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WO 2004/048581 PCT/FR2003/003447
1
METHODE D'EXPRESSION INDUCTIBLE D'ARNi DANS DES
CELLULES, LES MOLECULES D'ACIDE NUCLEIQUE POUR SA MISE EN
OUVRE ET LES CELLULES TRANSFORMEES PAR CES MOLECULES.
L'invention concerne le domaine de la biologie et plus
particulièrement la préparation d'oligonucléotides double
brin pour être utilisés dans un processus d'interférence ARN
(RNAi ou ARNi).
L'interférence ARN désigné aussi « SiRNA» ou « RNAi
ou encore co-suppression, a été mise en évidence dans les
plantes, où il a été observé que l' introduction d' un long
ARN double brin, correspondant à un gène, induit la
répression spécifique et efficace du gène ciblé. Le
mécanisme de cette interférence comporte la dégradation de
l'ARN double brin en courts duplex d'oligonucléotides de 20
à 22 nucléotides.
L'interférence ARN a maintenant été appliquée aux
mammifères pour inhiber spécifiquement des gènes pour des
applications en génétique fonctionnelle. En effet, les
siRNAs permettent d'identifier la fonction des gènes mis en
évidence par le séquençage du génome humain, soit dans des
modèles de culture cellulaire, soit dans des modèles animaux
en particulier chez la souris. L'interférence ARN est aussi
utile dans le domaine thérapeutique pour le traitement ou la
prévention de cancers, de maladies infectieuses et plus
généralement de maladies mettant en jeu un gène hétérologue
ou homologue muté (Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel,
W., Yalcin, A., Weber, K., and Tuschl, T. (2001a). Duplexes
of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured
mammalian tells. Nature 411, 494-498 ; Elbashir, S. M.,
Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., and Tuschl,
T. (2001b). Functional anatomy of siRNAs for mediating
efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.
Embo J 20, 6877-6888).
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2
Les siRNAs sont de courtes séquences d'ARN double
brin, qui peuvent être introduites sous forme
d'oligonucléotide synthétique ou sous forme de plasmide
permettant leur transcription.
La mise en oeuvre de plasmides présente de nombreux
avantages, en particulier pour les applications de génétique
fonctionnelle. Elle permet d'exprimer l'ARN double brin de
manière stable dans les cellules, et donc d'inhiber plus
facilement des protéines à longue demi-vie. En effet, les
siRNA synthétiques ont une durée de demi-vie de 3 jours dans
les cellules de mammifère. Elle permet aussi d'analyser des
effets à long terme. Par contre, elle nécessite d'établir
des lignées exprimant la construction de manière stable, ce
qui présente plusieurs inconvénients. En particulier, il
faut comparer des lignées stables entre elles, ce qui est en
général difficile d'interprétation parce que les lignées
cellulaires dérivent. D'autre part, il est impossible
d'étudier les protéines indispensables pour la cellule,
puisque leur inhibition bloquera la prolifération des
cellules et empêchera donc l'établissement de la lignée
stable. I1 est donc indispensable de pouvoir induire à
volonté l'expression du siRNA.
L'invention vise précisément à pallier ces
inconvénients en offrant un système d'expression d'un siRNA
de manière stable et inductible. Ce but est atteint grâce à
l'emploi du système CRE-lox pour l'expression d'un siRNA
dans des cellules de mammifères. L'invention a donc pour
objet une méthode d'expression d'ARNi dans des cellules
comprenant .
- l'introduction dans des cellules eucaryotes d'une
molécule d'acide nucléique comprenant les séquences sens et
antisens de l'ARNi placées sous le contrôle d'un promoteur
de transcription unique, lesdites séquences sens et antisens
étant séparées par une séquence d'ADN comprenant une
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séquence d'arrêt de ladite transcription, ladite séquence
d'ADN étant encadrée à chacune de ses extrémités par un site
lox,
- la mise en contact des sites lox avec Cre, pour
obtenir par recombinaison site-spécifique l'élimination de
la séquence d'ADN et de la séquence d'arrét de la
transcription de façon à ce que lesdites séquences sens et
antisens ne soient plus séparées que par la séquence lox
restante et ainsi permettre la transcription de l'ARNi dans
son intégralité avec la séquence lox résiduelle comme
boucle.
Selon une forme particulière de mise en oeuvre de la
méthode de l'invention, ladite molécule d'acide nucléique
comprend de 5' vers 3', comme montré à la figure 1, un
promoteur de transcription compatible avec lesdites
cellules, la séquence sens de l'ARNi, un premier site lox,
une séquence d'ADN comprenant un terminateur de
transcription, le second site lox et la séquence antisens de
l'ARNi.
Avantageusement, ladite molécule d'acide nucléique est
un plasmide. I1 peut aussi s'agir d'un rétrovirus.
Les cellules transfectées avec cette molécule d'acide
nucléique sont des cellules de mammifères. La méthode
s'applique aussi bien à la transfection de cellules en
culture que directement chez l'animal.
En effet, l'invention permet d'analyser de manière
fiable les gènes humains d'un point de vue fonctionnel, dans
des cellules en culture ou dans des animaux, en particulier
dans des souris. En effet, il existe des systèmes permettant
l'expression inductible de CRE, dans les cellules et dans
les animaux. Chez la souris, la CRE peut également être
exprimée de manière tissu spécifique, permettant
l'inactivation d'un gène spécifiquement dans ces tissus.
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4
La CRE peut être mise en contact avec les sites lox
via la transfection des cellules avec une molécule d' acide
nucléique comprenant une séquence régulatrice et le gène
cre.
La séquence d'ADN séparant les séquences sens et
antisens de l'ARNi et comprenant le terminateur de
transcription est avantageusement un gène de résistance à un
antibiotique, comme la néomycine, permettant ainsi en outre
de sélectionner les cellules transfectêes.
L'invention a également pour objet une molécule
d'acide nucléique décrite ci-dessus pour la mise en oeuvre de
la méthode d'expression inductible d'ARNi dans des cellules.
L'invention se rapporte encore à une cellule ou une
lignée de cellules transfectées par une molécule d'acide
nucléique décrite précédemment et les animaux dont des
cellules ont été transfectées par ladite molécule d'acide
nucléique. L'invention a enfin pour objet des compositions
notamment pharmaceutiques comprenant comme substance active
au moins une molécule d'acide nucléique ci-dessus ou des
cellules transformées par celle-ci éventuellement associées
dans la composition à un excipient compatible.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention
apparaîtront des exemples qui suivent et dans lesquels il
sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels .
La figure 1 représente la stratégie pour l'expression
de siRNAs de manière inductible selon l'invention.
La figure 2 et la figure 3 représentent l'induction de
l'activité de l'ARNi par la CRE.
La figure 4 représente l'inhibition du marqueur GFP
par l'ARNi.
La figure 5 représente l'inhibition du marqueur GFP
dépendante de CRE au cours de transfection en deux étapes.
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La figure 6 représente l'inhibition par l'ARNi du
marqueur GFP intégré dans une lignée cellulaire.
La figure 7 représente l'inhibition par l'ARNi du gène
endogène p53 avec établissement de lignées cellulaires
5 stables.
La figure 8 représente l'activité in vitro de l'ARNi.
EXEMPLE 1.
Le plasmide plox siRNA comporte un promoteur Pol II
contrôlant un gène de résistance à un antibiotique, la
néomycine. La cassette néomycine est entourée de sites lox.
Dans un premier temps, un promoteur Pol III (H1) a été
inséré dans le sens opposé au promoteur Pol II. Le promoteur
H1 introduit dans le plasmide derrière la deuxième région
loxp, avec les enzymes de restriction Nhe1 et Xbal est
obtenu par PCR à partir des amorces suivantes .
5' CTAGCTAGCCCATGGAATTCGAACGCTGACGTC 3' Forward (SEQ
ID NO. 1)
5' GCTCTAGAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC 3' Reverse
(SES ID NO. 2)
Ce plasmide est inspiré du plasmide pSUPER,
permettant l'expression constitutive de siRNA et décrit par
Brummelkamp et al.
Les séquences d'ADN correspondant au SiRNA sens ont
ensuite été introduites immédiatement après le promoteur H1
au niveau du site Xbal.
SiRNA sens .
5' CTAGACCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATT 3' (SEQ ID NO. 3)
SiRNA sens complémentaire .
5' CTAGAATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCGGT 3' (SEQ ID NO. 4)
Enfin, les séquences d'ADN correspondant au siRNA
anti-sens ont été introduites à la suite de la deuxième
rêgion loxp au niveau des sites Bamh1 et Kpnl.
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SiRNA anti-sens .
5'GATCCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTTTGGAAAGGTAC 3' (SEQ
ID NO. 5)
SiRNA anti-sens complémentaire:
5'CTTTCCAAAP,AAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATG 3' (SEQ ID NO.
6)
Le psiRNA lox est obtenu en insérant la totalité de la
séquence ADN du siRNA directement après le promoteur H1 au
niveau du site Xbal. Les siRNA sens et anti-sens sont
séparés par une boucle.
SiRNA:
5'CTAGTTTCCAAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTCTCTTGAAATGAAC
TTCAGGGTCAGCTTGCGGGT 3' (SEQ ID NO. 7)
SiRNA complémentaire .
5'CTAGACCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTCAAGAGAATGAACTTCAGGG
TCAGCTTGCTTTTTTGGAAA 3' (SEQ ID NO. 8)
Des cellules de mammifères COS-7 ont été transfectées
avec du polyfect (Qiagen) avec 4 ug de vecteurs d'expression
des siRNA (plox siRNA, psiRNAlox or plox) comme indiqué et
un vecteur exprimant la CRE recombinase ou le vecteur vide
correspondant (8 ug) ainsi qu'un vecteur d'expression de la
Green Fluorescent Protein ou GFP (500 ng). Soixante heures
après la transfection, un western blot a été réalisé à
partir des extraits totaux en utilisant un anticorps dirigé
contre la GFP (Santa Cruz) ou la tubuline cellulaire (Sigma)
afin d'évaluer la quantité de protéines utilisée pour ce
test (figure 2). Des cellules fibroblastes (3T3) ont été
transfectées avec 0,5 ug ou 1 ug de vecteur d'expression
plox siRNA, comme indiqué dans la figure 3, et un vecteur
exprimant la CRE recombinase ou le vecteur vide
correspondant (8 ~g) ainsi qu'un vecteur d'expression de la
GFP (500 ng). Soixante heures après la transfection, un
western blot a été réalisé à partir des extraits totaux en
utilisant un anticorps dirigê contre la GFP (Santa cruz) ou
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la tubuline cellulaire (Sigma) afin d'évaluer la quantité de
protéines utilisée pour ce test (figure 3).
En absence de CRE, les deux parties constituantes du
siRNA (brin sens et antisens) sont séparées par le gène
néomycine qui comporte une séquence d'arrêt de transcription
pour la Pol III. Dans ces conditions, seul le brin sens du
siRNA est transcrit et le siRNA est inactif . la protéine
cible est exprimée normalement comme montré à la figure 2 et
à la figure 3, Sème et gème ligne. En présence de CRE, le
plasmide subit dans la cellule un processus de
recombinaison, donnant un produit dans lequel la séquence
néomycine est éliminée, et dans lequel les deux 1l2 siRNAs
ne sont plus séparés que par la séquence lox restante, dans
laquelle il n' y a pas de séquence d' arrêt de transcription
pour la Pol III. Le siRNA est donc transcrit dans son
intégralité, avec la séquence lox résiduelle qui sert de
« boucle ». Ce siRNA est actif et la protéine cible est
inhibée (comparer les lignes 1 ou 2 avec les lignes 3 ou 4,
figures 2 et 3).
L'inhibition est bien liée à l'activité du siRNA,
puisque en présence de CRE, l'inhibition n'est observée
qu'en présence du siRNA complet, et pas en présence du
vecteur d' expression du siRNA vide ( ligne 1 ) . Son activité
est équivalente à celle d'un siRNA servant de contrôle
positif, exprimé de manière constitutive (parce que
l'intégralité de la séquence à partir de laquelle il est
transcrit est placée avant le gène néomycine).
D'autre part, l'analyse par Northern montre le
processing du précurseur et la synthèse du siRNA induite par
la CRE (Figure 4). L'ARN total des cellules COS-7 a été
extrait après 60h de transfection puis analysé par northern
blot avec une sonde marquée au 32P dirigée contre le brin
anti-sens des siRNAs produits .
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5' CTTTCCAAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATG 3' (SEQ ID NO.
9)
La figure 4 montre que 1 ~ inhibition est bien liée à
l'expression du siRNA, induite par la CRE.
EXEMPLE 2.
1) Méthodes.
Des constructions de plasmides ont été réalisées
suivant la méthode présentée dans l'exemple 1. Le vecteur
plox a été construit en insérant, dans le plasmide ploxNeo,
le promoteur Pol III (Hl) en tant qu'insert Nhel- Xba. Les
séquences correspondant' aux brins sens et anti-sens siRNA
ont été introduites comme oligonucléotides synthétiques en
utilisant de façon respective les sites de restriction Xbal
ou BamH1 et Kpn.
SiRNA sens:
5'CTAGCCCCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATT 3'(SEQ ID N0.10)
SiRNA anti-sens:
5' GATCCATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTGGTACCTAGACCC 3'(SEQ
ID N0.11)
Ce vecteur sera utilisé dans les exemples ultérieurs.
Des cellules de mammifères COS-7 ont été transfectées
en deux étapes. La première transfection a été réalisée avec
1 ~g de vecteurs d'expression des siRNA (plox siRNA,
psiRNAlox ou plox) et 2 ~g d'un vecteur exprimant la CRE
recombinase ou le vecteur vide correspondant. Vingt-quatre
heures après cette première transfection, les cellules ont
été transfectées avec 500 ng d'un vecteur d'expression CMV
d2GFP (Clontech). Un Western blot a été réalisé conformément
à l'exemple 1.
2)Résultats.
La figure 5 montre que la GFP est indétectable lors
d'une transfection en deux étapes au cours de laquelle le
siRNA a pu se former vingt-quatre heures avant la
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transfection du vecteur d'expression de la GFP.
EXEMPLE 3.
1) Méthodes.
Des cellules HeLa 1002 (lignée cellulaire dérivée des
cellules HeLa possédant un transgène intégré codant pour la
GFP inductible par la doxocycline) ont été transfectées avec
300 ng de vecteurs d' expression CMV luc ou CMV-RFP, avec 8
~,g de vecteur exprimant la CRE recombinase ou le vecteur
vide correspondant et avec 4 ~,g de vecteurs d'expression des
siRNA (plox siRNA, psiRNAlox ou plox). Soixante-douze heures
après la transfection, les cellules ont été traitées pendant
vingt-quatre à soixante-douze heures avec de la Doxocycline
(1 ~,g/ml) avant observation sous un microscope à
fluorescence Axiovert.
2) Résultats.
La figure 6 montre l'activité de siRNA sur
l'expression d'un gène marqueur GFP intégré dans le génome
de la lignée cellulaire et inductible par la doxocycline.
L'expression du marqueur est observée dans environ 30 ~ des
cellules vingt-quatre heures après induction (figure 6A) et
dans 60 % des cellules quarante-huit heures après induction
(figure 6B). Des proportions similaires sont observées dans
des cellules de contrôle de la transfection (RFP positives)
transfectées avec le vecteur vide plox (figure 6A et 6B).
Indépendamment de l'expression de la protéine CRE, aucune
expression de la protéine cible GFP n'est observée dans les
cellules transfectées avec le vecteur psiRNA lox exprimant
le siRNA de façon constitutive. En absence de CRE, parmi les
cellules transfectées avec le vecteur plox siRNA la
proportion de cellules GFP positives est d'environ 30 ô un
jour après induction et d'environ 65 ô deux jours après
induction ; mais cette proportion est inférieure à 5 ô en
présence de CRE.
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EXEMPLE 4,
1) Méthodes.
Un vecteur d'expression plox siRNA dirigé contre p53
(plox siRNA p53) a été construit selon la méthode présentée
5 dans l'exemple 2. Les séquences siRNA sens et anti-sens
utilisées sont les suivantes:
SiRNA sens:
5'GCATGAACCGGAGGCCCATT 3'(SEQ ID N0.12)
SiRNA anti-sens:
10 5'GATCCATGGGCCTCCGGTTCATGC 3'(SEQ ID N0.13)
Des cellules U20S ont été transfectées soit avec le
vecteur vide plox soit avec un vecteur d'expression plox
siRNA dirigé contre le gène p53 (plox siRNA p53). Des clones
stables sont établis grâce au marqueur de sélection
néomycine. Ces clones stables sont ensuite transfectés soit
avec un vecteur exprimant la CRE recombinase soit avec le
vecteur vide correspondant pMC, puis sélectionnés à l'aide
d'un marqueur de sélection différent (hygromycine).
L'expression de la P53 a été contrôlée quatre semaines plus
tard par Western blot.
2) Résultats.
La figure 7 montre trois exemples de clones
transfectés avec le vecteur plox siRNA p53 présentant une
inhibition de p53 dépendante de CRE. Aucune inhibition n'est
observée dans les clones ploxsiRNAp53 ayant été transfectés
avec le vecteur vide pMC, ainsi que dans les clones
transfectés de façon stable avec le vecteur vide plox. La
figure 7 montre des lignées cellulaires transfectées de
façon stable dans lesquelles un gène endogène cible est
inhibé.
EXEMPLE 5.
1) Méthodes.
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La construction MCK-nlslacZ contient la séquence
codant pour la (3-galactosidase nucléaire sous le contrôle du
promoteur de la créatine kinase de muscle. L'utilisation
d' un tel vecteur d' expression permet de marquer les noyaux
des fibres musculaires transfectées. Les autres vecteurs
d'expression utilisés sont . le vecteur d'expression de la
CRE ou le vecteur vide correspondant, le vecteur
d'expression plox, le vecteur d'expression plox siRNA.
Des souris transgéniques actine-GFP de cinq à dix
semaines (Ika~ra et al.) sont anesthésiées avec 300 ~1 de
0,05 ~ xyalazine-1,7 ô ketamine dans NaCl 0,9 %. Après
incision de la peau, 8 ~,g d'ADN contenant 3 ~,g de vecteurs
d'expression de la CRE et/ou des siRNA et 2 ~ug de MCK
nlslacZ, sont injectés dans le muscle tibialis anterior (TA)
à 1 ' aide d' une seringue de 1 ml pourvue d' une aiguille de
calibre 27. Des plaques d'électrode Caliper (Q-biogen,
France) sont immédiatement appliquées de chaque côté du
muscle et une série de huit pulsations électriques (2 Hz, 20
ms chacune) est délivrée à l'aide d'un électroporateur
standard de signal carré (ECM 830, ~-biogen). Le contact
électrique est assuré par l'application d'un gel conducteur.
Douze jours après l'injection, les muscles TA sont
disséqués et fixés au paraformaldéhyde à 4 % dans du tampon
PBS (Phosphate Buffer saline) puis incubés pendant deux -
trois heures dans du 5-bromo-4-chloro-indol-(3-galactoside
0,4 mg/ml, K3Fe(CN)6 4 mM, K4Fe(CN)6 4 mM et MgCl2 2mM, PBS
à 37°C pour la coloration lacZ. Les régions LacZ positives
sont ensuite disséquées sous microscope. Les images de
fluorescence et en contraste de phase sont obtenues à l'aide
d'un microscope confocal Zeiss (LSM510, Zeiss).
2) Résultats.
La figure 8 montre que la combinaison du plasmide
exprimant CRE et du vecteur plox siRNA GFP induit une
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diminution marquée de l'expression la GFP dans les fibres
transfectées (la flëche indique les noyaux LacZ positifs).
L' expression de CRE en présence du vecteur contrôle plox,
ainsi que la transfection du vecteur ploxsiRNA en absence de
CRE, n'affectent pas l'expression de la GFP dans les fibres
transfectées . La figure 8 montre que l' expression du siRNA
induite par la CRE peut diminuer l' expression d' un gène in
V1V0.
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hTSTAGE DE SEQUENCES
<110> Centre Natïonal de la Recherche Scientifique
<120> Méthode d'expression inductïble d'ARNi dans des cellules, les molécules
d'acide nucléique pour sa mise en oeuvre et les cellules transformées par ces
molécules
<130> 30016/PCT
<150> FR 02/14600
<151> 2002-11-21
<160> Z3
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc
feature
_
<222> (1) .. (33)
<223> Amorce sens utilise obtenir en PCR le promoteur
pour H1
<400> 1
ctagctagcc catggaattc gaacgctgacgtc 33
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (38)
<223> Amorce anti-sens pour
obtenr en PCR le promoteur
H1
<400> 2
gctctagagt ggtctcatac agaacttataagattccc 3g
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc
feature
_
<222> (1) . . (31)
<223> SiRNA sens
<400> 3
CtagaCCCJC aagCtgaCCC tgaagttcatt 31
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> SiRNA sens complmentaire
<400> 4
ctagaatgaa cttcagggtc agcttgcggt 30
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WO 2004/048581 ~ PCT/FR2003/003447
<210> 5
<211> 43
<2l2> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (43)
<223> SiRNA anti-sens
<400> 5
gatccatgaa cttcagggtc agcttgcttt tttggaaagg tac 43
<210> 6
<2l1> 35
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (35)
<223> SiRNA anti-sens complémentaire
<400> 6
ctttccaaaa aagcaagctg accctgaagt tcatg 35
<210> 7
<211> 72
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<223> SiRNA
<400> 7
ctagtttcca aaaaagcaag ctgaccctga agttcattct cttgaaatga acttcagggt 60
cagcttgcgg gt 72
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (72)
<223> SiRNA complémentaire
<400> 8
ctagacccgc aagctgaccc tgaagttcat ttcaagagaa tgaacttcag ggtcagcttg 60
cttttttgga aa 72
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . (35)
<223> Sonde marquée dirigée contre le brin anti-sens des siRNAs
<400> 9
ctttccaaaa aagcaagctg accctgaagt tcatg 35
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> unidentified
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WO 2004/048581 3 PCT/FR2003/003447
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (31)
<223> SiRNA sens
<400> 10
ctagccccgc aagctgaccc tgaagttcat t 31
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . (44)
<223> SiRNA anti-sens
<400> 1l
gatccatgaa cttcagggtc agcttgcttt tggtacctag accc 44
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1). (20)
<223> SiRNA sens
<400> 12
gcatgaaccg gaggcccatt 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> unidentified
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> SiRNA anti-sens
<400> 13
gatccatggg cctccggttc atgc 24
