 182,97
(C=S).
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j) Synthèse de l'ester tert-butylique de l'acide 2-~ 3-[2-(3-~ 2-[3-
(ditétradécyl-
carbamoyl)propionylamino]éthyl ~thiouréido)éthyl]thiouréido Whyl carbamique
(10)
A 1,98 inmol de l'amine (9) obtenue à l'étape précédente (1,47 g) on ajoute
directement 7,92 mmol de la triéthylamine (1,1 ml) et on laisse agiter pendant
15
minutes. On additionne ensuite 19,8 ml de dichlorométhane et 2,38 mmol de
l'isothiocyanate (7) précédemment obtenu (0,461 g) et on laisse réagir à
température
ambiante sous agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis
purifié par chromatographie éclair (acétate d'éthyle/heptane 6 :4 puis acétate
d'éthyle/méthanol 98 :2). On obtient 1,136 g du produit (10) souhaité
(rendement :
67 %).
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,74 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,12 (m, 44 H, -CH2-)1
1,30 (s, 9H, CH3)3), 1,45 (m, 4H, N-CH2-CH2), 2,41 (m, 2H, H5'2), 2,58 (m, 2H,
H5'2), 3,12 (m, 4H, N-CH2), 3,25 (m, 4H, H1, H4'2), 3,56 (m, 8H, H2, H"1, H"2,
H4' 1), 7,14 (4H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 14,06 (C6'14), 22,57 (C6'13), 27,11 (C6'3), 26,93
((CH3)3),
27,79 (C5'2), 28,38 (C6'2), 28,81 (C5'3), 29,56 (C6'4-C6'11), 31,83 (C6'12),
39,55 (C4'2),
43,66 (C2, C"1, C"2, C4'1), 46,49 et 48,23 (C6'1), 79,28 (C(IV)-Boc), 156,61
(CO-
Boc), 171,96 (CO-NH(C14H29)2), 173,72 (C5' 1), 182,93 (C=S).
k) Synthèse de la 2-~ 3-[2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]-
éthyl ~thiouréido)éthyl]thiouréido r'éthyl amine (11)
A 1,15 mmol du produit (10) obtenu à l'étape précédente (1 g) est ajouté
5,84 mmol de TFA distillé (0,45 ml). Au bout de 3 heures, la réaction est
totale. Le
produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à
froid. Le
rendement est quantitatif.
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,85 (t, 6H, J=6,6 Hz, -CH3), 1,25 (m, 40 H, -CH2-),
1,48 (m, 4H, N-CH2-CH2), 1,52 (m, 4H, N-CH2-CH2_CH2), 2,65 (m, 2H, H5'2), 2,77
(m, 2H, H5'3), 3,26 (m, 4H, N-CH2), 3,43 (m, 4H, H1, H4'2), 3,85 (m, 8H, H2,
H" 1,
H"2, H4' 1), 7,44 (4H, H thiourée).
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13C RMN (CDC13) : b (ppm) 14,05 (C6 14), 22,68 (C6'13), 27,05 (C6'3), 27,58
(C5'2),
28,71 (C6'2), 29,36 (C5'3), 29,67 (C6 4-C6'11), 31,94 (C6'12), 40,49 (C5'1),
43,49 (C en a
de C=S), 47,40 et 49,07 (C6'1), 172,16 (CO-NH(C14H29)2), 174,00 (NH-CO),
182,73
(C=S).
1) Synthèse de la DT-3TU (12)
A 0,28 mmol de l'amine (11) obtenue à l'étape précédente (0,24 g) on ajoute
directement 1,12 mmol de triéthylamine (0,16 ml) et on laisse agiter pendant
15
minutes. On additionne ensuite 2,8 ml de dichlorométhane et 0,34 mmol de
méthylisothiocyanate (0,024 g) et on laisse réagir à température ambiante sous
agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par
CLHP
(Chromatographie Liquide Haute Performance) sur une colonne C4 avec le
gradient
suivant : initialement un mélange eau/méthanol 95 :5 jusqu'à 100 % de
méthanol. Le
produit obtenu est à nouveau purifié sur une petite colonne de silice (acétate
d'éthyle/heptane 80 :20 puis 100 % d'acétate d'éthyle). On obtient ainsi 118
mg de
DTTU (rendement : 51 %).
1H RMN (CDC13) : S (ppm) 0,86 (t, 6H, J=6, 7Hz, -CH3), 1,24 (m, 40 H, -CH2-),
1,44 (m, 4H, N-CH2-CH2), 1,54 (m, 4H, N- CH2-CH2-CH2), 2,52 (m, 2H, H6'2),
2,67
(m, 2H, H6'2), 3,05 (m, 3H, -CH3 terminal), 3,21 (m, 4H, N-CH2), 3,32 (m, 2H,
H5'2),
3,75 (m, 10H, H' 1, H'2, H3' 1, H3'2, H5' 1), 7,14 (6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 14,09 (C7'14), 22,69 (C7'13), 27,24 (C7'3), 27,89
(C6'2),
28,87 (C7'2), 29,38 (C6'3), 29,67 (C7'4-C7'11), 31,26 (CH3 terminal), 31,94
(C7'12),
39,71 (C5'2), 43,63 (C'1, C'2, C3'1, C3'2, C"1), 46,67 et 48,40 (C7'1), 172,16
(CO-
NH(C14H29)2), 174,00 (C6'1), 182,73 (C=S).
EXEMPLE 2: Synthèse de la DT-4TU
Le DT-4TU ou du 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl]
propionylamino } -éthyl)-thiouréido] -éthyl } -thiouréido)-éthyl] -thiouréido
} -
éthyl )- 1 -méthylthiourée. Le DT-4TU est selon la formule générale (I), dans
laquelle:
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33
X = -CH3; m = 2; R = H; n= 4; -8 = 0; Y = NH-CO-CH2-CH2; et L = -N(RI)R2 où
Ri=
R2 = C14H29=
Pour synthétiser la DT-4TU, on procédera de même à partir de l'amine (11).
a) Synthèse de l'ester tai-butylique de l'acide 2{3-{2-[3 e -{3-[2-(3-
(ditétradécyl-
carbamoyl)propionylamino)-éthyl] thiouréido}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-
thiouréido)-éthyl
carbamique (13)
s s o
, Al / N\j4^3 3/I{1'\ N
\1 /%4~~}I N 1~ N 1 N, - N
17 II 15 17 l'I 71 II 9 rl T rl 5 II -
0 s 0
A l'amine (11) (0,8 g, ,92 mmol) , on ajoute de la triethylamine (0,643 ml,
4,6 mmol)
et on laisse agiter pendant 15 min. Ensuite on ajoute le CH2C12 (9,2mL). On
additionne ensuite l' isothiocyanate (7) (0,224 g, 1,104 mmol) et on laisse
réagir à t.a.
en agitant pendant 20h. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par
chromatographie (acétate d'éthyle/heptane 8:2 puis acétate d'éthyle/méthanol
90 :10) ; On obtient 252 mg du produit souhaité (rendement : 46%).
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,86 (t, 6H, J=6 Hz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,42 (s, 9H, CH3)3), 1,45 (m, 4H, H-2'), 2,55 (m, 2H, H-2), 2,69 (m, 2H,
H-3),
3,22 (m, 4H, H-l'), 3,31 (1n, 4H, H-5 et H-15), 3,74 (m, 12H, H-6, H-8, H-9, H-
11,
H-12, H-14), 7,31 (6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 14,06 (C-14'), 22,66 (C-13'), 27,21 (C-3'), 27,88 (C-
2),
28,50 ((CH3)3), 28,87 (C-2'), 29,64 (C-4'-C-1l'), 31,27 (C-3), 31,92 (C-12'),
39,639
(C-5), 40,44 (C-13), 43,73 (C-6, C-8, C-9, C-11, C-12, C-14), 46,64 et 48,38
(C-l'),
79,10 (C-17), 156,63 (C-16), 172,35 (C-1), 174,04 (C-4), 182,65 (C-7, C-10, C-
13).
b) Synthèse de la 2-(3-{2-[3-(2-{3-[2-(3-(ditétradécyl-carbamoyl)
propionylamino)-éthyl]-thiouréido}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-
éthyl amine (14)
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s H Fi s O
CF3000- H,N''~~H H 1119'N~~H H 6 N 4 a z
r ' N
s O
A l'amine boc (13) obtenu à l'étape précédente (0,22 g, 0,23 mmol) est ajouté
du TFA distillé (0,142 ml, 1,84 mmol). Au bout de 6 heures, la réaction est
totale. Le
produit est co-évaporé 2 fois avec du cyclohexane à l'évaporateur rotatif à
froid et
mis au dessicateur sur pastilles de soude pour la nuit. Le rendement est
quantitatif.
1H RMN (CDC13) : 8 (ppm) 0,74 (t, 6H, J=6,6 Hz, H-14'), 1,12 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,45 (m, 4H, H-2'), 2,41 (m, 2H, H-2), 2,58 (m, 2H, H-3), 3,12 (m, 4H, H-
l'),
3,25 (m, 4H, H-5 et H-15), 3,56 (m, 12H, H-6, H-8, H-9, H-11, H-12, H-14),
7,14
(6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 8 (ppm) 14,06 (C-14'), 22,57 (C-13'), 27,11 (C-3'), 27,79 (C-
2),
28,38 (C-2'), 28,81 (C-4'-C-1 l'), 29,56 (C-3), 31,83 (C-12'), 39,55 (C-5, C-
9), 43,66
(C-6, C-8, C-9, C-11, C-12, C-14), 46,49 et 48,23 (C-l'), 171,96 (C-1), 173,72
(C-4),
182,93 (C-7, C-10, C-13).
c) Synthèse de la 3-(2-{3-[2-(3-{2-[3-(2-{3-[ditétradécylcarbamoyl]
propionylamino}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-thiouréido}-
éthyl )-1-méthylthiourée (DT-4TU) (15)
s o
' 14 ' 1ZN 10 5 N 4 3
17 15 H H 11 s H H 5 z
s s O
A 0,23 mmol de l'amine (14) obtenue à l'étape précédente (0,224 g) on ajoute
directement 1,38 mmol de triéthylamine (0,19 ml) et on laisse agiter pendant
15
minutes. On additionne ensuite 2,3 ml de dichlorométhane et 0,46 mmol de
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méthylisothiocyanate (0,034 g) et on laisse réagir à température ambiante sous
agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié par
chromatographie éclair (100 % acétate d'éthyle puis acétate d'éthyle/méthanol
95 :5).
On obtient ainsi 109 mg de DT4TU (rendement : 51 %).
5
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,45 1,45 (m, 4H, H-2'), 1,58 (ln, 4H, H-3'), 2,57 (m, 2H, H-2), 2,73
(m, 2H, H-
3), 3,03 (m, 3H, H-17), 3,23 (ln, 4H, H-1'), 3,31 (m, 2H, H-5), 3,73 (m, 14H,
H-6, H-
8, H-9, H-11, H-12, H-14, H-15), 7,14 (8H, H thiourée).
10 13C RMN (CDC13) : b (ppm) 14,09 (C-14'), 22,69 (C-13'), 27,24 (C-3'), 27,89
(C-2),
28,87 (C-2'), 29,38 (C-3), 29,67 (C-4'-C-1l'), 31,26 (C-17), 31,94 (C-12'),
39,71
(C-5), 43,63 (C-6, C-8, C-9, C-11, C-12, C-14, C-15), 46,67 et 48,40 (C-l'),
172,16
(C-1), 174,00 (C-4), 182,73 (C-7, C-10, C-13, C-16).
15 EXEMPLE 3: Synthèse de la DT-2TU diol
Le composé 2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbalnoyl)propionylamino]éthyl
thiouréido)éthyl]-propane-1,2-diol ou DT-2TU répond à la formule générale (I)
dans
laquelle x = HO OH
20 m = 2;
R=H;
n= 2;
1=0;
Y = NH-CO-CH2-CH2; et
25 L = -N(R1)R2 où R1= R2 = C14H29.
a) Synthèse du 4-isothiocyanatométhyl-2,2-diméthyl-[1,3] dioxalane (16)
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H_ N--S
'3
H
o
~
Dans un ballon, on ajoute successivement le DCC (3,146 g, 15,25 mmol), le
disulfure
de carbone (6,253 ml, 104,005 mmol) dans du THF (9,6075 mL). Le mélange est
refroidit à -7 C avec un bain de glace/NH4Cl (4/1). On ajoute ensuite le 2,2-
diméthyl-1,2-dioxalane-4-methanamine (2 g, 15,25 mmol) dissout dans du THF
anhydre (7,1675 mL) goutte à goutte pendant 30 minutes. On laisse le mélange
revenir à température ambiante et on laisse agiter pendant 21H. Après
évaporation, on
additionne du diethyl éther. On filtre, on évapore et le mélange est
chromatographié.
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 1,33 et 1,44 (s, 3H, H-5, H-6), 3,57 (dd, 1H, J = 4,8
Hz,
J = 14,4 Hz, H-1),3,69 (dd, 1H, J = 4,9 Hz, J = 14,4 Hz, H-l'), 3,80 (dd, 1H,
J = 5,4
Hz et J = 8,7 Hz, H-3), 4,09 (dd, 1H, J = 6,3 Hz, et J = 8,7 Hz, H-3), 4,28
(m, 1H, H-
2).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 25,17, 26,77 (C-5, C-6), 47,49 (C-1), 66,55 (C-3),
73,70
(C-2), 110,29 (C-4), 132,76 (N=C=S).
b) Synthèse de la 2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino]
éthyl ~-thiouréido)éthyl-4-ylméthyl-2,2-diméthyl-[1,3]dioxalane (17)
O
13 11 HuH
N N~6\ 6 3 2
O 1z II N N^5 N N
1np s H H 4p
16
A 0,19 mmol de l'amine (9) obtenue à l'étape précédente (0,146 g) on ajoute
directement 0,95 mmol de diisopropyléthylamine (0,165 ml) et on laisse agiter
pendant 15 minutes. On additionne ensuite 1,9 ml de dichlorométhane et 0,209
mmol
de l'isothiocyanate (16) (0,027 g) et on laisse réagir à température ambiante
sous
agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié sur
cartouche en phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à
100%acétonitrile.
Le produit (17) est obtenu avec un rendement de 49%.
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11H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,34 et 1,43 (s, 3H, H-15, H-16), 1,48 (m, 4H, H-2'), 1,56 (m, 4H, H-
3'), 2,52
(m, 2H, H-2), 2,68 (m, 2H, H-3), 3,23 (m, 4H, H-l'), 3,37 (m, 2H, H-5), 3,73
(m, 8H,
H-6, H-8, H-9, H-11), 4,05 (m, 2H, H-13), 4,33 (m, 1H, H-12), 7,14 (4H, H
thiourée).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'),27,00 et
27,17 (C-15, C-16), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-
11'),
31,25 (C-17), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9), 44,53 (C-11),
46,73
et 47,13(C-l'), 66,87 (C-136), 74,62 (C-12), 109,05 (C-14), 172,21 (C-1),
174,14 (C-
4), 183,32 (C-7, C-10, C-13, C-16).
c) Synthèse de la [2-(3-~ 2-[3-(ditétradécylcarbamoyl)propionylamino] éthyl '-
thiouréido)éthyl]-propane-1,2-diol (DT-2TUdiol) (18)
H s O
;s ~z il N`1o/N---' -N N^5 N 4 3 z N
HO OH s H H O
On dissout le diol protégé (17) (0,05 g, ,05 mmol) dans 1 mL de solution HCL
1N/THF (1/1) à t.a; le mélange est agité pendant 18h. le brut est ensuite
extrait avec
par du dichlorométhane ( 2x 5 ml). Les phases organiques sont rassemblées puis
neutraliées par une solution d' hydrogénicarbonate de sodium. Les phases
aqueuses
sont extraites par du dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées
puis
séchées sur sulfate de mgnésium puis évaporéées. Le brut est chromatographié
sur
phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le
produit
(18) est obtenu avec un rendement de 49%.
1111 RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,43 (m, 4H, H-2'), 1,59 (m, 4H, H-3'), 1,79 (s, 2H, OH), 2,50 (m, 2H, H-
2),
2,70 (m, 2H, H-3), 3,24 (m, 4H, H-l'), 3,39 (m, 2H, H-5), 3,72 (m, 6H, H-6, H-
8, H-
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9), 3,9 (m, 2H, H-11), 4,22 ( m, 2H, H-13), 4,58 (m, 1H, H-12), 7,14 (4H, H
thiourée).
13C RMN (CDC13) : b (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'), 27,80 (C-
2),
28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-1l'), 31,25 (C-17), 31,92 (C-12'),
39,78
(C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9), 45,86 (C-11), 46,73 et 47,13 (C-l'), 63,54 (C-
13), 70,97
(C-12), 172,21 (C-1), 174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10).
EXEMPLE 4: Synthèse de la DT-3TU diol
Le composé 2-(3-{2-[3{2-{3-[2{3{diléhadécyl-carbamoyl)propionylamino)-éthyl]
thioureido}-
éthyl)thioui ido]-éthyl} thiouréido)-éthyl]-propane-1,2-diol ou DT-3TU diol
répond à
la formule (I) dans laquelle x = ~--<-
HO OH
m = 2;
RH;
n-- 3;
$=0;
Y= NH-CO-CH2-CH2; et
L = -N(RI)R2 où R1= R2 = C14H29,
Pour synthétiser la DT-3TU diol , on procédera de même à partir de l'amine
(11).
a) Synthèse de la 2 (3-{2-[3{2-{3-[2-(3-(ditéfradécyl-
carbamoyl)propionylamino)-
éthyl]-thiouréido}-éthyl}thiouréido]-éthyl} thiouréido)-éthyl-4-ylméthyl-2,2-
diméthyl-
[1,3]dioxalane (19)
s H 0
16 14
NN 1~ to N~~~NN^/N a a 1 N
H0H H H H s z
0 s 190
18
A 0,19 mmol de l'amine (11) obtenue à l'étape précédente (0,165 g) on ajoute
directement 0,95 mmol de diisopropyléthylamine (0,165 ml) et on laisse agiter
pendant 15 minutes. On additionne ensuite 1,9 ml de dichlorométhane et 0,209
mmol
de l'isothiocyanate (16) (0,027 g) et on laisse réagir à température ambiante
sous
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39
agitation pendant 12 heures. Le mélange est ensuite évaporé puis purifié sur
cartouche en phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 1
00%acétonitrile.
Le produit (19) est obtenu avec un rendement de 49%.
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,25 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,34 et 1,43 (s, 3H, H-18, H-19), 1,48 (m, 4H, H-2'), 1,56 (m, 4H, H-
3'), 2,52
(m, 2H, H-2), 2,68 (m, 2H, H-3), 3,23 (in, 4H, H-l'), 3,37 (m, 2H, H-5), 3,73
(m,
12H, H-6, H-8, H-9, H-11, H-12, H-14), 4,05 (m, 2H, H-16), 4,33 (m, 1H, H-15),
7,14 (6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : 6 (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'),27,00 et
27,17 (C-18, C-19), 27,80 (C-2), 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-
1l'),
31,25 (C-17), 31,92 (C-12'), 39,78 (C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9, C-11), 44,53
(C-14),
46,73 et 47,13(C-l'), 66,87 (C-16), 74,62 (C-15), 109,05 (C-17), 172,21 (C-1),
174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10, C-13, C-16).
b) Synthèse de la 2 (3-{2-[3-(2-{3-[2-(3 (ditétradéryl
trbamoyl)propionylamino)-
éthyl]-thiouréido}-éthyl)-thiouréido]-éthyl}-thiouréido)-éthyl]-propane-1,2-
diol (DT-
3Tudiol) (20)
s s o
12 H H e II H6 H 3
jj 1 ~
e m N 9
H H s 2
H
Ho
OH S 0
On dissout le diol protégé (19) (0,05 g, ,05 mmol) dans 1 mL de solution
HCL 1N/THF (1/1) à t.a; le mélange est agité pendant 18h. le brut est ensuite
extrait
avec par du dichlorométhane (2x 5 ml). Les phases organiques sont rassemblées
puis
neutraliées par une solution d' hydrogénicarbonate de sodium. Les phases
aqueuses
sont extraites par du dichlorométhane. Les phases organiques sont rassemblées
puis
séchées sur sulfate de mgnésium puis évaporéées. Le brut est chromatographié
sur
phase inverse C8 avec un gradient 100% eau jusqu'à 100%acétonitrile. Le
produit
(20) est obtenu avec un rendement de 55%.
1H RMN (CDC13) : 6 (ppm) 0,88 (t, 6H, J=6,3Hz, H-14'), 1,26 (m, 44 H, H-4'-H-
11'), 1,43 (m, 4H, H-2'), 1,59 (m, 4H, H-3'), 1,79 (s, 2H, OH), 2,50 (m, 2H, H-
2),
CA 02446951 2003-11-12
WO 02/092558 PCT/FR02/01626
2,70 (m, 2H, H-3), 3,24 (m, 4H, H-l'), 3,39 (m, 2H, H-5), 3,72 (m, 1OH, H-6, H-
8,
H-9, H-11, H-12), 3,9 (m, 2H, H-14), 4,22 (m, 2H, H-16), 4,58 (m, 1H, H-15),
7,14
(6H, H thiourée).
13C RMN (CDC13) : ô (ppm) 14,06 (C-14'), 22,67 (C-13'), 25,32 (C-3'), 27,80 (C-
2),
5 28,56 (C-2'), 28,84 (C-3), 29,66 (C-4'-C-1 l'), 31,25 (C-17), 31,92 (C-12'),
39,78
(C-5), 43,66 (C-6, C-8, C-9, C-11), 44,53 (C-14), 46,73 et 47,13(C-l'), 63,54
(C-16),
70,97 (C-15), 109,05 (C-17), 172,21 (C-1), 174,14 (C-4), 183,32 (C-7, C-10, C-
13,
C-16).
10 EXEMPLE 5: Compaction de l'acide nucléique en présence de DT-3TU (12)
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de fluorescence au bromure
d'éthidium : l'absence de fluorescence témoigne de l'absence d'acide nucléique
libre
15 ce qui signifie que l'acide nucléique est compacté par le composé
transfectant.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de DT-3TU
(12), par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents
titres dans
les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 l
de
complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 g/ml dans une solution de
20 chlorure de sodium à 150 mM avec des quantités croissantes de DT-3TU (12).
De la même façon, un contrôle a été réalisé en mettant l'acide nucléique en
présence
de quantités croissantes d'EPC (voir Figure 1) ou de DPPC (voir Figure 2), par
mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans les
solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 l de
complexes
25 d'acide nucléique de concentration 0,01 g/ml dans une solution de chlorure
de
sodium à 150 mM avec des quantités croissantes d'EPC ou de DPPC (Figures 1 et
2
respectivement).
CA 02446951 2003-11-12
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41
La fluorescence au bromure d'éthidium est mesurée au fil du temps (mesure à
20 C) en utilisant un FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs d'onde
d'excitation et d'émission de 260 nm et 590 nm respectivement. Les largeurs de
fentes pour l'excitation et l'émission sont réglées à 5 nm. La valeur de
fluorescence
est enregistrée après ajout de 3 gl de bromure d'éthidium à 1 g/l par ml de
solution
ADN/lipide (à 0,01 mg d'ADN/ml).
Les résultats sont résumés dans les Figures 1 et 2.
Dans la Figure 1, la courbe incluant des carrés montre que l'ajout d'une
quantité croissante de mélange lipidique DT-3TU / EPC (0,75 à 20 nmoles de DT-
3TU) par rapport à une quantité fixée d'acide nucléique (8 g) induit une
diminution
de la fluorescence liée à la réduction de l'insertion du bromure d'éthidium
entre les
paires de base de l'ADN. Ceci indique que l'association entre les liposomes DT-
3TU/EPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des
complexes. Nous avons ainsi pu obtenir jusqu'à 90 % d'exclusion de
fluorescence
soit 90 % d'association ADN-lipides DT-3TU/EPC. Afin de montrer le rôle actif
du
lipide DT-3TU dans cette association lipides/ADN, un contrôle a été réalisé.
Il
consiste à observer l'interaction entre le lipide EPC et l'ADN, ceci est
représenté par
la courbe contenant des losanges. Lorsque l'EPC est mise en contact avec de
l'ADN
dans des conditions identiques à celles utilisées pour l'étude des complexes
DT-
3TU/EPC-ADN, seule une faible diminution de fluorescence est observée (environ
5%), qui peut être attribuée à l'augmentation de la turbidité du mélange. Ce
contrôle
reflète donc l'absence d'association de l'EPC seule avec l'ADN dans les
conditions
expérimentales pré-citées.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à s'associer à
l'acide nucléique.
De la même façon, dans la Figure 2, la courbe incluant des carrés montre que
l'ajout d'une quantité croissante de mélange lipidique DT-3TU / DPPC (0,75 à
20
nmoles de DT-3TU) par rapport à une quantité fixée d'acide nucléique (8 g)
induit
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42
une diminution de la fluorescence lorsqu'une quantité identique de bromure
d'éthidium est ajoutée aux différents échantillons. Ceci indique que
l'association
entre les liposomes DT-3TU/DPPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure
le
bromure d'éthidium des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir jusqu'à 90 %
d'exclusion de fluorescence soit 90 % d'association ADN-DT-3TU/DPPC. Afin de
montrer le rôle actif du lipide DT-3TU dans cette association lipides/ADN, un
contrôle a été réalisé. Il consiste à observer l'interaction entre le lipide
DPPC et
l'ADN, ceci est représenté par la courbe contenant des losanges. Lorsque la
DPPC est
mise en contact avec de l'ADN dans des conditions identiques à celles
utilisées pour
l'étude des complexes DT-3TU/DPPC-ADN, seule une faible diminution de
fluorescence est observée (environ 5%). Ce contrôle reflète donc l'absence
d'association de la DPPC seule avec l'ADN dans les conditions expérimentales
pré-
citées.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à s'associer avec
l'acide nucléique.
EXEMPLE 6: Compaction de l'ADN par des complexes DT-3TU/EPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à compacter les acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur
gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la
compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas
sujet à
un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) ont été déposés
différents échantillons ADN/DT-3TU comportant des quantités croissantes de
lipide
DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une
heure
et demie à 70V et 70 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les
bandes
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ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe U.V. Les
résultats sont
représentés dans la Figure 3.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN lorsqu'il n'est pas
associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est
associé aux
lipides. Les puits 2 à 6 représentent l'ADN (0,01g/l) associé à des quantités
croissantes de liposomes DT-3TU/EPC : 0,75 puis 5 puis 10 puis 15 et enfin 20
ninoles de lipide DT-3TU. La comparaison entre le puits 1 et les autres puits
indique
que plus on augmente la quantité de lipide DT-3TU, plus l'ADN est retenu sur
gel
pour être totalement retardé à partir de 3 nmoles de DT-3TU/ g d'ADN, zone
d'agrégation des complexes. Les puits 8 à 13 correspondent respectivement à
l'ADN
seul (0,1 g/l,1 g pour le gel), les lipoplexes formés à la concentration de
0,1 g/1
d'ADN aux rapports lipide/ADN : 0,75 ou 5 ou 10 ou 15 et enfin 20 nmoles/ g
d'ADN. De la même façon, on peut observer qu'à cette concentration d'ADN
compatible avec des expériences in vivo, l'ADN est compacté dès le rapport 5
nmoles
lipide/ g d'ADN.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à compacter
l'acide nucléique.
EXEMPLE 7: Mesure du potentiel Zéta des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à compacter les acides nucléiques tout en conservant une
structure
globalement anionique, neutre, ou très faiblement cationique.
Ceci peut être démontré par une mesure de potentiel Zéta : la mesure donnée
en mV témoigne de la charge de surface de la particule relative à la mobilité
électrophorétique de l'échantillon.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de mélange
lipidique DT-3TU/EPC par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de
différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des
échantillons
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de 2 ml de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01g /1 dans tune
solution
de chlorure de sodium à 20 mlvi avec des quantités croissantes de DT-3TU.
La mesure de potentiel Zéta (mV) est réalisée en utilisant un zetasizerTM 3000
Hsa
(Malvern). La valeur du potentiel est réalisée 3 fois de suite sur 2 ml
d'échantillon
DT-3TU/EPC-ADN. Les résultats sont résumés dans la figure 4.
Les liposomes DT-3TU/EPC sont ajoutés à l'ADN dans une zone allant de
0,75 iunoles à 20 ranoles de lipides par g d'ADN. Dans cette zone de
variation de la
quantité de lipide, le potentiel Zéta varie de -35 mV à +15 mV. La partie
négative
correspond à ce qui est montré dans les Figures 1, 2 et 3, à savoir que le
potentiel Zéta
est négatif lorsque l'ADN n'est pas totalement compacté. Plus on ajoute de
lipide,
plus l'ADN est compacté et plus le potentiel Zéta se rapproche de zéro, les
lipoplexes
présentent alors un potentiel de surface quasiment nul. Le potentiel Zéta
devient
ensuite légèrement positif vers 8 nunoles de lipide/ g d'ADN. La relativité de
cette
mesure doit tenir compte de la comparaison des différents échantillons au
cours d'une
même expérience. Il est ainsi important de noter l'évolution du potentiel Zéta
en
fonction de l'augmentation de la quantité de lipide jusqu'à une valeur
faiblement
positive.
Cet exemple confirme ainsi la compaction de l'ADN par les composés
transfectants selon la présente invention, notamment le DT-3TU, et montre que
les
lipoplexes formés présentent un potentiel de surface proche de la neutralité.
EXEMPLE 8: Transfection in vitro des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à transfecter des cellules in vitro.
Cette étude a été menée pour des lipoplexes comprenant différentes quantités
de DT-3TU : 1,5 ou 5 ou 10 ou 15 ou 20 iunoles de DT-3TU / g d'ADN. Chacune
de ces conditions a été testée avec et sans sérum de veau foetal ( + Sérum
ou -
Sérum )
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Culture des cellules : des cellules HeLa (American type Culture Collection
(ATCC) Rockville, MD, USA) dérivées d'un carcinome d'epithélium cervical
humain, sont mises en culture en présence d'un milieu de type MEM ( minimum
essential meditun ) avec addition de 2 mM de L-glutamine, 50 unités/ml de
pénicilline, et 50 unités/ml de streptomycine. Le milieu et les additifs
proviennent de
Gibco/BRL life Technologies (Gaithersburg, MD,USA). Les cellules sont
cultivées
en flacons à 37 C et à 5 % de dioxyde de carbone en incubateur.
Transfection : un jour avant la transfection, les cellules HeLa sont
transférées
dans des plaques 24 puits avec tm nombre de cellules de 30000 à 50000 par
puits. Ces
dilutions représentent approximativement 80% de confluence après 24 heures.
Pour la transfection, les cellules sont lavées deux fois et incubées à 37 C
avec 500 l
de milieu avec sérum (10 % SVF v/v) ou sans sérum.
50 l de complexes contenant 0,5 g d'ADN plasinidique sont ajoutés dans
chaque
puit (les complexes sont préparés au moins 30 minutes avant l'ajout dans les
puits).
Après deux heures à 37 C les plaques sans sérum sont complérnentés avec 10 %
(v/v)
de SVF ( Sérum de Veau Foetal ).
L'ensemble des plaques est placé 24 heures à 37 C et à 5 % de dioxyde de
carbone.
Détermination de l'activité luciférase: Brièvement, les cellules transfectées
sont lavées deux fois avec 500 pl de PBS (tampon phosphate) puis lysées avec
250 pl de réactif (PromegaTM cell culture lysis reagent, du kit Luciferase
Assay System).
Un aliquote de 10 pl de surnageant du lysat centrifugé (12000 x g) 5 minutes à
4 C est mesuré au luminomètre WallacTM Victor2 (1420 Multilabel couter).
L'activité luciférase est dosée par l'émission de lumière en présence de
luciférine, de
coenzyme A et d'ATP pendant 10 secondes et rapportée à 2000 cellules traitées.
L' activité luciférase est ainsi exprimée en Unité de Lumière Relative ( RLU
:
Relative light unit ) et normalisée avec la concentration de protéines de
l'échantillon obtenue par l'utilisation d'un kit Pierce BCA (Rockford, IL,
USA).
Les résultats résumés dans la Figure 5 montrent une efficacité de
transfection optimale pour les lipoplexes comprenant 5 ou 10 nmoles de DT-3TU
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par pg d'ADN. La présence de sérum induit une faible inhibition de la
transfection
dans tous les cas.
EXEMPLE 9: détermination de la toxicité des lipoplexes DT-3TU/ADN vis-à-vis
des cellules
Le but de cet exemple est d'illustrer l'absence de toxicité des composés
transfectants selon l'invention.
Le niveau de protéine est mesuré après transfection. Le protocole de
transfection est identique à celui décrit pour l'exemple 8.
Détermination du niveau de protéine : Brièvement, les cellules transfectées
sont lavées deux fois avec 500 l de PBS (tampon phosphate) puis lysées avec
250 l
de réactif (Promega cell culture lysis reagent, du kit Luciferase Assay
System).
Un aliquote de 50 l de surnageant du lysat centrifugé (12000 x g) 5 minutes à
4 C
est transféré dans un tube en présence de 50 l d'iodoacétamide 0,1 M, d'acide
chlorhydrique tris 0,1 M à pH 8,2 et laissé 1 heure à 37 C. 20 l des
solutions
précédentes sont déposés dans une plaque de 96 puits et 200 l de réactif
BCA
protein assay (Pierce, Montluson, France) sont ajoutés. La plaque est alors
centrifugée à 2500 tours/min. puis incubée à 37 C pendant 30 minutes. En
parallèle,
une gamme d'albumine de sérum bovin (BSA) est réalisée afin de corréler la
valeur
d'absorbante obtenue pour les échantillons à une quantité de protéine présente
dans
l'échantillon.
Les résultats résumés dans la Figure 6 montrent un niveau de protéine
similaire quelle que soit la condition utilisée, les lipoplexes comprenant
0,75 ou 5 ou
10 ou 15 ou 20 nmoles de DT-3TU par g d'ADN. La présence de lipide DT-3TU
n'altère donc pas la cellule et aucune toxicité n'a été observée dans les
conditions
utilisées.
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47
Cet exemple illustre donc un des avantages majeurs des composés
transfectants selon l'invention, à savoir leur très faible toxicité
probablement liée
à l'absence de charges positives dans leur structure.
EXEMPLE 10 : Compaction de l'acide nucléique par des nanoémulsions de DT-
3TU /DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur
gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la
compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas
sujet à
un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) sont déposés
différents échantillons ADN/DT-3TU comportant différentes formulations de
lipide
DT-3TU par rapport à l'ADN. Le gel est soumis à un courant électrique d'une
heure
et demie à 70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les
bandes
ont été révélées avec du BET et par absorption sous une lampe U.V. Les
résultats sont
représentés dans la figure 7.
De la même façon, la capacité du composé DT-3TU diol à compacter l'ADN
est montrée par un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) sur lequel
sont
déposés différents échantillons ADN/DT-3TUdiol comportant différentes
formulations de lipide DT-3TUdiol par rapport à l'ADN. Le gel est soumis à un
courant électrique d'une heure et demie à 70V et 40 mA afin de faire migrer
l'ADN
par électrophorèse. Les bandes sont révélées avec du BET et par absorption
sous une
lampe U.V..
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48
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN lorsqu'il n'est pas
associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est
associé aux
lipides. Les puits 2 à 5 représentent l'ADN (0,01g/1) associé à des
nanoémulsions de
DT-3TU/DPPC (60nmol DT-3TU/ g d'ADN) contenant ou pas du calcium et de
l'éthanol. Le puits 2 représente 60nmo1/ g d'ADN sans Cal-', sans EtOH, dans
le
puits 3 a été ajouté 2% EtOH, dans le puits 4, 60eq Cal+/ PO- ADN, dans le
puits 5,
2% EtOH et 60eq de Cal+. La comparaison entre le puits 1 et les autres puits
indique
que les différentes formulations de DT-3TU étudiées retardent la migration de
l'ADN
sur le gel, ce qui a également été obtenu après dialyse des constituants Ca2+
et EtOH.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU incorporé dans
différentes formulations à compacter l'acide nucléique.
EXEMPLE 11 : Compaction de l'acide nucléique par des complexes stabilisés de
DT-3TU /DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur
gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'absence de migration de l'acide nucléique sur le gel témoigne de la
compaction de l'acide nucléique. L'acide nucléique libre quant à lui n'est pas
sujet à
un retard sur gel.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) ont été déposés
différents échantillons ADN/DT-3TU/DPPC et ADN/DT-3TUdiol/DPPC comportant
des quantités croissantes de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN associées ou
pas à du
cholestérol-PEG. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et
demie à
70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été
CA 02446951 2010-11-03
49
révélées avec du BET et par absorption sous une lampe U.V. Les résultats
sont représentés dans la Figure 8.
L'avantage de l'insertion de cholestérol-PEG dans les formulations DT-
3TU/DPPC provient de la possibilité de réduire la taille des particules à une
quantité
de lipide qui conduirait à une aggrégation sans insertion de lipide-PEG.
L'intérêt est
d'optimiser les quantités de transfectants injectés in vivo. En effet, les
tailles des
particules requises pour avoir des objets furtifs vis-à-vis des protéines
sériques et
ainsi un temps de demi-vie augmenté dans la circulation sanguine devraient
être
majoritairement inférieures à 500m-n. Or pour obtenir des tailles de
particules de cet
ordre, il est nécessaire d'utiliser au moins 40mnol de lipide DT-3TU/ g d'ADN.
L'insertion de lipide-PEG dans les formulations de lipide DT-3TU permet de
réduire
la quantité de DT-3TU nécessaire à une compaction de l'ADN et à la formation
de
particules majoritairement inférieures à 500 nm.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN lorsqu'il n'est pas
associé aux lipides (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il est
associé aux
lipides. Les puits 2 à 5 représentent l'ADN (0,01g/t) associé à des quantités
croissantes de nanoémulsions de DT-3TU/DPPC contenant ou pas du cholesterol-
PEG (20 motifs ethylène glycol) comme agent de stabilisation des particules.
Le puits
2 représente 20mnol/ g d'ADN + 15% chol-PEG, le puits 3 comporte 20mnol/ELg
d'ADN +20% chol-PEG, le puits 4 représente 30mnol/ g d'ADN +15% chol-PEG et
le puits 5 représente 20nmol/ g d'ADN +20% chol-PEG. La comparaison entre le
puits 1 et les autres puits indique que les différentes formulations de DT-3TU
étudiées retardent la migration de l'ADN sur le gel, indiquant la possibilité
d'incorporer à ces formulations des polymères de polyethylène glycol sans
libérer
l'ADN des complexes, donc sans les déstabiliser.
EXEMPLE 12 : Compaction de l'acide nucléique en présence de DT-4TU (15)
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à s'associer aux acides nucléiques.
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Ceci peut être aisément démontré par un test de fluorescence au bromure
d'éthidium : l'absence de fluorescence témoigne de l'absence d'acide nucléique
libre
ce qui signifie que l'acide nucléique est compacté par le composé
transfectant.
L'acide nucléique est mis en présence de quantités croissantes de DT-4TU,
par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de différents titres dans
les
solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des échantillons de 800 ffl de
complexes
d'acide nucléique de concentration 0,01 g/ml dans une solution de chlorure de
sodium à 150 n1M avec des quantités croissantes de DT-4TU (15).
De la même façon, un contrôle a été réalisé en mettant l'acide nucléique en
présence de quantités croissantes de DT-3TU (12) pour comparer les efficacités
de
complexion d'un lipide comportant 3 thiourées (voir Figure 2) par rapport à un
lipide
portant 4 thiourées, par mélange équivolumétrique de solutions lipidiques de
différents titres dans les solutions d'acide nucléique. On prépare ainsi des
échantillons
de 800 l de complexes d'acide nucléique de concentration 0,01 g/m1 dans une
solution de 5% glucose avec des quantités croissantes de DPPC.
La fluorescence au bromure d'éthidium est mesurée en utilisant un
FluoroMax-2 (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs d'onde d'excitation et
d'émission de 260 mn et 590 nm respectivement. Les largeurs de fentes pour
l'excitation et l'émission sont réglées à 5 iun. La valeur de fluorescence est
enregistrée après ajout de 3 l de bromure d'éthidium (lg/1) par ml de
solution
ADN/lipide (0,01 g/I d'ADN). Les résultats sont résumés dans la Figure 9.
La courbe incluant des carrés montre que l'ajout d'une quantité croissante de
mélange lipidique DT-3TU / DPPC (0,75 à 30 nmoles de DT-3TU) par rapport à une
quantité fixée d'acide nucléique (8 g) induit une diminution de la
fluorescence liée à
la réduction de l'insertion du bromure d'éthidium entre les paires de bases de
l'ADN.
Ceci indique que l'association entre les liposomes DT-3TU/DPPC et l'ADN est
CA 02446951 2011-06-22
51
suffisamment forte pour exclure le bromure d'éthidium des complexes. Nous
avons
ainsi pu obtenir 70% de compaction de l'ADN en utilisant 30nmol de lipides DT-
3TU/DPPC par pg d'ADN. Le rôle actif du lipide DT-3TU dans cette association
lipides/ADN a été montré dans les figures 1 et 2. De la même façon des
quantités
croissantes de mélange lipidique DT-4TU/DPPC (0,75 à 30 nmoles de DT-3TU) ont
été ajoutées à une quantité fixée d'acide nucléique (8 g). Cette association
induit une
diminution de la fluorescence liée à la réduction de l'insertion du bromure
d'éthidium
entre les paires de bases de l'ADN. Ceci indique que l'association entre les
liposomes
DT-4TU/DPPC et l'ADN est suffisamment forte pour exclure le bromure
d'éthidiiun
des complexes. Nous avons ainsi pu obtenir 60% de compaction de l'ADN pour
30nmoles de lipide/pg d'ADN (cercles, figure 9), ce qui est comparable avec
l'efficacité de complexion de la DT-3TU dans les mêmes conditions.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-4TU à s'associer à l'acide
nucléique.
EXEMPLE 13 : Protection de l'ADN vis-à-vis des DNAses par des complexes
DT-3TU/DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à protéger les acides nucléiques des hydrolyses enzymatiques
dont
les DNases.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur
gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'ADN libre ou complexé avec le lipide est traité par une quantité
appropriée
de DNase. L'ADN, extrait du milieu de digestion enzymatique, est déposé sur
gel et
son intégrité est vérifiée par comparaison de sa migration avec celle de
l'acide
nucléique non traité.
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) ont été déposés
différents échantillons d'ADN extrait qui a préalablement été traité par 2.10-
4 M de
DNase (Sigma). Le traitement de la DNase a été réalisé sur l'ADN libre et sur
l'ADN
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51a
complexé avec des quantités croissantes de lipide DT-3TU par rapport à l'ADN.
Le
gel a été soumis à un courant électrique d'une heure et demie à 70V et 70 mA
afin de
faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont été révélées avec du BET
et
par absorption sous une lampe U.V.. Les résultats sont représentés dans la
Figure
10.
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52
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN non traité par la
DNase (puits 1), puis sa différence de rétention lorsqu'il a été traité par la
DNase. Le
puits 2 représente la même quantité d'ADN (3 g) traitée par 2.10"4 M de DNase.
Suite à ce traitement (2.10-4 M DNase, 30min. 37 C), la bande correspondant à
l'ADN n'est pas révélée ce qui indique une dégradation de l'ADN. L'acide
nucléique,
complexé par 30 et 40 nmol de lipide DT-3TU par g d'ADN et par 40 nmol de
lipide DT-3TU + 6% Chol-PEG a été traité avec 2.10-4 M de DNase. Après
extraction
de l'ADN par un mélange phénol/chloroforme et précipitation de ce dernier,
l'acide
nucléique a été déposé sur ce gel dans les puits 3, 4 et 5 respectivement.
L'ADN
migre de façon comparable à l'ADN non traité à la DNase ce qui indique que
l'ADN
est intègre, il n'a pas été dégradé par le traitement à la DNase, il a donc
été protégé
par le lipide DT-3TU. L'ADN dans les complexes de lipide DT-3TU n'est donc pas
accessible à l'hydrolyse enzymatique, il est protégé de l'hydrolyse des
DNases.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à protéger l'acide
nucléique
de l'hydrolyse enzymatique.
EXEMPLE 14 : Protection de l'ADN vis-à-vis du sérum par des complexes DT-
3TU/DPPC
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à protéger les acides nucléiques des dégradations dans un
milieu
sérique.
Ceci peut être aisément démontré par un test de retard électrophorétique sur
gel d'agarose de l'ADN mis en évidence par utilisation de bromure d'éthidium
(BET) : l'ADN libre ou complexé avec le lipide est incubé dans différentes
proportions de sérum à 37 C. L'ADN, extrait du milieu sérique, est déposé sur
gel et
son intégrité est vérifiée par comparaison de sa migration avec celle de
l'acide
nucléique non traité.
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53
Sur un gel d'agarose (0,8 % d'agarose dans du TBE 1N) ont été déposés
différents échantillons d'ADN extrait qui a préalablement été incubé dans
150mM
NaCI, 20% sérum et 100% sérum. Les traitements salin et sérique ont été
réalisés sur
l'ADN libre et sur l'ADN complexé avec des quantités croissantes de lipide DT-
3TU
par rapport à l'ADN. Le gel a été soumis à un courant électrique d'une heure
et demie
à 70V et 40 mA afin de faire migrer l'ADN par électrophorèse. Les bandes ont
été
révélées avec du BET et par absorption sous une lampe U.V.. Les résultats sont
représentés dans la figure 11.
Le gel montre la migration électrophorétique de l'ADN témoin (puits 1), puis
sa différence de rétention lorsqu'il a été traité, non complexé, en milieu
salin (15OmM
NaCI) (puits 2), lorsqu'il est complexé par 40 mnol de lipide DT-3TU/ g d'ADN
(puits 3). La migration de l'ADN extrait du milieu salin est comparable pour
les 2
puits indiquant que l'ADN reste intègre dans ces conditions. Les puits
suivants
montrent dans le même ordre l'ADN (puits 4 et 6) et l'ADN + 40mnol de lipide
DT-
3TU (puits 5 et 7) dans deux conditions sériques différentes : 20% sérum pour
les
puits 4 et 5 et 100% sérum pour les puits 6 et 7. Lorsque l'ADN est libre, il
est
totalement dégradé dans les deux conditions de sérum étudiées au bout de 30
minutes
à 37 C (puits 4 et 6). En revanche, la complexion de l'ADN avec les
nanoémulsions
constituées de DT-3TU/DPPC conduit à la protection de l'acide nucléique
puisque la
bande de migration correspondante à l'ADN est révélée (puits 5 et 7). L'ADN
dans
les complexes de lipide DT-3TU est donc protégé de la dégradation en milieu
sérique
par rapport à l'ADN nu.
Cet exemple illustre ainsi la capacité du lipide DT-3TU à protéger l'acide
nucléique de la dégradation dans le sérum.
EXEMPLE 15: Transfection in vivo des compositions DT-3TU/ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité clés composés transfectants
selon l'invention à transfecter des tissus biologiques in vivo.
Ceci peut être démontré par injection intramusculaire de complexes d'ADN
codant pour la luciférase. Les prélèvements des muscles sont alors effectués
96h
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après l'injection et le niveau de l'expression de la luciférase est mesuré en
utilisant un
lurninomètre (wallac).
Des complexes comportant des quantités croissantes de lipide DT-3TU par g
d'ADN ont été injectés dans les deux muscles tibial cranial de souris,
auxquels ont été
appliqués ou non des pulsations électriques (Bureau, M et al, BBA 2000,
1474(3):353-9).
Des complexes comportant des quantités croissantes 40 et 60 runol de lipide
DT-3TU par pg d'ADN sont injectés sous un volume de 30 L à raison de 3 g
d'ADN par animal dans les deux muscles tibial cranial de souris C57b1/6
anesthésiées
avec un mélange de Kétamin/Xylazine. Cette injection a été suivie ou non de
l'application de pulsations électriques transcutanées appliquées par
l'intermédiaire
d'électrodes situées de part et d'autre du muscle (Bureau, M et al, BBA 2000,
1474(3): 353-9).
Après euthanasie des souris 96h post-injection, les muscles sont prélevés et
broyés dans 1ml de tampon de lyse. Après centrifugation (10min., 12000tr/min,
4 C),
10 l de surnageant sont prélevés et déposés dans des plaques 96 puits pour
lecture de
la luciférase après ajout de 50 1 de substrat luciférase. Le niveau arbitraire
de
luminescence est lu dans le surnageant en utilisant un luuninomètre (Wallac,
Victor).
Les valeurs obtenues sont indiquées dans la figure 12. Elles représentent les
niveaux d'expression relatif à la dose de lipide associée à l'acide nucléique,
20 et 40
nmol de lipide DT-3TU/ g d'ADN. Les niveaux d'expression obtenus sont
significatifs, et supérieurs au bruit de fond représentés par le muscle pris
comme
contrôle qui correspond à 5.104. L'ADN complexé par des quantités différentes
de
lipide DT-3TU est donc capable de transfecter les tissus musculaires avec un
niveau
de transfection significatif.
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Cet exemple illustre la capacité des composés transfectants selon l'invention
à
transfecter des tissus in vivo.
EXEMPLE 16: Biodistribution in vivo des complexes DT-3TU/DPPC/.ADN
Le but de cet exemple est d'illustrer la capacité des composés transfectants
selon l'invention à circuler longuement dans la circulation in vivo en raison
de leur
caractère neutre.
Ceci peut être démontré par injection de complexes d'ADN contenant un
10 lipide fluorescent dans la circulation sanguine de souris. Des prélèvements
sanguins
sont alors effectués à différents temps après l'injection et le niveau de
fluorescence
dans la circulation est mesuré en utilisant un FluoroMax-2 TM (Jobin Yvon-
Spex).
Des complexes comportant 40 nmol de lipide DT-3TU par g d'ADN, 1
équivalent molaire de lipide DPPC/DT-3TU et 0.7% de lipide-rhodamine par
rapport
aux lipides totaux ont été injectés sous un volume de 200 . l à raison de 11
p.g d'ADN
par animal dans la veine caudale de souris C57b1/6 anesthésiées avec un
mélange de
Kétamin/Xylazine.
A 30 minutes, lh et 6h post-injection, le sang est prélevé par ponction
intracardiaque sur souris anesthésiée. Après euthanasie des souris, le foie,
la rate et
20 les poumons sont immédiatement prélevés, pesés et homogénéisés dans du PBS
(5
l/mg de tissu). Les lipides sont extraits à partir de 100 l de sang et des
homogénats
des organes avec 3 ml d'un mélange 1/1 de chloroforme et méthanol par
agitation
vigoureuse pendant 30 min puis par centrifugation. La fluorescence est lue
dans le
surnageant en utilisant un FluoroMax-21M (Jobin Yvon-Spex), avec des longueurs
d'onde d'excitation et d'émission de 550 nm et 590 nm respectivement. Les
largeurs de fentes pour l'excitation et l'émission sont réglées à 5 nm.
Les valeurs obtenues sont indiquées dans la figure 13. Elles représentent le
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55a
pourcentage de la dose injectée obtenu dans le sang, les poumons et le système
réticulo-endothélial (foie et rate cumulés) 30 minutes, 1 h et 6h après
injection. La
mesure de fluorescence dans le sang après 30 minutes représente 50% de la dose
injectée ce qui est largement supérieur à ce qui peut être obtenu avec des
surfactants
de l'ADN de type cationique. Après Ili, 17% de la dose injectée a pu être
retrouvée ce
qui là encore représente une remarquable amélioration par rapport à des
complexes
cationiques. Le caractère neutre de ces complexes lipide/ADN (zeta très
faiblement
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WO 02/092558 PCT/FR02/01626
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positif : figure 4) présente donc un réel avantage pour obtenir des particules
furtives
aux protéines sériques. Il devrait également limiter leurs interactions avec
les
macrophages et les cellules de kupffer de la rate et du foie ce qui peut
expliquer la
quantité de liposome retrouvée à 30 min et 1 h dans le sang.
La quantité de lipoplexe retrouvé dans le poumon est faible comparativement
à celle qu'on retrouve dans le cas des lipoplexes cationiques. La neutralité
de ces
liposomes devrait également diminuer les interactions non spécifiques avec
l' endothélium négatif des poumons.
Cet exemple illustre la capacité des composés transfectants selon
l'invention à être furtifs vis-à-vis des protéines sériques.
