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PROCEDE DE DETECTION UNIVERSELLE DE
MICROORGANISMES ET MILIEU REACTIONNEL PERMETTANT LA
MISE EN ~LJVRE DU PROCEDE.
La présente invention appartient au domaine
de la microbiologie et, en particulier, elle concerne
les procédés de détection et d'identification de
microorganismes dans les différents milieux dans
lesquels ils peuvent se trouver.
De nombreux procédés de détection des
microorganismes ont été mis au point répondant ainsi à
des besoins variés. On peut ainsi citer l'analyse
d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans
l'industrie agroalimentaire et le suivi du traitement
des eaux.
La méthode de détection idéale des
microorganismes devrait être rapide, spécifique
(absence de faux positifs), sensible et simple à mettre
en oeuvre. Elle permettrait la détection des
microorganismes vivants et morts dans des milieux
divers. Enfin, une première identification des types de
bactéries impliquées serait un atout supplémentaire.
Les méthodes de culture, sur boîte ou en
phase liquide, permettent la détection de toutes les
bactéries en phase de croissance dans la plupart des
milieux, avec une bonne sensibilité. Une seule bactérie
suffit, en théorie, pour obtenir un résultat positif
après culture et les cultures en phase liquide sont
automatisables (Aubert G et al., 1993). Cependant, le
temps nécessaire à l'obtention du résultat est parfois
très long. Ainsi la détection dans les produits
sanguins des souches de propionibacterium demande plus
de quatre jours de culture (Brecher ME. et al., 2001).
Quant aux mycobacterium, plus de vingt jours peuvent
être nécessaires à leur détection (Saitoh H. et al.,
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2000). La croissance d'une bactérie est, également,
fortement conditionnée par le choix du milieu de
culture qui peut être simple ou enrichi et qui contient
ou non des inhibiteurs d'agents antibactériens. Les
conditions de culture sont également spécifiques de la
souche à détecter. On utilisera ainsi des températures
d'incubation variées et des conditions aérobies ou
anaérobies. Avec ces méthodes, l'identification des
microorganismes doit se faire dans un deuxième temps
suivant la culture. Enfin la détection des bactéries
mortes ou non revivifiables est impossible avec ce type
de technologie.
Les procédés mettant en ouvre des techniques
de biologie moléculaire sont rapides, puisque quelques
heures d'incubation sont suffisantes pour déclarer un
échantillon positif, et sensibles avec la possibilité
de détecter moins de dix microorganismes par réaction.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
permet la détection en temps réel des contaminations
bactériennes dans un échantillon en utilisant des
sondes fluorescentes spécifiques de l'ADN cible (He Q.
et al., 2002). I1 est nécessaire de purifier cet
échantillon afin de protéger la polymérase nécessaire à
la réaction d'amplification des inhibiteurs potentiels.
On rencontre par exemple de nombreux inhibiteurs de PCR
dans le plasma (A1-Soud WA. et al., 2000). Cette étape
préalable de purification fait que le procédé de
détection de microorganismes mettant en oeuvre la PCR
n'est pas un processus d'utilisation aisée. Aussi, dans
le cas d'un échantillon ayant contenu des bactéries
phagocytées par des leucocytes, toute trace d'ADN
résiduel entraînera la positivité de l'échantillon ce
qui nuit fortement à la spécificité de la méthode.
Les techniques d'hybridation permettent la
détection universelle et/ou la détection spécifique des
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bactéries (Braun-Howland EB. et al., 1992 ; Poppert S.
et al., 2002). Comme pour la PCR, l'étape de
préparation de l'échantillon est encore une fois une
étape contraignante et limitante dans cette méthode. La
présence d'acides nucléiques résiduels est une fois
encore source de faux positifs.
La principale limitation des techniques de
biologie moléculaire réside dans le choix de l'amorce
dont la spécificité doit être suffisamment large pour
une détection générique et cependant spécifique des
microorganismes à détecter pour éviter les réactions
faussement positives. Un mélange de différentes amorces
est généralement nécessaire provoquant des contraintes
techniques.
Les méthodes de marquage immunohistochimiques
ou immunocytochimiques (enzyme linked immunosorbent
assay, ELISA) faisant appel à un anticorps dirigé
contre la paroi bactérienne sont limitées par la
spécificité de l'anticorps. En effet, â ce jour, aucun
anticorps ne permet la détection universelle des
microorganismes. Cette technique n'est utilisable que
pour des souches de bactéries précisément identifiées
(Kakinoki K. et al. , 2001 ; Guarner J. et al . , 2002) .
Elle demande également une préparation particulière des
cellules ou tissus à analyser comprenant, par exemple,
des étapes de fixation et de pénétration cellulaire de
l'échantillon faisant intervenir des solvants de type
acétone, formaldéhyde et méthanol.
Les méthodes microscopiques qui font appel à
la colorimétrie utilisant par exemple des colorants de
GRAM, ou des colorants vitaux ou des fluorochromes
permettent une identification visuelle morphologique du
type de bactérie impliquée dans la contamination (Fazii
P. et al., 2002). Cependant, elles manquent de
sensibilité et elles demandent un temps de manipulation
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êlevé ainsi qu'une croissance de plusieurs jours du
microorganisme pour permettre sa visualisation (Mirrett
S. et al., 1982).
L'utilisation de la cytométrie permet la
détection des microorganismes de façon rapide et simple
(Reynolds DT. et al., 1999 ; Okada H. et al., 2000).
Toutefois, la limitation de cette méthode
réside dans le procédé de marquage. En effet, on
utilise soit des anticorps spécifiques de la paroi de
la souche ciblée qui ne permettent pas la détection
universelle des bactéries, soit des marqueurs de l'ADN
de type agents intercalants (molécules capables de
s'insérer entre les plateaux formés par les bases
appariées d'un acide nucléique). Cette dernière option
nécessite toutefois une manipulation préalable des
bactéries visant à perméabiliser leur paroi pour
laisser pénétrer le marqueur (Marie D. et al., 1996 ;
Okada H. et al. , 2000) . I1 est notable que ces agents
sont particulièrement sensibles au milieu et ne seront
efficaces que dans des conditions strictement définies
de concentrations en ions et de pH (Marie D. et al . ,
1996) .
Pour pallier les inconvénients ci-dessus
énumérés, la Demanderesse a conçu un procédé de
détection universelle des microorganismes qui met en
oeuvre un marqueur commun à toutes les bactéries,
levures, moisissures et parasites, par exemple un
composé intercalant de l'ADN, non spécifique d'une
séquence nucléique particulière.
Ce procédé de détection peut s'appliquer à
tout fluide biologique. Au sens de la présente
invention, on entend par fluide biologique, tout
fluide, pouvant contenir un ou plusieurs
microorganismes, tels que par exemple, des milieux
ioniques, des milieux de culture, des milieux
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physiologiques, comme par exemple le sang ou ses
dérivés comme les concentrés plaquettaires ou de
globules rouges ou le plasma, et concerne ainsi des
domaines d'application divers, comme l'analyse
5 d'échantillons médicaux, le contrôle de la qualité dans
l'industrie agroalimentaire ou encore le suivi du
traitement des eaux.
Avantageusement selon l'invention, le procédé
de détection des microorganismes s'applique au sang ou
ses dérivés comme les concentrés plaquettaires ou de
globules rouges ou le plasma.
Le procédé de marquage de microorganismes
objet de la présente invention met en ouvre un milieu
réactionnel comprenant un agent de marquage, des agents
de pénétration cellulaire qui favorisent le passage
moléculaire dudit agent de marquage vers le génome des
microorganismes et ce quelle que soit la nature dudit
microorganisme. De manière tout à fait avantageuse, le
procédé de marquage de l'invention permet de conserver
intègre la structure des microorganismes, notamment des
bactéries.
Ce milieu réactionnel permet le passage de
l'agent de marquage â travers .
- la membrane cytoplasmique, à savoir la
bicouche lipidique et les protéines membranaires des
microorganismes quels qu'ils soient ;
- la paroi des bactéries Gram positif
constituée en majeure partie de peptidoglycane ou
muréine qui vient au contact de la membrane
cytoplasmique et qui est, éventuellement, recouverte
d'une couche superficielle de polysaccharides ;
- la membrane externe des bactéries Gram
négatif, qui contient beaucoup de phospholipides, de
lipoprotéines et de lipopolysaccharides, gui est
séparée de la membrane cytoplasmique par un espace
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périplasmique où l'on trouve les protéines et qui est
percée de pores. Cette paroi est imperméable à la
plupart des substances, à l'exception de celles qui
pénètrent par les pores.
Ce nouveau procédé de marquage des
microorganismes permet le marquage universel tant des
microorganismes vivants que des microorganismes morts
ou non revivifiables.
Une analyse des microorganismes ainsi marqués
est réalisable, par exemple, en fluorescence par des
méthodes microscopiques avec microscope à
épifluorescence, et/ou de cytométrie en flux et/ou de
cytométrie en phase solide.
Le procédé de l'invention comprend une
préparation originale des microorganismes à partir des
échantillons les contenant. Différents réactifs sont
utilisés pour, dans une même étape, pénétrer les
microorganismes sans altérer leur morphologie et les
marquer en fluorescence.
Le procédé de l'invention permet de conserver
intègre la structure des bactéries pour une analyse
selon des techniques de biologie cellulaire permettant
éventuellement de différencier de façon visuelle les
grandes familles de microorganismes . bacilles, coques,
spores, levures.
Ledit procédé permet à la fois la détection
et l'identification morphologique des microorganismes
sur la base de leur forme et de leur taille. Ce procédé
est applicable à la détection de microorganismes dans
différents milieux physiologiques, de culture et/ou
ioniques.
Avantageusement ledit procédé permet à la
fois la détection et l'identification morphologique des
microorganismes sur la base de leur forme et de leur
taille dans le sang ou ses dérivés tels que les
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concentrés plaquettaires ou de globules rouges ou le
plasma.
Le procédé de détection universelle des
microorganismes comporte 4 ou 5 étapes.
Les microorganismes en suspension dans de
l'eau, du tampon, du sérum physiologique, du milieu de
culture, du sang, du plasma ou des dérivés sanguins
sont mis en présence d'un milieu réactionnel unique
comprenant l'agent intercalant de l'ADN, et au moins un
réactif de pénétration cellulaire.
Par réactif de pénétration cellulaire on
entend selon la présente invention une solution
comprenant au moins le mélange d'au moins un agent
perméabilisant, un détergent, un agent chélateur d'ions
et un antiseptique.
Plus précisément, l'invention a pour objet un
procédé de détection de microorganismes éventuellement
présents dans un fluide biologique, comprenant les
étapes suivantes .
a) on prélève un échantillon dudit fluide
biologique,
b) on met en contact ledit échantillon avec
un milieu réactionnel comprenant un agent de marquage
et un réactif de pénétration cellulaire de la membrane
desdits microorganismes,
c) on filtre ledit échantillon sur un filtre
susceptible de retenir les microorganismes marqués
éventuellement présents dans ledit échantillon et
d) on détecte les microorganismes marqués et
retenus dans le filtre à l'étape (c).
De préférence, l'agent de marquage est un
composé intercalant de l'ADN, choisi parmi le groupe
comprenant . les dérivés cyanines, l'iodure de
propidium, l'acridine orange et le bromure d'éthidium.
Avantageusement, les dérivés cyanines sont choisis dans
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le groupe constitué par le Picogreen, le SYBR green et
le YOPRO1. En ce qui concerne leurs concentrations
préférées, la concentration en dérivés cyanines est
comprise entre 0,001% et 0,5% (volume/volume), de
préférence entre 0,003% et 0,05%, la concentration en
iodure de propidium, en acridine orange ou en bromure
d'éthidium est comprise entre 0,1 ug/ml et 100 }zg/ml
et, de préférence, entre 1 ug/ml et 40 ~.zg/ml.
Préférentiellement, l'agent de marquage est
du Picogreen.
Par la suite dans le texte et dans les
revendications, et sauf indication contraire dans les
exemples, on entend par concentration préférée, la
concentration du produit considéré dans le milieu
réactif final « êchantillon biologique et milieu
réactionnel (agent de marquage + réactif de pénétration
cellulaire). L'Homme du métier sait adapter sans
difficulté la concentration des différents constituants
du réactif de pénétration, par exemple dans une
solution mère concentrée.
De préfêrence, le réactif de pénétration
cellulaire des microoraanismes est une solution
comprenant au moins le mélange d'au moins un agent
permêabilisant, un détergent, un agent chélateur d'ions
et un antiseptique.
Selon l'invention, les pourcentages (en
poids) de l'agent perméabilisant, du détergent, de
l'agent chélateur d'ions et de l'antiseptique dans le
réactif final est compris entre 1.10'%/0,03/0,02%/
6.10-4~ et 2,5.10-3/0,8%/0,6%/0,015%.
L'agent perméabilisant est choisi parmi le
polyéthylène glycol (PEG), la digitonine, la monensine,
le polyéthylènimine (PEI), le sodium hexaméthaphosphate
et le chlorure de benzalkonium.
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Les concentrations préférées desdits agents
perméabilisants sont les suivantes .
- la concentration en PEG est comprise entre
0,01% et 1% et, de préférence, entre 0,05% et 0,5% ;
- la concentration en digitonine est comprise
entre 0, O1 ug/ml et 10 ~zg/ml et, de préférence, entre
0, 05 pg/ml et 5 ~.zg/ml ;
- la concentration en monensine est comprise
entre 0,1 ~.zg/ml et 5 ug/ml et, de préférence, entre 0,5
}zg/ml et 1 ug/ml ;
- la concentration en PEI est comprise entre
1 ug/ml et 400 ug/ml et, de préférence, entre 5 ~.Zg/ml
et 120 ug/ml ;
la concentration en sodium
héxamétaphosphate est comprise entre 0,005% et 1% et,
de préférence, entre 0,01% et 0,1% ;
-la concentration en chlorure de benzalkonium
est comprise entre 0,001% et 0,1% et, de préférence,
entre 0,005% et 0,05%.
Préférentiellement l'agent perméabilisant est
du polyéthylènimine (PEI).
Parmi les détergents, on préfère ceux du
groupe comprenant . le N-octyl (3 D-glucopyranoside
(NOG), la saponine, le Tween, le Triton, l'Igepal et le
CHAPS. Leurs concentrations préférées sont détaillées
ci-après .
- la concentration en saponine ou en Tween
est comprise entre 0,005% et 10%, de préférence entre
0 ,05% et 0,5% ;
- la concentration en NOG est comprise entre
0,01% et 10%, de préférence entre 0,1% et 0,5% ;
- la concentration en Triton est comprise
entre 0,0001% et 0,05%, de préférence entre 0,0008% et
0, 002 % ;
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la concentration en Igepal est comprise
entre 0,01 % et 20%, de préférence entre 1% et 5%.
Préférentiellement le détergent est le N-
octyl (3 D-glucopyranoside (NOG).
5 En tant qu'agent chélateur d'ions, on préfère
ceux du groupe comprenant l'EDTA et l'EGTA.
Avantageusement, la concentration en agent
chélateur d'ions est comprise entre 0,05% et 0,8%.
Préférentiellement l'agent chélateur d'ion
10 est l'EDTA.
Avantageusement, la concentration de l'EDTA
est comprise entre 0,1 mM et 50 mM, de préférence entre
0,2mM et 7,5 mM.
L'agent antiseptique est choisi parmi le
groupe comprenant . la bétadine, le cetrimide, l'huile
de l'arbre à thé, le terpinene-4-ol, la chlorhexidine,
la polymyxine B et la rifampicine
Préférentiellement l'agent antiseptique est
de la chlorhexidine.
Avantageusement, la concentration en
chlorhexidine est comprise entre 0,0005% et 0,5% et, de
préférence, entre 0,001% et 0,05%.
La concentration en cetrimide est comprise
entre 0,01% et 5% et, de préférence, entre 0,05% et 1%.
La concentration en bétadine est comprise
entre 0,0001% et 0,001% et, de préférence, entre
0,0005% et 0,005%.
La concentration en huile d'arbre à thé est
comprise entre 0,0001% et 0,1% et, de préférence, entre
0,0005% et 0,05%.
La concentration en terpinen-4-ol est
comprise entre 0, 05 % et 10 % et, de préférence, entre
0,5% et 5%.
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La concentration en polymixine B et en
rifampicine est comprise entre 0, 1 ~.zg/ml et 100 pg/ml
et, de préfêrence, entre 1 ug/ml et 50 ug/ml.
Le réactif de pênétration peut en outre
comprendre une enzyme ou une bactériocine.
A titre d'enzyme, on utilise de préférence le
lysozyme et, à titre de bactériocine, on utilise
préférentiellement la nisine.
Avantageusement, la concentration de lysozyme
est comprise entre 0,5 ug/ml et 200 ug/ml, de
préférence entre 0,05 ug/ml et 20 ~zg/ml et la
concentration de nisine est comprise entre 0, 005 ~.zg/ml
et 10 ~xg/ml, de préférence entre 0, 005 ~.zg/ml et 0, 05
~.zg/ml .
Afin de pénétrer efficacement la paroi
bactérienne, on peut en outre utiliser selon
l'invention des agents cryoprotecteurs comme le DMSO,
ou des ions (NaCl, KC1, MgCl2, l'hypochlorite de
sodium) ou le sucrose.
La concentration en DMSO est comprise entre
0,05 et 20~ et, de préférence, entre 0,5% et 5~.
La concentration en sucrose est comprise
entre 0,5% et 70~ et, de préférence, entre 5% et 20°s.
La concentration en hypochlorite de sodium
est comprise entre 0,001 et 5% et, de préférence,
entre 0,005% et 0,5~.
La concentration en citrate de potassium est
comprise entre 0,5 mM et 200 mM et, de préférence,
entre 5 mM et 50 mM.
Selon un mode de réalisation particulier de
l'invention, l'étape b) du procédê de détection des
microorganismes est réalisée en deux sous-étapes b') et
b").
A l'étape b') on met en contact
l'échantillon avec un milieu réactionnel comprenant un
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agent de marquage et un polymère perméabilisant choisi
parmi le polyéthylène glycol (PEG) ou le
polyéthylènimine (PEI). Préférentiellement on utilise
le polyéthylènimine (PEI).
A l'étape b" ) on ajoute au milieu
réactionnel un mélange comprenant au moins un
détergent, un agent chélateur d'ions, un antiseptique
et un autre agent perméabilisant choisi parmi, la
nisine, la digitonine, la monensine, le sodium
hexaméthaphosphate et le chlorure de benzalkonium.
Lorsque l'étape b) du procédé de l'invention
est réalisée en deux étapes b' ) et b" ) , l' enzyme est
aj outée à l' étape b" ) .
L'invention a également pour objet un milieu
réactionnel pour le marquage de microorganismes
comprenant un agent de marquage et un réactif de
pénétration cellulaire desdits microorganismes.
Préférentiellement selon l'invention, l'agent
de marquage et le réactif de pénétration compris dans
le milieu réactionnel pour le marquage de
microorganismes sont identiques, ainsi que leurs
concentrations ou la concentration de leurs composants,
â ceux précédemment décrits comme utilisés dans le
procédé de détection selon l'invention.
Un réactif de pénétration cellulaire préféré
selon l'invention comprend .
- du Picogreen au 1/22000 (Molecular Probes) ;
- du PEI à la concentration finale de 5,5 ug/ml ;
- de la Chlorhexidine diacétate à la concentration
f finale de 4 , 5 x10-' % ;
-du N Octyl glucopyranoside à la concentration
finale de 0,16 = ;
0
- de la nisine à la concentration finale de 0,018
ug/ml ;
- de l'EDTA â la concentration finale de 0,45mM ;
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- du tampon Phosphate salin (PBS), en quantité
suffisante pour le volume final désiré
La présente invention est illustrée à l'aide
des exemples de mise en a~uvre indiqués ci-dessous
accompagnés des figures en annexe dans lesquelles les
concentrations sont indiquées comme les concentrations
dans le réactif de pénétration .
- la f figure 1 montre l' influence de l' aj out
de nisine sur la détection de Staphylococcus
epidermidis et Escherichia coli. Les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie
en phase solide (figure lA) et en pourcentage de
bactéries détectées (figure 1B) par rapport à la
méthode de détection enzymatique.
- la figure 2 montre l'effet de l'EDTA
utilisé seul pour la détection de Staphylococcus
epidermidis et Escherichia soli préparês dans
différents milieux tests.
- la figure 3 illustre les résultats du test
de diffêrentes concentrations de nisine associées à
différentes concentrations d'EDTA pour améliorer la
dêtection des bactéries GRAM - (Escherichia coli). Les
résultats sont exprimés en pourcentage de détection par
rapport à la méthode de détection enzymatique.
- la figure 4 illustre les résultats du test
de différentes concentrations de nisine associées à une
concentration fixe d'EDTA à 7,5 mM pour détecter les
bactéries GRAM - (Escherichia coli et Serratia
marcescens) et les bactéries GRAM + (Staphylococcus
epidermidis). Les résultats sont exprimés en nombre de
bactéries détectées sur le filtre en cytométrie phase
solide.
- la figure 5 illustre l'influence du pH sur
la détection d'E. coli avec un marqueur fluorescent
d'ADN en présence de nisine 0.2ug/ml/EDTA 7,5mM.
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- la figure 6 montre la détection des
bactéries GRAM - Escherichia coli, Serratia marcescens,
Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, Proteus
mirabilis avec un marqueur fluorescent d'ADN en
présence de nisine 0,2ug/ml/EDTA 7,5mM â pH 4,8.
- la figure 7 montre les résultats d'un test
du N Octyl Glucopyranoside en tant que réactif de
pénétration cellulaire en association avec de la nisine
0,2 ug/ml et de l'EDTA 7,5 mM pour améliorer le
marquage de Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de
Pseudomonas aeruginosa (GRAM -). (N/E - solution de
nisine 0,2 ug/ml / EDTA 7,5 mM.
- la figure 8 montre les résultats obtenus
avec la chlorhexidine en tant que réactif de
pénétration cellulaire pour améliorer le marquage
d'Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Serratia
marcescens (souches bactériennes GRAM -) et l'effet sur
Staphylococcus epidermidis.
- la figure 9 montre le marquage ADN et la
dêtection des bactéries (P. aeruginosa) dans différents
milieux.
- la figure 10 montre le marquage ADN et
détection des bactéries en chlorhexidine et prouve
l'intérêt de l'association avec du NOG pour augmenter
le pouvoir perméabilisant et la pênétration du
marqueur. La figure l0A montre le marquage d'une
suspension de bactéries en PBS. La figure 10B montre le
marquage d'une suspension de bactéries en concentré
plaquettaire.
- la figure 11 montre l'effet de différentes
concentrations en PEI sur la détection de Serratia
marcescens avec un marqueur fluorescent de l'ADN.
- la figure 12 montre l'effet du PEI sur le
marquage DNA et la détection d'E. coli en fluorescence.
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- la figure 13 montre les résultats de
détection des bactéries S. epidermidis et E. coli en
présence d'une composition de marquage comprenant de la
nisine/EDTA/CLX/NOG/PEI dans différents milieux.
5 Le procédé de détection de microorganismes
dans l'échantillon peut s'effectuer en mettant en oeuvre
un traitement de l'échantillon en deux étapes, une
première étape de marquage/pénétration cellulaire en
ajoutant audit échantillon une composition comprenant
10 l'agent de marquage et un premier réactif de
pénétration cellulaire, suivi, après un temps
d'incubation, d'une deuxième étape dans laquelle on
ajoute une composition comprenant d'autres réactifs de
pénétration cellulaire.
15 Un tel procédé peut être mis en aeuvre, par
exemple, selon le protocole décrit ci-dessous .
Trois millilitres de l'échantillon à traiter
sont incubês pendant 40 minutes dans un millilitre
d'une premiére solution de pénétration
cellulaire/marquage (Picogreen 0,5m1/1, PEI 60mg/1,
solution de PBS). Cette étape est réalisée â
température ambiante sous agitation.
Dans la deuxième étape, on ajoute sept
millilitres d'une composition en solution permettant de
poursuivre le marquage (nisine 0,2mg/1, NOG 2,5g/1,
EDTA 1,86g/1, diacétate de chlorhexidine 50mg/1).
L'incubation se fait à température ambiante pendant 20
minutes. L'échantillon est alors filtré sur un filtre
noir, par exemple en polycarbonate ou en polyester, et
analysé avec un cytomètre en phase solide.
Le procédé de détection de microorganismes
dans l'échantillon peut aussi s'effectuer en mettant en
oeuvre un traitement de l'échantillon en une seule
étape, en ajoutant audit échantillon une composition
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comprenant l'agent de marquage et un ou plusieurs
agents de pénétration cellulaire.
Un tel procédé peut être mis en oeuvre, par
exemple, selon le protocole dêcrit ci-dessous .
Huit millilitres de l'échantillon à traiter
sont incubés pendant 60 minutes à température ambiante
avec trois millilitres d'une solution de pénêtration
cellulaire/marquage (Picogreen 0,17 ml/l, PEI 20 mg/1,
EDTA 4,34 g/1, nisine 0,47 mg/1, NOG 5,83 g/1,
diacétate de chlorhexidine 116,7 mg/1). L'échantillon
est alors filtré sur un filtre noir en polycarbonate et
analysé avec un cytomètre en phase solide.
L'ensemble de ces traitements peuvent être
rêalisés indifféremment dans un dispositif ouvert, par
exemple dans des tubes ou dans un dispositif fermé,
comme une seringue ou un dispositif pour la préparation
des plaquettes sanguines en vue d'une analyse
bactériologique (Hemosystem, ref SPK01).
DETECTION DES MICROORGANISMES.
DETERMINATION DES COMPOSITIONS OPTIMALES DU
MILIEU REACTIONNEL POUR LE MARQUAGE/PENETRATION
CELLULAIRE.
1 - Marquage en présence de nisine.
Utilisation de la nisine seule en tant que
perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent
de marquage.
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular Probe).
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
17
Solution de nisine
Préparer en eau distillée une série de
dilutions de nisine (matière première à 2,5%
poids/poids):
0,1 g de nisine dans 50 ml eau distillée -
solution 50 ug/ml
0,02 g de nisine dans 50 ml eau distillêe -
solution 10 ~.zg/ml
0, 004 g de nisine dans 50 ml eau distillée -
solution 2 ~zg/ml.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (68.21)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 104 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactérie
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de nisine
Filtration sur filtre noir 0,4 }zm de
porosité.
III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé
par cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie
en phase solide et en pourcentage de bactéries
détectées par rapport à la méthode de détection
enzymatique.
Ces rêsultats montrent l'influence de l'ajout
de nisine sur la détection de Staphylococcus
epidermidis et Escherichia coli et sont illustrés dans
les figures lA et 1B en annexe.
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
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On peut constater que l'ajout de nisine
permet d' obtenir un bon marquage des GRAM+ et que des
concentrations faibles sont préférables.
S 2 - Utilisation de l'EDTA seul en tant que
perméabilisant pour favoriser la pénétration de l'agent
de marquage.
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de EDTA
EDTA 5 mM . 0, 093g EDTA disodique, QSP 50 ml
d'eau distillée.
Suspension de Bactéries préparées en PBS, en
eau distillée, en milieu TSB (tryptone soj broth) et en
plasma.
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactéries dans les
différents milieux
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution d'EDTA
Filtration sur filtre noir 0,4 um de
porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries fluorescentes.
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
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Ces résultats montrent l'effet de l'EDTA
utilisé seul pour la détection de Staphylococcus
epidermidis et Escherichia coli préparés dans
différents milieux tests et sont illustrês dans la
figure 2 en annexe.
On peut constater que l'EDTA seul ne permet
pas un marquage correct des bactéries Gram + et Gram -.
3 - Utilisation de l'association nisine/EDTA
en tant que perméabilisant pour favoriser la
pénétration de l'agent de marquage.
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de nisine/EDTA
nisine 10 ~zg/ml . 0, 02 g de nisine (matière
première à 2.5% poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 20 mM . 0, 372 g EDTA disodique, QSP 50
ml d'eau distillée,
Préparer une gamme de EDTA avec 0 , 2 5 ; 2 , 5 ;
12, 5 et 18, 75 ml d' EDTA 20 mM (gamme de concentration
0, 1 ; 1 ; 5 et 7, 5 mM)
Ajouter 50, 250, 500 uL ou 1 ml de nisine 10
ug/ml (gamme de concentration 0,01 ; 0,05 ; 0,1 et 0,2
11g/ ml )
QSP 50 ml d'eau distillée.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
+ 3 ml de suspension de bactérie
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de nisine ou nisine/EDTA
Filtration sur filtre noir 0,4 ~.zm de
5 porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie
10 en phase solide et en pourcentage de bactéries
détectées par rapport à la méthode de détection
enzymatique.
Ces résultats montrent l'influence de l'ajout
de nisine combiné à l'EDTA sur la détection de
15 Escherichia soli et sont illustrés dans la figure 3 en
annexe.
On peut constater un effet synergique sur la
détection des bactéries lorsque le marquage est
effectué en présence du mélange nisine/EDTA. On peut
20 constater également que le pourcentage des bactéries
Escherichia coli marquées est maximal pour une
concentration de nisine à 0,1 ~Zg/ml et EDTA 7,5 mM
4 - Optimisation des concentrations de
l'association nisine/EDTA en tant que réactif de
pénétration cellulaire pour détecter les bactéries
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de nisine/EDTA
0,02 g de nisine (matière première à 2,5~
poids/poids) dans 50 ml eau distillée soit 10 ug/ml
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nisine 0,05 ug/ml/EDTA 7,5 mM . 250 ~Z1 de
nisine 10 ug/ml + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 ml
d'eau distillée,
nisine 0,1 ug/ml/EDTA 7,5 mM . 500 ul de
nisine 10 ug/ml + 0,140 g EDTA disodique, QSP 50 ml
d'eau distillée,
nisine 0,5 ug/ml/EDTA 7,5 mM . 2,5 ml de
nisine 10 ug/ml + 0,1408 EDTA disodique QSP 50 ml
d'eau.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de nisine/EDTA à
différentes concentrations
Filtration sur filtre noir 0,4 um de
porosité.
III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé
par cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries détectées en cytométrie
en phase solide Les résultats de cette expérience
montrant la détection des bactéries GRAM - (Escherichia
coli, Serratia marcescens) et GRAM + (Staphylococcus
epidermidis) en présence de différentes concentrations
de nisine associées à de l' EDTA 7, 5 mM sont illustrés
dans la figure 4 en annexe.
On peut constater que le pourcentage des
bactéries Escherichia coli marquées est maximal pour
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une concentration de nisine à 0,1 ~.zg/ml et que l'on
obtient une meilleure détection de l'ensemble de
bactéries testées lorsque l'on utilise la nisine à une
concentration de 0, 2 ~Zg/ml associée à de l' EDTA à une
concentration 7,5 mM.
5 - Influence du pH sur le marquage des
bactéries en présence de nisine/EDTA
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de nisine/EDTA
nisine 10 ~zg/ml . 0,02 g de nisine (matière
première à 2,5°s poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 20 mM . 0,3728 EDTA disodigue, QSP 50 ml
d'eau distillée,
18,75 ml EDTA 20 mM
+ 1 ml de nisine 10 ug/ml
QSP 50 ml d'eau distillée
Cette solution est à pH 4,8
Tamponner avec NaOH (1 M) jusqu'à pH 6, pH 7,
pH 8.
Suspension de Bactéries prêparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Enterobacter aerogenes (CIP 60.86T)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Proteus mirabilis (CIP 104588)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
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+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes â 22°C
+ 7 ml de solution de nisine/EDTA à
différents pH
Filtration sur filtre noir 0, 4 ~.zm de
porosité.
III Analyse et résultats
Après la filtration, le filtre est analysé
par cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries fluorescentes
détectées.
Les résultats de cette expérience montrant
l'influence du pH sur la détection d'E.coli avec un
marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2
~.zg/ml / EDTA 7,5mM sont illustrés figure 5 en annexe.
On peut constater que dans les conditions
prédéfinies, l'augmentation du pH n'améliore pas le
marquage d'Escherichia coli.
La détection des bactéries GRAM +
Staphylococcus epidermidis et GRAM - Escherichia coli,
Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes,
Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis avec un
marqueur fluorescent d'ADN en présence de nisine 0,2
ug/ml / EDTA 7,5mM à pH 4,8 est illustrée figure 6 en
annexe .
On peut constater que dans les conditions de
pH à 4,8, le marquage des bactéries GRAM(-) est
homogène d'une souche â l'autre. La détection de
Staphylococcus epidermidis GRAM(+) est plus élevée que
celle des GRAM(-).
6 - Association nisine/EDTA/N Octy1
Glucopyranoside
I Réactifs
Solution de marquage
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Prêparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de nisine/EDTA/NOG
nisine 100 ~Zg/ml . 0,2 g de nisine (matière
première à 2,5% poids/poids) QSP 50 ml eau distillée
EDTA 100 mM . 1,86g EDTA disodique, QSP 50 ml
d'eau distillée,
N Octyl glucopyranoside 5s . 2,5 g dans 50 ml
eau distillée
20, 10, 5 ou 2,5 ml NOGà 5~
+ 3,75 ml EDTA 100 mM
+ 0,1 ml de nisine 100 ug/ml
QSP 50 ml d'eau distillée
Cette solution est à pH 4.8.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les prêparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de nisine/EDTA ou
nisine/EDTA/NOG
Filtration sur filtre noir 0,4 um de
porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries fluorescentes
Les résultats de cette expérience, avec une
composition du milieu réactionnel associant du N Octyl
CA 02507079 2005-05-24
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Glucopyranoside en tant que réactif de pénétration
cellulaire des microorganismes, avec de la nisine 0,2
ugJml et de l'EDTA 7,5 mM pour améliorer le marquage de
Staphylococcus epidermidis (GRAM +) et de Pseudomonas
5 aeruginosa (GRAM -) sont illustrés figure 7 en annexe.
On peut constater que l'ajout du N Octyl
Glucopyranoside à 0.25% et à 0,5% a des effets positifs
sur le marquage de Staphylococcus epidermidis et de
Pseudomonas aeruginosa.
7 - Marquage en présence de chlarhexidine
Test mettant en oeuvre la chlorhexidine seule
en tant qu'agent perméabilisant pour favoriser la
pénétration de l'agent de marquage des bactéries.
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de chlorhexidine
Chlorhexidine diacétate 5% . 1 g dans 20 ml
eau distillée
50, 25 ou 10 ul de chlorhexidine diacétate 5
% dans 50 ml d'eau distillée pour obtenir une gamme de
concentration de 0,01% ; 0,005% ou 0,001%.
Suspension de Bactéries préparêes en PBS, en
concentrê plaquettaire et plasma autologue
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (CIP 68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
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+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de chlorhexidine à
différentes concentrations
Filtration sur filtre noir 0,4 um de
porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries fluorescentes. Le
comptage sur boîte de pétri â 48 heures tient lieu de
méthode de référence.
Les résultats de cette expérience, avec une
composition du milieu réactionnel comprenant de la
chlorhexidine en tant que réactif de pénétration
cellulaire pour améliorer le marquage d'Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa et Serratia marcescens
(souches bactériennes GRAM -) et de Staphylococcus
epidermidis sont illustrés figure 8 en annexe.
On peut constater que la concentration
optimale de chlorhexidine pour la détection des
bactéries GRAM - est de 0,005 %. Cette concentration
est cependant toxique pour les bactéries GRAM + qui
sont détruites.
On constate que la présence de plasma
antagonise l'effet de la chlorhexidine sur la
pénétration cellulaire du marqueur pour Pseudomonas
aeruginosa comme illustré figure 9. Pour un marquage
universel dans différents milieux incluant les fluides
biologiques, la chlorhexidine seule ne peut être
utilisée.
8 - Association chlorhexidine/ N-Octyl
Glucopyranoside
I Réactifs
Solution de marquage
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Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe).
Solution de chlorhexidine/N Octyl
Glucopyranoside
Chlorhexidine diacétate 5% . 1 g dans 20 ml
eau distillée
N Octyl glucopyranoside 1% . 0,5 g dans 50 ml
eau distillée
50 ou 25 ul de chlorhexidine diacétate 1
(concentration finale de 0,001% ou 0,0005%)
+ N Octyl glucopyranoside à 5% (concentration
finale = 0,25 %)
QSP 50 ml d'eau distillée.
Suspension de Bactéries préparées en PBS et
en concentré plaquettaire d'aphérèse
Escherichia coli (CIP 105901)
Staphylococcus epidermidis (68.21)
Serratia marcescens (CIP 103716)
Pseudomonas aeruginosa (CIP 76110)
Ajuster les préparations pour obtenir une
suspension à 103 bactéries /ml.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml de suspension de bactéries
Incubation 15 minutes à 22°C
+ 7 ml de solution de Chlorhexidine /NOG
Filtration sur filtre noir 0, 4 ~.zm de
porosité.
III Analyse et résultats
Aprês filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats sont
exprimés en nombre de bactéries fluorescentes.
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Les résultats de cette expérience montrant le
marquage de l'ADN et la détection des bactéries
marquées en présence d'une composition du milieu
réactionnel comprenant de la chlorhexidine en
association avec du NOG pour augmenter le pouvoir
perméabilisant et la pénétration du marqueur sont
illustrés figures l0A et lOB en annexe.
On observe que la concentration de
chlorhexidine la plus élevée permet d'obtenir le
meilleur marquage des bactêries.
9 - Marquage en présence de PEI seul
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe) et ajouter du PEI pour une
concentration finale à 40, 80, 100, 120, 140 et 160
~.zg/ml .
Suspension de Bactêries préparées en PBS
Serratia marcescens (CIP 103716)
Echantillon analysê
Dilution >1/20 de la suspension bactêrienne
dans un échantillon de concentré plaquettaire pour
obtenir une concentration finale en bactérie Serratia
marcescens de 10' /ml .
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage
+ 3 ml d'échantillon Incubation 45 minutes à
23°C
Filtration 5 um (filtres PALL 32 mm)
Incubation 20 minutes dans 7 ml de PBS
Filtration 0,4 um de porosité.
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III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysê par
cytométrie en phase solide et les résultats exprimês en
nombre de bactéries dêtectées fluorescentes.
Les résultats de cette expérience montrant
l'effet de différentes concentrations en PEI sur la
détection de Serratia marcescens avec un marqueur
fluorescent de l'ADN sont illustrés figure 11 en
annexe.
On peut constater qu'une détection optimale
des bactéries est obtenue avec une gamme de
concentrations en PEI comprise entre 40 et 100 ug/ml.
10 - Association nisine/EDTA/N Octyl
Glucopyranoside/Chlorhexidine/PEI
L'objectif de cette expérience est de
déterminer la gamme de concentration optimale en PEI
pour le marquage d'E. coli.
I Réactifs
Solution de marquage
Préparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe) et ajouter du PEI pour une
concentration finale à 100, 80 et 60 ug/ml.
Solution de chlorhexidine/N Octyl
Glucopyranoside/EDTA
500 uL de chlorhexidine diacétate à 0,5 °s
(Chlorhexidine diacétate 5x10-3 % final)
+ 1 ml ou 500 ~zL N Octyl glucopyranoside 25%
(N Octyl glucopyranoside 0,5 ou 0,25 % final)
+ 500 uL nisine 20 ug/ml (nisine 0,2 ~zg/ml
ffinal)
+ 500 uL EDTA 0,5 M (EDTA 5mM final)
QSP 50 ml PBS.
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901), ajustement de
la concentration à 104 bactéries/ml.
Echantillon analysé
5 3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de
concentré plaquettaire soit une dilution au 1/10 de la
suspension bactérienne dans un échantillon de concentré
plaquettaire pour obtenir une concentration finale en
bactérie de 105/ml.
10 II Méthode
1,2 ml de solution de marquage à 60, 80 ou
100 ~Zg/ml de PEI
+ 3 ml d'échantillon
Incubation 45 minutes à 23°C
15 Filtration 5 um (filtres PALL 32 mm)
Incubation 20 minutes dans 7 ml de solution
de pénétration cellulaire à 0,5% ou 0,25% de NOG
Filtration 0,4 um (filtres noirs Whatman
monocolorés).
20 III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en
nombre de bactéries détectées fluorescentes.
Les résultats de cette expérience montrant
25 l'effet du PEI sur le marquage DNA et la détection d'E.
coli en fluorescence sont illustrés figure 12 en
annexe.
On peut constater que la concentration de 60
ug/ml en PEI permet une pénétration optimale du
30 marqueur DNA quelle que soit la concentration en NOG.
11 - Marquage universel des bactéries dans
différents milieux
I Réactifs
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WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
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Solution de marquage
Prparer en tampon PBS (phosphate buffer
saline, pH 7,4) une solution de Picogreen au 1/2000
(Molecular probe) et ajouter du PEI pour une
concentration finale 60 ug/ml.
Solution de chlorhexidine/N Octyl
Glucosamine/EDTA/Nisine
500 ul de chlorhexidine diactate 0,5%
(Chlorhexidine diactate 5x10-3 % final)
+ 500 ul N Octyl glucopyranoside 25% (N Octyl
glucopyranoside 0,25 % final)
+ 500 ~.zl nisine 20 ug/ml (nisine 0, 2 ~xg/ml
ffinal)
+ 500 ul EDTA 0,5 M (EDTA 5mM final)
QSP 50 ml PBS.
Suspension de Bactéries préparées en PBS
Escherichia coli (CIP 105901), ajustement de
la concentration à 10' bactéries / ml
Staphylococcus epidermidis (68.21).
Échantillon analysé
Dilution 1/10 de la suspension bactérienne
dans un échantillon de fluide biologique pour obtenir
une concentration finale en bactérie de 105 /ml soit .
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml d'eau
distillée
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de PBS
3 ml de suspension bactêrienne + 27 ml de
milieu de culture (tryptone soif broth)
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de
plasma humain
3 ml de suspension bactérienne + 27 ml de
concentré plaquettaire.
II Méthode
1,2 ml de solution de marquage + 3 ml
d'échantillon
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WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
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Incubation 45 minutes à 23°C
Filtration 5 um Incubation 20 minutes dans 7
ml de solution de pénétration cellulaire.
Filtration 0,4 um de porosité.
III Analyse et résultats
Après filtration, le filtre est analysé par
cytométrie en phase solide et les résultats exprimés en
nombre de bactéries détectées fluorescentes.
Les résultats de cette expérience montrant la
détection de S. epidermidis et E. coli dans différents
milieux sont illustrés figure 13 en annexe.
La formule ainsi définie permet la détection
des bactéries GRAM+ et des bactéries GRAM- dans
différents milieux ioniques, de culture et
physiologiques. Cette détection est comparable pour les
deux types de bactêries.
CA 02507079 2005-05-24
WO 2004/050902 PCT/FR2003/003487
33
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