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PROCEDE DE SELECTION DE LIGANDS D'HLA-DP4
ET SES APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un procédé de sélection de
ligands d'HLA-DP4 et à ses applications.
Les lymphocytes T CD4+ font partie des principales cellules régu-
latrices de la réponse immunitaire. Spécifiques des antigènes, ils sont en
effet capables
de reconnaître la présence d'un agent pathogène, d'un allergène ou d'une
cellule
tumorale et de déclencher une réponse immunitaire. La reconnaissance de ces
anti-
gènes conduit en effet à l'activation des lymphocytes T CD4+ qui sécrètent la
plupart
des cytokines nécessaires au recnitement de cellules effectrices que sont les
lympho-
cytes CD8+ cytotoxiques et les lymphocytes B producteurs d'anticorps. Les
lympho-
cytes T CD4+ interviennent également dans l'activation des cellules par des
contacts
cellulaires et par exemple induisent l'activation, par la molécule CD40, des
cellules
dendritiques présentatrices de l'antigène. L'activation des lymphocytes T CD4+
est un
pronostic favorable lors des infections par des virus tels que le virus de
l'immunodéfi-
cience humaine (VIH), les papillomavirus humains (HPV) ou le virus de
l'hépatite C
(HCV) et ces cellules apparaissent comme nécessaires à l'immunité anti-
tumorale.
Leur rôle n'est toutefois pas systématiquement bénéfique pour l'organisme. Les
mala-
dies autoimmunes résultent très souvent d'une activation incontrôlée de
lymphocytes
T CD4+. C'est le cas de la sclérose en plaque et du diabète insulino-
dépendant. Ces
lymphocytes contribuent également à l'établissement des maladies allergiques.
L'IL4,
qui est principalement sécrétée par les lymphocytes T CD4+, est en effet le
principal
facteur qui conduit à la production d'IgE. Enfin, le rôle des lymphocytes T
CD4+ dans
le déclenchement du rejet de greffe est bien établi. Ainsi, selon la maladie,
les traite-
menu visent à déclencher l'activation des lymphocytes T CD4+. (vaccination
contre un
agent pathogène ou une cellule tumorale) ou à diminuer l'état d'activation des
lympho-
cytes T CD4+ (désensibilisation contre l'allergie, prévention du rejet de
greffe).
L'activation des lymphocytes T CD4+ se fait sous l'effet de la pré-
sentation de peptides antigéniques par les molécules du complexe majeur
d'histo-
compatibilité de type II que portent les cellules présentatrices d'antigène
(APC pour
Antigen Presenting Celn ; chez l'homme, elles sont dénommées molécules HLA II
pour Ha~man Leucocyte Antigen type II. Ces peptides antigéniques, appelés
épitopes T,
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résultent de la dégradation protéolytique des antigènes par les cellules
présentatrices
d'antigène. Ils ont des longueurs variables, généralement de 13 à 25 acides
aminés et
possèdent une séquence qui les rend capables de se lier aux molécules HLA II.
Il est
bien connu qu'au même titre que l'antigène natif, un peptide épitope T est
capable de
stimuler in vitro des lymphocytes T CD4+ qui lui sont spécifiques ou de les
recruter in
vivo. Il est donc suffisant pour induire une réponse T CD4+. D'une manière
intéres-
sante, on sait également que selon les modes de présentation (voie
d'administration,
doses, adjonction ou non d'un adjuvant), la reconnaissance de ces peptides
entraîne
soit une activation des lymphocytes T CD4+ (ALEXANDER et al., J. Immacnol.,
2000,
164, 1625-1633 ; DEL GUERCIO et al., Vaccine, 1997, 15, 441-448 ; FRANKE et
al.,
Vaccine, 1999, 17, 1201-1205), soit leur anergie (MULLER et al., J. Allergy
Clin.
Immunol., 1998, 101, 747-754 ; OLDFIELD et al., J. Immunol., 2001, 167, 1734-
1739). Cés peptides épitopes T sont donc susceptibles à la fois de participer
à la
composition d'un vaccin ou de servir à diminuer l'activation non désirée de
lympho-
cytes T CD4+. Ils sont également susceptibles de participer à un test de
diagnostic de
l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux reposant sur la
détection directe
(test de prolifération lymphocytaire) ou indirecte (production d'anticorps, de
cyto-
kines...) desdits lymphocytes T CD4+ activés.
Un des problèmes majeurs qui limite l'utilisation de ces peptides est
l'identification de ces épitopes, étant donné que leur séquence varie d'un
individu à
l'autre en raison du polymorphisme des molécules HLA II. En effet, les
molécules
HLA II sont des hétérodimères constituées d'une chaîne alpha (a) et d'une
chaîne béta
((3) polymorphes. II existe quatre types de molécules HLA II par individu (2
HLA-DR,
1 HLA-DQ et 1 HLA-DP). La molécule HLA-DR dont la chaîne béta ((3) est codée
par le gène DRB1 est la plus exprimée. A ce jour, la chaîne béta codée par le
gène
DRB 1 est la plus polymorphe et compte 273 allèles. Pour les molécules HLA-DQ
et
HLA-DP, les deux chaînes (a et (3) qui les constituent sont polymorphes mais
elles
présentent moins d'allèles. On compte en effet 21 allèles DQA1 (chaîne a de
HLA-
DQ), 45 allèles DQB1 (chaîne (3 de HLA-DQ), 19 allèles DPA1 (chaîne a de HLA-
DP) et 93 allèles DPB1 (chaîne (3 de HLA-DP). Cependant, la combinaison entre
les
deux chaînes a et ~i codées par ces allèles donne naissance à de nombreuses
molécules
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HLA-DQ et HLA-DP. Du fait de ce polymorphisme, ces isoformes possèdent des pro-
priétés de liaison différentes entre elles, ce qui implique qu'elles peuvent
lier des
peptides différents d'un même antigène. Ainsi, chaque individu reconnaît dans
un
antigène un ensemble de peptides dont la nature dépend des molécules HLA II
qui le
caractérise. Comme il existe un grand nombre d'allèles I-ILA II, on peut
supposer qu'il
existe dans une séquence donnée un répertoire important de peptides épitopes T
de
séquences très différentes, chacun spécifique d'un allèle différent.
Toutefois, cette diversité de molécules HLA II n'est pas aussi
importante à l'échelle de chaque population qu'à l'échelle mondiale comme
illustré par
le Tableau I ci-dessous.
Tableau I : Fréquences géniques des molécules HLA de classe II les plus
abondantes
dans la population Caucasienne (Europe, USA) ', d'après Colombani J., 1993,
HLA:
fonctions immzmitaires et applications médicales, Eds John Libbey Eurotext.
Molécules Chaîne a Fréquence Chaîne (3 Fréquence Molécules abondantes
(%)
ini v
HLA-DR DRA*0101 100 DRB 1 *01019,3 DRA*0101 /DRB 1
*0101
DRB I * 8,0 DRA*O 101/DRB 1
1501 * 1501
DRB 1 *030110,9 DRA*0101/DRB 1
*0301
DRB 1 *04015,6 DRA*0101/DRB 1
*0401
DRB 1 * 9,2 DRA*0101/DRB 1
1101 * I 101
DRB 1 * 6,0 DRA*0101/DRB 1
1301 * 1301
DRB 1 *070114,0 DRA*0101/DRB 1
*0701
DRB3*0101 9,2 DRA*0101/DRB3*0101
DRB3*0202 12,0 DRA*0101/DRB1*0202
DRB4*0101 28,4 DRA*0101/DRB4*0101
DRBS*0101 7,9 DRA*0101/ DRBS*0101
HLA-DQ DQA I *010117,0 DQB 1 *050114,9 DQA1 *0101/ DQB
1 *0501
DQA 1 *0102 15,8 DQB 1 *06029,8 DQA 1 *0501/ DQB
1 *0301
DQA 1 *0201 12,4 DQB 1 *06035,8 DQA I *0501/ DQB
1 *0201
DQA 1 *0301 14,5 DQB 1 *020121,3 DQA 1 *0301/ DQB
1 *0302
DQA 1 *0501 20,9 DQB 1 *030112,0 DQA 1 *0102/ DQB
1 *0602
DQB 1 *030213,0 DQA 1 *0201/ DQB
1 *0201
HLA-DP DPA1 *010378,2 DPB 1 *01017,1 DPA 1 *0201/ DPB
1 *0101
DPA 1 *0201 21,2 DPB 1 *020111,9 DPA I *0103/ DPB
1 *0201
DPB 1 *03019,1 DPA 1 *0103/ DPB
1 *0301
DPB1*0401 40,1 DPA1*0103/DPB1*0401
DPB1*0402 11,0 DPA1*0103/ DPB1*0402
'Les fréquences géniques des 2 molécules HLA-DP4 sont indiquées en gras
Ainsi, pour les molécules HLA-DR et HLA-DQ, une dizaine
d'allèles suffisent pour couvrir plus de 60 % de la fréquence génique
retrouvée dans la
population caucasienne et donc concerner plus de 85 % de la population
caucasienne.
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Pour les molécules HLA-DP, la molécule la plus fréquente est la
molécule DP4 issue des allèles DPA 1 *0103 et DPB I *0401 qui ont des
fréquences
géniques de 78,2 % et 40 % respectivement. Trois autres molécules DP ont des
fréquences qui dépassent les 5 % : une molécule DP3 (DPA1*0103/DPB1*0301), une
molécule DP2 (DPA1 *0103/DPB 1 *0201) et une molécule DP4
(DPA 1 *0103/DPB 1 *0402) ; les molécules HLA II sont dénommées en fonction de
l'allèle DPB 1 codant la chaîne ~ qui est la plus polymorphe.
Ainsi, quatre molécules HLA-DP (1 molécule DP3, I molécule DP2
et 2 molécules DP4) suffisent donc pour couvrir 71 % de la fréquence génique
de la
population caucasienne, les deux molécules DP4, couvrant à elles seules 51 %.
Chacune de ces molécules DP4 comprend une chaîne a variable codée, soit par
DPA 1 *0103 qui est la plus fréquente (78,2 %), soit par DPA1 *0201 (20,2 %),
les
deux chaînes a différant uniquement au niveau de 3 acides aminés (positions 3
I, 50 et
83 ; Tableau II). Les molécules HLA-DP4 qui présentent une fréquence allélique
élevée dans la population caucasienne (de l'ordre de 50 % en Europe et 80 % en
Amérique du Nord), sont également présentes à des fréquences non négligeables
dans
les autres populations (fréquence allélique de l'ordre de 60 % en Amérique du
Sud, 60
en Inde, 25 % en Afrique et 15 % au Japon, Colombani et al., précité).
Tableau II : Polymorphisme des chaînes a et ~3 des molécules HLA-DP dans la
population Caucasienne (Europe, USA), d'après Colombani J., précité.
Positions polymorphiques*
Chane a AlllesFreq 8 9 11 37 57 5859 67 78 8687 8889
(%) 38 71
401 40.1 L F G F A A E I M G G P M
A K
402 11.0 _ _ _ _ D E _ _ _ _ _ _ _
V _
201 11.9 - - - - D E - - - - - - -
V E
501 1.3 - - - L E - - - - D - -
V -
101 7.1 V Y G Y - - - - - D E A V
- -
301 9.1 V Y L - D E D L V D E A V
V -
901 1.1 V H L - D E D I V D E A V
V E
Chaine a Freq 31 5083
Allles (%)
103 78.2 M Q T
201 21.2 Q R A
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'' Les séquences, disponibles sur le site internet
http://www.ebi.ac.ulJim~t/hla, sont numérotées selon la
numérotation de STERN et al. (Natzzre, 1994, 368, 215-221 ) pour la molécule
HLA-DR ; comme les
résidus en positions 23 et 24 sont absents dans les séquences de DPB, les
résidus indiqués aux positions
37, 38, 57, 59, 67, 71, 78, 86, 87, 88 et 89 correspondent respectivement aux
positions 35, 36, 55, 56,
5 57, 65, 69, 76, 84, 85, 86 et 87 dans la séquence de DPB.
Pourtant, malgré leur fréquence élevée chacune de ces molécules
DP4 n'a été que très partiellement étudiée ; les études les plus nombreuses
résultent en
fait de l'isolement de clones de lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules
HLA-
DP4 et spécifiques des peptides présentés dans le Tableau III, ci-après, issus
des anti-
gènes suivants
- antigènes de microorganismes pathogènes tels que la toxine
tétanique (WYSS CORAY et al., Eacr J. Immunol, 1992, 22, 2295), l'antigène WI-
1 de
Blastomyces dermatitidis (CHANG et al., Inf. Immun., 2000, 68, 502), la
protéine hsp
65 de Mycobacterizcm bovis (GASTON et al., Int. Immunol., 1991, 3, 965-972),
l'anti-
gène S du virus de l'hépatite B (HBsAg pour Hepatitis B virus S antigen ;
CELIS et
al., J. Virol., 1989, 63, 747), la phosphoprotéine du virus de la rage (RV-NS
pour
Rabies Virus Non-Structural phosphoprotein) ou la neuraminidase du virus de la
grippe (IBV-Nm pour influenza B virus Nezcraminidase ; CELIS et al., J.
Immzcnol.,
1990, 145, 305) et la protéine UL21 du virus de l'herpes simplex de type 1
(KOELLE
et al., J. Virol., 2000, 74, 10930-10938),
- allergènes tels que l'allergène majeur de Derrnatophagoides ptero-
nyssinus (HIGGINS, J. Allergy Clin. Immunol., 1992, 90, 749), et
- antigènes tumoraux tels que MAGE-A3 (SCHULTZ et al., Cancer
Res., 2000, 60, 6272), et NY-ESO1 (ZENG et al., P. N. A. S., 2001, 98, 3964-
3969).
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Tableau III: Séquences des peptides ligands des molécules HLA-DP4
Peptides Squences Numro Rfrence
d'identification
TT 947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE SEQ ID N0:1 Wyss Coray
et al., 1992
PSN 265 DPYNCDWDPYHEKYDWDLWNKWCNSEO ID N0:2 Chang et al.,
2000
S1d FFLLTRILTI SEQ ID N0:3 Celis et al.,
HBsA 19-28 1989
NS-p2 GVQIVROIRSGERFLKIWSO SEQ ID N0:4 Celis et al.,
RV NS 101-120 1990
FLU-p1 GISKCRFLKIREGR SEQ ID N0:5 Celis et al.,
VIB Nm 1990.
247-260
MT 451-466IAFNSGMEPGVVAEKV SEO ID N0:6 Gaston et
a1.,1991
MT 456-471GMEPGVVAEKVRNLSV SEQ ID N0:7 Gaston et
a1.,1991
Derp 101-119PNAQRFGISNYCQIYP SEO ID N0:8 Higgins, 1992
MAG 247-258TQHFVQENYLEY SEQ ID N0:9 Schultz et
al., 2000
NY-ES01 MWITQCFLPVFLAQPPSGOR SEQ ID N0:10Zeng et al.,
161-180 2001
NY-ES01 QLSLLMWITQCFLPVFLAQPP SEO ID N0:11Zeng et al.,
156-175 2001
UL21 283-293RELWWVFYAGD SEQ ID N0:12Koelle et
a1.,2000
IL3 127-146GPGAPADVOYDLYLNVANRR SEQ ID N0:13Falk et al.,
1994
UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL SEQ ID N0:14Falk et al.,
UNK 1-17 1994
UNK2 KKYFAATQFEPLAARL SEQ ID N0:15Falk et al.,
UNK 2-17 1994
UNK3 EKKYFAATQFEPL SEQ ID N0:16Falk et al.,
UNK 1-13) 1994
Les études précitées qui reposent sur l'isolement de clones de
lymphocytes T CD4+ restreints aux molécules HLA-DP4 mettent en oeuvre un test
fonctionnel (test de prolifération) qui n'a pas permis de mettre en évidence
un motif de
liaison aux molécules DP4, partagé par l'ensemble de ces peptides. En outre,
ce test
est très lourd à mettre en oeuvre du fait qu'il nécessite de nombreux patients
correc-
terrent échantillonnés, de manière à ce qu'ils représentent la diversité des
molécules
HLA II de l'ensemble de la population. En outre, les épitopes définis sont
ceux utilisés
par le système immunitaire des patients lors de l'infection naturelle par un
antigène ;
ces épitopes ne sont pas nécessairement les plus efficaces pour induire une
réponse
immunitaire contre ce même antigène.
En utilisant une autre approche, à savoir l'analyse de quatre peptides
naturellement présents sur les molécules DP4 [peptide 127-146 de la chaîne a
du
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récepteur de l'IL3 (IL3 127-146 ; SEQ ID N0:13) et trois peptides d'origine
inconnue : LTNK1 (SEQ ID N0:14), LJNK2 (SEQ ID N0:15) et LJNK3 (SEQ ID
N0:16) ; Tableau III], FALK et al. (Immunogenetics, 1994, 39, 230-242) ont
proposé
une séquence consensus de liaison aux molécules DP4. Cette séquence comprend
trois
résidus d'ancrage respectivement en positions P l, P7 et P9/P 10. P 1 et P7
sont hydro-
phobes ou aromatiques (Y, V, L, F, I, A, M, W) et P9/P 10 sont de préférence
alipha-
tiques ; toutefois, un résidu Y est toléré en position P9/P10 mais pas un
résidu F. Les
résidus P 1 et P7 sont précédés de groupes de résidus chargés (K, R, E, N, Q
pour P 1 et
N, K, E pour P7), et des résidus de petite taille (A, V) sont fréquents en
position P3 et
P9. Le Tableau III montre que les seuls autres peptides ligands de DP4
présentant ce
motif sont les peptides chevauchants NY-ESO1 161-180 et NY- ESO1 156-175. En
conséquence, ce motif proposé par FALK et al. ne permet pas de définir un
motif de
liaison aux molécules DP4 partagé par l'ensemble des peptides ligands des
molécules
DP4, identités par des tests fonctionnels.
Alors que des tests de liaison aux molécules DP9 (DONG et al., J.
Imrnunol., 1995, 154, 4536-4545) et DP2 (CHICZ et al., J. ImmZCnol., 1997,
159,
4935-4942), dérivés de ceux développés pour les molécules DR [MARSHALL et al.,
J. Irnmunol., 1994, 152, 4946 (HLA-DR 1 ) ; Brevet FR 99 0879 et TEXIER et
al., .l.
Immunol., 2000, 164, 3177 (HLA-DR1, -DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DR11 et -DR13)]
permettent d'isoler des peptides spécifiques de respectivement DP9 et DP2, ces
tests
ne permettent pas d'isoler des peptides spécifiques de DP4 (CHICZ et al.,
précité) : les
peptides isolés par le test de liaison à DP2 ont une forte affinité pour DP2
(activité de
liaison < 10 nM) alors que des peptides connus pour être restreints à DP4
comme le
peptide HBsAg 14-33, présentent une activité médiocre (20 pM).
En outre, du fait des différences importantes des résidus du site de
liaison, entre les principales molécules DP, les tests de liaison développés
pour ces
molécules ne permettent pas d'identifier des peptides restreints à DP4.
Ainsi, les motifs de liaison partagés par l'ensemble des peptides
capables de se lier aux molécules HLA-DP4 n'ont pas été identifiés, notamment
du
fait qu'il n'existe pas de procédé d'identification de tels peptides qui soit
simple à
mettre en ceuvre et adapté au criblage simultané d'un grand nombre de peptides
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comme des banques de peptides chevauchants représentant la séquence d'antigène
d'intérêt.
Pourtant, compte tenu de la fréquence des molécules DP4, les pep-
tides qui se lient aux molécules DP4 constituent des peptides candidats pour
l'immunothérapie spécifique et la vaccination et pourraient servir au
diagnostic de
l'état immunitaire de patients ou d'individus normaux.
Les Inventeurs ont donc développé un procédé de sélection de
ligands d'HLA-DP4 qui leur a permis d'isoler des ligands spécifiques d'HLA-
DP4,
notamment des peptides et de préciser le motif de liaison partagé par les
peptides
ligands d'HLA-DP4, à partir des peptides obtenus.
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de
sélection de molécules ligand d'HLA-DP4 comprenant les étapes suivantes
(i) incubation d'HLA-DP4 purifiée avec un traceur constitué par un
peptide préalablement marqué et apte à être détecté par un signal approprié,
lequel
peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides
présentant un
rapport signal/bruit de fond supérieur à 5, à la concentration de 10 nM, dans
un test
direct de liaison à HLA-DP4, et répondant à la formule générale (I)
ZiXiX2X3X~X5X6X7XgXgZ2 dans laquelle
- Zi et Z~, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun
un peptide de 1 à 100 acides aminés naturels ou synthétiques, de préférence de
1 à 30
acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés,
- X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien
une cystéine (C),
- X~ représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X~
représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C),
un
acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou
un acide
glutamique (E), et
- X~, X3, X~, X5, X~ et Xs représentent chacun un acide aminé naturel
ou synthétique,
en présence de différentes concentrations de molécules) à tester,
(ii) séparation des différents complexes formés,
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(iii) révélation des complexes HLA-DP4/peptide traceur par mesure
du signal associé audit peptide traceur et
(iv) sélection des molécules ligand qui présentent une activité de
liaison ICso < 1000 nM, correspondant à la concentration de ces molécules qui
inhibent 50 % de la liaison du peptide traceur.
Les résidus Xi, X6 et X9 de la formule générale (I) telle que définie
ci-dessus, qui constituent les résidus d'ancrage dans les poches de la
molécule d'HLA-
DP4, sont également dénommés respectivement résidus P1, P6 et P9. Parmi ces
rési-
dus, les résidus X1 (ou P1) et X6 (ou P6) sont les résidus qui contribuent
majoritaire-
ment à la liaison à HLA-DP4. Le résidu X9 ou P9 est moins important et
contribue
plus faiblement à la liaison à HLA-DP4.
Au sens de la présente invention, on entend par
- acides aminés naturels ou synthétiques, les 20 a-acides aminés
naturels communément trouvés dans les protéines (code à une lettre: A, R, N,
D, C, Q,
E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement
rencontrés
dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine,
diméthyllysine..), les
acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la ~3-alanine,
l'acide y-
aminobutyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la
norleucine,
la cyclohexylalanine..., ainsi que les énantiomères et les diastéréoisomères
des acides
aminés précédents.
- acide aminé hydrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à
une lettre) : A, V, L, I, P, W, F et M.
- acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à
une lettre) : F, W et Y.
L'utilisation d'un peptide traceur, tel que défini à l'étape (i) permet
de sélectionner effectivement des ligands spécifiques d'HLA-DP4, c'est-à-dire
des
molécules, notamment des peptides, qui présentent une bonne affinité pour I-
ILA-DP4
c'est-à-dire une activité de liaison < 1000 nM.
Un peptide traceur conforme à l'invention est sélectionné en mettant
en oeuvre un test direct de liaison à HLA-DP4, par exemple en suivant les
étapes (i)
(ü) et (iii) du protocole défini ci-dessus mais en l'absence de compétiteur,
corres-
pondant à la molécule à tester. Le signal approprié détecté (fluorescence...)
révèle les
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complexes HLA-DP4/peptide traceur [étape (iii)] et le bruit de fond représente
le
signal correspondant, obtenu en l'absence d'HLA-DP4.
De préférence
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et
S - X~ est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est
sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Des peptides traceurs conformes à l'invention sont représentés par
les peptides NS-p2 (SEQ ID N0:4), MAG 247-258 (SEQ ID N0:9), UL21 283-293
(SEQ ID N0:12), IL3 127-146 (SEQ ID N0:13), UNK1 (SEQ ID NO: 14), UL21
10 283-302 (SEQ ID N0:18) et MAG 245-258 (SEQ ID N0:19).
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le
peptide traceur est choisi dans le groupe constitué par les peptides
biotinylés, radio-
marqués ét les peptides couplés à un fluorochrome.
A l'étape (ü), la séparation des complexes formés des peptides non
liés est effectuée par exemple, par transfert des complexes formés sur une
plaque de
microtitration préalablement recouverte d'un anticorps spécifique d'HLA-DP,
par
chromatographie sur une colonne de gel-filtration ou par centrifugation.
Lorsque le peptide traceur est radiomarqué ou couplé à un fluoro-
chrome, notamment à l'europium, les .complexes HLA-DP4/peptide traceur sont
détectés de manière directe par la mesure de la radioactivité ou de la
fluorescence
émise par lesdits complexes.
Lorsque le peptide traceur est biotinylé, les complexes HLA-
DP4/peptide traceur sont détectés de manière indirecte à l'aide de
streptavidine conju-
guée, par exemple par une révélation immunoenzymatique à l'aide de
streptavidine
conjuguée à une enzyme telle que la phosphatase alcaline et d'un substrat de
la
phosphatase alcaline tel que le 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate (MUP).
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, le
peptide traceur est utilisé à une concentration < 200 nM, de préférence
inférieure à
20 nM ; de manière encore plus préférée, le traceur est utilisé à la
concentration de
10 nM.
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Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit pro-
cédé, ladite HLA-DP4 de l'étape i) est choisie dans le groupe constitué par
les molé-
cules codées par les allèles DPA 1 * 103/DPB 1 *0401 et DPA 1 * 103/DPB 1
*0402.
Le procédé selon l'invention permet avantageusement de sélection-
ner n'importe quel ligand d'HLA-DP4; il s'agit aussi bien de molécules
minérales ou
organiques comme les peptides et les pseudopeptides.
Selon un autre mode de mise en ceuvre avantageux dudit procédé,
lesdites molécules à tester représentent une banque de peptides chevauchants
recou-
orant la séquence d'un antigène.
La présente invention a également pour objet des ligands d'HLA-
DP4 susceptibles d'être obtenus par le procédé de sélection tel que défini ci-
dessus,
correspondant à une molécule minérale ou organique, naturelle ou synthétique,
présentant une activité de liaison à HLA-DP4 inférieure à 1000 nM.
L'activité de liaison à HLA-DP4 d'une molécule ligand, telle que
définie ci-dessus, correspond à la concentration de ladite molécule ligand qui
inhibe
50 % de la liaison à HLA-DP4 d'un peptide traceur marqué, dans un test en
compéti-
tion comme le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 défini ci-dessus.
Parmi ces molécules ligand, on peut citer notamment les peptides et
les peptides modifiés tels que les glycopeptides, les lipopeptides, les
peptides compre-
nant des acides aminés D, des liaisons pseudo-peptidiques (pseudo-peptides) ou
des
modifications des extrémités C-ou N-terminales.
La partie lipidique du lipopeptide ligand est notamment obtenue par
addition d'un motif lipidique sur une fonction a-aminée desdits peptides ou
sur une
fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé de la partie
peptidique ; elle
peut comprendre une ou plusieurs chaînes, dérivées d'acides gras en C~-CZO,
éven-
tuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide
linoléique,
acide linolénique, acide 2-amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou
déri-
vées d'un stéroïde. Le procédé de préparation de tels lipopeptides est
notamment décrit
dans les Demandes internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. La partie lipi-
digue préférée est notamment représentée par un groupe Na-acétyl-lysine
N~(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).
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Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand
d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, sa séquence peptidique répond à la formule
géné-
raie (I) ZiX~XzX3XqX5X6X7XgX9Z2, dans laquelle
- Z~ et Zz, identiques ou différents, sont nuls ou représentent chacun
un peptide de 1 à 100 acides aminés tels que définis ci-dessus, de préférence
de 1 à 30
acides aminés ; de manière encore plus préférée, de 1 à 10 acides aminés,
- X6 représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe ou bien
une cystéine (C),
XI représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe et/ou X9
représente un acide aminé aromatique ou hydrophobe, ou bien une cystéine (C),
un
acide aspartique (D), une glutamine (Q), une sérine (S), une thréonine (T) ou
un acide
glutamique (E), et
- X~, X3, X4, X5, X~ et X8 représentent chacun un acide aminé naturel
ou synthétique,
à condition que ledit peptide ligand d'HLA-DP4 de formule générale (I) ne
corres-
ponde à aucune des séquences SEQ ID NO: 1 à 17.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand
- X6 est sélectionné parmi L, I, W, F, M, Y et C, et
- X, est sélectionné parmi A, V, L, I, W, F, M et Y, et/ou X9 est
sélectionné parmi A, V, L, I, P, W, F, M, Y, C, D, Q, S, T et E.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit
peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1 *0401 (activité de liaison à DPB
1 *0401
au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1 *0402) et X6 est
différent
de C, et/ou X, est différent de A et de V, et/ou X9 représente W ou Y ou X9
est diffé-
rent de E et de C, et/ou X~ est différent de K et de R.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation,
ledit peptide ligand se lie spécifiquement à DPB 1 *0402 (activité de liaison
à
DPB 1 *0402 au moins deux fois supérieure à l'activité de liaison à DPB 1
*0401 ) et X~
représente C, et/ou X, représente A ou V, et/ou X9 représente E ou C ou X9 est
diffé-
rent de Y et W, et/ou X~ représente K ou R.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide ligand,
Z, et Z~ sont choisis dans le groupe constitué par
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les séquences de l'antigène qui sont adjacentes à l'épitope CD4+
restreint à HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, et/ou
- un ou plusieurs épitopes T CD8+, et/ou
- des épitopes CD4+ multiples, tels que le peptide 830-846 de la
toxine tétanique TT (O'SULLIVAN et al., J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le
peptide 307-319 de l'hémagglutinine HA du virus de la grippe (O'SULLNAN et al,
précité), l'épitope Pan DR ou PADRE (ALEXANDER et al., DEL GUERCIO et al.,
FRANKE et al, précités) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium
falcipa-
rum tels que le peptide CS.T3 (S1NIGAGLIA et al., Nature, 1988, 336, 778-780)
et
les peptides CSP, SSP2, LSA-1 et EXP-1 (DOOLAN et al., J. Immzznol., 2000,
165,
1123-1137) et/ou
- un ou plusieurs épitopes B, par exemple un peptide ou un glyco-
peptide dâns lequel ledit épitope B est constitué par un sucre (ALEXANDER et
al.,
précité).
De telles séquences permettent avantageusement de déclencher ou
de moduler une réponse immunitaire, de manière appropriée.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide
ligand, il présente la séquence SEQ ID N0:84 correspondant au peptide NY-ESO1
87-111.
La présente invention englobe également les peptides ligands tels
que définis ci-dessus, polymérisés.
La présente invention a également pour objet un procédé d'identifi-
cation de peptides ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus, à partir
d'une
séquence d'acides aminés, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes
suivantes
a) l'établissement d'une matrice de liaison à HLA-DP4 par calcul,
-pour tous les mutants d'un peptide traceur tel que défini ci-dessus,
représentant
l'ensemble des substitutions des résidus en position 1, 4, 6 ou 9 dudit
peptide traceur
par les 19 autres acides aminés naturels-, du rapport des ICSO desdits
peptides mutants
et dudit peptide traceur, à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 tel que défini
ci dans le
procédé ci-dessus,
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b) l'évaluation de la liaison à HLA-DP4 de peptides d'au moins 9
acides aminés inclus dans ladite séquence d'acides aminés, par calcul, pour
chaque
fragment de 9 acides aminés dudit peptide, de la somme des scores de liaison à
HLA-
DP4 des résidus en position l, 4, 6 et 9 dudit fragment, à partir de la
matrice de liaison
établie en a), et
c) l'identification des peptides ligands d'HLA-DP4 correspondant à
ceux dont la perte de liaison à HLA-DP4, par rapport audit peptide traceur est
la plus
faible, c'est à dire ceux dont la somme des scores de liaison présente la
valeur la plus
faible exprimée en logarithme (log) ; de préférence inférieure à 2, de manière
préférée
inférieure à 1, de manière encore plus préférée, proche de 0.
Cette matrice de liaison à HLA-DP4 qui est illustrée pour le peptide
de référence LJNK 3-15 (SEQ ID NO: 28), par le Tableau XIV de l'exemple 6,
permet
d'estimer l'activité de liaison à HLA-DP4 de n'importe quel peptide d'au moins
9
acides aminés ; des peptides présentant des scores de liaison de
respectivement 0, 1, 2,
3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un
facteur 1, 10,
100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (ICSO 10 nM), c'est-à-dire
présentant une activité de liaison estimée de respectivement 10 nM, 100 nM,
1000
nM, 10 pM et 100 pM.
Par exemple, l'antigène tumoral NY-ESO1 comprend un peptide
WIT(~CFLPV possédant un score de liaison à DP*0401 et DP*0402, de 0 + 0,3 + 0
+
0,3 = 0,6 correspondant à une activité de liaison estimée (à l'aide de la
matrice de liai-
son à HLA-DP4) de 39 nM et une activité calculée (par le test de liaison à
DP*0401 et
DP*0402) de respectivement 20 nM et 67 nM.
Le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4 selon
l'invention qui est facile à mettre en couvre et automatisable permet,
notamment à
l'aide d'un logiciel approprié, de prédire la séquence des peptides ligands
d'HLA-DP4
présents dans toutes les protéines représentant des antigènes d'intérêt. Les
séquences
peptidiques ainsi identifiées peuvent ensuite être vérifiées par un test de
liaison à
HLA-DP4, défini dans le procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 selon
l'inven-
tion.
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La présente invention a également pour objet une molécule d'acide
nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide ligand tel que
défini ci-
dessus.
L'objet de l'invention englobe également les molécules d'acide
S nucléique recombinantes comprenant au moins une molécule d'acide nucléique
conforme à l'invention liée à au moins une séquence hétérologue.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétéro-
logue relativement à une séquence d'acide nucléique codant un peptide ligand,
toute
séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont
immédiatement
10 adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant un peptide.
L'objet de la présente invention englobe en particulier
- des cassettes d'expression comprenant au moins une molécule
d'acide nûcléique conforme à l'invention et les séquences nécessaires au
contrôle de la
transcription et de la traduction de ladite molécule d'acide nucléique
(promoteur,
15 intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation),
et
- des vecteurs recombinants, comprenant un insert constitué par une
molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Avantageusement ces
vecteurs
d'expression, comprennent au moins une cassette d'expression telle que définie
ci-
dessus.
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule
d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une
cellule hôte
eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur
approprié
dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de
la
séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence
sous
forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique
de
l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte.
Par exemple, on peut utiliser entre autres des vecteurs viraux tels
que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV, dans lesquels a
été insérée
préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite
séquence (iso-
lée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant
de
franchir la membrane des cellules-hôte, par exemple une préparation de
liposomes, de
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lipides ou de polymères cationiques, ou bien l'injecter directement dans la
cellule
hôte, sous forme d'ADN nu.
L'invention a en outre pour objet des cellules procaryotes ou euca-
ryotes transformées par au moins une molécule d'acide nucléique conforme à
S l'invention.
Des cellules transformées conformes à l'invention peuvent être
obtenues par tous moyens, connus en eux-mêmes, permettant d'introduire une
molé-
cule d'acide nucléique dans une cellule-hôte. Par exemple, dans le cas de
cellules
animales, on peut utiliser les vecteurs ou les préparation de lipides tels que
définis ci-
dessus.
La présente invention a également pour objet une composition
immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un ligand
d'HLA-
DP4 ou une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-DP4 tels
que
définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est incluse dans
un vecteur tel que défini ci-dessus.
Selon le choix du ligand d'HLA-DP4 et de son mode de présentation
(voie d'administration, dose, adjonction ou non d'adjuvant), une telle
composition
immunomodulatrice entraîne, soit une activation des lymphocytes T, soit leur
anergie.
En effet, il a été montré qu'une injection unique, par voie sous-cuta-
née, d'une faible quantité de peptide entraîne une anergie (OLDFIELD et al.,
J.
Immamol., 2001, 167, 1734-1739.). En revanche, il est connu que des injections
répé-
tées de quantités supérieures de peptide en présence d'adjuvant entraîne une
activation
des lymphocytes T. En outre, l'association à des peptides Z, et Z~ tels que
définis ci-
dessus, permet également d'augmenter la réponse immunitaire spécifique de
l'antigène
(ALEXANDER et al., précité).
En conséquence, ladite composition est utilisée aussi bien pour la
vaccination contre un agent pathogène ou une cellule tumorale, que pour le
traitement
des maladies autoimmunes (sclérose en plaques, diabète insulino-dépendant), de
l'allergie ou du rejet de greffe.
La présente invention a également pour objet un réactif de diagnos-
tic de l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au
moins un
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ligand d'HLA-DP4 tel que défini ci-dessus, éventuellement marqué ou complexé,
notamment complexé à des molécules HLA-DP4 marquées (biotinylées), sous la
forme de complexes multimériques comme des tétramères.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un ligand
d'HLA-DP4 ou d'une molécule d'acide nucléique codant un peptide ligand d'HLA-
DP4 tels que définis ci-dessus pour la préparation d'un médicament
immunomodula-
teur ou d'un réactif de diagnostic de l'état immunitaire d'un individu.
Au sens de la présente invention, on entend par diagnostic de l'état
immunitaire d'un individu, la détection de la présence, chez ledit individu,
de lympho-
cytes T CD4+ spécifiques d'un antigène issu d'un agent pathogène ou d'une
cellule
tumorale, d'un allergène, d'un alloantigène ou d'un autoantigène.
Le réactif conforme à l'invention qui est apte à détecter la présence
de lymphôcytes T CD4+ spécifiques d'un antigène est utilisé pour la détection
: d'une
infection par un agent pathogène, d'un cancer, d'une maladie autoimmune, d'une
aller-
gie ou d'un rejet de greffe, à partir d'un échantillon biologique d'un
patient.
La présente invention a également pour objet une méthode de
diagnostic de l'état immunitaire d'un individu comprenant les étapes de
- mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un
réactif de diagnostic tel que défini ci-dessus, et
- détection de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène par
tout moyen approprié.
La présente invention a également pour objet un kit de détection de
l'état immunitaire d'un individu, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un
réactif
tel que défini ci-dessus, associé à un moyen de détection de lymphocytes T
CD4+
spécifiques d'un antigène.
La détection des lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, est
effecW ée par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser
des
moyens directs comme les tests de prolifération lymphocytaire ou la cytométrie
de
flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou
bien des
moyens indirects comme le dosages de cytokines telles que l'IL2, l'IL4, l'IL5
et l'INFy,
notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT).
De manière plus précise
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* pour ce qui concerne le test de prolifération
Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules
CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro
avec les
peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) est cultivée
pendant 3
à 5 jours en présence desdits ligands d'HLA-DP4 et au besoin de cellules
présenta-
trices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues
ou hété-
rologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après
infection par
le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La prolifération des
cellules
est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules.
Les
peptides tels que définis ci-dessus, permettent de révéler dans la suspension
initiale la
présence de cellules spécifiques de ces peptides.
* pour ce qui concerne le test ELISPOT
Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécré-
tant de l'IFN-y, spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus.
De manière plus précise, les cellules T sont révélées par mesure de
la sécrétion d'IFN-y après incubation des PMBC des patients avec lesdits
peptides
conformément à la méthode décrite dans la Demande Internationale WO 99/51630
ou
Gahéry-Ségard et al., (J. Virol., 2000, 74, 1964).
* pour ce qui concerne la mise en oeuvre de complexes multi-
mériques et notamment de complexes tétramériques
- on met en contact un échantillon biologique, de préférence des
cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) avec des complexes tétramé-
riques tels que définis ci-dessus, et
- on analyse des cellules marquées par cytométrie de flux.
De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de
l'échantillon biologique avec ledit complexe, on l'enrichit en cellules T
CD4+, en le
mettant en contact avec des anticorps anti-CD4, pour enrichir ledit
échantillon.
Les tétramères sont préparés, comme précisé, par exemple dans
NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al.
(J.
Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756).
Brièvement, les tétramères sont fabriqués en incubant, pendant 72
heures à 37°C et dans un tampon phosphate citrate 10 mM, NaCI 0,15 M à
un pH
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compris entre 4,5 et 7, des molécules HLA II solubles et biotinylées avec un
excès
d'un facteur 10 de ligands d'HLA-DP4 tels que définis ci-dessus.
La forme tétramérisée est obtenue en ajoutant à la préparation de la
streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre
(mole à
mole) par rapport aux molécules HLA II. L'ensemble est incubé une nuit à
tempéra-
ture ambiante.
Pour utiliser ces tétramères, on met en contact une suspension de
cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD8+, lymphocytes T préalablement
enrichis par une étape de culture in vitro avec les ligands d'HLA-DP4 tels que
définis
ci-dessus ou des lymphocytes T clonés) avec un ou plusieurs tétramères (10 à
20
mg/ml) pendant 1 à 3 heures. Après lavage, la suspension est analysée par
cytométrie
de flux : on visualise le marquage des cellules par les tétramères grâce au
fait que ces
constructïons sont fluorescentes.
La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les
tétramères des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé de tri
de lymphocytes T CD4+ spécifiques d'un antigène, caractérisé en ce qu'il
comprend
au moins les étapes suivantes
- mise en contact d'un échantillon cellulaire avec des tétramères
marqués par un fluorochrome, préparés à partir de complexes entre des ligands
d'HLA-DP4 tels que défini ci-dessus et des molécules HLA-DP4 solubles, et
- tri des cellules liées audit tétramères, en cytométrie de flux.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui
se réfère à
des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, avec
références
aux dessins annexés dans lesquels
- la figure 1 illustre l'activité de liaison de peptides aux molécules
HLA-DP4 codées respectivement par DPB 1 *040 ( (A) et DPB 1 *0402 (B),
déterminée
selon le procédé conforme à l'invention avec comme peptide traceur, le peptide
L1NK1
biotinylé ( 10 nM) ; le pourcentage de liaison aux molécules DP4 est exprimé
en fonc-
tion de la concentration molaire des peptides. La liaison maximale (100 %)
correspond à la valeur obtenue pour le peptide traceur seul, en l'absence de
peptide
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compétiteur. UNK: UNK1 (SEQ ID NO: 14), IL: IL3 127-146 (SEQ ID NO: 13),
MAG: MAG 245-258 (SEQ ID NO: 19), NSP2: SEQ ID NO: 4, TT: TT 947-963
(SEQ ID NO: 20), DQB: DQB 43-57 (SEQ ID NO: 23), HCI 46-63: SEQ ID N0: 24)
et HA: HA 306-318 (SEQ ID NO: 21),
5 - la figure 2 illustre la corrélation entre le score de liaison à HLA-
DP4 (estimé par le procédé d'identification de peptides ligands d'HLA-DP4
conforme
à l'invention) et l'affinité pour les molécules HLA-DP4 (déterminée par la
valeur
d'ICSO, mesurée à l'aide du test de liaison à HLA-DP4 défini dans le procédé
de sélec
tion de peptides ligands d'HLA-DP4 conforme à l'invention), analysée sur un
10 ensemble de 44 peptides.
EXEMPLE 1 : PRINCIPE DU TEST DE LIAISON HLA-DP4/PEPTIDE
1) Préparation des peptides
Tous les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en syn
thèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par
spectrométrie de
15 masse (ES-MS).
Les peptides sont biotinylés au niveau de leur résidu NHz terminal,
selon le protocole tel que décrit dans Texier et al., précité.
2) Préparation des anticorps
Les anticorps spécifiques des molécules HLA-DP tel que l'anticorps
20 B7/21 (WATSON et al., Nature, 1983, 304, 358-361), sont purifiés à partir
du surna-
geant de culture des hybridomes correspondants, sur des colonnes de Protéine A-
Sépharose. Ces anticorps sont ensuite couplés sur des colonnes Sépharose 4B ou
pro-
téine A-Sépharose pour la purification des molécules HLA-DP4.
D'une manière plus précise, après centrifugation à 1100 g, le surna-
geant de culture des cellules productrices de l'anticorps B7/21 est filtré à
0,22 pm et
son pH est ajusté à 7-8 avec du tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Ce surnageant est
ensuite appliqué sur une colonne de Protéine A Sépharose 4 Fast Flow de 10 ml,
pré-
alablement lavée avec 100 ml de tampon Tris-HC1 0,1 M, pH 8. Puis, la colonne
est
lavée avec 100 ml de tampon Tris-HCI 0,1 M, pH 8 et 100 ml de tampon Tris-HCl
0,01 M, pHB. Les anticorps sont élués avec le tampon glycine HC1 0,1 M, pH 3.
Le
rinçage de la colonne s'effectue avec 100 ml de tampon Tris-HC1 0,1 M, pH 8.
La
fraction éluée qui contient l'anticorps B7/21 est immédiatement neutralisée
avec du
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tampon Tris-HC1 1 M, pH 8 avant d'être dialysée extensivement contre du tampon
borate 0,1 M, pH 8,2. La quantité d'anticorps obtenus est déterminée à partir
de la
densité optique (DØ) à 278 nm.
Les colonnes d'affinité destinées à la purification des molécules
HLA-DP4 sont préparées de la manière suivante : 0,75 g de Protéine A Sépharose
4B
(3 ml de gel final) sont mis à gonfler dans de l'eau puis dans du tampon
borate 0,1 M
pH 8,2. 15 mg d'anticorps monoclonal, tel que B7/21 en tampon borate 0,1 M pH
8,2
sont ajoutés au gel, préalablement centrifugé. Le couplage est effectué
pendant deux
heures à température ambiante puis contrôlé par l'absorbance à 278 nm du
surnageant.
Le gel est ensuite lavé successivement avec 100 ml de tampon borate 0,1 M, pH
8,2,
120 ml de tampon triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 ; 120 ml de tampon
diméthylpyrimi-
date 20 mM, triéthanolamine 0,2 M, pH 8,2 et 150 ml de tampon éthanolamine 0,2
M
pH 8,2. t~près coulage du gel, celui-ci est rincé avec 150 ml de tampon borate
0,1 M,
pH 8,2. Le contrôle final du couplage est effecW é par une élution en tampon
glycine
0,1 M, pH 2,5, NaCI 0,5 M, l'absorbance à 278 nm des fractions de 1 ml devant
être
inférieure à 0,1. La colonne est immédiatement rincée par 50 ml de tampon
borate
0,1 M, pH 8,2 et 20 ml de tampon borate 0,1 M, NaN3 0,02%, pH 8,2. Elle est
conser-
vée dans ce tampon à 4°C jusqu'à l'emploi.
3) Purification des molécules HLA-DP4
Les molécules HLA-DP4 sont purifiées à partir de différentes
lignées humaines de lymphocytes B transformées par le virus Epstein Barr (EBV)
homozygotes pour DP, par immunoaffinité au moyen d'anticorps monoclonaux spéci-
fiques de toutes les molécules DP. L'origine des lignées et les allèles qui
les caracté-
risent sont indiqués dans le Tableau IV.
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Tableau IV
Lignes Spcificit Allle Allle rfrence
DP DPA1 DPB1
HOM2 DP4 DPA 1 *0103DPB I
*0401
BOLETH DP4 DPA 1 *0103DPB 1
*0401
PITOUT DP4 DPA1 *0103DPB I SOUTHWOOD et al.,
*0401 prcit
HHKB DP4 DPA 1 *0103DPB 1 DAVENPORTH et al,
*0401 P. N.A.S., 1995,
92, 6567.
SHU DP4 DPA1*0103 DPBI*0402'"
MLF DP4 DPA 1 *0103DPB 1
*0402
BM92 DP4 DPA 1 *0103DPB 1
*0402
'l'origine des lignées est décrite sur le site internet de la Collection
européenne de Culture Cellulaire
(http: // fuseiv.co.uk/camr/.)
La purification des molécules HLA-DP4 est effectuée à partir d'un
culot de ces cellules humaines transformées par EBV, selon un protocole dérivé
de
ceux utilisés pour les molécules HLA-DR (GORGA et al., ,l. Biol. Chem., 1987,
262,
16087; TEXIER et al., précité).
D'une manière plus précise, 5 à 6.109 cellules sont lysées à une
concentration d'environ 108 cellules/ml en tampon de lyse (Tris 0,01 M, NaCI
0,15 M,
NaN3 0,02%, pH 7, NP40 1 %, aprotinine 10 l.tg/ml, EDTA 5 mM, PMSF 10 ~tM)
dans
la glace pendant 30 minutes. Le milieu de lyse est débarrassé des gros débris
cellu-
laires par centrifugation à 1100 g pendant 10 minutes à 4°C. Le
surnageant est ensuite
ultracentrifugé à 100 000 g à 4°C pendant I heure. La suite de la
purification se
déroule en chambre froide à 4°C. Le lysat est passé successivement sur
une colonne
de Sépharose 4B (10 ml de gel préparés en PBS 1x), une colonne de Protéine A
Sépharose 4B (5 ml de gel préparés en ZPBS 1x) puis sur la colonne d'affinité
anti-DP.
Les colonnes sont ensuite rincées par 250 ml de tampon de lyse. La colonne
Sépharose 4B est jetée. La colonne Protéine A Sépharose 4B est rincée avec 25
ml de
tampon TBS 1x (Tris 0,01 M, NaCI 0,15 M, NaN3 0,02%, pH 7) ; 50 ml de tampon
(glycine, O,1M; NaCI 0,5M, pH 2,5) et 200 ml de tampon PBS 1x, avant d'ëtre
stockée à 4°C. La colonne anti-DP est rincée avec 250 ml de tampon TBS
contenant 1
mM de dodécyl maltoside (DM). Elle est ensuite éluée individuellement avec le
tampon d'élution (Na~C03 100 mM, NaCI 500 mM, NaN3 0,02%, DM 1,1 mM, pH
11,5) en 15 fractions de 3 ml. L'éluat est immédiatement neutralisé avec 10%
de
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tampon (Tris-HCI 2 M, pH 6,8), puis dialysé extensivement à 4°C contre
du tampon
PBS 1x contenant 1 mM de DM.
4) Test de liaison HLA-DP4-peptide
Le test de liaison des peptides aux molécules HLA-DP4 est un test
en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, dérivé de celui mis au
point
pour des molécules HLA-DR (HLA-DR1: MARSHALL et al., précité, HLA-DR1,
-DR2, -DR3, -DR4, -DR7, -DR11 et -DR13 : Brevet FR 99 0879 et TEXIER et al.,
précité). Il est effectué en plaques 96 puits, ce qui permet d'étudier de
nombreux
échantillons dans la même expérience. Brièvement, les molécules HLA-DP4
purifiées
sont incubées avec un peptide biotinylé qui sert de traceur et différentes
concentra-
tions du peptide à tester. Le peptide biotinylé est un peptide ligand de DP4,
il s'agit
d'un peptide reconnu par des lymphocytes T CD4+ spécifiques de DP4 tel que
ceux
précisés dans le Tableau III ci-dessus ou d'un nouveau peptide isolé à l'aide
du présent
test de liaison à DP4. Parmi ces peptides, on peut citer par exemple le
peptide LNK1
ou le peptide IL3 127-146. L'incubation se fait dans un tampon, dont le pH
peut
varier. Il est généralement de 5, l'incubation dure généralement 24h. Après
l'incubation, les échantillons sont neutralisés, puis 100 p1 de chaque
échantillon est
transféré sur une plaque ELISA préalablement sensibilisée par un anticorps
anti-DP,
tel que B7/21. Les complexes molécules HLA-DP/peptides biotinylés fixés au
fond de
la plaque par l'intermédiaire de l'anticorps sont révélés au moyen de
streptavidine
phosphatase et d'un substrat fluorescent. L'activité de chaque peptide est
caractérisée
par la concentration qui inhibe 50 % de la liaison du peptide biotinylé
(ICSO).
EXEMPLE 2 . DETERMINATION DES PA1RAIVIETRES DU TEST DE
LIAISON
1) Peptide traceur
a) Matériel et méthodes
La liaison de peptides aux deux molécules DP4 (DP401 codé par
l'allèle DPA 1 *0103/DPB 1 *0401 et DP402 codé par l'allèle DPA 1 *0103/DPB 1
*0402)
a été analysée en ELISA par le test direct de liaison suivant
Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à
l'exemple 1 sont diluées 10 fois en tampon phosphate 10 mM (dilution 1/10).
Elles
sont ensuite incubées avec différentes concentrations d'un peptide biotinylé
(10~6M,
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10-~M et 10-gM) dans du tampon phosphate 10 mM, NaCI 150 mM, DM 1 mM, citrate
mM, thimérosal 0,00 3%, pH 5, dans des plaques 96 puits en polypropylène,
pendant 24 h à 37°C. Des échantillons sans molécules DP4 sont utilisés
comme
témoin. A la fin de l'incubation, les échantillons sont neutralisés avec 50 ~l
de tampon
5 Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils sont
ensuite transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur lesquelles les
anti-
corps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 ~g/ml
d'anticorps
anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 yl/puits) puis les plaques
ont été saturées
avec le tampon Tris-HCI 100 mM, pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal 0,003 % pendant
10 une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces plaques est
réalisée pendant deux
heures à température ambiante, comme la suite du test puis des lavages
extensifs sont
effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1 M pH, 7,5, Tween-20 0,05%.
Le
peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP est détecté par l'ajout de 100
~l/puits du
conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45 minutes) dilué au 1/2000 dans
le
tampon Tris IOmM pH 7, NaCI 0,15 M; Tween 20 0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal
0,003 %, puis par l'ajout de 200 ~l/puits du substrat MUP 100 yM en tampon
NaHC03 0,05 M pH 9,8, MgCI~ 1 mM. L'émission de fluorescence par le produit de
la réaction enzymatique est mesurée à 450 nm après excitation à 365 nm et le
rapport
des valeurs obtenues avec ou dans DP4 est déterminé (RF = valeur de
fluorescence en
présence de DP4/valeur de fluorescence en l'absence de DP4).
b) Résultats
La liaison à la molécule DP401 de peptides dérivés des peptides
ligands de DP4 précédemment décrits (Tableau III), a été testée
- peptide bUL21 283-302 (RELWWVFYAGDRALEEPHAE ; SEQ ID NO: 18)
- peptide bIL3 127-146 (SEQ ID NO: 13)
- peptide bMAG 245-258 (LLTQHFVQENYLEY ; SEQ ID NO: 19)
- peptide bMT 451-466 (SEQ ID N0:6)
- peptide bNS-p2 (SEQ ID N0:4)
- peptide bTT 947-963 (FNNFTVSFWLRVPKVSA ; SEQ ID NO: 20)
- peptide bUNKI (SEQ ID NO: 14)
Deux peptides spécifiques respectivement de DR1 et de DR7 ont été
utilisés comme témoin de la spécificité de liaison à DP4
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- peptide bHA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT ; SEQ ID NO: 21) décrit par HILL et
al., J. Immunol., 1994, 152, 2890, et
- peptide bYKL (AAYAAAKAAALAA ; SEQ ID N0:22) décrit par MARSHALL
et al., précité.
5 Les résultats sont illustrés par le Tableau V.
Tableaû V : Sélection des traceurs par un test direct de liaison à HLA-DP4
RF = valeur
de fluorescence
en prsence
de DP4/ valeur
de
fluorescence
en l'absence
de DP4
peptide 10-'M 10-'IVI 10-'1VI
bUL21 283-302 8,3 13,3 10,1
bIL3 127-146 10 20 17,3
bMAG 245-258 1,5 6,7 5,4
bMT 451-466 5,5 4 2
bNS-p2 1 4,2 7,8
bTT 947-963 1,7 3,6 2,7
bUNKl 21,6 21,7 20
bHA 306-318 4,9 4,7 2,7
bYKL 4,8 3,2 3
Les résultats montrent que
- les peptides bUNKI, bIL3 127-146 ont une forte capacité de liai-
10 son à DP4,
- les peptides bTT 947-963 et bMT 451-466 ont une faible capacité
de liaison et
les peptides bNS-p2, bUL21 283-302 et bMAG 245-258 ont une
capacité de liaison intermédiaire.
15 Les peptides présentant un RF > 5 à la concentration de 10-g M sont
considérés comme des bons traceurs utilisables dans le test de liaison.
Le peptide UNK1 qui a donné les meilleurs résultats a été utilisé
pour optimiser le test de liaison.
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2) temps, pH, concentration du peptide traceur
De manière à disposer d'un test sensible et spécifique de DP4, la
concentration en molécules HLA-DP4, la concentration du peptide biotinylé, le
pH et
le temps d'incubation peptides-molécule HLA-DP4 ont été optimisés avec le
peptide
bUNK 1.
a) Matériels et méthodes
Les molécules HLA-DP4 purifiées selon le protocole décrit à
l'exemple 1 ont été diluées au 1/10, 1/20, 1/40 et 1/80, en tampon phosphate
10 mM ;
NaCI 150 mM, DM 1 mM ; citrate 10 mM, thimérosal 0,003 % à différents pH (pH 4
;
5 ; 5,5 ; 6 ; 6,5 et 7), avec le peptide bUNKI à différentes concentrations et
plusieurs
concentrations de peptides compétiteurs dans des plaques 96 puits en
polypropylène.
A la fin de l'incubation à 37°C, les échantillons ont été neutralisés
avec 50 p1 de
tampon Tris-HCl 450 mM, pH 7,5, thimérosal 0,003 %, BSA 0,3 %, DM 1 mM. Ils
ont ensuite été transférés sur des plaques ELISA maxisorp 96 puits sur
lesquelles les
anticorps anti-DP ont été préalablement adsorbés. Très exactement, 10 ~g/ml
d'anticorps anti-DP ont été incubés une nuit à 4°C (100 pl/puits) puis
les plaques ont
été saturées avec le tampon Tris-HCI 100 mM pH 7,5, BSA 0,3 %, thimérosal
0,003 % pendant une nuit à 4°C. L'incubation des échantillons sur ces
plaques a été
réalisée pendant deux heures à température ambiante, comme la suite du test
puis des
lavages extensifs ont été effectués entre chaque étape en tampon Tris-HCl 0,1
M, pH
7,5, Tween-20 0,05 %. Le peptide biotinylé lié aux molécules HLA-DP a été
détecté
par l'ajout de 100 ~l/puits du conjugué streptavidine-phosphatase alcaline (45
minutes) diluée au 1/2000 dans le tampon Tris 10 mM pH 7, NaCI 0,15 M, Tween
20
0,05 %, BSA 0,2 %, thimérosal 0,003 %, puis par l'ajout de 200 p.l/puits du
substrat
MUP 100 ~M en tampon NaHC03 0,05 M, pH 9,8, MgCl2 1 mM. L'émission de fluo-
rescence par le produit de la réaction enzymatique a été mesuré à 450 nm après
exci-
tation à 365 nm. La liaison maximale a été déterminée en incubant le peptide
biotinylé
avec la molécule de CMH II en l'absence de peptide compétiteur. La spécificité
de
liaison a été contrôlée par l'ajout d'un excès de peptide non biotinylé. Le
bruit de fond
obtenu ne diffère pas significativement de celui obtenu en incubant le peptide
bioti-
nylé sans les molécules de CMH II.
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Les résultats sont exprimés sous la forme de la concentration de
peptide compétiteur qui inhibe 50 % de la liaison maximale du peptide marqué
(ICSO).
b) Résultats
Les conditions optimales sont présentées dans le Tableau VI
Tableau VI: Conditions du test de liaison aux molécules DP4
Molcules DPA1*0103/DPB1*0401DPA1*0103/DPB1*0402
Peptide biotinyl bUNK 1-17 bUNK 1-17
Concentration 10 nM 10 nM
pH 5 5
Temps d'incubation24h 24h
Concentration Dilution 1/20 1/40'
en
HLA-DP4
'ales dilutions indiquées sont effectuées à partir de la préparation de
molécules HLA-DP4 purifiées
obtenues à l'exemple 1.
EXEMPLE 3 : SENSIBILITE ET SPECIFICITE DU TEST DE LIAISON AUX
MOLECULES DP4
a) Spécificité
Les résultats, illustrés par la figure 1 montrent que l'activité de liai-
son mesurée dans le test est spécifique d'HLA-DP4 dans la mesure où
- des peptides connus pour être des ligands de molécules DP4 lient
effectivement les molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit du peptide IL3 127-
146
(naturellement présent sur une molécule DP4), des peptides spécifiques de
lympho-
cytes T CD4+ restreints à DP4 : NS-p2 (ou NSP2), TT 947-963 et dans une
moindre
mesure le peptide MAL 245-258, et
- des peptides connus pour lier d'autres molécules HLA II ne se lient
pas aux molécules HLA-DP*0401 et 0402. Il s'agit des peptides : DQB 43-57
(DVEVYRAVTPLGPPD, SEQ ID N0:23), HCI 46-63
(EPRAPWIEQEGPEYWDQE, SEQ ID N0:24) et HA 306-318 (SEQ ID N0:21) qui
sont connus pour se lier respectivement à des molécules HLA-DQ3, HLA-DQ2 et
HLA-DR (MARSHALL et al., précité, JOHANSEN et al., Immunogenetics, 1996, 45,
142).
La spécibcité du test résulte de l'utilisation
- d'un anticorps spécifique des molécules HLA-DP pour la purifica-
tion et pour l'adsorption sur les plaques ELISA, et
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du peptide biotinylé qui se lie avec une forte affinité, la figure 1
montre que le peptide UNK qui est la contrepartie non biotinylé du peptide
traceur
bLJNK inhibe totalement la liaison du traceur aussi bien sur la molécule HLA-
DPB 1 *0401 que sur la molécule DPB 1 *0402.
b) Sensibilité
La sensibilité du test est reflétée par l'ICSO observée avec le peptide
non-biotinylé (UNK1) correspondant au traceur (bUNKI). La figure 1 indique des
valeurs de respectivement 8 et 9 nM pour DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402,
traduisant une
bonne sensibilité.
La figure 1 montre également que les activités de liaison des
peptides aux molécules DPB 1 *401 et DPB 1 *402, bien que comparables, sont
distinctes. Ces résultats confirment que les molécules DPB 1 *401 et DPB 1
*402 pré-
sentent des différences qui peuvent être détectées par ce test de liaison.
EXEMPLE 4 CRIBLAGE DE PEPTIDES LIGANDS DE HLA-DP4 A
PARTIR D'UNE BANQUE DE PEPTIDES
1) Matériels et méthodes
Les peptides chevauchants couvrant la séquence totale de l'allergène
majeur du venin d'abeille (Api ml), décrits dans le Brevet FR 99 00879, ont
été syn-
thétisés et soumis aux tests de liaison à la molécule DP401 et à la molécule
DP402,
dans les conditions définies dans le Tableau VI.
2) Résultats
Les résultats sont présentés dans le Tableau VII, ci-après
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Tableau VII : Liaison des peptides de Api ml
aux molécules HLA-DPB1*0401 et DPB1*0402
Peptide ICso (nM)
DP0401 DP0402
1-18 > 10000 > 10000
5-22 > 10000 > 10000
9-26 > 10000 > 10000
13-30 > 10000 > 10000
17-34 > 10000 > 10000
21-38 > 10000 > 10000
25-42 > 10000 > 10000
29-46 > 10000 > 10000
33-50 > 10000 > 10000
37-54 > 10000 > 10000
41-58 > 10000 > 10000
45-62 > 10000 > 10000
49-66 > 10000 > 10000
_ > 10000 > 10000
53-70
57-74 > 10000 > 10000
61-78 > 10000 > 10000
65-82 50000 6500
69-86 > 10000 > 10000
73-90 > 10000 > 10000
77-94 450 175
81-98 2250 1225
85-102 > 10000 > 10000
89-106 > 10000 > 10000
93-110 > 10000 > 10000
97-114 > 10000 > 10000
101-118 > 10000 > 10000
105-122 > 10000 > 10000
109-126 > 10000 > 10000
113-130 > 10000 > 10000
117-134 > 10000 > 10000
Ces résultats montrent que le peptide 77-94 de l'antigène majeur du
S venin d'abeille 94 (Api ml 77-94 : TISSYFVGKMYFNLIDTK, SEQ ID N0:17) est
un peptide ligand des molécules DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402.
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EXEMPLE 5 . DETERMINATION DES MOTIFS DE LIAISON AUX
MOLECULES DP4
1) Matériel et méthodes
a) détermination d'un peptide minimum dérivé d'LJNK 1 capable de se lier aux
molé-
5 cules DP4
Des peptides dérivés du peptide UNK1 (LJNK 1-17, SEQ ID N0:14)
comprenant des délétions croissantes à l'une des extrémités NH~ ou COOH ou
bien
aux deux extrémités, ont été synthétisés. La séquence de ces peptides (UNK 1-
11, 1-
12, 1-13, 2-14, 3-15, 4-16, 5-17, 6-17, 7-17, 3-17 et 1-15) correspondant
respective-
10 ment aux SEQ ID NO: 25-26, 16 et 27-34 est présentée dans le Tableau VIII.
L'acti-
vité de liaison des peptides, exprimée par la valeur ICSO, a été déterminée
par le test de
liaison en compétition, dans les conditions définies au Tableau VI.
b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux
molé-
cules DP4
15 Des mutants du peptide LJNK 3-15 (KYFAATQFEPLAA ;
SEQ ID NO: 28) ont été synthétisés ; chaque mutant contient un seul des
résidus Y4,
F5, T8, Q9, F10, E11, P12, L13 substitué en alanine ou en lysine, le résidu K3
substi-
tué en alanine, ou bien l'un des résidus A6, A7, A 14 et A 15 substitué en
lysine.
La séquence de ces peptides (UNK K3A, Y4A, FSA, TBA, Q9A,
20 F10A, E11A, P12A, L13A, Y4K, FSK, A6K, A7K, TBK, Q9K, F10K, E11K, P12K,
L13K, A14K et A15K) correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N0:35 à
55 est présentée dans le Tableau IX.
L'activité de liaison des peptides, exprimée par la valeur ICso, a été
déterminée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies
au
25 Tableau VI. La perte de liaison des peptides mutants est exprimée par le
rapport des
ICSO du peptide mutant et du peptide UNK1.
c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402
Les résidus F en P1, T en P4, F en P6 ou L en P9 du peptide UNK1
ont été substitués par l'un des résidus suivants
30 -P1:Y,L,E,N,T,D,G,H,I,M,P,Q,R,S,VouW,
-P4:F,L,E,D,N,Y,R,S,G,HouP,
-P6:Y,L,W,E,N,T,D,G,H,I,M,P,Q,R,S,V,WouC,
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31
-P9:F,Y,E,D,N,R,V,G,H,I,P,Q,S,TouW.
La séquence de ces peptides, correspondant aux séquences SEQ ID
NO: 56 à 81 et SEQ ID NO: 96 à 129, est présentée respectivement dans les
Tableaux
Xa et Xb.
S La perte de liaison des peptides mutants aux molécules DP4 a été
déterminée par le test décrit pour les mutants alanine et lysine.
2) Résultats
a) détermination d'un peptide UNK 1 minimum
Les résultats sont présentés dans le Tableau VIII, ci-après
Tableau VIII : Liaison à DP401 et DP402 des peptides dérivés de UNK1 (LTNK 1-
17)
peptides Positions ICSO
des (nM)
squences
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 121314 1516 17401 402
UNK 1-17 E K K Y F A A T Q F E P L A A R L 11 14
UNK 1-11 E K K Y F A A T Q F E 55 95
UNK 1-12 E K K Y F A A T Q F E P 93 100
UNK 1-13 E K K Y F A A T Q F E P L 14 28
UNK 2-14 K K Y F A A T Q F E P L A 15 23
UNK 3-15 K Y F A A T Q F E P L A A 19 23
UNK 4-16 Y F A A T Q F E P L A A R 38 25
UNK 5-17 F A A T Q F E P L A A R L 65 38
UNK 6-17 A A T Q F E P L A A R L 150006000
UNK 7-17 A T Q F E P L A A R L 1500012500
UNK 3-17 K Y F A A T Q F E P L A A R L 18 14
UNK 1-15 E K K Y F A A T Q F E P L A A 18 17
Les résultats obtenus montrent que
- la perte de liaison observée avec les peptides UNK 1-11, UNK 1
12, UNK 4-16, UNK 5-17 suggère que le peptide minimum à une taille de 13 à 15
acides aminés,
- la perte de liaison observée avec les peptides UNK 6-17 et UNK 7-
17 suggère que le résidu F en position 5 est le premier résidu d'ancrage des
peptides
dans le site de liaison des molécules DP4 (résidu P1).
b) détermination des résidus du peptide UNK1 impliqués dans la liaison aux
molé-
cules DP4
Les résultats sont présentés dans le Tableau IX, ci-après
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32
Tableau IX : Perte de liaison à DP401 et DP402
des mutants alanine et lysine
PEPTIDEI 2 4 5 6 7 8 9 l0I1l2131415 DP*0401DP*0402
3 16
17
UNK1 E K Y F A A T Q F E P LA A R I 1,00
K L
UNK K Y F A A T Q F E P LA A I,5 1,7
3-15
P1 P4 P6 P9
UNK A Y F A A T Q F E P LA A 0,9 I
K3A
UNK K A F A A T Q F E P LA A 1,2 0,9
Y4A
UNK K Y A A A T Q F E P LA A 41 5,7
FSA
UNK K Y F A A A Q F E P LA A 0,8 0,8
T8A
UNK K Y F A A T A F E P LA A 0,8 0,6
Q9A
UNK K Y F A A T Q A E P LA A 336 62
FlOA
UNK K Y F A A T Q F A P LA A 0,5 0,5
EI
1A
UNK K Y F A A T Q F E A LA A 1,2 0.9
P12A
UNK K Y F A A T Q F E P AA A 3,l 2,3
Ll3A
UNK K K F A A T Q F E P LA A 1,2 1
Y4K
UNK K Y K A A T Q F E P LA A 569 297
F_SK
UNK K Y F K A T Q F E P LA A 1,6 l
A6K
UNK K Y F A K T Q F E P LA A 2 1.2
A7K
UNK K Y F A A K Q F E P LA A 31 3,6
T8K
UNK K Y F A A T K F E P LA A 1,6 0,9
Q9K
UNK K Y F A A T Q K E P LA A 420 350
FIOK
UNKEIIKK Y F A A T Q F K P LA A 1,3 0,7
UNK K Y F A A T Q F E K LA A l,8 1,4
P12K
UNKL(3KK Y F A A T Q F E P KA A 81 70
UNK K Y F A A T Q F E P LK A 1,7 l,4
A14K
UNK K Y F A A T Q F E P LA K 1,7 1,4
A15K
Les résultats montrent une perte de liaison pour FSA, F10A, FSK,
F10K et L13K, ce qui suggère fortement que les résidus d'ancrage des peptides
dans le
site de liaison des molécules DP4 sont respectivement la FS en position P1, la
F10 en
position P6 et la L 13 en position P9.
c) détermination des motifs de liaison aux molécules DP401 et DP402
Les résultats sont présentés dans les Tableaux Xa, Xb et le Tableau
XI, ci-après
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33
Tableau Xa : Perte de liaison à DP401 et DP402~'
des
mutants
en
P1,
P4,
P6
et
P9
(SEQ
ID
NO:
56
81)
PEPTIDEI 2 4 5 67 8 9 1011 1213l4IS16 l7 DP*0401DP*0402
3
UNKI E K Y F AA T Q F E PL A A R L 1.00 1,00
K
UNK K Y F AA T Q F E PL A A l,4 l,4
3-IS
PI P4 P6 P9
UNK K Y Y AA T Q F E PL A A 3 3,9
FSY
UNK K Y L AA T Q F E PL A A 3,6 6
FSL
UNK K Y E AA T Q F E PL A A 117 123
FSE
UNK K Y N AA T Q F E PL A A 398 76
FSN
UNK K Y T AA T Q F E PL A A 234 126
FST
UNK K Y F AA F Q F E PL A A 2,7 1,7
T8F
UNK K Y F AA L Q F E PL A A 1,9 2,6
T8L
UNK K Y F AA E Q F E PL A A 2,7 3,7
T8E
UNK K Y F AA D Q F E PL A A 2 2,3
T8D
UNK K Y F AA N Q F E PL A A 4,1 4,8
T8N
UNK K Y F AA Y Q F E PL A A 4, I 2,4
T8Y
UNK K Y F AA R Q F E PL A A 17 6,7
T8R
UNK K Y F AA S Q F E PL A A 2,7 3,4
T$S
UNK K Y F AA T Q Y E PL A A 2,4 3,4
FIOY
UNK K Y F AA T Q L E PL A A 7,2 6,7
F10L
UNK K Y F AA T Q W E PL A A 2,2 2,5
FIOW
UNK K Y F AA T Q E E PL A A 1405 1190
FIOE
UNK K Y F AA T Q N E PL A A 2460 1809
F10N
UNK K Y F AA T Q T E PL A A 1171 476
F
l
OT
UNK K Y F AA T Q F E PF A A 1,7 4
L13F
UNK K Y F AA T Q F E PY A A 2 15
Ll3Y
UNK K Y F AA T Q F E PE A A 11 8
L13E
UNK K Y F AA T Q F E PD A A 9,4 9
L13D
UNK K Y F AA T Q F E PN A A 17 10
LI3N
UNK K Y F AA T Q F E PR A A 64 43
L13R
UNK K Y F AA T Q F E PV A A 2,5 l,9
L13V
'~ 10 indiques en
les sont gras.
valeurs
suprieures
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34
Tableau Xb : Perte de liaison à DP401 et DP402'~
des mutants en P1, P4, P6 et P9 (SEQ ID 110: 96 à 129)
peptides1 2 4 5 7 8 9 10l 13l41 l6 17 perte
3 6 ! S
l2
UNK E K Y F A T Q F E L A A R L DP*0401
K A P DP*0402
LJNK K Y D A T Q F E L A A 150 57
FSD A P
UNK K Y G A T Q F E L A A 160 55
FSG A P
LJNK K Y H A T Q F E L A A 150 36
FSH A P
UNK K Y I A T Q F E L A A 3 2
FSI A P
UNK K Y IvI A T Q F E L A A 3 3
FSM A P
UNK K Y P A T Q F E L A A 100 48
FSP A P
UNK K Y Q A T Q F E L A A 260 97
FSQ A P
UNK K Y R A T Q F E L A A 14U 54
FAR A P
UNK K Y S A T Q F E L A A 160 42
FSS A P
UNK K Y V A T Q F E L A A 11 6
FSV A P
UNK K Y W A T Q F E L A A 0,5 l
FSW A P
UNK T8G K Y F A A G Q F E P L A A l 2
UNK.~'8P K Y F A A P Q F E P L A A 3 2
UNK T8H K Y F A A H Q F E P L A A 6 2
UNK F K Y FA A T Q D E P L AA 2700 120
l OD
UNK F K Y FA A T Q E P L AA >7100 3700
l OG
UNK F K Y FA A T Q H E P L AA 2400 220
l OH
UNK F K Y FA A T Q I E P L AA 7 6
1 O1
UNK F K Y FA A T Q IvIE P L AA 4 l
l OM
UNK F K Y FA A T Q P E P L AA 210 12
I OP
UNK F K Y FA A T Q Q E P L AA >7100 230
I OQ
UNK F K Y FA A T Q R E P L AA >7100 370
1 OR
UNK F K Y FA A T Q S E P L AA 500 33
l OS
LINK F K Y FA A T Q V E P L AA 42 22
I OV
UNKF10W K Y FA A T Q W E P L AA l
UNKFIOC K Y FA A T Q E P L AA 17 2
UNKLl3G K Y FA A T Q F E P AA 15 12
UNKL13H K Y FA A T Q F E P H AA 13 35
UNK L K Y FA A T Q F E P I AA 1 3
I 3I
LINK Ll3PK Y FA A T Q F E P P AA 9 3
UNK L13Q K Y FA A T Q F E P Q AA 8 2
UNKLl3S K Y FA A T Q F E P S AA 9 5
L1NK L K Y FA A T Q F E P T AA 5 3
13T
UNKLl3W K Y FA A T O F E P W AA l 13
* les valeurs supérieures à 10 sont indiquées en gras.
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Tableau XI : Spécificité de la liaison aux molécules DP4'~
P1 P6 P9
P4 -
+ - + . + - +
DP* F,Y,L,H,T,S F,L,Y,K R F,Y,L,H,V,A F,Y,VH,G,
0401 I,M,WA,G,P,H,T,A, W,I,MG,T,P A,I,P,K,R
K,R,D S,G,P, S,K,R,W~L E,N,
M
E,N,Q,I,M,Q, E,D,N,Q,S,T,
C~ E,D,N, Q~ D
V
V,W,C
D F,Y,LH,T,S F,L,Y, F,Y,L,H,V,A,F,V,A,Y,H,
P*
0402 A,I,M,G,P, H,T,A, W,I,MG,T,P,I,P,L,W,G,
V,W K,R,D S,G,P, C S,K,R,M,,Q,K,R,N
E,N,Q,1~M(~,E E,D,N,S,T,D,
C D,N,V, Q E
K,W,C,
R
~' Les acides aminés qui provoquent respectivement une perte de liaison d'un
facteur supérieur à
10 et inférieur à 10 sont indiquées dans la colonne (-) et la colonne (+) ;
les résidus d'ancrage sont
représentés en gras et les différences entre DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402 sont
soulignées.
5
Les résultats obtenus montrent que
- les poches P1, P6 et P9 du site de liaison des molécules DP4
acceptent des résidus aromatiques et hydrophobes,
- la poche P4 du site de liaison des molécules DP4 est très permis-
10 sive, et dans une moindre mesure la poche P9 qui accepte également les
résidus Q, S,
T et D, et
- l'allèle DPB 1 *0401 accepte un résidu tyrosine ou tryptophane en
P9 mais n'accepte pas de résidus cystéine et acide glutamique à cette
position, ni de
résidus alanine et valine en P1, ni de résidus lysine et arginine en P4 ou
bien encore
15 de résidu cystéine en P6 ; l'allèle DPB 1 *0402 accepte un résidu alanine
ou valine en
P1, un résidu lysine ou arginine en P4, un résidu cystéine en P6 et un résidu
cystéine
ou acide glutamique en P9 mais n'accepte pas de résidu tyrosine ou tryptophane
à
cette position.
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36
d) Identification d'un motif de liaison dans la séguence de peptides
ligands de DP4
L'activité de liaison de différents peptides ligands de DP4 a été
mesurée par le test de liaison en compétition, dans les conditions définies au
Tableau
VI. Les résultats sont exprimés par la valeur ICSO (Tableau XIII) ou par la
valeur du
rapport des ICSO du peptide ligand et du peptide LJNK1 (Tableau XII).
Les peptides testés correspondant respectivement aux séquences
SEQ ID NO: suivantes, sont présentés dans les tableaux XII et XIII:
- TT 947-963 (SEQ ID N0:20),
- UNK1 (SEQ ID N0:14),
- NY-ESO1 87-11, 119-143, 158-180, 166-180 (SEQ ID N0:94, 83,
82, 95),
- UL21 283-302 (SEQ ID N0:18),
- IL3 127-146 (SEQ ID N0:13)
- NS-P2 (SEQ ID N0:4)
Api-ml 65-72, 69-86, 73-90, 77-94, 81-98 (SEQ ID N0:85, 88, 89,
17, 86)
- MAG 245-258 (SEQ ID N0:19)
- MART1 1-20, 41-60, 51-73, 62-72, 103-118 (SEQ ID N0:90, 91,
87, 92, 93).
En parallèle, les séquences de ces peptides ligands de DP4 ont été
alignées et la présence d'un motif de liaison à DP4 tel que défini au Tableau
XI, a été
recherchée (Tableaux XII et XIII).
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37
Tableau XII: Alignement des séquences des peptides ligand de DP4
Peptides Squences oaal~oaoz~
P1 P6 P9
TT947-963 FNNFTVSFWLRVPKVSA 0,570,75
UNK1 EKKYFAATQFE PLAARL 1 1
NY-ES01158-180LLP~'IWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 2 7
UL21283-302RELWWVFYAGDRALEEPHAE 2,862,78
IL3127-146GPGAPADVQYDLYLNVANRR 3,983,06
NS-p2 GVQIVRQIRSGERFLKIWSQ 4,693,89
NY-ES01 PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 ~
119-143 12
NY-ES01119-143PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 12
NY-ES01119-143PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR 12 12
NY-ES0187-111LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ 20 9
Api m1 TISSYFVGKMYFNLIDTK 30 10
77-94 I I
Api m1 T I S S Y FVG KMYFN L I DT K 30 10
77-94
Api m1 DKFYDCLKNSADTSSYF NT 371,4
65-72
MAG 245-258LLTQHFVQENYLEY 30,238,89
MAG245-258LLTQHFVQENYLEY 30,238,89
Apim181-98YFVGKMYFNLIDTKCYKL 150 70
MART151-73RNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR 857 414
~ 0401: activité relative de liaison des peptides à DP81' 0401 par rapport au
peptide UNK1 (activité de liaison égale à 1)
~ 0402: activité relative de liaison des peptides à DPB1' 0402 par rapport au
peptide UNK1 (activité de liaison égale à 1)
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38
Tableau XIII: Liaison des peptides Api ml, NY-ESO1 et
MARTI à DPB1*0401 et DPB1*0402'~.
ICso (nM)
s
enc
Se~
peptides e 401 402
N
UNK1 EKKYFAATQFEPLAARL 12 13
Api ml 65-72 DKFYDCLKNSADTISSYF 50000 6500
Api ml 69-86 DCLKNSADTISSYFVGKM > 10000> 10000
Api ml 73-90 NSADTISSYFVGKMYFNL > 10000> 10000
Api ml 77-94 TISSYFVGKMYFNLIDTK 450 175
Api ml 81-98 YFVGRMYFNLIDTKCYKL 2250 1225
MART1 1-20 MPREDAHFIYGYPKKGHGHS > 10000> 10000
MART1 41-60 LLIGCWYCRRRNGYRALMDK > 10000> 10000
MARTL 51-73~~ RRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRR 8000 4000
MART1 62-72 LMDKSLHVGTQCALTRRCPQ > 100001> 10000
MART1 103-118 AYEKLSAEQSPPPYSP > 10000> 10000
NY-ESO1 87-111 LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ 183 83
NY-ESO1 PGVLLKEFTVSGN_ILTIR_LTAA_DHR 110 117
119-143~''~*
NY-ESOl 158-180 LLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR 20 67
NY-ESO1 166-180 FLPVFLAQPPSGQRR > 10000> 100001
~ Les acides aminés compatibles avec le motif de liaison aux allèles DPB 1
*0401
S et DPB 1 *0402 sont indiqués en gras et les motifs de liaison complets sont
soulignés.
~'~' La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., PNAS, 2000, 97,
400-405.
~+~ La séquence de ce peptide est décrite dans Zarour et al., Cancer Res.,
2000, 60, 4646-4952.
Les résultats montrent qu'il existe pour la plupart des peptides
ligands de DP4 une forte corrélation entre la présence d'au moins 2 résidus P
1 et P6
ou P6 et P9 tels que définis au Tableau XI et une afimité élevée pour les
molécules
DP4 (ICSO< 1000nM). Ces résultats montrent également que les résidus les plus
importants dans la liaison à HLA-DP4 sont les résidus aromatiques ou
hydrophobes en
position P 1 et P6 ; ces mêmes résidus en position P9 sont moins importants.
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
39
EXEMPLE 6 : PREDICTION DE LA SEQUENCE DE PEPTIDES LIGANDS
D'HLA-DP4 A PARTIR D'UNE SEQUENCE D'ACIDES AMINES
1) Matériels et méthodes
Une matrice de liaison aux molécules HLA-DP4 a été établie à partir
des activités de liaison (ICSO) des mutants du peptide UNK 3-15 mesurées par
le test
de liaison aux molécules DP4 codées par les allèles DPB 1 *0401 et DPB 1
*0402, tel
que défini ci-dessus, en utilisant comme peptide traceur le peptide UNK 3-15
(exemple 5 et Tableaux IX, Xa, Xb et XI). La contribution de chacun des acides
aminés en position P l, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants à la liaison aux
molécules DP*0401 et DP*0402 est évaluée par un score de liaison correspondant
au
logarithme (log) du rapport des ICSO du peptide mutant et du peptide UNK 3-15.
Le
score de liaison aux molécules DP*0401 et DP*0402, obtenu pour chacun des
acides
aminés en position P1, P4, P6 et P9 desdits peptides mutants constitue la
matrice de
liaison à HLA-DP4 présentée dans le Tableau XN ci-dessous:
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
U M CD N ~ Of~OO M a~O
C~jO ~ r ~ O O O
O O O p
O O O
O O O
O O
V tC~N ~.,~OO ~
O r- tD I~ M
~
O O O O
7 Cfl~ p CD
O O H ~ O
O O
N N .- N
N 00N
N N M f~ O p ~ ~ I~
N D N ~ r, O
Is~ f~~ c0
j
N ~ M ~ N
O ~ M O~O~O ~ M M M
N O M O ~- O N O
M ~ O M
~t C ~t
O~
N O ~ O ~
.O
N p u'7t1~a0 p 00
Z M r- r t~ O 00
cC N O M ~ r- O M O
Q1
V ~ ~ M CO O ct M p M
O O O O O
Q
p M O p M I~
0. ~ 0
A o
00 M lI)00 ~ CO p
~ N N N
O
N ~ N N N
00 ~ 00 00
M M M
OO O
O O O O O O O O
" O ~ r t~ M M
t
_~ _ ~ I' _ _
y N O M ~ N ~
N O ~ '
0
Vr O 00 r u O
7
'y",~ N M M
CC
11O ~ O O O O O
H ~ M O~ p ~ ~ 0 0
~pp 0
0
O N ~ O N O
O
CC Q s M M ~ ~ M ~ 07
I
O ~ M O r- O M O
O
C O M O 00 a0 CO
a O O O O
~tn
C
O ~ '~TtD 07a- ~ t0
O
a a a a a a a a a
w,
N
O O
O O
0 0 0
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 ' ' PCT/FR02/03555
41
A partir d'une séquence en acides aminés, la liaison des peptides d'au
moins 9 acides aminés inclus dans ladite séquence est calculée à partir de la
matrice
ci-dessus en effectuant, pour chaque fragment de 9 acides aminés dudit
peptide, par
exemple des fragments chevauchant de 9 acides aminés couvrant la totalité de
cette
séquence, la somme des scores de liaison des résidus en position l, 4, 6 et 9
dudit
fragment.
Des peptides présentant des scores de liaison de respectivement 0, l,
2, 3 et 4 correspondent à des peptides présentant une perte de liaison d'un
facteur 1,
10, 100, 1000 et 10000 par rapport au peptide UNK 3-15 (ICSO 10 nM), c'est- à -
dire,
présentant une activité de liaison estimée, de respectivement 10 nM, 100 nM,
1000
nM, 10 yM. et 100 pM.
Les peptides présentant les scores de liaison les plus faibles, de
préférence inférieur à 2, de manière préférée inférieur à 1, de manière encore
plus
préférée proche de 0 sont sélectionnés; ces peptides correspondent à ceux dont
l'activité de liaison à HLA-DP4, estimée à partir de la matrice de liaison
telle que
définie ci-dessus, est la plus élevée.
2) Résultats
La corrélation entre le score de liaison des peptides (estimé à l'aide
de la matrice de liaison à HLA-DP4, Tableau XN) et leur affinité pour les
molécules
HLA-DP4 (mesurée par le test de liaison tel que défini ci-dessus) a été
analysée pour
44 peptides étudiés aux exemples 4 et 5.
Les résultats sont illustrés par le Tableau XV et la figure 2.
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
42
Tableau XV: Score de liaison et activité de liaison à HLA-DP4
de différents peptides
Peptide DP'0401 DP'0402
ICso score ICso score
(nM) de (nM) de
liaison liaison
TT 947-963 4,61 0,90 7 1,08
UNK 1 9,47 0,00 10,00 0,00
NY-ES01158-18030,00 0,60 70,00 0,60
UL21283-30222,89 1,77 20,00 2,01
IL3127-146 30,37 1,94 30,00 1,86
NSP2 40,00 2,44 40,00 2,69
NY-ES01119-143100,00 2,16 100,00 1,90
NY-ES0187-11186,12 1,73 87,00 1,26
MAG 245-258250,00 0,90 400,00 1,68
MART151-73 8000,00 3,76 4000,002,45
Api-m11-18 10000,001,89 10000,002,08
Api-m15-22 10000,004,88 10000,003,33
Api-m19-26 10000,003,58 10000,003,33
Api-m113-3010000,002,92 10000,002,38
Api-m117-3410000,002,92 10000,002,38
Api-m121-3810000,004,08 10000,003,40
Api-m125-4210000,003,97 10000,002,64
Api-m129-4610000,002,56 10000,001,86
Api-m133-5010000,002,56 10000,001,86
Api-m137-5410000,004,00 10000,003,07
Api-m141-5810000,004,00 10000,003,07
Api-m145-6210000,003,23 10000,002,45
Api-m149-6610000,003,23 10000,002,45
Api-m153-7010000.003,15 10000,002,45
Api-m157-7410000,003,15 10000,002,90
Api-m161-7810000,003,15 10000,002,90
Api-m165-8250000,003,64 6500,002,90
Api-m169-8610000,002,70 10000,001,94
Api-m 1 10000,001,78 10000,001,18
73-90
Api-m177-94450 1,34 175,00 1,18
Api-m181-982250 1,34 1225,000,78
Api-m185-10210000,001,71 10000,000,78
Api-m189-10610000,001,71 10000,000,78
Api-m193-11010000.004,27 10000,003,02
Api-m197-11410000,004,98 10000,003,46
Api-m1101-11810000,003,67 10000,003,21
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
43
Api-m1105-12210000,003,65 10000,003,21
Api-m1109-12610000,003,65 10000,003,44
Api-m1113-13010000,003,96 10000,003,50
Api-m 1 117-13410000,001,86 10000,001,98
MART11-20 10000,003,16 10000,002,16
MART141-60 10000,002,48 10000,002,20
MART162-72 10000,004,00 10000,002,46
MART1103-11810000,004,11 10000,002,95
Ces résultats montrent qu'il existe une forte corrélation entre le score
de liaison et l'affinité des peptides pour HLA-DP4. En effet, en prenant comme
seuil
d'activité un score de liaison < 2 et une activité de liaison ICSO < 1000 nM
- 80 % des peptides présentant un score de liaison < 2 pour les
molécules HLA-DP4 (DP*0401 et DP*0402) présentent une affinité élevée pour ces
molécules (ICSO < 1000 nM, peptides vrais positifs) et
- 82 % et 76 % des peptides présentant un score de liaison >_ 2 pour
les molécules HLA-DP4 (respectivement DP*0401 et DP*0402) présentent une
faible
affinité pour ces molécules (ICSO >_1000 nM, peptides vrais négatifs).
En conséquence, la matrice de liaison à HLA-DP4 peut-être utilisée
pour prédire la séquence de peptides ligands d'I-ILA-DP4 à partir de n'importe
qu'elle
séquence d'acides aminés, notamment une séquence représentant un antigène
d'intérêt.
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
1
LISTE DE SÉQUENCES
<110> COMMISSARIAT A L'ÉNERGIE ATOMIQUE
SEDAC THERAPEUTICS
MAILLERE, Bernard
CASTELLI, Florence
BUHOT, Cécile
GEORGES, Bertrand
<120> Procédé de sélection de ligands d'HLA-DP4 et ses
applications
<130> sF263ext70
<140>
<141>
<160> 129
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 21-
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 1
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala Ser His Leu Glu
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 2
Asp Pro Tyr Asn Cys Asp Trp Asp Pro Tyr His Glu Lys Tyr Asp Trp
1 5 10 15
Asp Leu Trp Asn Lys Trp Cys Asn
<210> 3
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
2
<211> 10
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 3
Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 4
Gly Val Gln Ile Val Arg Gln I1e Arg Ser Gly Glu Arg Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Trp Ser Gln
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 5
Gly Ile Ser Lys Cys Arg Phe Leu Lys Ile Arg Glu Gly Arg
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
3
<400> 6
Ile Ala Phe Asn Ser Gly Met Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 7
Gly Met Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Leu Ser Val
1 5 10 15
<210> 8
<211> 1E
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 8
Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro
1 5 10 15
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 9
Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
4
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 10
Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro
1 5 10 15
Ser Gly Gln Arg
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 11
Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe
1 5 10 15
Leu Ala Gln Pro Pro
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 12
Arg Glu Leu Trp Trp Val Phe Tyr Ala Gly Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 13
Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val
1 5 10 15
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
S
Ala Asn Arg Arg
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 14
Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg
1 5 10 15
Leu
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Sëquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 15
Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 16
Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
6
<213> Séquence artificielle
<400> 17
Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp
1 5 10 15
Thr Lys
<210> 18
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle:pepride
synthétique
<400> 18
Arg Glu Leu Trp Trp Val Phe Tyr Ala Gly Asp Arg Ala Leu Glu Glu
1 - 5 10 15
Pro His Ala Glu
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<400> 19
Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 20
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1 5 10 15
Ala
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 - PCT/FR02/03555
7
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 21
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1 5 10
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 22
Ala Ala Tyr Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 23
Asp Val Glu Val Tyr Arg Ala Val Thr Pro Leu Gly Pro Pro Asp
1 5 10 15
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 24
Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp
1 5 10 15
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
8
Gln Glu
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 25
Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 26
Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro
1 5 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 27
Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
9
<400> 28
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 29
Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 30-
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 30
Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 31
Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 32
Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 33
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala Arg Leu
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 34
Glu Lys Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10 15
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<400> 35
Ala Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
<400> 36
Lys Ala Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 37
Lys Tyr Ala Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 38-
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 38
Lys Tyr Phe Ala Ala Ala Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 39
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 39
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Ala Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
12
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 90
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ala Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 41
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Ala Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 42
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Ala Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 43
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ala Ala Ala
1 5 10
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
13
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 94
Lys Lys Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 45
Lys Tyr _Lys Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 13
<212> PRT
<213> Sëquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 46
Lys Tyr Phe Lys Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 47
Lys Tyr Phe Ala Lys Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 13
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
14
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 48
Lys Tyr Phe Ala Ala Lys Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 49
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Lys Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 50
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Lys Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<900> 51
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Lys Pro Leu Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de 1a séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 52
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Fhe Glu Lys Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 53
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ala
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 54
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Lys Ala
1 5 10
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 55
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Lys
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
16
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 56
Lys Tyr Tyr Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 57
Lys Tyr Leu Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<400> 58
Lys Tyr Glu Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 59
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<900> 59
Lys Tyr Asn Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
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17
<210> 60
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 60
Lys Tyr Thr Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 61
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 61
Lys Tyr Phe Ala Ala Phe Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 62
Lys Tyr Phe Ala Ala Leu Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 63
Lys Tyr Phe Ala Ala Glu Gln Phe Glu Pro Leu Ala A1a
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
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18
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 64
Lys Tyr Phe Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 65
Lys Tyr Phe Ala Ala Asn Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 66
Lys Tyr Phe Ala Ala Tyr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 67
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 67
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
19
Lys Tyr Phe Ala Ala Arg Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 68
Lys Tyr Phe Ala Ala Ser Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 69
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 69
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Tyr Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 70
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr G1n Leu Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 71
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
CA 02463705 2004-04-14
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<400> 71
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Trp Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 72
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Glu Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 73
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 73
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Asn Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 74
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Thr Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
CA 02463705 2004-04-14
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21
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 75
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Phe Ala Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 76
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Tyr Ala Ala
1 5 10
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 77
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Glu Ala Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 78
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Asp Ala Ala
1 5 10
<210> 79
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
CA 02463705 2004-04-14
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22
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 79
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Asn Ala Ala
1 5 10
<210> 80
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 80
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Arg Ala Ala
1 5 10
<210> 81
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 81
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr G1n Phe Glu Pro Val Ala Ala
1 5 10
<210> 82
<211> 23
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 82
Leu Leu Met Trp I1e Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln
1 5 10 15
Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
23
<210> 83
<211> 25
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 83
Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr
1 5 10 15
Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg
20 25
<210> 84
<211> 25
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 84
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala
1 5 10 15
Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln
20 25
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 85
Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ser Ser Tyr
1 5 10 15
Phe
<210> 86
<211> 18
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
24
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 86
Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr
1 5 10 15
Lys Leu
<210> 87
<211> 23
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220> _
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 87
Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr
1 5 10 15
Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg
<210> 88
<211> 18
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 88
Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly
1 5 10 15
Lys Met
<210> 89
<211> 18
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 89
Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 90
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 90
Met Pro ärg Glu Asp Ala His Phe Ile Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly
1 5 10 15
His Gly His Ser
<210> 91
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 91
Leu Leu Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Met Asp Lys
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 92
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
26
Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr Gln Cys Ala Leu Thr Arg
1 5 10 15
Arg Cys Pro Gln
<210> 93
<211> 16
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 93
Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gln Ser Pro Pro Pro Tyr Ser Pro
1 5 10 15
<210> 94
<211> 25
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 94
Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala
1 5 10 15
Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln
20 25
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<900> 95
Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser G1y Gln Arg Arg
1 5 10 15
<210> 96
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
27
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 96
Lys Tyr Asp Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 97
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle:peptiàe
synthétique
<400> 97
Lys Tyr Gly Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 98
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 98
Lys Tyr His Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 99
<211> 13~
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 99
Lys Tyr Ile Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
28
<210> 100
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 100
Lys Tyr Met Ala Ala Thr G1n Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 101
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220> _
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 101
Lys Tyr Pro Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 102
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 102
Lys Tyr Gln Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 103
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 103
Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
29
<210> 104
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 104
Lys Tyr Ser Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 105
Lys Tyr Val Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 106
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 106
Lys Tyr Trp Ala A1a Thr Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 107
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 107
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
Lys Tyr Phe Ala Ala Gly Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 108
Lys Tyr Phe Ala Ala Pro Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 109
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 109
Lys Tyr Phe Ala Ala His Gln Phe Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 110
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Asp Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 111
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
31
<400> 111
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Gly Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 112
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 112
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln His Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 11~
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 113
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ile Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 114
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 114
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Met Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
32
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 115
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Pro Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 116
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description àe la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 116
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Gln Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 117
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 117
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Arg Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 118
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 118
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Ser Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 119
<211> 13
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
33
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 119
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Val Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 120
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 120
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Trp Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 121
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 121
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Cys Glu Pro Leu Ala Ala
1 5 10
<210> 122
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 122
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Gly Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
34
<210> 123
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 123
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro His Ala Ala
1 5 10
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220> _
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 124
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ile Ala Ala
1 5 10
<210> 125
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 125
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Pro Ala Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 126
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Gln Ala Ala
1 5 10
CA 02463705 2004-04-14
WO 03/040299 PCT/FR02/03555
<210> 127
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 127
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Ser Ala Ala
1 5 10
<210> 128
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 128
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Thr Ala Ala
1 5 10
<210> 129
<211> 13
<212> PRT
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: peptide
synthétique
<400> 129
Lys Tyr Phe Ala Ala Thr Gln Phe Glu Pro Trp Ala Ala
1 5 10
