PROCEDE POUR GENERER L'EMPREINTE CATALYTIQUE IDIOSYNCRASIQUE D'UN ECHANTILLON, LE TRAITEMENT DE LADITE EMPREINTE ET LES SYSTEMES POUR LEUR MISE EN OEUVRE

METHOD FOR GENERATING IDIOSYNCRATIC CATALYTIC FINGERPRINT OF A SAMPLE, PROCESSING OF SAID PRINT AND SYSTEMS THEREFOR

English Abstract

The invention concerns a method for generating idiosyncratic catalytic fingerprint of a sample, characterized in that it comprises the following steps: contacting the sample capable of having catalytic activity with an assembly of substrates; capturing signals generated after said contact. Advantageously, after capturing the signal, providing a processing thereof which consists in assigning to each signal a numerical value constituting a component of a graphic representation, for example a coloured representation, of the idiosyncratic fingerprint.

French Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour générer l'empreinte
catalytique idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend
les étapes suivantes, on met en contact l'échantillon susceptible de posséder
l'activité catalytique avec un ensemble de substrats; on capture de façon les
signaux générés après ladite mise en contact. Avantageusement, après la
capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci consistant à affecter
à chaque signal une valeur numérique constituant une composante d'une
représentation graphique, par exemple une représentation en couleurs, de
l'empreinte idiosyncrasique

Claims

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REVENDICATIONS
1) Procédé pour générer l'empreinte catalytique
idiosyncrasique d'un échantillon, caractérisé en ce qu'il
Comprend les étapes suivantes :
a) on met en contact l'échantillon susceptible
de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de
substrats,
b) on capture les signaux générés après ladite
mise en contact.
2) Procédé selon la revendication 1,
caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les substrats sont
ordonnés.
3) Procédé selon la revendication 1,
caractérisé en ce qu'à l'étape (a) les substrats sont sous
forme de mélange.
4) Procédé selon l'une des revendications 1 à
3, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), on capture les
signaux de façon ordonnée.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à
4, caractérisé en ce qu'à l'étape (b), les signaux générés
après ladite mise en contact sont capturés en utilisant une
technique séparative comme l'HPLC.
6) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 5, caractérisé en ce que chaque
substrat comporte au moins un groupe fonctionnel sensible
à la présence d'une activité catalytique d'un échantillon
et permet la génération d'un signal de manière directe ou
indirecte.

39
7) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après la
capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci
consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique
constituant une composante d'une représentation graphique,
par exemple une représentation en couleurs, de l'empreinte
idiosyncrasique.
8) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'après la
capture des signaux, on réalise un traitement de ceux-ci
consistant à affecter à chaque signal une valeur
numérique, puis à associer par groupe d'au moins deux
valeurs, les valeurs numériques issues d'un même ensemble
de substrats ou de plusieurs ensembles de substrats, et
d'affecter à chaque groupe une valeur numérique
constituant une composante d'une représentation graphique
par exemple une représentation en couleurs, d'une
empreinte idiosyncrasique.
9) Procédé selon l'une des revendications 6 à
8, caractérisé en ce que chaque substrat comprend un
groupement chimique susceptible de lui conférer une
spécificité pour une activité définie par le groupe
fonctionnel.
10) Procédé selon la revendication 9,
caractérisé en ce que les groupements chimiques capables de
conférer au substrat une spécificité pour une activité
définie par le groupe fonctionnel sont constitués par des
variations de substitution.
11) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les signaux
générés par la mise en contact des substrats avec

40
l'échantillon peuvent être mesurés sur le même type de
capteur.
12) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que les
signaux générés par la mise en contact des substrats avec
l'échantillon sont de même type.
13) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que les
substrats sont capables de réagir sur un temps de réaction
court, par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement
inférieur à 20 minutes.
14) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que les
substrats sont peu ou pas sensibles à la dégradation ou aux
activités non-spécifiques.
15) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que les
activités catalytiques de l'échantillon sont inconnues.
16) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que
l'activité catalytique de l'échantillon correspond â au
moins une enzyme ou un mélange d'enzymes.
17) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les substrats
sont choisis parmi ceux répondant à l'une des formules (I)
à (V) suivantes.

41
<IMGS>
dans lesquelles:
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure
par une réaction d'oxydation chimique,
- Di représente le précurseur d'un produit
détectable,
- X et Y, identiques ou différents, sont
choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une
amine de formule -NR11R12, R11 est choisi parmi : un atome
d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués
ou non, et R12 n'est pas un atome d'hydrogène,
- R1 à R3, identiques ou différents sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou
non ou un groupement chimique comme défini précédemment,
- P1 et P2, identiques ou différents sont des
groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus
un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène,
- P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un
groupe -PO2R11 ou un groupe R11PO-, où R11 présente la même
signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe
-CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou
glycosyle, un groupe SiR14R15 où R14 et R15, identiques ou
différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy
ou alcoxy et un groupe AsO2H-,

42
- G est choisi parmi un atome d'oxygène, un
atome de soufre, un groupe amine de formule NR13 où R13 est
R11 ou R12, Rll et Rl2 ayant la même signification que ci-
dessus,
et en ce que lesdits substrats de formules (I)
à (V) sont transformés par l'échantillon en des produits
qui vont être oxydés pour obtenir de manière directe ou
indirecte un composé détectable correspondant à un ou
plusieurs composés susceptibles de présenter seuls ou en
combinaison une ou plusieurs variations de leurs propriétés
biophysiques, biologiques ou chimiques avant et après
l'étape d'oxydation.
18) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les substrats
(S) sont choisis parmi ceux dont la transformation en
produit (P) peut être détectée en mesurant un changement de
pM résultant de la différence de pouvoir chélatant du
substrat (S) et du produit (P) vis-à-vis d'un ion
métallique, et en ce que la transformation d'un substrat
(S) en un produit (P) est effectuée en mesurant le
changement des propriétés spectrales d'un détecteur
chimique (L), chélateur d'un ion métallique, résultant
d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre suivant .
ML~ (MP et/ou MS) + L
où:
S représente un substrat, qui peut être toute
molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent
de celui du produit résultant de la transformation chimique
du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique,
comme l'acide phytique pour les phytases ou des protéines
entières pour les protéases. Ce substrat peut présenter des
propriétés énantiosélectives. Les substrats n'ont pas de
contrainte structurale autre que celle d'avoir une

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différence de pouvoir chélatant avec les produits
correspondants.
P représente le produit issu de la
transformation chimique de S et présentant un pouvoir
chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits
n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir
une différence de pouvoir chélatant avec les substrats
correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi
désigné « sensor pM », correspondant à tout ligand capable
de chélater les ions métalliques en solution tel que la
chélation du métal par le détecteur chimique donne un
changement de pM mesurable par toute méthode appropriée
comme par exemple un changement de propriété spectrale du
détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel
qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre
le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le
ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le
substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du
détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser
la méthode de l'invention avec des quantités faibles de
détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut
correspondre â un dérivé de fluorescéine ou tout autre
noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand
présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
19) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre
de substrats est avantageusement d'au plus 1000.

44
20) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce que le nombre
de substrats est de l'ordre de 1 à 200.
21) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 4 à 16, caractérisé en ce que les substrats
possèdent des groupes fonctionnels différents.
22) Procédé selon l'une quelconque des
revendications 10 à 21, caractérisé en ce que les substrats
possèdent des groupements chimiques différents.
23) Procédé selon l'une quelconque des
revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après la
capture des signaux générés par un échantillon, on effectue
une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique.
24) Procédé selon la revendication 23,
caractérisé en ce que ladite analyse consiste à
caractériser ou à effectuer un suivi de l'évolution de
l'échantillon.
25) Procédé selon l'une des revendications 23
ou 24, caractérisé en ce que ladite analyse comprend la
comparaison de l'empreinte catalytique idiosyncrasique
obtenue avec une autre empreinte catalytique
idiosyncrasique.
26) Application d'un procédé selon l'une
quelconque des revendications précédentes au contrôle
qualité.
27) Un ensemble de substrat comme défini dans
l'une quelconque des revendications 6 à 22.

45
28) Un ensemble d'empreintes catalytiques
idiosyncrasiques constituant une base de données obtenue
par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1
à 25.
29) Un système pour la mise en ouvre d'un
procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25,
caractérisé en ce qu'il comprend un support sur lequel sont
ordonnés plusieurs substrats et un ou plusieurs accessoires
suivants :
- un dispositif pour commander la mise en
contact de l'échantillon avec au moins un substrat,
- des capteurs pour mesurer les signaux générés
à partir de la transformation des substrats par
l'échantillon,
- un premier analyseur permettant de générer
l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon,
- une mémoire permettant de stocker dans une
base de données les empreintes catalytiques
idiosyncrasiques originales,
- un second analyseur permettant la
superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique
nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées
dans la mémoire.
30) Un système pour la mise en ouvre d'un
procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 25,
caractérisé en ce qu'il comprend un mélange de substrats et
un ou plusieurs accessoires suivants :
- un dispositif pour commander la mise en
contact de l'échantillon avec au moins un substrat,
- des capteurs pour séparer et mesurer les
signaux générés à partir de la transformation des substrats
par l'échantillon,

46
- un premier analyseur permettant de générer
l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon,
- une mémoire permettant de stocker dans une
base de données les empreintes catalytiques
idiosyncrasiques originales,
- un second analyseur permettant la
superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique
nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées
dans la mémoire.

Description

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1
PROCEDE POUR GENERER L'EMPREINTE CATALYTIQUE IDIOSYNCRASIQUE
D'UN ECHANITLLON, LE TRAITEMENT DE LADITE EMPREINTE ET LES SYSTEMES
POUR LEUR MISE EN OEUVRE
La présente invention concerne un procédé
permettant de générer l'empreïnte catalytique
idiosyncrasique d'un échantillon. L'invention concerne
aussi les systèmés pour la mise, en ouvre d'un tel procédé
et leur utilisation.
Un échantillon peut présenter des
caractéristiques catalytiques diverses. Elles s'expriment
par exemple par les différentes classes enzymatiques.
On connaît dans l'art antérieur l'utilisation
d'un même type de substrats permettant de révéler une
enzyme donnée.
On peut citer ceux concernant la détermination
du meilleur substrat d'une protéase spécifique (PNAS 97
(14), 7754-7759 et Nature Biotechnology 28, 187-193). Cette
technique consiste à tester des banques de plusieurs
milliers à plusieurs centaines de milliers de substrats
uniquement de type peptide avec une protéase connue. Ceci
est limité aux cas des protéases car les substrats
protéiques sont synthétisés par chimie combinatoire.
On peut citer aussi la détection de
microorganismes (brevet US 4,603,108 ; brevet EP 451 775 ;
J. Clin. Microbiol (1982), 16 (3), 417-21). Ces techniques
sont basées sur la détection d'enzymes pour identifier des
microorganismes dont on connaît déjà les caractéristiques.
La demande de brevet PCT publiée sous le No.
W001/60986 concerne des estérases possédant une activité
particulière. L'identification de ces estérases se fait par
comparaison à des profils d'estérase de référence
préalablement réalisés sur des substrats estérase. I1
s'agit de rechercher la meilleure enzyme pour un type de

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substrat donné. Ces substrats correspondent uniquement à
des fonctions ester.
La présente invention a pour but de palier les
inconvénients des techniques de l'art antérieur en offrant
un procédé permettant de générer l'empreinte catalytique
idiosyncrasique d'un échantillon, c'est à dire sa carte
d'identité spécifique.
L'invention a donc pour objet un procédé pour
générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un
échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes
suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible
de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de
substrats,
b) on capture les signaux générés après ladite
mise en contact.
Le procédé de l'invention est remarquable en ce
que cette empreinte peut être obtenue sans connaître les
activités catalytiques de l'échantillon.
A l'étape (a), les substrats peuvent être
ordonnés ou sous forme de mélange.
On entend par empreinte catalytique
idiosyncrasique selon l'invention l'image ou la carte
d'identité, individuelle des activités catalytiques. Cette
empreinte est spécifique d'un échantillon. Elle est
obtenue après la mise en contact dudit échantillon avec un
ensemble de substrats. L'empreinte catalytique
idiosyncrasique combine les mesures effectuées sur
différents substrats. L'empreinte catalytique
idiosyncrasique atteste de l'identité d'un échantillon
sous la forme d'une représentation d'un échantillon ayant
réagi avec un ensemble de substrats.

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On entend par idiosyncrasique la capacité
individuelle d'un échantillon à réagir avec un ensemble de
substrats.
On entend par activité catalytique toute
activité de l'échantillon susceptible de modifier un
substrat. Cette activité peut correspondre par exemple à
celle d'une ou plusieurs protéines, molécules d'ADN,
molécules d'ARN ou un mélange de celles-ci. Avantageusement
cette activité correspond à celle d'une enzyme ou d'un
mélange d'enzymes. Ces activités peuvent être aussi celles
de produits recombinants obtenus par génie génétique.
Ces activités peuvent correspondre par exemple
à des hydrolases, des oxydoréductases, des transférases,
des lyases, des isomérases, des ligases.
L'activité catalytique définie au sens de
l'invention peut correspondre à un mélange d'activités,
elle peut être connue ou inconnue.
L'échantillon peut provenir de différentes
origines. I1 peut être par exemple chimique, biologique,
microbiologique, animal, végétal, humain. I1 peut provenir
de tous types d'environnements et de prélèvements.
L'échantillon peut être simple ou complexe,
préparé à partir de techniques classiques d'extraction
puis éventuellement purifié ou utilisé tel quel.
Selon une première forme de mise en oeuvre, à
l'étape (a), la mise en contact est réalisée avec un
ensemble de substrats ordonnés. Ainsi, dans ce mode de
réalisation, la capture des signaux est faite de façon
ordonnée conformément à l'ordonnancement de l'ensemble des
substrats.
Selon une seconde forme de mise en oeuvre, à
l'étape (b), on capture les signaux de façon ordonnée.
Le procédé de l'invention comprend après la
capture des signaux une étape de traitement de ceux-ci
consistant à affecter à chaque signal une valeur numérique

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constituant une composante d'une représentation graphique,
par exemple une représentation en couleurs, de l'empreinte
idiosyncrasique.
Ce traitement peut être appliqué à chaque
signal ou à une combinaison de signaux issus d'un même
ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de
substrats. Il s'agit alors d'affecter à chaque signal une
valeur numérique, puis d'associer par groupe d'au moins
deux valeurs, les valeurs numériques issues d'un même
ensemble de substrats ou de plusieurs ensembles de
substrats, et d'affecter à chaque groupe une valeur
numérique constituant une composante d'une représentation
graphique par exemple une représentation en couleurs,
d'une empreinte idiosyncrasique.
Un tel traitement permet par exemple de
combiner plusieurs empreintes de façon à génèrer une
nouvelle empreinte, et d'obtenir une représentation
graphique, tout particulièrement en couleurs facilitant la
visualisation, et donc l'exploitation, des caractéristiques
cumulées d'un échantillon. Ainsi, le traitement des
empreintes peut inclure une représentation en couleur de la
nouvelle empreinte du type basé sur le système RVB (Rouge,
Vert, Bleu).
Les substrats après la mise en contact avec
l'échantillon susceptible de posséder l'activité
catalytique peuvent soit restés intactes ou être
transformés en un ou plusieurs produits. Les substrats
et/ou produits obtenus après la mise en contact avec
l'échantillon peuvent être ordonnés ou sous forme de
mélange.
Selon le premier mode de mise en a~uvre ci-
dessus, les substrats sont ordonnés sur un support, comme,
par exemple sur une plaque de micro-titration ou un
microsystème. Ce support, possédant l'ensemble des

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substrats, peut constituer un système mis en ouvre pour
générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique selon le
procédé de l'invention. Dans certains cas particuliers, on
peut avoir les substrats disposés sur plusieurs supports.
5 Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un
échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible
de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de
substrats ordonnés,
b) on capture les signaux générés après ladite
mise en contact.
Selon le second mode de mise en ouvre ci-
dessus, les substrats sont mélangés et la capture des
signaux est réalisée de façon ordonnée.
Les signaux peuvent être ordonnés en utilisant
une technique séparative telle que L'HPLC (Chromatographie
Liquide à Haute Pression), la CCM (Chromatographie sur
Couche Mince) ou la SM (Spectrométrie de Masse).
Ainsi, l'invention se rapporte à un procédé
pour générer l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un
échantillon, comprenant les étapes suivantes .
a) on met en contact l'échantillon susceptible
de posséder l'activité catalytique avec un ensemble de
substrats sous forme de mélange,
b) on capture de façon ordonnée les signaux
générés après ladite mise en contact. Dans ce mode de
réalisation, on capture de façon ordonnée les signaux
générés après ladite mise en contact en utilisant une
technique séparative telle que l'HPLC
Chaque substrat comporte au moins un groupe
fonctionnel sensible à la présence d'une activité

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catalytique d'un échantillon et permet la génération d'un
signal de manière directe ou indirecte.
Un substrat mis en a~uvre dans le procédé de
l'invention est toute molécule comportant au moins un
groupe fonctionnel sensible à la présence d'une activité
catalytique et permettant la génération d'un signal.
Les groupes fonctionnels correspondent à titre
d'exemples non limitatifs .
- groupe ester, adapté aux lipases, estérases,
peptidases ;
- groupe carbonate, adapté aux lipases,
estérases, peptidases ;
- groupe carbamate, adapté aux peptidases ;
groupe amide, adapté aux peptidases ;
- groupe lactam, adapté aux peptidases,
lactamases ;
- groupe époxyde, adapté aux hydrolases, en
particulier époxyde hydrolases ;
- groupe phosphate, adapté aux phosphatases,
phytases ;
- groupe glycoside, adapté aux glycosidases ;
- groupes éther, alcène, alcane, adaptés aux
monoxygenases, hydroxylases ;
- groupe alcool adapté aux alcools
déshydrogénases ;
- groupe aldol adapté aux aldolases.
Outre, les groupes fonctionnels ci-dessus
définissant des activités catalytiques, chaque substrat
peut comprendre un groupement chimique susceptible de lui
conférer une spécificité pour une activité définie par le
groupe fonctionnel. Dans un mode de réalisation préféré,
ces groupements chimiques sont constitués par des
variations de substitution. La nature des variations sera
préférentiellement d'ordre .

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stérique, comme, par exemple, différents
groupements alkyles ou aryles, ou
- stéréochimique, ou encore
- électronique, comme, par exemple, des groupes
électrodonneurs ou électroattracteurs.
Ainsi, des variations d'ordre stéréochimique
permettent d'utiliser séparément chaque énantiomère d'une
paire d'énantiomères, plus généralement chacun des
stéréoisomères d'un groupe de stéréoisomères.
Les substrats permettent en outre la génération
d'un signal de manière directe ou indirecte. On entend par
un signal direct tous signaux obtenus directement après
mise en contact du substrat avec l'échantillon.
On entend par signaux indirects tous signaux
obtenus après une ou plusieurs réactions notamment
chimiques après mise en contact du substrat avec
l'échantillon.
Les signaux émis sont fonction de la nature du
substrat et/ou du système de détection choisi ainsi que des
conditions de mesure. Ils peuvent être de différents types
notamment spectrophotométrique (absorbance ou fluorescence
de lumière à une longueur d'onde donnée), électriques ou
chimiques. On utilise préférentiellement des substrats de
type chromogénique ou fluorogénique. Mais on peut aussi
enregistrer le déroulement de la réaction sur un substrat
quelconque par des senseurs externes appropriés, tel qu'une
sonde thermométrique, un indicateur de pM, un senseur de
produit de type protéine (anticorps anti-produit) ou
chemosenseur synthétique, ou mesure couplée à des enzymes
secondaires. On peut citer comme exemple l'alcool
déshydrogénase pour détecter la formation d'éthanol par
formation de NAD+ ou par la détection directe du produit
après séparation analytique (CE (Electrophorèse
capillaire), HPLC, TLC).

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Les signaux sont mesurés par tous capteurs
appropriés capables de mesurer les signaux générés comme
par exemple un fluorimètre, un spectrophotomètre, un
ampèremètre, un pHmètre, un thermomètre ou une sonde
thermographique. L'empreinte catalytique idiosyncrasique
générée est recueillie par un analyseur adapté à la
reconnaissance des signaux.
Quel que soit le mode de mise en aeuvre de
l'invention, les signaux générés après la mise en contact
de l'étape (a), peuvent âtre capturés à l'étape (b) en
utilisant une technique séparative comme l'HPLC.
Avantageusement, les substrats sont tels que
les signaux générés sont du même type.
Ils peuvent être mesurés sur le même type de
capteur.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique
correspondant aux signaux générés peut être interprétée de
manière directe ou de manière indirecte après traitement
des valeurs brutes. Ce traitement sera envisagé en fonction
des signaux analysés.
Les substrats présentent avantageusement la
caractéristique de réagir sur un temps de réaction court,
par exemple inférieur à 2 heures, préférentiellement
inférieur à 20 minutes. Cette caractéristique a l'avantage
d'obtenir rapidement l'empreinte catalytique
idiosyncrasique d'un échantillon. Elle permet aussi une
étude de son évolution au cours du temps. Cela facilite
notamment les analyses en contrôle qualité.
Les substrats mis en oeuvre dans le procédé de
l'invention possèdent avantageusement chacun une réactivité
spécifique pour un type d'activité catalytique donné. Ils
sont peu ou pas sensibles à la dégradatïon ou aux activités
non-spécifiques. De plus, lorsque des substrats stables

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sont utilisés, ils peuvent être conservés pendant de
longues périodes.
Le procédé de l'invention permet de suivre un
échantillon dans le temps à travers son empreinte
catalytique idiosyncrasique en utilisant des substrats à
partir desquels plusieurs mesures pourront être effectuées.
La visualisation de l'effet d'activités
catalytiques sur un ensemble de substrats est
reproductible.
Les substrats décrits correspondent
avantageusement à ceux décrits dans la demande de brevet
internationale PCT/FR01/01686 et dans l'article de G. Klein
et JL. Reymond, Helvetica Chimica Acta , vol. 82 , 1999.
Ces substrats répondent aux formules (I) à (V) ci-dessous .
Y~ P1 P
X CiDi ~ ~~Di ~~C~ Di
p/ ~ C~ ~ Xw / ~ C~ v
R3 /Cy R3 / ~ R3
R1 R2 R1 R2 R1 R2
(I) (II) (III)
R1 Yi Pl
R3
Ci Di
R2 ¿a
Di / 1 R3
R1
(IV) (V)
dans lesquelles .
- la liaison C1-C2 est insensible à une coupure
par une réaction d'oxydation chimique.
- Di représente le précurseur d'un produit
détectable,
- X et Y, identiques ou différents, sont
choisis parmi un atome d'oxygène, un atome de soufre, une
amine de formule -NRllRlz. R11 est choisi parmi . un atome

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d'hydrogène, un groupe alkyle, un groupe aryle, substitués
ou non, et R1~ n'est pas un atome d'hydrogène.
- R1 à R3, identiques ou différents sont choisis
parmi un atome d'hydrogène, un groupe alkyle substitué ou
5 non ou un groupement chimique comme défini précédemment.
- P1 et PZ, identiques ou différents sont des
groupes fonctionnels comme définis précédemment, et au plus
un des groupes P1 et P2 est un atome d'hydrogène.
- P3 est choisi parmi un groupe carbonyle, un
10 groupe -P02R11 ou un groupe R11P0-, où R11 présente la mème
signification que précédemment, un groupe -SO2, un groupe
-CHOR13 où R13 représente un groupe aryle, alkyle ou
glycosyle, un groupe SiRl4Rls où R14 et R15, identiques ou
différents, représentent un groupe aryle, alkyle, aryloxy
ou alcoxy et un groupe AsO2H-.
- G est choisi parmi un atome d'oxygène, un
atome de souf re , un groupe amine de formule NR13 où R13 e s t
R11 ou R12, Rl~ et R~2 ayant la même signification que
précédemment.
Ces substrats sont détectés après leur
transformation chimique par un échantillon pour donner des
produits qui vont être oxydés de manière chimique pour
obtenir de manière directe ou indirecte un composé
détectable correspondant à un ou plusieurs composés
susceptibles de présenter seuls ou en combinaison une ou
plusieurs variations de leurs propriétés biophysiques,
biologiques ou chimiques avant et après l'étape d'oxydation
telles que notamment une variation de type spectral ou une
variation de solubilité. A titre d'exemple, la figure 2
représente un principe de détection de substrats
fluorescents.
Un second exemple de substrats utiles selon le
procédé de l' invention comprend des substrats (S) dont la
transformation en produit (P) peut être détectée en

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mesurant un changement de pM résultant de la différence de
pouvoir chélatant du substrat (S) et du produit (P) vis-à-
vis d'un ion métallique. De tels substrats sont décrits
dans la demande de brevet français No. 01/05574 et dans les
articles de Jean-Louis Reymond et al. (G. Klein, D.
Kaufmann, S. Schürch et JL. Reymond, Chem. Commun., 2001,
561-562 ; G. Klein et JL. Reymond, Angew. Chem., 2001, 113,
Nr.9). Ces substrats permettent la détection de la
transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en
mesurant le changement des propriétés spectrales d'un
détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique,
résultant d'échanges d'ions métalliques selon l'équilibre
suivant .
ML ~ (MP et/ou MS) + L
où .
S représente un substrat, qui peut être toute
molécule chimique, dont le pouvoir chélatant est différent
de celui du produit résultant de la transformation chimique
du substrat. I1 s'agit notamment de substrat spécifique
comme des protéines entières pour les protéases. Ce
substrat peut présenter des propriétés énantiosélectives.
Les substrats n'ont pas de contrainte structurale autre que
celle d'avoir une différence de pouvoir chélatant avec les
produits correspondants.
P représente le produit issu de la
transformation chimique de S et présentant un pouvoir
chélateur différent de S. Comme les substrats, les produits
n'ont pas de contrainte structurale autre que celle d'avoir
une différence de pouvoir chélatant avec les substrats
correspondants.
L représente un détecteur chimique, aussi
désigné « sensor pM >a, correspondant à tout ligand capable
de chélater les ions métalliques en solution tel que la
chélation du métal par le détecteur chimique donne un

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changement de pM mesurable par toute méthode appropriée
comme par exemple un changement de propriété spectrale du
détecteur. Le sensor pM possède un pouvoir chélatant tel
qu'il puisse y avoir des échanges d'ions métalliques entre
le produit (P) et le ligand (L) ou le substrat (S) et le
ligand (L) selon respectivement que le produit (P) ou le
substrat (S) possède le pouvoir chélatant le plus fort.
Comme indiqué précédemment, le pouvoir chélatant du
détecteur chimique (L) est avantageusement supérieur à
celui du substrat (S) ou du produit (P) de façon à réaliser
la méthode de l'invention avec des quantités faibles de
détecteurs chimiques. Le détecteur chimique (L) peut
correspondre à un dérivé de fluorescéine ou tout autre
noyau fluorescent substitué par un groupement chélatant.
ML représente le complexe métal-ligand
présentant des propriétés spectrales différentes de L.
MS représente le complexe métal-substrat.
MP représente le complexe métal-produit.
Lesdits complexes ML, MS et MP n'ont pas
forcément une stochiométrie de 1/1.
Ces substrats permettent la détection de la
transformation d'un substrat (S) en un produit (P) en
mesurant le changement des propriétés spectrales d'un
détecteur chimique (L), chélateur d'un ion métallique,
résultant d'échanges d'ions métalliques .
- entre le produit (P) et le détecteur chimique
(L) lorsque le produit (P) présente un pouvoir chélatant
supérieur à celui du substrat (S), ou
- entre le substrat (S) et le détecteur
chimique (L), lorsque le substrat (S) présente un pouvoir
chélatant supérieur à celui du produit (P).
Une combinaison de différents substrats pourra
être utilisée pour réaliser les empreintes catalytiques
idiosyncrasiques.

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L'invention a aussi pour objet un ensemble de
substrats permettant de générer l'empreinte catalytique
idiosyncrasique selon le procédé de l'invention.
Dans une mise en ouvre de l'invention, on
choisira des substrats possédant des groupes fonctionnels
différents ou des groupements chimiques différents ou une
combinaison de ces deux possibilités notamment des
substrats possédant des groupements fonctionnels identiques
et des groupement chimiques différents.
Dans une autre mise en ouvre, les substrats
seront identiques. La mise en contact des substrats avec
l'échantillon se fera alors dans des conditions
réactionnelles différentes. Les conditions réactionnelles
sont à titre d'exemple non limitatif au niveau du pH, de la
température, de la durée d'incubation, de la concentration
en substrat ou une quantité d'échantillon ou à un mélange
de celles-ci. Ces conditions peuvent également correspondre
à d'autres paramètres pouvant être pris à la fois de
manière individuelle ou en combinaison. Ces conditions
peuvent également correspondre à l'addition d'un ou
plusieurs réactifs supplémentaires.
Les substrats pourront également correspondre à
une combinaison de substrats différents et identiques.
Dans un mode particulier de réalisation de
l'invention, l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un
échantillon peut être réalisée en utilisant des substrats
capables de révéler différentes sous classes d'au moins une
classe d'activité catalytique.
A titre d'exemple, les substrats de type
epoxyde, ester, carbonate, amide, cyano, lactame,

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carbamate, glycoside, halogénure d'alkyle, phosphate mono-
et diester, ether d'énol et ether d'alkyle peuvent
permettre de révéler l'empreinte catalytique
idiosyncrasique hydrolasique d'un êchantillon. De même, les
substrats de type éthanol, méthanol, isopropanol, butanol,
glycérol, éthylène glycol, acide lactique, acide malique,
acide citrique, acide formique, acide acétique, acide
propionique, acide benzoique, benzaldéhyde, acétaldéhyde,
propionaldéhyde peuvent permettre de révéler une empreinte
catalytique idiosyncrasique deshydrogénasïque d'un
échantillon.
Le nombre de substrats est avantageusement d'au
plus 1000. Il est généralement de l'ordre de 1 à 200.
Les substrats mis en ouvre dans le procédé de
l'invention peuvent être ordonnés sur un même support,
comme, par exemple sur une plaque de micro-titration ou un
microsystème. Ce support possédant des substrats peut
constituer un système mis en ouvre pour générer l'empreinte
catalytique idiosyncrasique selon le procédé de
l'invention. La capture des signaux sera réalisée de façon
ordonnée grâce à l'agencement ordonné des substrats sur le
support.
Les substrats peuvent aussi être mélangés et
dans ce cas la capture des signaux sera réalisée de façon
ordonnée par exemple grâce à un étalonnage préalable.
Dans une forme de mise en ouvre, les signaux
peuvent être capturés de façon ordonnée en utilisant une
technique séparative telle que l'HPLC.
La réaction des substrats avec l'échantillon
peut être suivie en temps réel ou en point final.
Les empreintes catalytiques idiosyncrasiques
obtenues peuvent être stockées de manière à créer des bases
de données d'empreintes d'échantillons.

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L'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un
échantillon peut correspondre à la combinaison de plusieurs
empreintes obtenues selon différentes formes de mise en
oeuvre ou au cours du temps.
5 Le procédé de l'invention peut également
comprendre après le recueil d'empreintes catalytiques
idiosyncrasiques des signaux générés par un échantillon,
une analyse de l'empreinte catalytique idiosyncrasique.
Cette analyse permet de caractériser ou d'effectuer un
10 suivi de l'évolution de l'échantillon. I1 n'est pas
nécessaire de connaître exactement toutes les activités
pour effectuer cette analyse.
Le signal est fonction de la modification
réalisée sur l'activité. Ainsi dans un échantillon, des
15 activités catalytiques appartenant à une même classe vont
pouvoir réagir sur les mêmes substrats avec une vitesse de
réaction différente. Le signal généré sera différent.
L'empreinte d'un échantillon est susceptible
d'évoluer par exemple parce que l'échantillon a été mis en
présence de contaminants ou parce que l'échantillon se
dégrade ou s'altère au cours du temps. Pour le suivi
d'évolution d'échantillon comme par exemple le contrôle
qualité, on peut considérer le résultat obtenu en le
comparant avec une empreinte faisant partie d'une base de
données ou avec une empreinte effectuée avant ou après
l'échantillon analysé.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique obtenue
peut être superposée à une autre empreinte obtenue à titre
d'exemple .
- avec le méme ensemble de substrats en
présence d'un mélange d'échantillons ou d'un échantillon de
référence.
- avec le. même échantillon mais avec un
ensemble de substrats différents.

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avec le même ensemble de substrats révélés
avec le même échantillon à un temps différent.
- avec le même ensemble de substrats révélés
avec le même échantillon prélevé à un temps différent.
- avec le même ensemble de substrats révélés
dans des conditions réactionnelles différentes.
Cette comparaison d'empreintes catalytiques
idiosyncrasiques peut être effectuée par toutes techniques,
notamment .
par comparaison visuelle des empreintes
catalytiques de modification ou signaux générés obtenus
- par analyse graphique informatique.
La modification d'une empreinte catalytique
idiosyncrasique d'un échantillon est l'indicateur d'une
variation ou d'une apparition ou d'une disparition d'une ou
plusieurs activités catalytiques.
L'utilisation du procédé de l'invention et de
la superposition d'empreintes est tout à fait appropriée
pour le suivi de procédés ou de produits mettant en oeuvre
des activités catalytiques pour faire notamment du contrôle
qualité.
Le procédé de l'invention est aussi remarquable
en ce qu'il peut être automatisé. En effet, une telle
automatisation consiste en le traitement éventuellement
informatique des résultats de transformation des substrats
pour obtenir l'empreinte numérique catalytique
idiosyncrasique caractéristique des signaux et
l'interprétation de ladite empreinte idiosyncrasique pour
caractériser l'échantillon.
A titre d'exemple d'un tel traitement
informatique, on peut citer tout particulièrement celui se
rapportant à la combinaison de plusieurs empreintes dont le

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traitement génère une nouvelle empreinte graphique en
couleurs permettant de visualiser des caractéristiques
cumulêes d'un échantillon. Cette méthode de visualisation
des résultats permettant de cumuler au moins 2 mesures (2
signaux) pour créer une nouvelle donnée représentée sous
forme d'une valeur spécifique. Cette valeur donne
l'information sur une caractéristique de l'échantillon
d'intérêt. Dans l'exemple 4 ci-après, la valeur obtenue est
traduite en une couleur spécifique.
Le traitement des empreintes peut inclure une
représentation en couleur de la nouvelle empreinte du type
basé sur le système RVB (Rouge, Vert, Bleu).
L'invention a aussi pour objet un système pour
la mise en oeuvre d'un procédé décrit précédemment,
comprenant un mélange de substrats et un ou plusieurs
accessoires suivants .
- un dispositif pour commander la mise en
contact de l'échantillon avec au moins un substrat,
- des capteurs pour séparer et mesurer les
signaux générés à partir de la transformation des substrats
par l'échantillon,
- un premier analyseur permettant de générer
l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon,
- une mémoire permettant de stocker dans une
base de données les empreintes catalytiques
idiosyncrasiques originales,
- un second analyseur permettant la
superposition entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique
nouvellement obtenue et l'ensemble des empreintes stockées
dans la mémoire.

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L'invention a encore pour objet un système
comprenant un support sur lequel sont ordonnés plusieurs
substrats tels que définis précédemment, identiques ou
différents permettant de mettre en oeuvre le procédé de
l'invention. Ce système peut comprendre, outre l'ensemble
de substrats, un ou plusieurs accessoires suivants .
- Un dispositif servant à commander la mise en
contact de l'échantillon avec au moins un substrat,
- Des capteurs pour mesurer les signaux générés
à partir de la transformation des substrats par
l'échantillon. Ces capteurs peuvent correspondre à titre
d'exemple non limitatif à un fluorimètre, un
spectrophotomètre, un ampèremètre, un pHmètre.
- Un analyseur permettant de générer
l'empreinte catalytique idiosyncrasique d'un échantillon.
L'empreinte sera par exemple stockée sous la forme d'une
série de bits en échelle de gris ou en utilisant le système
RVB.
Une mémoire permettant de stocker dans une
base de données les empreintes catalytiques
idiosyncrasiques originales.
- Un analyseur permettant la superposition
entre l'empreinte catalytique idiosyncrasique nouvellement
obtenue et l'ensemble des empreintes stockées dans la
mémoire. Cet analyseur sera capable d'effectuer des tests
statistiques connus de l'homme de métier permettant
d'effectuer des analyses de différences et de similitudes
entre l'empreinte nouvellement obtenue et l'ensemble des
empreintes stockées dans la mémoire.
Ces tests statistiques peuvent impliquer par
exemple des tests de discordance ou de corrélation.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.

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L'invention concerne alors également l'utilisation d'un
système tel que défini précédemment pour faire le suivi de
l'évolution d'un échantillon caractérisé en ce que .
- on met en contact au moins un échantillon
avec un ensemble de substrats ordonnés sur ledit système,
comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon,
- on capture les signaux générés résultant de
ladite mise en contact des substrats avec l'activité
catalytique d'un échantillon.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
Le système de l'invention peut être utilisé
pour faire le suivi de l'évolution d'un échantillon.
L'invention concerne alors également l'utilisation d'un
système tel que défini précédemment pour faire le suivi de
l'évolution d'un échantillon caractérïsé en ce que .
- on met en contact au moins un échantillon
avec un ensemble de substrats sous forme de mélange,
comportant chacun au moins un groupe fonctionnel sensible à
la présence d'activité catalytique de l'échantillon,
- on capture de façon ordonnée, les signaux
générés résultant de ladite mise en contact des substrats
avec l'activité catalytique d'un échantillon, en utilisant
une technique séparative telle que l'HPLC.
- On compare l'empreinte pour un échantillon à
une autre empreinte établie.
D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent. Ces
exemples montrent que le procédé de l'invention permet
d'obtenir les empreintes idiosyncrasiques d'un échantillon.
Le mode de réalisation de ces exemples pourra
âtre facilement appliqué à tout type d'échantillon.

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Dans ces exemples, il sera fait références aux
dessins en annexe dans lesquels .
- La figure 1 représente des exemples de
formules de substrats fluorogéniques (figure 1a) et
5 chromogéniques (figure 1b) utiles selon l'invention.
- La figure 2 représente un principe de
détection des substrats fluorescents.
- La figure 3 représente la cinétique du signal
d'absorbante (O D, à ~, - 405 nm) pour l'empreinte
10 catalytique idiosyncrasique des signaux générés par un
échantillon avec la grille de substrats chromogènes.
- La figure 4a représente les empreintes
catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats
fluorescents. La distribution des substrats a été donnée
15 dans la figure 1a. Les différents échantillons testés par
empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-dessous.
- La figure 4b représente les empreintes
catalytiques idiosyncrasiques obtenues avec des substrats
chromogéniques. La distribution des substrats a été donnée
20 dans la figure 1b. Les différents échantillons testés par
empreinte sont indiqués dans le tableau 1 ci-après.
m..l.'1 ....,..
1 A = Aspergillus niger lipase (ANL), B - Aspergillus
niger lipase (ANL) lU/mg, C - Aspergillus oryzae
lipase (AOL), D = Candida antarctica lipase (CAL),
E =
Candi da cylindracea lipase (CCL) , F - Candida
lipolytica lipase (CLL), G - hog pancreatic lipase
(HPL), H = Mucor javanicus lipase (MJL)
2 A - Mucor miehei lipase (MML) , B - Penicillium
roqueforts lipase (PRL), C - Pseudomonas cepacia
lipase (PCL) 40U/mg, D - Pseudomonas cepacia lipase
(PCL) 50U/mg, E - Pseudomonas fluorescens lipase
(PFL) , F - Rhizomucor miehei lipase (RML) , G
Rhizopus arrhizus lipase (RAL), H - Rhizopus niveus
lipase (RNL)
3 A = wheat germ lipase (WGL), B = Bacillus sp. esterase
(BSE), C - Bacillus stearothermophilus esterase
(BStE), D - Bacillus thermoglucosidasius esterase

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(BTE), E = Candida lipolytica esterase (CLE), F = hog
liver esterase (HLE) 100~,g/ml, G = hog liver esterase
(HLE) 10~.g/ml, H = horse liver esterase (HrLE)
4 A - Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH)
100~.1,g/ml, B - Chromobacterium viscosum lipoprotein
lipase (CVL), C = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase
(PSL) 1500U/mg, D = Pseudomonas sp. lipoprotein lipase
(PSL) 50000U/mg, E - Pseudomonas sp. Type B
lipoprotein lipase (PSBL), F = Mucor miehei esterase
(MME), G = Saccharomyces cerevisiae esterase (SCE),
H
Thermoanaerobium brockii esterase (TBE)
A = Aspergillus niger epoxide hydrolase (AEH) 10~.g/ml,
B - Aspergillus melleus acylase I (AMA), C
Eseherichia soli penicillin G acylase (PGA), D
Bacillus thermoproteolyticus thermolysin (The), E
porcine stomach mucosa pepsin (Pep), F - Clostrdium
histolytcum clostripain (Clos), G - Papaya latex
papain (Pap) , H - Electrophorus electricus
acetylcholine esterase (AChE)
6 A = Rhodotorula glutinis epoxide hydrolase (REH), B
hog kidney acylase I (HKA), C = Bacilles licheniformis
subtilisin (Sub), D - hog pancreas trypsin (Try), E
=
porcine pancreatic elastase (Ela), F - bovine
pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 37U/mg, G - bovine
pancreatic a-chymotrypsin (Chy) 70U/mg, H = blank
- La figure 5 représente la liste des substrats
testés.
La figure ~ représente les étapes du
5 traitement des valeurs pour former une empreinte en couleur
d'une activité catalytique. Figure 6A . traitement des
données pour l'obtention des valeurs relatives. Figure 6B .
sauvegarde des valeurs dans un fichier csv. Figure 6C .
création du fichier ppm. Figure 6D . Image d'une empreinte
(fichier bmp) .
- La figure 7 représente l'exemple du système
RVB de codage des couleurs (disponible dans chaque logiciel
du Pack Office de Microsoft).
- La figure 8 représente la clé des couleurs
obtenues conformément à l'exemple 3, et indique la
proportionnalité de la teinte avec la sélectivité et de
l'intensité avec la vitesse de réaction.

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- La fïgure 9 représente les empreintes
obtenues à l'exemple 5 par combinaison des résultats cités
dans l'exemple 1.
La figure 10 représente différents substrats
f luorogéniques et chromogéniques.
- La figure 11 représente les empreintes
idiosyncrasiques obtenues à l'exemple 6, ainsi que les
pourcentages de conversion maximale.
- La figure 12 représente une série de
substrats chromophores mis en oeuvre à l'exemple 7 dans les
conditions expérimentales de capture des signaux identiques
â celles décrites dans l'exemple 1.
- La figure 13 représente les empreintes
ïdiosyncrasiques de l'activité catalytique en fonction de
la dilution du catalyseur obtenues à l'exemple 7.
- La figure 14 représente le code de couleur
établi selon l'exemple 4, pour chaque substrat de l'exemple
7.
- La figure 15 représente la visualisation de
l'activité catalytique de l'échantillon de l'exemple 7 en
fonction de sa dilution, en tenant compte uniquement de la
vitesse maximale obtenue sur l'ensemble des mesures
effectuées avec cet échantillon.
- La figure 16 représente le même traitement
qu'à la figure 15 de l'exemple 7 mais en tronquant les
résultats obtenus pour les meilleurs substrats en écrasant
les valeurs supérieures à 25000 pM/s, qui sont ramenées à
la couleur noire.
- La figure 17 représente une série de 1,2-
diols de structures diverses et analysables par HPLC.
- La figure 18 représente un exemple de la
trace HPLC d'une série de 1,2-diols de structure diverse.
- La figure 19 représente une série d~acétates
pseudo-énantiomériques qui peuvent être mélangés par paires

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de façon à réaliser une empreinte simple d'activité
estérasique sur des acétates.
- La figure 20 représente une série de 10
substrats esters/carbonates qui peuvent être utilisés en
mélange équimolaire pour mesurer l'empreinte estérasique
d'un échantillon.
- La figure 21 représente une série de produits
présentant une variété de groupes fonctionnels pour une
analyse par HPLC d'un mélange de ceux-ci.
- La figure 22 représente la structure des
quatre substrats esters utilisés pour générer l'empreinte
d'activité catalytique idiosyncrasique d'enzymes de type
lipase/esterase.
- La figure 23 représente les traces HPLC (UV
295 nm) donnant l'empreinte idiosyncrasique de l'estérase
de Mucor Miehei (gauche) et de la lipase de Pseudomonas
Fluorescens (droite).
- La figure 24 représente les empreintes
idiosyncrasiques de l'estérase de Mucor Miehei (1) et de la
lipase de Pseudomonas Fluoreseens (2). Chaque carré de la
grille correspond à la surface du pic de l'un des quatre
produits obtenus après activité enzymatique.
Exemple 1 Empreintes catalytiques
idios ncrasiques d'échantillons.
1) Les différents substrats fluorescents et
chromogéniques sont disposés dans les puits de plaques de
microtitration respectivement selon la disposition de la
figure 1a et 1b, sous forme de 5 microlitres d'une solution
stock à 2 mM dans un mélange DMF/eau 50/50. La grille
comprend des solutions des produits de référence qui
serviront de contrôle positif dans la mesure.
2) On ajoute ensuite dans chaque puits une
solution d'un échantillon prédiluée dans un tampon
contenant l'agent révélateur (NaI04 1 mM, BSA 2mg/mL), et

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on suit la réaction en fonction du temps pendant 2 heures.
La liste des échantillons testés est représentée dans le
tableau 1. Seules les données des 30 premières minutes sont
nécessaires pour le calcul ultérieur des signaux générés
pour réaliser les empreintes catalytiques idiosyncrasiques
correspondantes.
3) Les empreintes sont obtenues de la manière
suivante .
a) Conversion des données de fluorescence ou
d'absorbante à 405 nm en concentration d'umbelliférone ou
nitrophénol selon des courbes de calibrage. Une empreinte
de réaction typique est exemplifiée à la figure 3.
Conditions . 0.1 mg/mL d'échantillon enzymatique, 100 ~..t,M
substrat, 20 mM aq. borate pH 8.8, 2.5% v/v DMF, 26°C, 2
mg.mL-1 BSA, 1 mM NaI04. Les vitesses déterminées à partir
de ces courbes sont les suivantes . 17 209' 300 pM. s-1, 16
130' 800 pM. s-l, (S) -12a 31' 800 pM. s-1, (S) -12b 25' 500 pM. s-l,
(R) -12a 25' 000 pM. s-1, (R) -12b 22' 000 pM. s-1, 15 4' 000 pM. s-
l, (R) -10 2' 600 pM. s-1, (S) -10 2' 300 pM. s-l, 14 1' 600 pM. s-1,
(S) -13 l' 400 pM. s-1, (R) -13 1' 300 pM. s-l .
b) Détermination des vitesses maximum
apparentes à partir de la pente maximum apparente dans
l'empreinte de vitesse, qui se situe toujours avant 30
minutes de réaction (figure 3).
c) Soustraction des vitesses enregistrées pour
la mesure de référence sans échantillon dans les mêmes
conditions.
d) Division de toutes les vitesses par la
vitesse maximum observée dans la grille pour un échantillon
donné.
e) Coloration de la case correspondant au
substrat en échelle de gris en proportion de la vitesse
relative. 0 = blanc. Maximum = noir.
La représentation de l'empreinte analysée, qui
est nécessaire pour l'analyse visuelle, peut

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avantageusement prendre la forme d'une grille carrée ou
rectangulaire où chaque carré de la grille est teinté en
échelle de gris en proportion de la valeur attribuée à un
substrat donné de la série, variant de blanc (pas
5 d'activité) à noir (activité maximum).
L'empreinte catalytique idiosyncrasique des
signaux générés est ensuite affichée ainsi que la valeur de
la vitesse maximum apparente en pM/s.
Nous avons vérifié que ces mesures sont
10 reproductibles, à savoir que le même échantillon donne la
même empreinte catalytique idiosyncrasique lorsque la
mesure est répétée dans les mêmes conditions. 0.1 mg/mL
d'échantillon, 2 mg/mL BSA (albumine de sérum bovin), 20 mM
tampon borate pH 8.8, 0.1 mM de chaque substrat, 1 mM NaI~4
15 incubation 26 °C.
Pour les figures 4a et 4b, 47 échantillons
donnés dans le tableau 1 ci-dessus ont été testés.
Les empreintes idiosyncrasiques correspondantes
ont été obtenues (figures 4a et 4b) . Elles illustrent la
20 capacité individuelle de chaque échantillon à réagir avec
un ensemble de substrats.
Exemple 2 Combinaison de substrats pouvant
être utilisée our générer l'em ceinte catal tiaue
25 idiosyncrasique d'un échantillon.
Les 148 substrats et 4 substrats témoins, dont
les formules sont données dans la figures 5, ont été
utilisés.
Tous les substrats sont testés à la
concentration de 0,1 mM, à pH 7,4, dans deux types de
conditions .
1) en temps direct . échantillon (0.1 mg/mL),
BSA (2 mg/mL), un tampon inorganique (phosphate,
borate,ammonium carbonate) aqueux (10-100 mM) avec 7 < pH <
11. Température entre 15 et 45 °C .

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2) en point final . a) incubation de
l'échantillon (0.1 mg/mL) à un pH/température donné en
tampon inorganique ; b) ajout de tampon stabilisateur pour
obtenir un pH final entre 7 et 9, BSA (2 mg/mL), puis
enregistrement du signal soit directement, soit après 20
minutes.
Substrats A-F et contrôles K: ajout de NaI04 (1
mM ) .
Substrats G: ajout de NAD+ (1 mM) et NADP+ (1
mM).
Les signaux générés après la mise en contact de
cet ensemble de substrats avec un échantillon seront
fluorescents.
Ces différents substrats permettent de révéler
les classes d'enzymes suïvantes .
Lipases, estérases, protéases et amidases: A1-
A22, B1-B22, C1-C22, Dl-D22, E1-E4
- Phosphatases: A23 - D23
- Sulfatases: A24-D24
- Uréases: A25-D25
- Argininases: A26-D26
- Déhalogénases: A27-D27
- Aldolases: A28-D28 sans NaI04
- Bayer-villigerases: A28-D28 avec lipase et
NaI04
- Ether-hydrolases: A29-D29, A30-D30
- Epoxyde hydrolases: F1-F4
- Alcool déshydrogénases: G1-G4 sans NaI04 avec
NAD+/NADP+
- hydroxylases: H1-H8 sans NaI04
- Glycosidases: J1-J8 sans NaI04
Dans une autre forme de mise en oeuvre, on
réalisera la même grille de substrats avec le para-
nitrophenol remplaçant la coumarine(Coum) comme groupe

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partant . Les signaux mesurés après la mise en contact des
substrats avec l'échantillon seront chromogéniques.
Exemple 3 Empreinte idiosyncrasique en
utilisant des substrats nécessitant la présence d'un
senseur.
L'empreinte idiosyncrasique d'un échantillon
peut être réalisé par une grille de substrats non-
chromogéniques ou non-fluorogéniques si la réaction peut
être suivie de manière indirecte, par exemple à l'aide d'un
senseur, tel qu'une sonde thermographique, ou un senseur pH
ou pM. A titre d'exemple, on utilisera une grille composée
d'esters pour obtenir l'empreinte d'échantillons de lipases
et estérases en utilisant un indicateur pH pour la mesure.
Une série de dérivés d'acides aminés tels que les N-acyl
acides aminés (20 N-acétyl acide aminés L naturels + 20 N
acétyl acide aminés D correspondants) servira
avantageusement pour obtenir l'idiosyncrasique
d'échantillon contenant des acylases en suivant la réaction
à l'aide d'un senseur pM.
Exemple 4 Génération d'une empreinte à partir
de plusieurs empreintes et sa représentation graphique en
couleur.
Les exemples 5, 6 et 7 se rapportent à la
combinaison de plusieurs empreintes dont le traitement
génère une nouvelle empreinte graphique en couleurs
permettant de visualiser des caractéristiques cumulées d'un
échantillon. Cette méthode de visualisation des résultats
permettant de cumuler au moins 2 mesures (2 signaux) pour
créer une nouvelle donnée représentée sous forme d'une
valeur spécifique. Cette valeur donne l'information sur une
caractéristique de l'échantillon d'intérêt. Dans les
exemples décrits, la valeur obtenue est traduite en une
couleur spécifique.

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Ainsi, il est possible d'apprécier la
sélectivité d'un échantillon incluant sa stéréosélectivité,
son énantiosélectivité, son activité en fonction du pH, son
activité en fonction de la concentration de l'échantillon
etc.... Le traitement des empreintes inclut une
représentation en couleur de la nouvelle empreinte, qui,
dans les exemples ci-après utilise le système RVB (Rouge,
Vert, Bleu). Ainsi, dans l'exemple 5, pour
l'énantiosélectivité d'un échantillon, on cumule les
résultats obtenus de cet échantillon sur sa réaction avec
les deux énantiomères (R) et (S) séparément. Dans l'exemple
5, on attribue la couleur verte à la sélectivité de
l'échantillon pour l'énantiomère S et la couleur rouge pour
l'énantiomère R.
Dans ces exemples, on associe à un triplet de
valeurs une caractéristique représentée sous forme de
couleur. Cependant, on peut imaginer un autre arrangement
de valeurs auquel on associerait une caractéristique.
De manière générale, les empreintes sont
obtenues à partir des valeurs de vitesse brutes diminuées
du bruit de fond correspondant, et réduites à des valeurs
entières comprises entre 0 (pas d'activité catalytique) et
255 (qui correspond à la valeur de vitesse maxïmale dans
chaque empreinte, étape A représentée à la figure 6A). Ces
entiers sont alors inversés entre 255 (luminosité maximale
dans l'échelle des 256 couleurs) et 0 (luminosité
minimale), distribués dans les positions voulues et
convertis en un fichier csv (coma separated values) dans
Microsoft Excel (étape B représentée à la figure 6B) . Le
fichier csv est transformé en un fichier ppm (portable
pixel map) grâce au logiciel Bloc-Notes de Windows (étape C
représentée à la figure 6C) où chaque triplet de valeurs
est converti en un carré de 1 pixel avec la couleur
correspondante, et l'image obtenue ainsi est sauvée en tant
que fichier bitmap en utilisant l'éditeur d'images JASC

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Paint Shop Pro (étape D représentée à la figure 6D).
L'empreinte, étant composée de carrés de 1 pixel seulement,
est donc non seulement de haute qualité, mais aussi très
facile à exploitée dans un traitement informatique. Un
exemple de traduction d'un triplet de valeurs en une
couleur est présenté dans la figure 7, dans le cas du carré
en bas à gauche de l'empreinte.
La mise en a~uvre de ce traitement dans le cas
de mesures catalytiques comprend .
1) Pour une caractéristique . la valeur est
rapportée entre 0 et 255 par rapport à la valeur maximale
obtenue, et répétée pour chaque paramètre du système RVB
(exemple 1).
2) Pour deux caractéristiques . chaque valeur
peut être rapportée entre 0 et 255 par rapport au maximum
de toutes les valeurs, ou chaque valeur d'une
caractéristique normée par rapport à la valeur maximale de
cette caractéristique ; les valeurs obtenues peuvent alors
être distribuées dans l'un ou l'autre des paramètres du
système RVB, le troisième paramètre étant obtenu par
combinaison des deux autres (moyenne mathématique, maximum,
minimum, etc...) (voir exemple 4 ) .
3) Pour trois caractéristiques . chaque valeur
correspondant à une caractéristique est affectée à un
paramètre du système RVB. Le choix de la correspondance
n'aura un effet que sur les couleurs obtenues dans
l'empreinte finale (composante majeure dans le rouge, le
vert ou le bleu par exemple) (exemple 6).
4) Pour plus de trois caractéristiques, les
valeurs obtenues devront être combinées mathématiquement
afin de les réduire à au plus trois caractéristiques
différentes dans le cas d'une représentation utilisant le
système RVB.
5) Le traitement informatique des données
brutes expérimentales permettant l'obtention de nombres

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entiers entre 0 et 255 peut se faire selon n'importe quelle
formule mathématique. Le traitement le plus simple reste
cependant la normation des valeurs brutes entre 0 et 1,
l'extrapolation à un intervalle 0-255, puis l'arrondi des
5 valeurs en nombres entiers.
La normation entre 0 et 1 peut se faire en
rapportant les valeurs brutes à un même nombre de référence
(à leur valeur maximale par exemple), de manière générale
sur les trois paramètres du système RVB. Elle peut aussi se
10 faire en modifiant le traitement mathématique selon le
paramètre rouge, vert ou bleu, soit en changeant de nombre
de référence, soit en distinguant les valeurs décimales des
données brutes (les valeurs entre 0 et 10 pour le rouge,
entre 10 et 100 pour le vert et entre 100 et 1000 pour le
15 bleu, par exemple), soit en distinguant les ordres de
grandeur par une fonction logarithmique par exemple.
Exemple 5: Empreintes d'activités catalytiques
idiosyncrasiques énantio- et stéréosélectives.
20 Les propriétés de stéréo- et
d'énantiosélectivité des enzymes étant importantes dans les
applications synthétiques, les signaux enregistrés dans
l'exemple 1 sont combinés pour former une échelle de
coloration du vert au rouge représentant la sélectivité de
25 l'échantillon.
Dans cette représentation, les paires
énantiomériques et stéréoisomériques de substrats sont
combinées en une seule position. Ces empreintes de
sélectivité sont générées par combinaison des vitesses
30 obtenues pour les substrats chromogéniques et
fluorogéniques . dans le cas d'une paire énantiomérique, la
vitesse obtenue pour l'énantiomère R est définie comme la
valeur correspondant à la composante rouge du système RVB
(Rouge, Vert, Bleu) pour la définition informatique des
couleurs, tandis que la vitesse obtenue pour l'énantiomère

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S correspond à la composante verte. La composante bleue du
système RVB est alors simplement définie comme la moyenne
mathématique des deux autres composantes.
Les substrats racémiques et achiraux sont aussi
représentés, mais en échelle de gris comme décrit dans
l'exemple 1, afin d'obtenir une grille de substrats
rassemblant tous les substrats décrits dans l'exemple 1.
Les substrats sont disposés sous la forme du
tableau 2 ci-dessous de 5 lignes et 6 colonnes, où la
numérotation se réfère aux figures 1a et 1b.
m-1-1 ..__ n
A B C D E F
1 A1 B1 B'3 C1 D1 B'4
2 A2/A3 A'1/A'2 E2/E3 C2/C3 E1/F1 G2
3 B2/B3 B'1/B'2 F2/F3 D2/D3 G1 C'1/C'2
A4/A5 A'3/A'4 G4/G5 B4/B5 H1/H2 G3
5 C4/C5 D4/D5 E4 E5/F4 H3/H4 Ref
La clé des couleurs, représentée figure 8,
indique la proportionnalité de la teinte avec la
sélectivité, et de l'intensité avec la vitesse de réaction.
L'empreinte catalytique idiosyncrasique de
sélectivité des signaux générés est ensuite affichée ainsi
que la valeur de la vitesse maximum apparente en pM/s.
Les empreintes obtenues par combinaison des
résultats cités dans l'exemple 1 sont représentées figure
9. Les codes des différents échantillons testés par
empreinte sont décrits dans le tableau 1.
Ces différentes empreintes permettent de mettre
en évidence, par une simple analyse visuelle, les
propriétés de stéréo- et/ou d'énantiosélectivité des
différents échantillons. Par exemple, les échantillons
notés PFL et WGL, qui présentent des empreintes d'activité
similaires, montrent des empreintes de sélectivité
opposées. La sélectivité d'un échantillon peut varier aussi

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d'un substrat à un autre, comme dans le cas de
l'échantillon PRL où les résultats sont opposés pour les
substrats situés en positions C2 et C3 du tableau 2.
Exemple 6: Empreintes d'activités catalytiques
idiosyncrasiques à différents pH.
Des empreintes d'activités catalytiques
idiosyncrasiques traduisant différentes conditions
expérimentales de capture des signaux peuvent être générées
par exemple en combinant les mesures effectuées à
différentes valeurs de pH sur une même grille de substrats
phosphatases.
1) Les différents substrats fluorogéniques,
représentés sur la figure 10, sont testés séparément dans
des puits de plaques de microtitration, en présence de 4
phosphatases différentes décrites dans le tableau 3, aux pH
2.5, 4.5, 5.5 et 6.5, dans les conditions décrites dans
l'exemple 1.
2) Le pH de la solution de mesure est ensuite
ajusté à 9, l'agent révélateur est ajouté (NaI04 1 mM, BSA
2 mg/ml), et les résultats enregistrés après 1 heure.
3) Les valeurs de fluorescence ou d'absorbance
sont ensuite converties en concentrations de produit formé
(umbelliférone ou 4-nitrophénol), et ces valeurs de
conversion sont rapportées à des niveaux de gris allant du
blanc (pas de conversion) au noir (conversion maximale pour
un échantillon sur l'ensemble des mesures effectuées).
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues, ainsi
que les pourcentages de conversion maximale, sont
représentées sur la figure 11. Dans ce cas, l'activité de
l'échantillon, qui dépend du pH, donne des résultats
différents selon le substrat et le pH. La combinaison de
toutes les données permet alors d'obtenir une empreinte
spécifique de l'échantillon selon son activité à
différentes valeurs de pH.

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m..'L.'1 ..-, ....
CIAP Phosphatase alcaline de muqueuse 1.4 U/mg
intestinale de veau
A. f. Phytase d'Aspergillus ficuum 3.5 U/mg
Novo Phytase Novo -
Natuphos Phytase Natuphos -
Exemple 7: Empreintes d'activités catalvtiaues
idiosyncrasiques à différentes concentrations
d'échantillon.
Des empreintes d'activités catalytiques
idiosyncrasiques combinant les activités de l'échantillon à
différentes concentrations peuvent de même être générées en
combinant par exemple les mesures d'activités lipasiques de
plusieurs échantillons sur une même grille de substrats,
pour 3 concentrations différentes de l'échantillon.
Les conditions expérimentales de capture des
signaux sont les mêmes que celles décrites dans l'exemple
1, pour une série de substrats chromophores (figure 12).
Simplement la concentration de l'échantillon ajouté à la
solution est modifiée, de telle sorte que dans l'exemple
présent, la concentration finale de l'échantillon est de
100, 10 ou 1 microg/ml.
Les substrats sont disposés dans les puits de
plaques de microtitration, selon l'agencement illustré
figure 12. Les vitesses de réaction obtenues dans chaque
cas sont enregistrées, puis distribuées selon l'ordre
suivant .
1) les vitesses obtenues pour une concentration
de 100 microg/ml sont définies comme la composante rouge du
système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon
sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale
de rouge,
2) les vitesses obtenues pour une concentration
de 10 microg/ml sont définies comme la composante verte du

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système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon
sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale
de vert,
3) les vitesses obtenues pour une concentration
de 1 microg/ml sont définies comme la composante bleue du
système RVB, la vitesse maximale obtenue pour l'échantillon
sur la grille entière correspondant à l'intensité maximale
de bleu.
Les empreintes idiosyncrasiques obtenues sont
représentées sur la figure 13. Sous chaque empreinte sont
aussi reportées les valeurs des vitesses maximales obtenues
sur la grille de substrats, à chaque concentration, et dans
l'ordre suivant . 100, 10 et 1 microg/ml.
Les résultats obtenus selon ce traitement
permettent de mettre en évidence l'activité de chaque
échantillon selon sa concentration, par rapport à une même
grille de substrats.
De manière visuelle, ces empreintes montrent la
tendance de l'activité catalytique en fonction de la
dilution du catalyseur, selon le code de couleur représenté
sur la figure 14 établi selon l'exemple 4, pour chaque
substrat. Par ailleurs ces mêmes empreintes donnent une
idée de l'ordre de grandeur de l'activité catalytique selon
l'intensité de la couleur obtenue.
Une autre solution consiste à vouloir obtenir
une visualisation de l'activité catalytique de
l'échantillon en fonction de sa dilution, mais d'une
manière générale sur toute la grille, en tenant compte
uniquement de la vitesse maximale obtenue sur l'ensemble
des mesures effectuées avec cet échantillon. Les empreintes
obtenues ainsi (figure 15) permettent toujours de
visualiser la tendance de l'activité en fonction de la
concentration, mais en focalisant la perception sur les
substrats les plus actifs.

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Enfin ce même traitement peut être effectué,
mais en tronquant les résultats obtenus pour les meilleurs
substrats en écrasant les valeurs supérieures à 25000 pM/s,
qui sont ramenées à la couleur noire (figure 16). Ainsi les
5 observations sont identiques que dans le cas de la figure
15, mais en élargissant l'échelle de.graduation des
couleurs pour les faibles vitesses (de 0 à 25000 au lieu de
0 à Vmax).
10 Exemple 8 Réalisation d'empreinte d'activités
catalytiques idiosyncrasiques à partir d'un mélange de
c"~,c+-r~~-c
On peut également réaliser une empreinte en
mesurant la réaction de chaque substrat dans une série de
15 substrats différents qu'on met en contact avec
l'échantillon sous forme de mélange. On analyse ensuite la
réaction par HPLC après un temps de conversion donné.
L'analyse est particulièrement simple si tous les produits
formés par la réaction des différents substrats sont
20 facilement séparable et visualisable par HPLC. Par exemple,
la plupart des dérivés 1,2-diol ou 1,2-aminoalcohol sont
facilement séparables par HPLC, et tous ces dérivés
produisent un signal intense et spécifique, soit la
fluorescence à 440 nm, soit l'absorbance W 325 nm, ce qui
25 facilite leur détection par HPLC. Le schéma 1 montre une
série possible de diols. Le schéma 2 montre la séparation
des cinq diols par RP-HPLC (Reverse phase HPLC). La
réaction testée est la formation de ces produits à partir
de divers substrats, qui sont choisis pour apparaître à des
30 temps de rétention différents sur l'analyse HPLC.
La figure 17 donne un exemple d'une série de
1,2-diols de structure diverse et analysable par HPLC.
La figure 18 représente la trace HPLC d'un
mélange de cinq diols dans les conditions isocratiques
35 suivantes . 60% (CH3CN/H~O 1 : 1) / 40% (0, 1% TFA DANS H20) .

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L'empreinte par mélange se fait par analyse de
la réaction d'au moins un mélange de substrats avec
l'échantillon de la manière suivante:
- on met l'échantillon en contact avec le
mélange des substrats;
- après un temps de réaction donné, on analyse
la quantité de chaque produit formé par intégration des
pics HPLC des produits;
- on compose l'empreinte à partir des quantités
de produits formés.
Les mélanges de substrats comportent entre deux
et une centaine de substrats, voir un millier de substrats.
Chaque substrat est présent dans une concentration comprise
entre 10 et 200 microM, tout particulièrement 20-50 microM.
On peut par exemple utiliser le mélange de
trois paires d'acétates pseudo-énantiomériques 10/11,
12/13, et 14/15 représentés à la figure 19. La réaction du
mélange donne lieu à la formation ou non de six produits de
type 1,2-diol qui donnent chacun un pic HPLC différent. On
réalise ainsi une empreinte simple d'activité d'estérase
sur des acétates.
Dans une seconde mise en oeuvre, on peut
s'intéresser à l'activité estérolytique en fonction de la
nature de la partie acide carboxylique ET de la partie
alcohol. Par exemple, la série des 10 substrats
esters/carbonates 16-25 représentés à la figures 20 peut
être utilisée en mélange équimolaire pour mesurer
l'empreinte estérasique d'un échantillon. Chaque substrat
engagé donne par hydrolyse un produit de type diol
identifiable dans le mélange par analyse HPLC.
Le concept peut être utilisé de manière
générale en utilisant une variété de groupes fonctionnels.
Les variétés structurales sur le produit qu'on analyse par
HPLC sont multiples, comme par exemple avec les produits
26-31 représentés à la figure 21. On peut réaliser un

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mélange de substrats avec des groupements divers, tel que
amide, époxide, ester, carbonate, phosphate, sulfate,
époxide, oléfine, etc.
De manière générale, on peut appliquer la
méthode pour toute série de substrats qui donnent en
correspondance unique une série de produits correspondants
analysables par séparation analytique (GC (chromatographie
gaz, HPLC, MS, RMN (résonance magnétique nucléaure)).
Exemple 9 Empreintes d'activités catalytiques
idiosyncrasiaues obtenues après analyse HPLC.
Une série de quatre substrats de type acétate
ester, 1, 3, 5 et 7 (Figure 22) est utilisée en mélange
équimolaire à une concentration de 0.1 mM de chaque
substrat. L'enzyme (0,05 mg/ml) est incubé avec le mélange
de substrats à 25°C pendant une heure dans du tampon
phosphate pH 7.4 contenant 1 mg/ml de BSA. Les produits de
type diol 2, 4, 6, 8 formés par la réaction d'hydrolyse
enzymatique sont analysés et quantifiés par RP-HPLC
(Reversed-phase HPLC. C18, Vydac 218-TP54, 0.5 x 22 cm, 1.5
ml/min, gradient eau/acétonitrile). Les produits de départ
ne sont pas visibles dans les conditions d'analyse
choisies. Cette analyse permet d'identifier l'enzyme par un
spectre unique de concentration relative de produits
formés. Les spectres obtenus sont reproductibles et
caractéristiques des enzymes utilisés. Les quatres pics
représentent donc les concentrations relatives des quatre
produits 2, 8, 4 et 6, dans leur ordre d'élution (Figure
23). Les spectres HPLC obtenus sont ensuite représentés
sous forme de grille de quatre carrés (Figure 24). Ainsi,
la surface du pic obtenu pour chacun des quatre produits
est convertie en carré teinté en échelle de gris.