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CONSTRUITS CELLULAIRES CULTIVES IN VITRO,
PREPARATION ET UTILISATIONS
Introduction et état de l'art
La présente invention se rapporte aux domaines techniques de la
biologie, de la biotechnologie, de la toxicologie, de la pharmacologie et de
la
médecine. Ses applications concernent notamment les domaines de la santé
humaine et animale. Plus particulièrement, l'invention décrit de nouvelles
méthodes de culture et de reconstitution de tissus humains ou animaux in vitro
ou ex vivo, typiquement à partir de cellules qui les composent. Ces méthodes
permettent de préserver les capacités de différentiation des cellules
utilisées tout
en orientant cette différentiation dans le sens souhaité. L'invention concerne
en
outre les construits cellulaires et les tissus ainsi reconstitués, de même que
les
nombreuses utilisations qu'il est possible d'en faire. Elle porte par ailleurs
sur
des outils et kits pour la mise en oeuvre de ces méthodes.
L'invention est particulièrement utile dans le domaine des greffes ou de
l'implantologie (reconstitution ou réparation tissulaire), ainsi que dans
l'industrie
pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou
bénéfique de molécules susceptibles d'entrer en développement
pharmaceutique et/ou dans des compositions pharmaceutiques.
La reconstitution tissulaire combine des méthodes de la bio-ingénierie
avec les principes qui régissent les sciences de la vie de manière à
comprendre
les interconnexions structurales et fonctionnelles des tissus normaux et
pathologiques chez les mammifères. L'un des objectifs recherchés est de
produire des substituts biologiques pour tester, restaurer, maintenir ou
améliorer
des fonctions biologiques in vitro ou in vivo, et de produire in vitro des
tissus ou
construits cellulaires les plus semblables possibles aux tissus natifs que
l'on
cherche à reconstruire.
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L'utilisation de cellules d'organismes eucaryotes supérieurs, pour des
besoins expérimentaux (études génétiques, études de toxicité, etc.),
pharmacologiques ou thérapeutiques (thérapie cellulaire, réparation
tissulaire,
etc.) a connu un développement très important. Pour ce faire, différentes
méthodes d'obtention de cellules ou tissus ont été mises au point, notamment
pour la préparation de cultures primaires de cellules, basées essentiellement
sur
le prélèvement et le traitement ex vivo d'une biopsie.
Des méthodes de reconstitution de tissus (par exemple de vaisseaux) ont
été rapportées antérieurement, basées principalement sur l'utilisation d'une
membrane poreuse ou d'une charpente synthétique exogène, destinée à
supporter et à permettre la culture des cellules du tissu à reconstituer. Par
ailleurs, si des cultures tissulaires ont pu étre réalisées en l'absence de
matrice
synthétique ou de membrane poreuse, elles sont essentiellement limitées à des
tissus particuliers et ne présentent pas des caractéristiques adaptées à un
usage
thérapeutique direct.
Description générale de l'invention
Le problème que la présente invention se propose de résoudre consiste à
obtenir un construit cellulaire fonctionnel capable de s'intégrer de façon
biologique dans les tissus d'un sujet hôte receveur, grâce aux ressources des
cellules dudit construit et aux propriétés dudit construit. Des tissus
particulièrement avantageux au sens de l'invention sont les tissus capables de
se comporter de manière fonctionnelle lorsqu'on les greffe à un hôte receveur,
c'est-à-dire de s'incorporer ou s'intégrer de façon durable à l'intérieur de
cet hôte
et/ou à être progressivement remodelé par les cellules de l'hôte, dans le but
de
combler, réparer ou restaurer des propriétés défectueuses.
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Un premier aspect particulier de l'invention concerne des tissus
reconstitués ou construits cellulaires comprenant des cellules ayant une
capacité
de minéralisation et/ou d'ossification.
Un autre aspect de l'invention est relatif à des construits ou tissus
cellulaires reconstitués capables de s'incorporer ou de s'intégrer de façon
durable à l'intérieur d'un hôte et comprenant des zones de minéralisation
et/ou
d'ossification.
Les tissus ou construits cellulaires de l'invention peuvent être produits à
partir de différents types cellulaires, seuls ou en combinaisons, notamment de
cellules de ligament, dent, os, tendon, et comprennent une matrice
extracellulaire dans laquelle lesdites cellules sont enrobées.
Un aspect spécifique de l'invention réside dans un tissu reconstitué à
partir de cellules de ligament, notamment de ligament parodontal.
Un autre aspect particulier de l'invention est de fournir des tissus
reconstitués présentant une épaisseur importante, typiquement supérieure ou
égale à 100 Nm environ, en particulier dans lesquels les cellules et la
matrice
sont organisées fonctionnellement.
D'une manière générale, la présente invention concerne des tissus (ou
construits) cellulaires reconstitués à partir de cellules animales, de
préférence de
mammifères, par exemple des cellules humaines, cultivées in vitro sans
l'intervention d'une charpente ou matrice synthétique destinée à donner sa
tenue
au tissu. Les construits cellulaires peuvent ainsi avantageusement être
réalisés
uniquement à l'aide de cellules animales, de préférence mammifères, par
exemple des cellules humaines, et de composants de matrice extracellulaire
endogène (i.e., produits par ces cellules).
Un autre aspect de l'invention réside dans une composition thérapeutique
comprenant un tissu cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant.
L'invention
fournit en particulier des pansements cellulaires (ou pansements bio actifs)
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comprenant un tissu ou amas cellulaire reconstitué tel que défini ci-avant, et
destiné à une implantation chez un sujet.
L'invention concerne également des méthodes de traitement ou de
réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué et son
implantation à un sujet, dans un contexte autologue, allogénique ou
xénogénique, de préférence dans un contexte autologue.
L'invention est utilisable pour le traitement ou la réparation de défauts
tissulaires chez des sujets, pour la préparation d'implants, pour la
réalisation
d'essais in vitro ou ex vivo, etc.
Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne des construits cellulaires préparés in vitro,
leur production et leurs utilisations.
Un objet particulier de l'invention concerne plus spécifiquement un
construit cellulaire caractérisé en ce qu'il comprend
(i) des cellules animales cultivées in vitro dans des conditions
assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle,
et
(ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites
cellules sont emprisonnées,
et en ce qu'il comprend, parmi lesdites cellules, des cellules ayant une
capacité
de minéralisation et/ou d'ossification.
Au sens de la présente invention, le terme « construit » ou « construit
cellulaire » désigne un amas ou tissu cellulaire en forme de construit étalé.
II
peut s'agir d'un amas ou tissu comprenant une ou plusieurs couches de cellules
superposées les unes aux autres, typiquement de 1 à 20 couches de cellules,
préférentiellement de 2 à 15 couches environ. Les cellules du construit sont
enrobées dans un réseau tridimensionnel dense de matrice extracellulaire
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S
synthétisée par les propres cellules du construit, et qui donne sa structure
et sa
tenue au construit de l'invention. Le terme construit désigne, de manière
générale, un construit tissulaire artificiel (c'est-à-dire notamment fabriqué,
cultivé
ou maintenu in vitro) comprenant une ou plusieurs couches de cellules
cultivées
S in vitro, enrobées dans une matrice extracellulaire produite par lesdites
cellules,
des cellules du construit étant biologiquement actives, i.e., susceptibles de
division, prolifération, remodelage, libération de facteurs biologiques, etc.
Selon
l'origine des cellules et les conditions de culture, le construit présente
généralement une polarité, avec une face basale et une face apicale ayant des
propriétés différentes.
Minéralisation
Une caractéristique particulièrement avantageuse des tissus ou construits
cellulaires reconstitués selon l'invention réside dans le fait qu'ils peuvent
comprendre des cellules ayant conservé une capacité de minéralisation et/ou
d'ossification. La présente demande montre en effet qu'il est possible de
reconstituer artificiellement des tissus ou construits possédant la capacité
de
minéralisation, créant ainsi des zones minéralisées. Cet aspect de l'invention
est
particulièrement inattendu et important, puisqu'il permet la construction de
tissus
ayant des propriétés biologiques adaptées à la reconstitution de défauts et/ou
possédant des propriétés d'intégration dans un hôte fortement améliorées.
Au sens de l'invention, on entend par cellules ayant la capacité de
produire une minéralisation/ossification, des cellules produisant,
naturellement
ou après stimulation particulière, une activité enzymatique catalysant la
formation et/ou l'accumulation, dans la matrice extra-cellulaire, de phosphate
de
calcium ou de carbonate de calcium ou d'un mélange de ces différents ions,
typiquement sous forme de particules, dépôts, plaques, etc. II s'agit
typiquement
de cellules produisant, dans les conditions de culture, la phosphatase
alcaline
et/ou les protéines complémentaires (BMP, BSP, OPN, OCN, etc.), permettant
ainsi la production de phosphate inorganique.
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L'invention montre que des construits peuvent être réalisés à partir
d'expiants, dans lesquels des cellules conservent la capacité de fabriquer des
zones minérales, malgré les étapes de culture et/ou de traitement réalisées.
Cette minéralisation conduit généralement à la création d'une face
S minéralisée et/ou ossifiée du construit cellulaire, qui correspond
généralement à
celle exposée au support de culture. Comme il sera décrit dans la suite du
texte,
cette face est également la plus riche en collagène. En effet la
minéralisation
s'effectue au milieu de fibres de collagène présentes dans le construit,
permettant ainsi un ancrage solide de ces dernières dans les dépôts de
minéralisation. En outre, les cellules progénitrices augmentent en nombre à
proximité du support de culture et facilitent la minéralisation initiée par la
matrice
et le réseau collagénique.
Cette caractéristique de l'invention est particulièrement importante et
avantageuse pour la réalisation de construits cellulaires de réparation de
structures telles que ligaments, tendons, dents, os, articulation, etc., dans
la
mesure où la production d'une minéralisation favorise l'ancrage des fibres de
collagène du tissu dans la couche minéralisée et conduit à un tissu
reconstitué
plus proche du tissu natif, notamment d'un tissu incluant un cément.
Les cellules minéralisantes des construits de l'invention sont typiquement
des cellules du mesenchyme ou des précurseurs de ces cellules. Leur capacité
de minéralisation est conservée par les conditions de culture et/ou de
traitement
des cellules dans le construit, et/ou en raison de l'origine tissulaire
particulière de
ces cellules.
Composition cellulaire
Comme indiqué ci-avant, les construits ou tissus reconstitués selon
l'invention
comprennent avantageusement des cellules animales, en particulier des cellules
de mammifère, de préférence des cellules humaines. II peut s'agir de cellules
souches indifférenciées ou de cellules dérivées de tissus matures, ou d'une
combinaison de telles cellules. Si les cellules sont prélevées dans un tissu
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mature, il peut s'agir de tout type de cellules capables de produire de la
matrice
extra-cellulaire et/ou de conserver ou d'acquérir une capacité de
minéralisation
et/ou d'ossification notamment sous l'influence de facteurs extérieurs. Les
cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent ainsi provenir de
S populations cellulaires différentes formant ainsi une population hétérogène.
II s'agit par exemple de cellules dérivées de tissus matures tels que le
muscle, l'os, la dent, le cartilage, le tendon ou le ligament, en particulier
la dent
et le ligament, notamment le ligament parodontal ou le ligament antérieur
croisé.
Préférentiellement, lorsque les cellules sont issues du parodonte, elles
comprennent, au moins dans les cultures initiales, des cellules du ligament
parodontal, des cellules du cément et de la dentine à savoir essentiellement
des
fibroblastes (environ 80%). Les cellules dérivées du ligament parodontal
comprennent typiquement des fibroblastes, des cellules épithéliales, des
cémentoblastes, des ostéoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents
types
cellulaires. Lorsqu'elles sont issues de la dent, elles comprennent des
odontoblastes, des améloblastes, des cellules pulpaires, des cellules
épithéliales, des cémentoblastes et/ou des progéniteurs de ces différents
types
cellulaires. II peut encore s'agir d'un prélèvement contenant une majorité de
cellules souches indifférenciées dont la différentiation sera orientée par des
moyens de culture appropriés. II peut également s'agir de chondrocytes ou
d'ostéoblastes. Ces cellules peuvent avoir pour origine des cellules souches
mésenchymateuses et/ou des cellules isolées à partir d'un extrait de moelle
osseuse.
La présence par exemple de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou
de précurseurs de celles-ci du type pré-ostéoblaste ou pré-chondroblaste ou
encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas
nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment
des
zones de minéralisation et/ou d'ossification.
Le tissu selon l'invention peut étre composé d'une seule population
cellulaire ou d'une combinaison ou mélange de plusieurs types (ou populations)
cellulaires, répartis uniformément ou non au sein du tissu de façon à mimer la
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composition cellulaire et la structure des tissus natifs. Si différents types
cellulaires sont présents, il est préférable que l'un au moins desdits types
cellulaires soit capable de minéralisation et/ou d'ossification. Le ou les
types
cellulaires ne présentant pas de capacité de minéralisation peu(ven)t en outre
être stimulés) ou transformé (s) de manière à induire une minéralisation et/ou
une ossification.
II est par ailleurs possible d'amener les cellules du construit (par exemple
les fibroblastes) à exprimer des composés absents naturellement, par exemple
en les exposant à une substance chimique, en exerçant un stimulus physique ou
encore en utilisant des méthodes transgéniques.
Les différentes populations cellulaires peuvent être associées au début de
la période de culture, par exemple dans un ratio donné, ou encore de façon
successive, par exemple par l'association de plusieurs construits.
Un objet particulier de l'invention réside dans un construit cellulaire tel
que
défini ci-avant, réalisé à partir de (ou comprenant des) cellules de ligament
cultivées in vitro, en particulier de ligament parodontal ou antérieur croisé.
L'invention montre que des tissus minéralisés artificiels peuvent étre
fabriqués à
partir de ce type de cellules, qui peuvent étre remodelés pour produire des
construits épais, et qui possèdent une organisation biologique fonctionnelle.
Matrice extracellulaire endogène
Comme indiqué ci-avant, les tissus ou construits selon l'invention
comprennent des cellules qui sont noyées ou enrobées ou emprisonnées dans
une matrice extra-cellulaire endogène, c'est-à-dire produite par les cellules
en
culture. La matrice extracellulaire comprend typiquement (et essentiellement)
un
réseau de fibres de collagène organisées notamment en fibrilles, des
protéoglycanes sulfatés, impliqués potentiellement dans la régulation in vivo
du
diamètre des fibrilles, ainsi que des glycosaminoglycanes (GAG) simples ou
sulfatés. Parmi les GAG simples, on trouve typiquement de l'acide hyaluronique
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(HA) et/ou de la fibronectine et, parmi les GAG sulfatés, on peut trouver
notamment de l'acide di-hyaluronique, du di-chondroïtine-0-sulfate, du di-
chondroïtine-4-sulfate, du di-chondroïtine-6-sulfate, du di-chondroïtine-4,6-
sulfate, du di-chondroïtine-4-sulfate-UA-2S et/ou du di-chondro'itine-6-
sulfate-
UA-2S. La matrice extracellulaire peut en outre comprendre de la décorine,
telle
que du biglycane ou du versicane, ainsi que de la ténascine, une glycoprotéine
extra-cellulaire de la matrice que l'on trouve en particulier dans le
mésenchyme
ou les tissus en réparation. II semble que les cellules en culture remplissent
progressivement l'espace qui les sépare avec une matrice lâche riche en
collagène de type III et en fibronectine puis remodèlent cette matrice avec du
collagène de type I de manière à la rendre plus dense.
II n'est pas nécessaire que la composition exacte de la matrice
extracellulaire soit connue, pour une mise en oeuvre de l'invention.
Typiquement,
le construit comprend des cellules ayant la capacité de synthétiser une
matrice
extra-cellulaire endogène, dont la composition est semblable à celle que l'on
trouve dans le tissu d'origine, sauf modifications volontaires (e.g.,
incorporation
de matériaux synthétiques, modification génétique des cellules, etc.).
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un
construit tel que défini ci-avant comprenant une couche basale et une couche
apicale par rapport au support de culture, ladite couche basale étant riche en
collagène et comprenant en outre des fibroblastes et des cellules
progénitrices à
l'origine de la minéralisation et/ou de l'ossification et ladite couche
apicale étant
moins riche en collagène que ladite couche basale, et comprenant typiquement
plus de cellules prolifératives.
Dimensions du construit
Les construits selon l'invention peuvent être de dimensions variables, tant
en surface qu'en épaisseur. En outre, ils peuvent avoir ou prendre des formes
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variées. Les dimensions et la forme peuvent étre adaptées par l'homme du
métier ou par l'utilisateur, en fonction des applications recherchées.
Une caractéristique particulière avantageuse des construits ou tissus
selon l'invention réside dans leur épaisseur importante, comprise typiquement
5 entre 30 et 120 microns, préférentiellement entre 50 à 120 Nm, encore plus
préférentiellement supérieure ou égale à environ 100 Nm. La présente demande
montre en effet qu'il est possible de réaliser des construits cellulaires in
vitro
présentant une épaisseur élevée, dans lesquels les cellules sont capables de
s'organiser, de se différencier et de proliférer, pour créer une polarité
10 fonctionnelle dans le construit sans entrainer de nécrose cellulaire
particulière.
Cette caractéristique est avantageuse car elle fournit un tissu reconstitué
dans lequel les cellules s'organisent et développent des propriétés
biologiques
avantageuses. Ainsi, du fait de l'épaisseur accrue du tissu, les cellules ont
un
comportement différent. En particulier, la diffusion endogène globale de
substances au sein du tissu, et donc dans l'environnement des cellules est
diminuée, ce qui augmente l'effet potentiel des cellules et conduit à leur
réorganisation et à leur remodelage. Cette organisation favorise en outre
l'apparition d'une minéralisation, la polarisation du tissu, l'expression
d'une
couche proliférative sur la face apicale, la tenue du construit et/ou son
intégration chez un sujet.
L'épaisseur du construit peut être modulée de différentes manières.
Préférentiellement, elle est obtenue artificiellement, par exemple par
repliement
ou roulage sur lui-même d'un construit plus mince, de manière à augmenter son
épaisseur par fusion et remodelage des différentes couches cellulaires.
L'invention montre en effet qu'il est possible de compacter un premier
construit
tissulaire comportant environ 3 couches de cellules obtenues par culture, et
que
ce compactage (e.g., pliage, enroulement, etc.) conduit à un tissu dans lequel
les cellules s'organisent, se différencient, et développent des propriétés
biologiques avantageuses. L'invention montre également qu'il est possible de
découper un tissu ou construit en parcelles qui peuvent ensuite étre repliées
ou
roulées sur elles-mêmes. L'épaisseur peut également être augmentée
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artificiellement par un décollement des bords du construit qui provoque la
rétractation de ce dernier et le compactage des cellules.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside également dans un
construit cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules
animales
cultivées in vitro dans des conditions assurant la formation d'une structure
tissulaire tridimensionnelle et (ü) une matrice extra-cellulaire endogène dans
laquelle lesdites cellules sont enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il
possède une épaisseur supérieure ou égale à 100 pm environ.
De manière plus particulière, le construit comporte ou est réalisé à partir
de cellules présentant une capacité de minéralisation, et/ou comporte ou est
réalisé à partir de cellules de ligament, tendon, dent ou os.
Un objet plus particulier de l'invention réside ainsi dans un construit
cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à
partir de
ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des
conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle,
et (ü)
une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont
enrobées (ou emprisonnées), et en ce qu'il possède une épaisseur supérieure
ou égale à 100 Nm environ.
Un autre objet plus préféré de l'invention réside ainsi dans un construit
cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend (i) des cellules prélevées à
partir de
ligament, tendon, dent et/ou os de mammifère(s), cultivées in vitro dans des
conditions assurant la formation d'une structure tissulaire tridimensionnelle,
et (ü)
une matrice extra-cellulaire endogène dans laquelle lesdites cellules sont
enrobées (ou emprisonnées), en ce qu'il possède une épaisseur supérieure ou
égale à 100 Nm environ et en ce qu'il comporte des cellules présentant une
capacité de minéralisation et/ou des zones minéralisées.
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Typiquement, le construit comporte une couche (face) basale et une
couche (face) apicale, la couche basale étant riche en collagène et en zone
minéralisée.
Comme indiqué, la surface du construit ou tissu peut être adaptée par
l'homme du métier en faisant varier la quantité de cellules ensemencées, la
durée de la culture, les dimensions du dispositif de culture, etc. En outre,
comme
indiqué, des parcelles de construit peuvent être découpées, possédant une
forme adaptée à l'utilisation ultérieure du construit, par exemple
rectangulaire,
carrée, circulaire, etc., et une surface également adaptée à ladite
utilisation, par
exemple comprise entre 1 et 20 cm2, de préférence entre 1 et 15 cm2, encore
plus préférentiellement entre 2 et 10 cm2.
Préparation
Les tissus ou construits selon l'invention peuvent être produits de
différentes façons. Selon un mode particulièrement préféré, qui constitue
également un objet de la présente demande, les construits cellulaires sont
préparés par une méthode comprenant typiquement:
a) la culture de cellules d'intérêt dans des conditions adaptées
à la synthèse d'une matrice extra-cellulaire et à la formation d'un
construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules
enrobées dans la matrice extracellulaire endogène
néosynthétisée, et
b) ~ la récupération du construit.
Cette méthode peut en outre comprendre préalablement aux étapes a) et
b), les étapes a') et b') suivantes
a') l'extraction des cellules d'intérêt d'un ou de plusieurs tissus, par
tout moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique,
traitement mécanique, expiant, etc., et
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b') l'amplification desdites cellules extraites durant l'étape a') dans
un milieu approprié, typiquement en présence d'acide ascorbique
ou d'un dérivé dudit acide.
La méthode peut par ailleurs comprendre en outre une étape c) de
récupération du construit cellulaire (par exemple par décollement) et une
étape
d) d'augmentation artificielle de l'épaisseur dudit construit, notamment par
repliement (par exemple par repliements successifs), roulement du construit
sur
lui-même ou rétractation du construit.
Dans l'étape a'), les cellules peuvent être extraites du tissu choisi par tout
moyen approprié, par exemple par digestion enzymatique (e.g., collagénase) ou
grâce à l'utilisation d'une technique d'expiant connue de l'homme du métier.
II
peut s'agir d'une dissection mécanique (e.g., scalpel), d'une lavage
enzymatique, d'une concentration cellulaire, d'un découpage mécanique (e.g.,
ciseaux), etc. Les cellules ainsi extraites sont généralement constituées
d'une
population de cellules de natures variées, par exemple de cellules matures et
de
cellules progénitrices. Ces cellules sont typiquement représentatives de la
composition du tissu ou construit à reconstituer.
Les cellules ainsi obtenues sont ensuite mises en suspension dans du
milieu de culture, pour la réalisation de l'étape b') d'amplification (ou
d'expansion
ou de prolifération). Cette étape vise essentiellement à augmenter le nombre
de
cellules pour faciliter la constitution du tissu. Elle peut être réalisée
pendant une
période de temps variable, par exemple de 1 à 10 jours, ou plus, selon le type
cellulaire, la quantité de cellules disponibles, etc. Le milieu de culture
utilisé est
typiquement un milieu de culture de base tel que décrit ci-après
(éventuellement
supplémenté d'acide ascorbique ou d'une molécule similaire), qui peut être
changé 2 ou 3 fois par semaine selon l'état de prolifération des cellules. A
l'issue
de cette étape, lorsque les cellules sont à confluence ou approximativement à
50
de confluence, la culture est traitée pour décoller les cellules adhérentes,
par
exemple au moyen de trypsine. Selon le type de cellule ou l'état de
confluence,
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la durée du passage à l'étuve qui suit et permet le décollement du tissu, sera
plus ou moins longue. Elle sera par exemple de 3 minutes pour des cellules
endothéliales, de 5 minutes pour des fibroblastes, de 8 minutes pour des
kératinocytes, etc. (voir exemples). Durant cette phase, les cellules ne
produisent qu'une faible quantité de matrice extra-cellulaire.
Les cellules amplifiées ainsi obtenues sont ensuite utilisées pour la
préparation du construit. A cet effet, elles sont ensemencées dans un
dispositif
adapté et cultivées dans des conditions adaptées à la synthèse d'une matrice
extra-cellulaire et à la formation d'un construit comprenant une ou plusieurs
couches de cellules enrobées dans la matrice extracellulaire endogène
néosynthétisée.
Typiquement, les cellules sont ensemencées (par exemple dans des
boîtes de Pétri), à une densité comprise entre environ 103 et 106
cellules/cm2, de
préférence entre 3.103 et 5.105 cellules/cmz, typiquement entre 3000 et 12000
cellules/cm2. Dans une expérience typique, on utilise ainsi environ 5.105
cellules
par boîte de 75 cm2, par exemple.
Les cellules sont ainsi cultivées pendant une durée suffisante pour
permettre
- la production d'un construit ayant une surface désirée, composé
d'une ou plusieurs couches de cellules, typiquement 1 à 3 (soit
environ 30 Nm d'épaisseur), enrobées dans une matrice
extracellulaire endogène,
- l'adhésion du construit au support,
- la prolifération des cellules en surface, et,
- de préférence, de produire ou initier une minéralisation (ou
ossification).
Cette culture peut ainsi étre maintenue pendant 2 à 6 semaines,
éventuellement sous agitation douce, avantageusement en renouvelant le milieu
1 à 3 fois par semaine.
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Pour assurer la formation d'une matrice extracellulaire, les cultures sont
avantageusement réalisées dans un milieu de culture de base comprenant de
l'acide ascorbique ou un dérivé de celui-ci. L'ascorbate est ajouté pour
promouvoir l'hydroxylation de la proline et la sécrétion du procollagène,
5 précurseur soluble du collagène, mais également parce qu'il constitue un
cofacteur important d'enzymes actifs au moment de la phase post-
traductionnelle et qu'il régule en amont la synthèse des collagènes de type I
et
III. L'acide ascorbique peut étre remplacé par l'un de ses dérivés
synthétiques
ou par un nutriment agissant sur la synthèse de matrice extra-cellulaire. De
ce
10 fait, le procédé de l'invention ne requiert pas l'utilisation de matrice
exogène.
Les milieux de culture de base utilisés sont des milieux adaptés aulx)
types) cellulaires) et au tissu ou construit à reconstituer. Le milieu et les
conditions de culture doivent stimuler la croissance cellulaire en construit
et la
15 synthèse de matrice extra-cellulaire. II est préférable de choisir un
milieu de
composition connue, c'est-à-dire notamment ne comprenant pas d'organe ou
d'extrait tissulaire animal, bien que la présence de tels composés non définis
soit
possible si elle favorise l'obtention d'un construit selon l'invention. Des
équivalents fonctionnels synthétiques ou recombinants connus de l'homme du
métier peuvent aussi étre ajoutés au milieu de culture de composition connue.
L'homme du métier peut déterminer facilement les composés de base
nécessaires à la culture des cellules animales. Parmi les milieux commerciaux
disponibles sur le marché et utilisables dans le cadre de la présente
invention,
on peut citer notamment des milieux qui fournissent des sels inorganiques, une
source énergétique, des acides aminés et de la vitamine B tels que le DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), le MEM (Minimal Essential Medium), le
RPMI 1640, l'EDMEM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), les milieux Ham
(notamment Ham's F-12) ou NCTC 109. Un milieu de base préféré selon
l'invention est un mélange DMEM/Ham F12 (50 :50 en volume). Le milieu peut
contenir du sérum. Le milieu de base est typiquement complété avec notamment
des composés tels que des acides aminés et en particulier de la proline et de
la
glycine qui rentrent dans la structure du collagène, des facteurs de
croissance,
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des hormones et des sels inorganiques. Des milieux de culture spécifiques
utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrits dans la
demande
W096/21003. D'autres milieux sont décrits dans les exemples.
Les cultures peuvent être réalisées dans tout dispositif approprié, tel que
plaque, boite, flasque, poche, etc. II s'agit typiquement de boites de Pétri
ou
similaires. Les cultures sont avantageusement maintenues dans un incubateur
qui permet de contrôler température, humidité et mélanges gazeux. Des
conditions de culture préférées sont par exemple une température comprise
entre 35 et 40°C environ, de préférence 37°C environ, une
atmosphère
contenant de 5 à 10% C02 et une humidité relative comprise entre environ 75 et
95%.
Le tissu ainsi fabriqué contient des cellules associées à un réseau
tridimensionnel dense de matrice extra-cellulaire néosynthétisée par lesdites
cellules. Durant cette étape, et en réponse à la stimulation des cellules par
l'acide ascorbique ou par un dérivé de cet acide, les cellules se multiplient,
se
superposent et fabriquent une matrice extra-cellulaire dont la composition est
essentiellement identique à celle d'une matrice extra-cellulaire naturelle.
Lorsque
le construit cellulaire est préparé à partir de cellules issues notamment de
tendon ou de ligament, de la peau ou du derme, il comprend ainsi, aux environs
de la troisième semaine de culture, une forte proportion de collagène
concentrée
en particulier dans la moitié du construit dont la face est directement en
contact
avec le support de culture. C'est au niveau de ce réseau de collagène que la
minéralisation va être initiée.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, les
cellules sont cultivées dans des conditions assurant la formation ou le
maintien
de la capacité des cellules à produire une minéralisation (ou une
ossification).
Cette capacité peut être liée aux cellules utilisées, et favorisée par la
culture en
présence d'un stimulus activant ou augmentant la minéralisation et/ou
l'ossification des cellules, notamment des cellules progénitrices basales.
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Dans un mode particulier, la minéralisation du tissu est obtenue de façon
surprenante en modifiant les conditions de culture. Cette minéralisation
concerne
la matrice néosynthétisée et en particulier la matrice constitutive de la
moitié du
construit en contact avec le support de culture. La stimulation peut être
obtenue
par mise en contact du construit ou des cellules avec un matériau particulier
ou
avec des particules de ce matériau, par l'ajout de facteurs) de
différentiation, de
milieu conditionné, de substances synthétiques ou encore par l'ajout de
substances naturelles telles que du corail ou par stimulation mécanique. Parmi
les matériaux minéralisant utilisables, on peut citer notamment un support ou
des particules comprenant de l'hydroxyapatite, du verre bioactif (ou bio-
verre),
un substitut collagénique minéralisé, un substitut osseux, une céramique,
notamment à base de zirconium, ou du corail, ou tout matériau (par exemple un
matériau composite) dont la surface est revêtue, au moins en partie, de l'un
de
ces composants. Ainsi, le matériau minéralisant peut étre également produit à
partir d'un matériau inerte bio-activé par le greffage en surface de
substances
susceptibles d'induire la minéralisation du construit. Parmi les substances ou
facteurs utilisables, on peut citer par exemple des adjuvants incorporés dans
le
milieu de culture et renforçant l'effet stimulant de la minéralisation crée
par le
support choisi (cytokine, de la déxaméthasone, du béta-glycérophosphate, du
béta-aminopropionitrile)
Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention comprend donc une
méthode de préparation d'un construit cellulaire minéralisé ou minéralisant,
comprenant une étape de mise en contact des cellules avec un stimulus tel
qu'un support ou matériau minéralisant, des particules de ce matériau, des
facteurs de différenciation, des cytokines, un milieu conditionné, une
substance
synthétique ou une substance naturelle, stimulant la minéralisation ou la
capacité de minéralisation des cellules. De préférence le stimulus est
provoqué
par un support ou matériau minéralisant, comprenant avantageusement de
l'hydroxyapatite ou du bio-verre. A terme, l'hydratation du bio-verre provoque
sa
résorption, et ce type de support est donc particulièrement adapté et
avantageux
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lorsque le tissu à reconstituer est destiné à être greffé, puisqu'à terme seul
le
greffon subsiste au sein de l'hôte receveur.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans un procédé de
préparation d'un construit ou tissu cellulaire reconstitué, comprenant la
culture in
vitro de cellules dans des conditions assurant la synthèse de matrice
extracellulaire et la minéralisation. II s'agit avantageusement d'une culture
en
présence d'un stimulus, tel qu'un support, agent ou traitement minéralisant,
avantageusement d'une culture sur un support minéralisant ou en présence de
particules minéralisantes. L'obtention d'un construit selon l'invention
présentant
des zones de minéralisation ne nécessite pas l'ajout de facteur de croissance,
tel
que par exemple le TGF-(31.
Un objet particulier de l'invention porte également sur un construit ou tissu
cellulaire, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un
procédé
comprenant la culture in vifro, en l'absence de matrice ou charpente
synthétique,
de cellules dans des conditions assurant la formation d'un construit
comprenant
une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice extracellulaire
endogène, et dans des conditions stimulant la minéralisation ou
l'ossification.
La minéralisation est généralement réalisée ou initiée en même temps
que l'étape de formation du construit et de synthèse de la matrice
extracellulaire.
Toutefois, la minéralisation se poursuit généralement après la récupération du
construit et/ou son épaississement artificiel.
Un objet particulier de l'invention consiste donc à mettre les cellules
culture en présence d'agents minéralisant, par exemple de micro ou de nano-
particules de bio-verre ou d'hydroxyapatite, dès le début de la culture. Ces
agents favorisent la migration des cellules progénitrices et stimulent leur
capacité de minéralisation et/ou d'ossification.
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Une telle minéralisation et/ou ossification améliore de façon
particulièrement avantageusement l'intégration du tissu ou construit
cellulaire
reconstitué au sein des tissus de l'hôte récepteur.
La minéralisation peut être observée par coloration à l'aide par exemple
de paragon ou via une coloration von Kossa. A titre d'exemple spécifique, des
cellules de parodonte ensemencées à raison d'environ 5000 cellules/cm2,
peuvent ainsi être cultivées pendant trois semaines environ, en présence de
microparticules d'hydroxyapatite (voir figure 5). Les cellules en culture
reconnaissent le stimulus et produisent des enzymes spécifiques de type
phosphatase alcaline. Des substrats phosphatés comme par exemple le ~3-
glycérophosphate vont être hydrolysés. Ils libèrent ainsi des phosphates
capables de provoquer la cristallisation partielle du tissu en se complexant
aux
ions calcium pour donner du phosphate de calcium.
Comme indiqué, les tissus ou construits peuvent être fabriqués dans tout
dispositif approprié, tel que plaque, boite, flasque, poche, etc. II s'agit
typiquement de boites de Pétri ou similaires. Préférentiellement, la
préparation
est réalisée en l'absence de matrice ou charpente tridimensionnelle
synthétique.
Un objet particulier de l'invention réside dans un procédé de préparation
d'un construit ou tissu reconstitué, comprenant la culture in vitro de
cellules
issues de ligament parodontal ou croisé, dans des conditions assurant la
synthèse de matrice extracellulaire.
Une fois le construit produit, il peut être récupéré du support par toute
technique connue, typiquement par décollement. Une des caractéristiques de
l'invention réside en effet dans la facilité de récupération du construit
cellulaire
reconstitué par simple décollement dudit construit de son support de culture.
Par ailleurs, dans une étape supplémentaire d), le construit ou tissu ainsi
récupéré peut être traité (e.g., compacté) en vue d'augmenter son épaisseur,
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typiquement par repliement, enroulement, amassement, etc. Généralement,
avant qu'elle n'ait été augmentée artificiellement, l'épaisseur du construit
cellulaire correspond à environ 2 ou 3 couches de cellules empilées les unes
sur
les autres, soit environ 30 Nm. Les cellules sont en effet généralement
5 maintenues en culture jusqu'à ce qu'elles aient sécrété une quantité
suffisante
de matrice pour assurer une tenue minimale au construit cellulaire. II est
alors
possible de décoller le construit cellulaire de son support de culture sans
qu'il ne
se déchire, et de produire un construit cellulaire ayant une épaisseur
augmentée,
par exemple de deux à cinq fois par rapport à un construit mince cultivé.
Un objet particulier de l'invention concerne également des construits ou
tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus
par
un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou de
charpente synthétique, de cellules dans des conditions assurant la formation
d'un construit comprenant une ou plusieurs couches de cellules enrobées dans
une matrice extracellulaire endogène, et une étape de décollement du construit
de son support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-méme,
permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Un autre objet particulier de l'invention concerne également des construits
ou tissus cellulaires, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'étre
obtenus
par un procédé comprenant la culture in vitro, en l'absence de matrice ou
charpente synthétique, de cellules de ligament parodontal ou antérieur croisé
dans des conditions assurant la formation d'un construit comprenant une ou
plusieurs couches de cellules enrobées dans une matrice , extracellulaire
endogène, et, de préférence, une étape de décollement du construit de son
support de culture, repliement ou roulement du construit sur lui-même,
permettant de produire un tissu reconstitué ayant une épaisseur augmentée.
Les construits selon l'invention peuvent être maintenus en culture pendant
une période variable, typiquement en présence de milieu, pour favoriser la
réorganisation cellulaire, la poursuite de la minéralisation, etc. Les
construits ou
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tissus peuvent ensuite être utilisés dans le cadre d'applications cliniques
(greffe,
implant) ou pharmaceutiques.
Conservation/Maintien
Les construits ou tissus selon l'invention peuvent être conservés dans tout
dispositif adapté, en présence de milieu de culture, de milieu nutritif ou de
solutions salines isotoniques. Typiquement, les tissus sont conservés ou
maintenus dans des boites, tubes, flasques, ampoules, poches, etc.,
préférentiellement en présence d'une quantité importante de milieu. Les tissus
peuvent être utilisés extemporanément ou conservés, de préférence au froid.
Utilisations
Les construits ou tissus décrits ci-dessus peuvent être utilisés dans le
domaine des greffes ou de l'implantologie ainsi que dans l'industrie
pharmaceutique, pour l'étude des tissus et l'analyse du profil toxique ou
bénéfique de molécules, notamment de médicaments candidats.
Un tissu ou construit selon l'invention peut ainsi être utilisé dans le
domaine des greffes ou de l'implantologie. Le tissu ou construit est dans ce
cas
préférentiellement d'épaisseur importante, typiquement de 100 um environ. II
peut ainsi s'agir avantageusement d'un construit compacté, e.g., replié ou
roulé
sur lui-même de manière à augmenter son épaisseur par fusion et remodelage
des différentes couches cellulaires comme décrit ci-avant, ou simplement
détaché du support pour former un amas cellulaire.
Pour un usage en réparation tissulaire, les construits de l'invention
peuvent être utilisés tels quels, sous forme de pansements ou de « patch »
cellulaires, ou pour enrober ou recouvrir tout ou partie d'un implant destiné
à être
introduit chez un sujet.
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Le tissu ou construit cellulaire selon l'invention peut être directement
utilisé dans le cadre d'une greffe. L'invention propose en effet la
réalisation d'un
pansement cellulaire, comprenant essentiellement un amas cellulaire tel que
défini ci-avant. Un objet de l'invention réside donc notamment dans une
composition pharmaceutique comprenant un construit ou tissu tel que décrit cl-
avant. II s'agit avantageusement d'un tissu épais ou compacté tel que décrit
cl-
avant. Le pansement peut être appliqué directement sur une cavité ou sur un
tissu lésé, lors d'opérations chirurgicales simples. Par exemple, si le tissu
est
reconstitué à partir de cellules du parodonte, le pansement de l'invention
peut
être utilisé dans le cadre du traitement des poches parodontales. S'il s'agit
de
cellules de ligament, il est possible de reconstituer ou réparer un ligament
tel que
le ligament croisé antérieur par exemple. Si le tissu est reconstitué à partir
de
chondrocytes ayant conservé leur capacité de minéralisation et/ou
d'ossification,
une greffe peut également être directement envisagée au niveau du site atteint
de l'hôte récepteur.
L'invention propose donc également une méthode de traitement ou
réparation tissulaire, comprenant la préparation d'un tissu reconstitué par
culture
in vitro comme décrit ci-avant, et l'injection de ce tissu, éventuellement
après
conditionnement dans toute solution ou véhicule acceptable sur le plan
pharmaceutique. Dans ce contexte, le tissu peut éventuellement être associé à
une matrice exogène, telle que du collagène.
Dans un autre mode de mise en oeuvre, le tissu ou construit de l'invention
est utilisé pour la préparation d'un implant, notamment pour recouvrir ou
enrober
tout ou partie d'un implant. II peut s'agir d'un implant dentaire (cf. :
exemple 4
relatif au « ligaplant »), ligamentaire, d'une prothèse osseuse ou
cartilagineuse,
etc. Dans ce cas, le construit produit est typiquement disposé ou enroulé
autour
de la structure de l'implant.
Un implant dentaire peut par exemple comprendre une partie coronaire
sur laquelle sera fixée la couronne de la dent à remplacer et une partie
radiculaire correspondant à la racine de ladite dent et autour de laquelle il
est
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possible de rouler un construit cellulaire selon l'invention. La présente
invention
concerne donc une méthode de préparation d'un implant à l'aide d'un construit
tel que décrit ci-avant, comprenant l'enroulement dudit construit à la surface
de
l'implant et la mise en culture dudit implant associé audit construit dans des
conditions permettant de maintenir ou stimuler la prolifération et/ou la
différentiation des cellules tout en favorisant la fusion et le remodelage des
différentes couches cellulaires dudit construit à la surface de l'implant.
Ce construit peut en particulier être reconstruit à partir de cellules du
parodonte cultivées pendant environ trois semaines dans les conditions
indiquées ci-dessus (voir également Figure 4). La face minéralisée du
construit
cellulaire qui correspond à celle exposée au support de culture est exposée
ensuite directement à l'implant, dans un milieu d'amplification et en présence
d'acide ascorbique. Cette face du construit cellulaire permet alors à
l'ensemble
du construit d'adhérer à l'implant de façon stable, solide et particulièrement
avantageuse, notamment grâce aux cellules progénitrices qui vont augmenter en
nombre autour dudit implant et vont faciliter la minéralisation initiée par la
matrice et le réseau collagénique. La structure ainsi reconstituée est alors
très
proche du cément naturel de la dent. Le milieu d'amplification facilite quant
à lui
la fusion et le remodelage des différentes couches cellulaires du construit,
dans
la mesure où aucune limite nutritionnelle n'est imposée. Le tissu minéralisé
selon
l'invention améliore ainsi globalement l'intégration de l'implant dans le site
alvéolaire receveur.
Un construit selon l'invention peut donc être utilisé pour préparer un
implant dentaire ou ligamentaire par exemple.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation dans l'industrie
pharmaceutique d'un tissu ou construit cellulaire selon l'invention, pour
l'étude
des tissus et l'analyse du profil toxique ou bénéfique de molécules. Dans un
mode particulier de mise en oeuvre, les tissus reconstitués de l'invention (ou
une
partie de ceux-ci) sont mis en contact avec un ou plusieurs composés tests, et
l'effet dudit composé test est déterminé, par exemple de façon à caractériser
les
réactions cellulaires à l'égard de ce ou ces composés tests.
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Le composé test peut être de nature très variée. Ainsi, il peut s'agir d'un
composé isolé ou d'un mélange de substances. Le composé peut être de nature
chimique ou biologique. II peut s'agir notamment d'un peptide, polypeptide,
acide
nucléique, lipide, glucide, d'une molécule chimique, d'extraits végétaux, de
banques combinatoires, etc. Le composé test peut également être un traitement
appliqué aux tissus (radiations, UV, etc.).
Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le composé test peut
être appliqué à différentes concentrations, choisies par l'utilisateur.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué
tel que défini ci-avant, pour l'évaluation (in vitro ou ex vivo) des
propriétés
biologiques et/ou toxiques d'un composé test, notamment de molécules
destinées à un usage thérapeutique.
Elle a également pour objet l'utilisation d'un tissu reconstitué tel que
défini
ci-avant, pour le criblage de molécules destinées à un usage thérapeutique.
La présente demande a également pour objet des kits pour la mise en
oeuvre des procédés de préparation et d'études et également pour l'utilisation
des tissus reconstitués tels que décrits ci avant. De tels kits comprennent
avantageusement un conteneur et/ou des réactifs de culture, et/ou un construit
tissulaire tel que défini ci-avant.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits plus en détails
à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme
illustratifs
et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1 : Cellules extraites d'un ligament parodontal ensemencées à 5000
cellules/cm2 à J2 (A) après trois semaines de culture (B). Les cellules se
multiplient, se superposent et synthétisent de la matrice extra-cellulaire.
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Figure 2 : Aspect macroscopique d'un construit après trois semaines de culture
statique dans une boite de pétri de 100 mm de diamètre.
Figure 3: Tissu minéralisé. La coloration Paragon permet de visualiser les
5 dépôts de minéralisation.
Figure 4 : Implant dentaire et association d'un tissu selon l'invention à
l'implant
dentaire.
10 Figure 5 : Tissu minéralisé par l'ajout d'hydroxyapatite pour le traitement
des
poches parodontales. Des cellules du parodonte sont cultivées en présence de
micro-particules d'hydroxyapatite pendant trois semaines. La matrice
collagénique néosynthétisée contient des dépôts de minéralisation (coloration
von Kossa).
Figure 6 : Coupe histologique (Grossissement X100) d'un construit élaboré à
partir de cellules du ligament parodontal (cellules de la jonction cémento-
amélaire) cultivées à la surface d'un support d'hydroxyapatite, selon le
procédé
de l'invention, et implantées sous la peau d'une souris athymique (Swiss nu
nu)
pendant 12 semaines. L'Inclusion est réalisée dans de la paraffine après
déminéralisation de l'échantillon et la coloration est réalisée avec le
trichrome de
Masson.
On distingue les noyaux des cellules qui apparaissent plus foncés dans la
partie
appelée « cellules ». Les fibres de collagène (fibres de Sharpey) et les
protéines
de la matrice minéralisée au contact du support d'hydroxyapatite correspondent
à la masse poreuse appelée « HA ».
La structure tissulaire obtenue est comparable à celle d'un cément cellulaire
fibrillaire comme il en existe sur une dent normale.
Figure 7: Cette figure représente un tissu d'un feuillet simple, marqué par
immunohistochimie pour détecter le collagène de type V. La couleur gris clair
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représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du
collagène
de type V.
Figure 8 : Cette figure représente un tissu identique à celui de la figure 7
après
avoir été plié ou roulé. Le profil du marquage montre ainsi le remodelage
(sans
conservation de la polarité de chaque repliement du tissu). La couleur gris
clair
représente la contre-coloration et la couleur gris foncé le marquage du
collagène
de type V.
Exemples
MATERIELS ET METHODES
Les milieux et/ou produits utilisés (e.g., vitamine C, acide ascorbique 2-
phosphate, collagénase, dexaméthasone, etc.) sont généralement d'origine
commerciale, ou sont disponibles dans le commerce. Ces substances sont
généralement stérilisées avant emploi.
Ainsi, la collagénase A (clostridiopeptidase A) utilisée est une protéase
bactérienne
produite par clostridium histolyticum. Cette protéase a une spécificité pour
les liens
X-Gly des séquences Pro-X-Gly-Pro (X représentant un acide aminé neutre)
retrouvé dans les triples hélices collagéniques. La collagénase n'est pas
inhibée par
le sérum mais par l'EDTA et est activée par le calcium. Son pH optimal est
situé
entre 6 et 8. Sous forme lyophillisée, elle est stable entre +2 et +8°C
et en solution
entre -15° et -25°C. La collagénase peut être reconstituée dans
des solutions
tamponnées, telles que le PBS, le HBSS ou le DMEM/F12, qui contiennent du
calcium.
La Déxaméthasone est un glucocorticoide de PM de 392,5, qui permet
d'augmenter le niveau de phosphatase alkaline. Elle est préparée à partir de
source commerciale (Sigma D-2915).
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Le ~i-glycérophosphate, dont le PM est de 216, est hydrolysé par la
phosphatase
alcaline en ions phosphates, nécessaires à une bonne minéralisation. II est
préparé
à partir de source commerciale (Sigma G-9891 ).
Pour la préparation et le contrôle des milieux, des aliquots des produits sont
décongelés dans un bain-marie et décontaminés, avant d'étre entrés sous la
hotte à flux laminaire. Ils sont ajoutés stérilement dans le DMEM/F12 liquide.
Les milieux sans antibiotique sont préparés 1 ou 2 jours avant utilisation,
afin de
pouvoir en contrôler la stérilité. II sont homogénéisés et contrôlés. Les
antibiotiques sont ajoutés extemporanément au moment de l'utilisation du
milieu.
Le contrôle bactériologique est réalisé selon les méthodes classiques. Le
stockage s'effectue typiquement entre +2°C et +8°C.
Milieu de s,~mthèse
Produits Concentrations
DMEM 1 :1
Ham F12 1 :1
SV supplment 10%
en
Fer Hyclone
Acide ascorbique1 mM
2-
phosphate
Pnicilline 100 UI/ml
Gentamicine 20 Ng/ml
Amphotricine 1 Ng/ml
B
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Milieu de différentiation
Produits Concentrations
DMEM 1 :1
Ham F12 1 :1
SV supplment 10%
en
Fer Hyclone
Acide ascorbique1 mM
2-
phosphate
(3-glycrophosphate10 mM
Dexamethasone 10 nM
Pnicilline 100 UI/ml
Gentamicine 20 Ng/ml
Amphotricine 1 Ng/ml
B
EXEMPLE 1 : Extraction et culture d'un feuillet cellulaire à partir de
cellules
prélevées sur une racine de dents
Dans cet exemple, l'extraction a été réalisée en suivant les étapes suivantes
Les tissus dentaires obtenus sont maintenus dans un milieu de transport
jusqu'à
ce qu'ils soient traités, si possible dans les 24 heures suivant la réception.
Les
tissus sont ensuite lavés 3 fois dans du PBS, en présence d'antibiotiques, de
manière à éliminer l'excès de sang. Les racines des dents sont alors placées
dans des boîtes de pétri de 60 mm de diamètre par exemple avec environ 5 ml
de collagénase A (voir le paragraphe relatif aux milieux). Les dents sont
grattées
avec un scalpel à partir de la moitié de la racine jusqu'à son extrémité
inférieure,
jusqu'à l'obtention de petits fragments de cément et de dentine. Les fragments
sont incubés une nuit à 37°C (environ entre 16 et 20 heures) dans un
incubateur
à C02. Les cellules et les fragments de tissus sont mis dans un tube,
centrifugés
et resuspendus dans du milieu de culture. La suspension de cellules et de
débris
est alors réensemencée dans la boîte de pétri d'extraction avec 4 ml de milieu
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de culture. Le milieu de culture est changé 2 ou 3 fois par semaine selon
l'état
de prolifération des cellules. La culture est maintenue entre 10 jours et 3
semaines environ avant d'être prête à être trypsinée. La boîte de pétri doit
préférentiellement présenter approximativement 50 % de confluence.
Lorsque les cellules cultivées sont pré-confluentes ou confluentes, elles sont
traitées selon les étapes suivantes
La boîte de culture est rincée avec du PBS culture, puis de la trypsine-EDTA
est
ajoutée de façon à recouvrir toute la culture (approximativement 5 ml par
75cm2).
Les flasques sont mises à l'étuve à 37°C. Selon le type de cellule ou
l'état de
confluence, le temps sera plus ou moins long, de préférence inférieur à
environ 5
minutes pour des cellules endothéliales ou des fibroblastes, et inférieur à
environ
ou 10 minutes, pour des kératinocytes. Le décollement des cellules est suivi
15 et/ou contrôlé par observations, par exemple au microscope. La suspension
cellulaire est agitée et transférée dans un tube, dont un aliquot d'environ
50N1 est
prélevé pour numération des cellules. Après centrifugation (environ 10 minutes
à
1200 tours/min), le surnageant est éliminé et une quantité de milieu de
culture
est ajoutée de façon à avoir une suspension contenant 100 000, 1 million ou 10
millions de cellules par ml selon les besoins. La suspension finale peut être
faite
à différentes concentrations selon les besoins.
EXEMPLE 2 : Production du construit
Le tissu fabriqué contient des cellules associées à un réseau tridimensionnel
dense de matrice extracellulaire néosynthétisée par ces mêmes cellules. Cette
matrice extracellulaire est produite suite à la stimulation des cellules par
l'acide
ascorbique, un dérivé synthétique de ce produit ou un nutriment agissant sur
la
synthèse de matrice extracellulaire, sans avoir recours à l'ajout de matrice
exogène.
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Ce tissu est réalisé dans des dispositifs de culture, poreux ou non, de
tailles
variées selon les dimensions désirées. Les fibroblastes sont ensemencés à une
densité comprise entre 3000 et 12000 cellules/cm2. Le milieu de culture est
changé régulièrement, par exemple 3 fois par semaine pendant 2 à 6 semaines,
5 avec ou sans agitation des cultures, de façon à maintenir des conditions
environnementales (physico-chimiques) et nutritionnelles favorables au
développement de la culture.
Les cellules impliquées dans la reconstruction du tissu peuvent provenir d'une
10 même population cellulaire ou de populations cellulaires différentes
formant ainsi
une population hétérogène. II peut s'agir de fibroblastes du ligament
parodontal,
de cémentoblastes, d'odontoblastes, d'améloblastes, de cellules pulpaires, de
fibroblastes des ligaments et tendons, de chondrocytes, d'ostéoblastes, de
cellules souches mésenchymateuses, d'extraits de moelle osseuse, de tout autre
15 type cellulaire ayant la capacité de minéraliser notamment sous l'influence
de
facteurs extérieurs ou d'un mélange desdites cellules. La présence par exemple
de cellules du type ostéoblaste ou chondroblaste ou de cellules précurseurs de
ces dernières telles que des pré-ostéoblastes ou des pré-chondroblastes ou
encore de cellules extraites de la moelle osseuse n'est néanmoins pas
20 nécessaire pour obtenir un construit selon l'invention présentant notamment
des
zones de minéralisation.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires ne présentant pas de
capacité de minéralisation, mais qui peuvent étre stimulés de manière à
25 provoquer cette minéralisation. II peut s'agir par exemple de fibroblastes
de la
peau et/ou de cellules musculaires.
Le tissu peut être composé de plusieurs types cellulaires à la fois, répartis
uniformément ou non.
La minéralisation des tissus peut être obtenue en modifiant les conditions de
culture de façon à provoquer la minéralisation de la matrice néosynthétisée.
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Cette stimulation peut être obtenue par contact avec un matériau ou des
particules de ce même matériau et/ou par l'ajout de facteurs de
différentiation,
de cytokines, de milieu conditionné, de dexamethasone, de beta-
glycérophosphate, beta-aminopropionitrile, par l'ajout de substances
synthétiques de type phosphate de calcium, carbonate de calcium,
hydroxyapatite, verre bioactif (bioactive glass), de céramiques, de substances
naturelles de type corail mais aussi par stimulation mécanique. L'obtention
d'un
construit selon l'invention présentant des zones de minéralisation ne
nécessite
pas l'ajout de facteur de croissance, tel que par exemple le TGF-~i1.
A l'issue de la culture des cellules prélevées dans l'Exemple 1, un feuillet
est
obtenu qui est récupéré par décollement. Le construit est représenté sur les
figures 1-5.
EXEMPLE 3 : Implantation d'un construit in vivo
Cet exemple décrit l'introduction in vivo d'un implant de l'invention
comprenant
un construit tissulaire.
Le construit a été préparé comme décrit dans les exemples 1 et 2 à partir de
cellules de ligament parodontal (PDL) humain, puis enroulé autour d'un implant
en bio-verre (45 S 5). Le construit a été stocké dans du milieu DMEM
additionné
d'antibiotique (gentamycine). Des souris mâles athymiques (Swiss NU/NU de 4
semaines) ont été anesthésiées. Une implantation sous-cutanée, au niveau
dorsal, a été réalisée. Pour cela, 4 poches sont préparées sur chaque souris,
en
conditions stériles. Les implants sont placés dans ces poches, qui sont
ensuite
suturées. Un pansement a été placé sur la zone suturée.
Un mois après l'implantation, les souris ont été sacrifiées, et les construits
ont
été récupérés avec le tissu adjacent d'origine murine. L'ensemble a été inclus
dans de la résine après fixation. Des coupes ont été produites et colorées au
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Paragon. Les coupes sont analysées, et les construits obtenus sont comparés à
ceux produits à partir de fibroblastes de peau, traités de façon similaire, et
à des
construits n'ayant pas subi d'implantation. Les coupes histologiques montrent
que les construits issus de PDL selon l'invention et implantés chez les souris
présentent des structures fibrillaires denses, proches de celles que l'on
trouve
dans un ligament parodontal natif. Les résultats obtenus montrent de plus que
l'ensemble de fibres est ancré à la surface de l'implant par une couche de
minéralisation épaisse, d'origine cellulaire. Ces structures tissulaires sont
absentes des autres préparations.
Ces résultats illustrent les avantages des tissus et méthodes de l'invention,
permettant la production de construits ayant des propriétés biologiques
avantageuses et compatibles avec un usage in vivo. L'insertion in vivo des
construits de l'invention permet de stimuler le recrutement de facteurs
exogènes
à la biopsie d'origine du construit, et entraine une maturation du construit
contenant des cellules biologiquement actives.
EXEMPLE 4 : Fabrication du « Ligaplant » à partir de cellules autologues
Le « Ligaplant » est un produit destiné à remplacer une dent perdue chez un
patient, il associe un ligament reconstitué à partir des cellules de ce
patient, à un
implant produit à partir d'un biomatériau. Le ligament parodontal est un
ligament,
qui est ancré sur la racine, principalement, par des céments cellulaire et
acellulaire fibrillaires. Ce ligament est aussi rattaché à l'os de l'alvéole
par une
structure fibrillaire enchâssée dans l'os (fibres de Sharpey). Le ligament est
reconstruit à la surface d'un implant, en réunissant les conditions pour qu'un
ancrage proche du cément soit synthétisé in vitro, avant la réimplantation du
produit. La restauration de l'ancrage du côté de l'alvéole se fera une fois le
produit réimplanté. La présence de cette structure tissulaire néoformée
oriente le
processus de cicatrisation, en évitant l'ostéointégration de l'implant.
L'utilisation
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des cellules du patient pour reconstruire la partie ligamentaire du Ligaplant
en
fait un produit autologue.
Une population hétérogène est extraite de la surface de la dent perdue
par grattage de la partie médiane de la racine. Cette population comprend les
principaux types cellulaires du PDL : fibroblastes, cémentoblastes, cellules
endothéliales, et progéniteurs de ces différents types cellulaires. La
présence de
ces cellules est confirmée à la fois par l'observation en microscopie optique,
mais aussi par les résultats des analyses de biologie moléculaire pratiqués
sur
cette population directement issue de la biopsie extraite de la surface
radiculaire.
La détection par RT-PCR des ARN messagers codant pour la phosphatase
alcaline, l'ostéocalcine (OCN), l'ostéopontine (OPN), la bone sialo-protéine
(BSP) et du collagène de type I, confirme à la fois cette hétérogénéité de la
population par la diversité des marqueurs cellulaires exprimés, mais aussi les
possibilités, qui existent, de reconstruction du PDL à partir de ces cellules.
Au
cours de la phase de prolifération menée pendant le procédé de fabrication du
produit, une synthèse importante de collagène de type I prouvant la présence
de
fibroblastes actifs dans la culture est constatée. Dans le même temps, la
phosphatase alcaline et des marqueurs spécifiques de cellules capables de
produire une minéralisation de la structure tissulaire (OPN, OCN, BSP)
s'expriment.
Ces activités spécifiques sont conservées tout au long du procédé et sont
exploitées pour constituer la partie tissulaire du Ligaplant.
La biopsie collectée à la surface de la racine de la dent perdue est traitée
par la collagénase, de façon à accélérer l'extraction des cellules. Une étude
réalisée par les inventeurs a montré que l'utilisation de la collagénase ne
diminue ni les capacités prolifératives des cellules ni leurs capacités à
exprimer
des fonctions spécifiques (minéralisation et production de matrice extra
cellulaire). A l'issue de la phase d'extraction, on se trouve en présence
d'une
population hétérogène de cellules à la morphologie bien marquée (cellules
rondes :cémentoblastes, cellules allongées : fibroblastes).
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La population cellulaire est d'abord amplifiée de façon à augmenter le
nombre des cellules récoltées. La prolifération des cellules est maintenue à
un
niveau élevé dans la phase exponentielle de la courbe de croissance par des
passages répétés, réalisés avant que la culture ne parvienne à confluence. Au
cours de cette phase, les conditions de culture (composition du milieu,
technique
de culture) provoquent une sélection des cellules : les cellules endothéliales
disparaissent, en effet elles ne peuvent ni adhérer au support, ni proliférer,
alors
que les fibroblastes se multiplient activement. La présence des cémentoblastes
est détectable par le niveau d'expression des marqueurs de minéralisation qui
leur sont spécifiques. La différence de morphologie des cémentoblastes, qui
permettait de les identifier sous le microscope, a disparu, tendant à prouver
que
leur forme a évolué vers une forme en fuseau similaire à celle des
fibroblastes. II
s'agit là d'un phénomène courant, constaté lors de la culture de cellules
présentes dans des structures tissulaires minéralisées, de type chondrocytes,
ostéocytes. Cependant cette dédifférenciation des cémentoblastes semble
limitée à leur morphologie. En effet, la production de zones de
minéralisation,
induite in vitro par adjonction de f3-glycérophosphate au milieu de culture,
prouve
la fonctionnalité de ces cellules.
A la fin du 3eme passage, les cellules ne sont pas décollées mais laissées
dans la boîte de pétri en présence d'un milieu de prolifération, additionné de
vitamine C pour stimuler la synthèse de matrice extra cellulaire. Un tapis
continu
se forme, après 3 semaines de culture, constitué de plusieurs couches de
cellules englobées dans une matrice extra cellulaire dense. Dés qu'un nombre,
de l'ordre de 5.105 cellules par cm2 de surface de boite de Petri, est obtenu,
la
culture est prolongée au-delà de la confluence de façon à induire une
production
importante de matrice extra cellulaire. A la fin de cette étape, la culture
s'est
structurée et prend la forme d'un feuillet épais constitué de cellules à
l'intérieur
d'une matrice extra cellulaire dense.
Ce feuillet est décollé du fond de la boîte par des moyens mécaniques
(roulage). II peut être alors manipulé, compte tenu de ses bonnes propriétés
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mécaniques. Un morceau de 15 cm2 de ce feuillet, est découpé à l'aide d'un
scalpel. II est enroulé en plusieurs couches autour de l'implant (cylindre de
5 mm
de diamètre et de 11 mm de long) et constitue la partie cellulaire du
« Ligaplant ».
5
Le futur « Ligaplant » est prét pour une phase ultime de différenciation qui
doit
permettre aux cellules de produire un ancrage minéral. Cette phase est obtenue
en cultivant ce construit dans un milieu favorable à la minéralisation pendant
2
semaines.
10 L'ancrage du feuillet sur l'implant est obtenue par synthèse d'une
minéralisation
de la MEC par les cellules, en présence d'un milieu de culture contenant 10 mM
de f3-glycérophosphate. La nature de l'interface cellules-implant guide cette
minéralisation. Les céramiques de phosphate de calcium peuvent ainsi être
utilisées pour obtenir un lien direct avec un tissu minéralisant. Les cellules
15 réagissent au contact de ce biomatériau en produisant une couche minérale
d'accroche à partir de laquelle un cément est reconstruit lorsque le produit
est
placé in vivo.
Afin de comprendre comment une telle organisation cellulaire pouvait se
20 différencier in vivo, et comment cet ancrage primaire pouvait évoluer vers
un
cément, les inventeurs ont procédé à l'implantation sous cutanée au niveau du
crane de souris nude (Swiss nu nu) de constructions feuillet -implant.
L'évolution
de ces constructions a été évaluée sous forme de cinétique, avec des points
pris
à 4, 8 et 12 semaines après implantation, en faisant varier différents
paramètres
25 telle que l'origine de la biopsie (apex, zone centrale de la racine,
collet), la nature
du matériau constituant l'implant (dentine, hydroxyapatite, titanes revêtus de
phosphate de calcium).
Les résultats les plus significatifs ont été obtenus avec un feuillet
constitué
30 de cellules extraites d'une biopsie correspondant au PDL de la partie
médiane de
la racine de la dent, appliquées sur un implant d'hydroxyapatite. Par
l'utilisation
d'immunomarquage (anticorps spécifiques de composants du tissu humain) les
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inventeurs ont pu vérifié que les constructions n'étaient pas dénaturées par
la
présence du tissu murin environnant et qu'elles préservaient leur identité
structurale spécifique d'origine. Les marquages effectués permettent
d'identifier
l'origine des tissus reconstruits après réimplantation. Les inventeurs ont pu
constater qu'il existait une limite bien identifiée entre l'implant et les
cellules
humaines qui lui sont associées et le tissu murin environnant.
L'intensité de la minéralisation de la MEC a été mesurée par des
traitements appropriés des coupes histologiques. Les résultats obtenus
montrent
une évolution progressive en fonction du temps de l'épaisseur des couches
minéralisées présentent à l'interface de l'hydroxyapatite. Au fur et à mesure
que
ce processus se développe apparaissent de façon marquée des fibres de
collagène enchâssées dans ce substrat minéral. II est possible de constater
par
endroits la présence de cellules incluses dans la partie minérale. Ces
éléments
structuraux sont présents sur toute l'interface cellules-biomatériau. Les
conclusions de cette analyse histologique montrent qu'un tissu caractéristique
du
cément cellulaire fibrillaire, avec une quantité importante de fibres de
Sharpey,
est reconstruit par les cellules du PDL et constitue un ancrage du feuillet
sur
l'implant.
L'implant étant soumis à des charges importantes, le matériau constitutif a
été sélectionné pour obtenir la bio-compatibilité optimale tout en gardant une
résistance mécanique comparable à celle des implants de type « ostéo
intégrés ». Le matériau qui a été choisi pour constituer l'implant est produit
par
bio activation du titane.
La couche d'apatite d'ancrage naturellement produite est très fine (~1 pm),
ce qui élimine le risque de rupture fragile dans la couche (71 ) et préserve
la
micro-rugosité de surface de l'implant (et donc la liaison mécanique entre les
phases métalliques et minérales). En outre et du fait du procédé chimique et
physiologique d'activation du titane, la liaison titane-apatite est une
liaison de
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type covalente résistante qui constitue une transition continue entre les 2
phases.
