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PROMOTEUR DE L'ARN POLYMÉRASE I DE POULET
ET S~1~~ UTILISATI~1~~
La présente invention concerne un nouveau p~lynucléotide possédant une
activité promotrice de transcription, des vecteurs contenant ce polynucléotide
et leur
utilisation pour la transcription de séquences d'intérét, telle que pour la
production de
virus ARN non coiffé. La présente invention concerne également les cellules
h~tes,
préférablement d'origine aviaire, contenant un polynucléotide ou un vecteur de
l'invention.
La prévention de la grippe repose essentiellement sur la vaccination, qui est
fortement recommandée. Elle est par exemple prise en charge à 100 % en France
par la
. Caisse Nationale d'Assurance Maladie, chez les sujets à risques :
essentiellement les
personnes âgées de 65 ans et plus, et les sujets atteints d'affections
chroniques
(respiratoires, cardiovasculaires, rénales, ou métaboliques). L'immunité post-
vaccinale
est conférée par la production d'anticorps dirigés contre les glycoprotéines
de surface,
notamment contre fhémagglutinine (HA) mais aussi contre la neuraminidase (NA).
I- Les méthodes actuelles : production sur neuf de poule embryonné, et
inactivation
Les vaccins antigrippaux sont composés de trois souches de virus différentes,
fane de type A(H3N2), une autre de type A(H1N1) et la troisième de type B. Le
choix
des souches vaccinales est reconsidéré chaque année en fonction des données de
la
surveillance des variants en circulation, et fait l'objet d'une recommandation
émise par
fOMS vers la mi-février pour l'hémisphère nord. Les vaccins couramment
utilisés
depuis une trentaine d'années sont composés de virus multipliés sur neuf de
poule
embryonné et inactivés (Manuguerra, 2001, Repères sur les infections
bronchopulmonaires, pp. 32~-342. Edited by P. Léophonte ~ ~'. Mouton: PIL).
Pour les virus de type A, des virus réassortants à haut pouvoir de
multiplication
sur neuf embryonné et possédant les HA et les NA des variants indiqués par
f~MS sont
préparés et fournis aux producteurs industriels de vaccins. Il faut compter un
à deux
neufs embryonnés pour fabriquer une dose de vaccin trivalent. La purification
est
réalisée de manière différente selon la société de fabrication, mais en
suivant le même
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principe : le liquide allantoïque est prélevé et les virus sont inactivés par
traitement au
formaldéhyde ou à la 13-propiolactone, avant d'être purifiés par
ultracentrifugation. Ils
peuvent éventuellement étre fragmentés à l'aide de solvants de lipides et/ou
de
détergents tels que le T°v~een 80. Les virus entiers ou fragmentés sont
ensuite ajustés à la
dose habituelle de 15 ~.g de HA par dose de vaccin, pour chacune des souches.
LJne
étape de purification en présence de détergent dialysable permet de produire
un vaccin
sous-unitaire, qui ne contient plus essentiellement que les glycoprotéines
d'enveloppe
(HA et IVA) du virus. IW fait de la plus forte réactogénicité du vaccin à base
de virus
entier, ce sont surtout les vaccins fragmentés et sous-unitaires qui sont
désormais
commercialisés. Le délai nécessaire à la production et au contrôle de la
qualité du
vaccin avant sa mise sur le marché en conformité avec les normes européennes
est de
l'ordre de 6 mois.
Composés de virus inactivés, les vaccins antigrippaux sont généralement très
bien tolérés, et ne provoquent que de très faibles effets indésirables :
réactions locales
au point d'injection, réactions fébriles et céphalées dans les deux jours
suivant
l'injection. Les contre-indications de la vaccination antigrippale se limitent
aux allergies
aux protéines de foeuf, principalement l'ovalbumine, et aux allergies à des
résidus de
fabrication ou au mercuro-thiolate. En l'absence d'information sur l'effet
qu'elle peut
avoir sur le développement foetal, la vaccination antigrippale est
déconseillée chez la
femme enceinte au premier trimestre de la grossesse.
L'efficacité avec laquelle les vaccins composés de virus inactivés protègent
confire une infection grippale subséquente est difficile à évaluer, car elle
peut varier
énormément d'une saison à l'autre, en particulier en fonction du degré de
parenté
antigénique entre les virus circulants et ceux inclus dans le vaccin, et elle
dépend
également du statut immunitaire du vacciné. En France, l'amélioration de la
couverture
vaccinale entre 1979 et 1999 s'est accompagnée d'une diminution de la
mortalité liée à
la grippe (environ 20 000 morts par an en 1979, 2 500 morts par an depuis
1985), ce qui
suggéra, sans pour autant le démontrer, un impact positif de la politique
vaccinale. Par
ailleurs, la compilation de nombreuses études a permis d'estimer que la
vaccination chez
les personnes ~.gées permet de diminuer de l'ordre de 50 % le nombre de
pneumonies
virales et d'hospitalisations, et de (ordre de 70 % le nombre de cas de grippe
mortelle
(cross et al., 1995, Annals of Internal Medecine, 123, 518-527).
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II- Les perspectives d'évolution des vaccins antigrippaux
Plusieurs voies de recherche sont actuellement explorées dans le but 1)
d'améliorer l'intensité, la qualité, et la durée des réponses induites pai le
vaccin
antigrippal, et d'élargir leur spécificité ; et 2) de permettre une réponse
rapide en cas
d'émergence d'un virus de sous-type nouveau potentiellement pandémique. Les
travaux
concernant la production de vaccins vivants, d'une part, et la production de
virus
vaccinaux sur culture de cellules, d'autre part, sont résumés ci-dessous.
Parmi les autres
voies de recherche explorées, on peut citer également l'utilisation d'
adjuvants, de
vaccins sous-unitaires recombinants ou de vaccins polynucléotidiques.
- Pr oduction de vaccins vivants
Un vaccin antigrippal vivant est susceptible d'induire une immunité plus large
et
plus durable, en particulier du fait de la stimulation de l'immunité à
médiation
cellulaire, et d'être mieux accepté par la population générale, parce
qu'administré par
voie nasale et non par voie parentérale. Deux types de vaccins vivants peuvent
aujourd'hui être envisagés : les vaccins vivants atténués et les vaccins
vivants
recombinants.
Tlaccifzs vivants atténues
Les souches atténuées sont obtenues par réassortiment des souches sauvages
circulantes avec une souche donneuse atténuée par adaptation au froid, dont le
génotype
est bien caractérisé, sans toutefois que les relations entre les mutations
observées et le
phénotype (d'atténuation, d'adaptation au froid, de thermo sensibilité) ne
soient
parfaitement établies (Keitel et al., 1998, Textbook of Influenza, pp. 373-
390. Edited by
I~. G. Nicholson, R. G. Webster ~ A. J. Hay. Oxford, England: Blackwell
Science,
Ltd.).
Le procédé de production des vaccins atténués sur aeuf de poule embryonné est
analogue à celui décrit ci-dessus, l'étape d'inactivation du virus étant bien
entendu
supprimée. Les résultats d'essais clinques menés récemment par des
laboratoires
américains indiquent que des vaccins trivalents composés de souches atténuées
administrés par voie intranasale sont inoffensifs chez (adulte, les personnes
àgées et les
â0 enfants, avec comme seuls effets secondaires l'irritation de la, gorge et
un écoulement
nasal pendant les deux jours suivant la vaccination. Ils pourraient avoir une
efficacité
protectrice supérieure à celle des vaccins inactivés, du fait en particulier
de l'induction
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d'une réponse mucosale en anticorps de type IgA, mais leur potentiel de
transmission et
de réversion reste à documenter. La vaccination à (aide de virus vivants
atténués est
pratiquée à large échelle en Russie depuis plusieurs di~.ain es d'années, mais
il est
difficile d'en tirer des résultats globaux convaincants à cause d'une très
grande
dispersion des conditions employées.
Tlaccins vinants s°ec~rnbincznts
La. mise au point récente de systèmes de génétique inverse pour les virus
grippaux (Neumann et al., 2001, Virology 2~7, 243-50) permet d'envisager la
production de virus recombinants dans le génome desquels des modiâxcations
génétiques
auraient été introduites spécifiquement afin de leur conférer des propriétés
d'atténuation
et d'immunogénicité adéquates. Cette approche présenterait une sécurité accrue
(du fait
de l'absence d'agents contaminants du type de ceux pouvant être présents dans
les
prélèvements à l'origine des souches virales, et de la possibilité de
minimiser et
contrôler plus aisément les risques de réversion du virus vaccinal) et
permettrait de
répondre de manière plus spécifique à des situations épidémiques variées. Les
systèmes
de génétique inverse existant à ce jour reposent sur l'utilisation du système
de
transcription de l'ARN polymérase I humaine. Du fait de la spécificité
d'espèce étroite
de l'ARN polymérase I, leur utilisation est restreinte à des cellules
d'origine humaine ou
de primates. Ils pourraient s'appliquer à la production de virus vaccinaux
recombinants
sur culture de cellules, mais non sur neuf embryonné de poule.
- Production de virus vaccinaux sur culture de cellules
Les principaux avantages des neufs embryonnés de poule comme support de la
production de virus grippaux vaccinaux sont : i) un rendement de virus très
élevé ; et ü)
le moindre risque de contamination par des agents pathogènes pour l'homme, qui
est
tout particulièrement à prendre en compte dans la perspective de la production
de
vaccins non inactivés. La possibilité de produire des virus vaccinaux sur des
cellules
cultivées en milieu dépourvu de sérum est aussi explorée. Les industriels
~axter et
Solvay ont récennnent fait homologuer des banques de cellules dérivées des
lignées
~ero et IVIDCI~, respectivement, pour la production de virus vaccinaux. LTn
vaccin
~0 produit sur ~DCI~ et inactivé a obtenu l'autorisation de mise sur le marché
en 2001,
mais n'est pas encore commercialisé.
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Le futur verra probablement co-exister sur le marché plusieurs types de
vaccins
anti-grippaux, inactivés ou vivants, produits sur neuf embryonné de poule ou
sur cellules
en culture, parmi lesquels certains se révèleront peut-âtre particuliérement
indiqués pour
la vaccination d'une certaine catégorie de sujets, et moins indiqués pour une
autre. En
5 cas de pandémie, tous les moyens de production disponibles, sur neufs
embryonnés et
sur cellules en culture, devront âtre mobilisés.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela
sera
apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente
description
de l'invention.
La présente invention concerne un polynucléotide, des ADN recombinants
contenant ce polynucléotide et leur utilisation, préférablement pour la
production de
virus à ARN non coiffé pour fin de vaccination.
Plus spécifiquement, la présente invention a pour objet un polynucléotide
isolé
ou purifié qui comprend la séquence SEQ ID NO: 1, présentée à la figure 1, ou
un
fragment de celui-ci, et qui possède préférablement une activité promotrice de
transcription.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé ou purifié
comprenant la séquence SEQ ID NO: 2, présentée à la figure 2, ou un fragment
de celui-
ci, et possédant préférablement une activité promotrice de transcription.
L'invention concerne en outre un ADN recombinant comprenant un des
polynucléotides de l'invention ou un fragment de celui-ci ; un vecteur
comprenant un
des polynucléotides de l'invention ou un ADN recombinant ou un fragment de
ceux-ci ;
une cellule hôte et un neuf embryonné d'origine aviaire contenant un
polynucléotide
et/ou un ADN recombinant selon l'invention.
L'invention porte également sur l'utilisation d'au moins un des éléments
suivants pour la production d'une séquence d'intérêt telle que par exemple un
virus à
AIN non coiffé recombinant
- un polynucléotide selon l'invention ;
~0 - un ADN reGO111b111a11t selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
- une cellule hôte selon l'invention ; et
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- un neuf embryonné d'origine aviaire selon l'invention.
D~.ns une mise en ouvre particuliére, l'invention concerne une méthode de
production de virus non coiffés recombinants par génétique inverse,
caractérise en ce
qu'elle comprend les étapes suivantes
a) introduction dans une cellule ou dans un neuf embryonné d'origine aviaire
d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines
nécessaires à la transcription/réplication de l'AIN viral ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant
l'expression de virus recombinants ; et
c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
Dans une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose une méthode de
production de virus grippaux recombinants par génétique inverse, caractérisée
en ce
qu'elle comprend les étapes suivantes
a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule
d'au moins un vecteur comprenant un ADN recombinant selon un mode
préféré de l'invention et de vecteurs exprimant les protéines PA, PB1, PB2 et
NP d'un virus grippal ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant
l'expression de virus grippaux recombinants ; et
c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
L'invention vise une composition comprenant en outre un véhicule
pharmaceutiquement acceptable et un virus recombinant produit par une méthode
selon
la présente invention.
L'invention vise particuliérement une composition antigrippale comprenant en
outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable et un virus grippal
recombinant
produit par une méthode de production selon la présente invention.
La présente invention concerne aussi une composition thérapeutique comprenant
en outre une séquence transcrite par un polynucléotide de l'invention.
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Le clonage du promoteur de l'ARN polymérase I de poulet permet
avantageusement de mettre au point un système de génétique inverse adapté à la
production de virus vaccinaux recombinants sur ouf embryonné de poule, qui
pourrait
s'avérer particuliérement adaptée à la production de vaccins vivants.
BR~VE DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre une séquence (SEQ ID NO: 1) correspondant au fragment
AgeI-SacI de l'ADN génomique de poulet contenant le promoteur de l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 2 montre un second fragment d'ADN génomique de poulet (BsaI-
SacI) de séquence SEQ ID NO: 2 contenant le promoteur de l'ARN polymérase I de
poulet.
La Figure 3 montre le protocole utilisé pour analyser l'efficacité de
transcription
de la séquence CAT à partir des séquences dérivées du cosmide C13-18.
La Figure 4 montre les résultats de l'analyse itérative de fragments de
restriction
dérivés du fragment PacI/NotI dérivé du cosmide C13-18.
La Figure 5 montre le résultat de réactions de séquençage et d'extension
d'amorce menée en parallèle, qui mettent en évidence, au sein du fragment
AgeI/SacI,
décrit à la figure 1, le principal site d'initiation de la transcription par
l'ARN
polymérase I de poulet.
La Figure 6 est un schéma montrant les niveaux de CAT mesurés dans les
extraits cytoplasmiques de cellules transfectées avec des plasmides codant
pour des
pseudo ARN grippaux sous contrôle des promoteurs Poli humain ou de poulet (en
ng/106 cellules transfectées et à 24 h post-transfection).
L'originalité de la présente invention porte sur une séquence
polynucléotidique
qui possède préférablement une activité promotrice de transcription,
principalement
dans les cellules aviaires. Les inventeurs ont identifié cette séquence
promotrice comme
étant le promoteur de l'ARN polymérase I de poulet.
L'111ventlon ~~llCeâlle aussi l'implication de ce polynucléotide dans la
production
de séquences d'intérêts, telles que par exemple des virus grippaux
recombinants selon le
système de génétique inverse.
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1. Polynucléotide et ADN recombinant
Selon un premier aspect, (invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
comprenant la séquence SEQ ID N~: 1 présente à la figure 1 ou la séquence SE(~
~
N~: 2 présentée à la figure 2, ou un fragment de celles-ci. Préférablement, ce
polynucléotide, ou l'un de ses fragments, posséda une activité promotrice de
transcription.
Par fragments, on préféra les fragments dont la séquence comprend au moins 10,
12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 4~0, 45, 50, 60, 75 ou 100 nucléotides consécutifs
de la
séquence SE(~ ID N~: 1 ou SEQ ID N~: 2 et possédant une activité promotrice de
transcription.
Bien que le polynucléotide ou le promoteur de l'invention se caractérise
préférablement par le fait qu'il possède une activité promotrice de
transcription dans les
cellules aviaires, ce promoteur possède particulièrement la capacité de
promouvoir la
transcription dans les cellules de volaille, et encore plus particulièrement
dans les
cellules de poulet.
Par séquence nucléotidique, acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide
nucléique, polynucléotide, séquence polynucléotidique, termes qui seront
employés
indifféremment dans la présente demande, on entend désigner un enchaînement
précis
de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une
région d'un
polynucléotide, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant
correspondre aussi bien à un ADN double brin ou à un ADN simple brin. Ceci
inclut
également les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences
artificielles et tous les fragments de ceux-ci. Il va de soi que les
définitions "dérivé",
"variant" et "muté" s'appliquent également aux polynucléotides selon la
présente
invention. Tout polynucléotide qui a été modifié chimiquement, enzymatiquement
ou
métaboliquement mais qui a conservé les propriétés du polynucléotide
d'origine, c'est-à-
dire, l'activité promotrice de transcription dans les cellules aviaires, est
inclus dans la
portée de la présente invention.
Il doit êtxe compris que la présente invention ne concerne pas les séquences
nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à
l'état
naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-
dire qu'elles ont
été prélevées directement ou indirectement, par exemple par clonage,
amplification
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et/ou synthèse chimique, leur environnement ayant été au moins partiellement
modifié.
Il doit âtre compris qu'un polynucléotide qui est introduit dans un organisme
par
transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode
de
recombinaison est "isolé" méme si il est présent dans ledit organisme.
Les séquences promotrices selon l'invention possèdent préférablement une
séquence d'ADN présentant un pourcentage d'identité de plus de 70 % avec l'une
ou
l'autTe des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 décrites au~~ figures 1 et
2. Plus
particulièrement, les séquences promotrices de l'invention présentent un
pourcentage
d'identité de plus de 80 %, et encore plus préférablement de 90 °/~
avec l'une ou l'autre
des séquences SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2 décrites aux figures 1 et 2, ou un
fragment de celles-ci. Par « pourcentage d'identité », on entend un
pourcentage qui
indique le degré d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques le long
des
séquences dans leur entier. Si les séquences considérées sont de taille
différente, le
pourcentage d'identité est exprimé en fonction de la longueur totale de la
plus courte
séquence. Pour calculer le pourcentage d'identité, les deux séquences sont
superposées
de façon à maximiser le nombre de bases identiques en autorisant des
intervalles, puis le
nombre de bases identiques est divisé par le nombre total de bases de la plus
courte
séquence.
Un autre aspect de l'invention concerne un ADN recombinant comprenant un
polynucléotide tel que défini ci-dessus.
Cet ADN recombinant peut contenir, par exemple la séquence promotrice SEQ
ID NO: 1 présentée à la figure 1 ou SEQ ID NO: 2 présentée à la figure 2, ou
un dérivé
de celles-ci, dans laquelle est inséré un site de clonage, facilitant ainsi
l'utilisation de
cette séquence cornlne promoteur « portable ». Selon un mode préféré, l'ADN
recombinant de la présente invention contient en outre une séquence à
transcrire. Par
« séquence à transcrire » ou <e séquence d'intérêt », on entend une séquence
pouvant
servir de matrice pour synthétiser des molécules d'A1~N, telle des APvNv.
Préférablement, la séquence à transcrire est un ADNc de virus à A1~N non
coiffé, c'est-
à-dire que les extrémités du produit de transcription ne doivent pas contenir
de
â0 nucléotides supplémentaires. Plus préférablement, la séquence à transcrire
est un ADNc
de virus à ARN de polarité négative, tel un orthomyxovirus ou un
paramyxovirus. A
titre d'exemple, l'orthomyxovirus est un Influenza, préférablement de type A,
tandis
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que le paramyxovirus est préférablement choisi parmi le genre des Rubulavirus
(préférablement le virus des oreillons ou le virus de la maladie de
Newcastle), le genre
des Morbilivi~-us (préférablement le virdas de l~, rougeole), le genre des
Pneumovirus
(préférablement le virus respiratoire syncitial) ou le genre des
Métapneumovirus. Selon
5 un mode préféré de l'invention, l'ADN recombinant est caractérisé en ce
qu'il exprime
un ARNv d'un orthomyxovirus, tel un virus grippal et préférablement un ARNv
choisi
parmi les segments d'ARNv 1 à 8 du virus de l'influera. La e< séquence à
transcrire ~>
ou la <e séquence d'intérêt » peut également servir pour la production d'ARN
anti-sens,
c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible
(par exemple
10 un virus à ARN de polarité négative) une inhibition de la réplication ou
transcription
d'un ARN viral ou une inhibition de l'expression d'un produit protéique
correspondant.
La présente invention concerne également des vecteurs contenant des ADN
recombinants comme décrits précédemment. Ces vecteurs permettent
l'introduction et
éventuellement l'expression de la séquence à transcrire dans une cellule hôte.
Comme
exemple de vecteurs, on peut citer les vecteurs d'expression plasmidiques, les
vecteurs
viraux, les vecteurs intégratifs et les vecteurs autosomaux. Plus
particulièrement, un
vecteur selon la présente invention est le plasmide pGEM-ChPolI-C15. Ce
plasmide est
contenu dans la souche pGEM-ChPolI-C15-E.Coli 1305 déposée selon le traité de
Budapest à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM)
Institut
Pasteur 28, rue du Dr. Roux, 75724 PARIS (France) le 24 Février 2003 sous le
numéro
I-2976. Le plasmide pGEM-ChPolI-C15 est dérivé du plasmide pGEM52F+ (Promega).
Un fragment de restriction EaeI de 524 pb dérivé de la séquence codant la
chloramphénicol acétyle transférase bactérienne (CAT) a été clonée au site
NotI de
pGEM52F+. Un fragment de restriction AgeI-SacI dérivé du cosmide C13-18 a été
cloné au niveau du site EcoRI de pGEMSF+, en amont de l'insert CAT. Ce
fragment de
1260 pb contient le promoteur minimal de l'ARN polymérise I de poulet de la
présente
invention.
L'invention concerne aussi la production d'oiseaux transgéniques, exprimant
sous contrôle du promoteur Poli des ARNs conférant une résistance contre des
infections par des microorganismes pathogén es, en particulier confire les
virus grippaux
aviaires.
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2. Cellule et neuf embryonné d'origine aviaire
Selon un autre aspect, (invention concerne des cellules transformées par un
polynucléotide, et/ou par un ADN recombinant et/ou par un vecteur tel que
décrit
précédemment. Préférablement, la cellule hôte ainsi transformée est d'origine
aviaire.
Selon une variante préférée de l'invention, la cellule hôte est une cellule de
volaille, et
encore plus préférablement une cellule de poulet. Il est entendu qu'au sens de
la
présente invention les cellules hôtes transformées le sont préférablement de
manière
stable. Toutefois, il est envisageable de fournir des cellules transformées de
manière
transitoire.
Selon un aspect connexe, la présente invention concerne également des aeufs
embryonnés « transfectés » d'origine aviaire (préférablement de poule). Plus
particulièrement, les neufs embryonnés de la présente invention comprennent un
polynucléotide, et/oû un ADN recombinant et/ou un vecteur tel que décrit
précédemment.
Les procédés employés pour introduire un polynucléotide, et/ou un ADN
recombinant et/ou un vecteur tel que décrit précédemment dans une cellule hôte
ou dans
un neuf embryonné selon la présente invention reposent sur les connaissances
générales
d'une personne du métier en matière de transfection cellulaire et d'incubation
d'oeuf, et
ne seront donc pas décrits plus en détails.
3. Méthodes et procédé d'utilisation
Selon un autre aspect, l'invention concerne la production de séquences
d'intérêts
telles que par exemple de virus vaccinaux recombinants, et plus
particulièrement la
production d'un virus à ARN non coiffé recombinant. Dans un aspect
supplémentaire,
l'invention vise l'utilisation d'au moins un des éléments suivants pour la
production
d'une séquence d'intérêt, par exemple d'un virus à ARN non coiffé recombinant
- un polynucléotide selon l'invention ;
- un ADN recombinant selon l'invention ;
- un vecteur selon l'invention ;
â0 - une cellule hôte selon l'invention ; et
- un neuf embryonné d'origine aviaire selon l'invention.
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Dans un aspect connexe, la présente invention propose une méthode de
production de virus non coiffés recombinants. ZJne telle production se base
sur le
systéme de production de virus recombinants par génétique inverse tel que
décrit
précédemment. Plus particuliérement, la méthode selon la présente invention
comprend
les étapes suivantes
a) introduction dans une cellule ou dans un ouf embryonné d'origine aviaire
d'un ou de plusieurs vecteurs, ledit ou lesdits vecteurs comprenant un ADN
recombinant selon l'invention et les ADN exprimant les protéines
nécessaires à la transcription/réplication de l'A1ZN viral (comme par exemple
les protéines PA, PB 1, PB2 et NP d'un virus grippal) ;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant
l'expression de virus recombinants ; et
c) récupération des virus recombinants obtenus en b).
On comprendra qu'à l'étape a), tous les ADN (ADN recombinant selon
l'invention et les ÄDN exprimant les protéines nécessaires à la
transcription/réplication
de l'ARN viral) peuvent être portés par un seul vecteur ou par deux vecteurs
ou plus.
Selon une mise en oeuvre préférée, la présente invention propose également une
méthode de production de virus grippaux recombinants, laquelle comprend les
étapes
suivantes
a) introduction dans une cellule aviaire ou dans un neuf embryonné de poule
d' au moins un vecteur comprenant préférentiellement un ADN recombinant
exprimant un ARNv d'un virus grippal et de vecteurs exprimant les protéines
PA, PB1, PB2 et NP d'un virus grippal tel l'influenza, préférablement de
typeA;
b) application à la cellule ou à l'oeuf obtenu en a) de conditions permettant
l'expression de virus grippaux recombinants ; et
c) récupération des virus grippaux recombinants obtenus en b).
On comprendra que l'étape c) des méthodes de l'invention, soit la récupération
des virus recombinants, peut avoir lieu directement sur les cellules, après
lyse cellulaire,
~0 ou bien à partir du surnageant. Dans le cas oû des veufs embryonnés sont
utilisés, une
personne versée dans le domaine saura les méthodes à utiliser afin de
récupérer les virus
recombinants ainsi produits.
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4. Compositions
La présente invention porte également sur l'utilisation de ces polynucléotides
et
~hT recornbinants et/ou vecteurs les contenant pour la préparation de
composition
pour fins de vaccination. Plus spécifiquement, une composition selon la
présente
invention comprend en outre une séquence transcrite par un polynucléotide
précédemment décrit. Selon une mise en oruvre préférée, la présente invention
porte sur
l'utilisation de virus recombinants pour la préparation de compositions
vaccinales.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition de la présente invention
contient, en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et un virus
recombinant
obtenu grâce à une méthode de production de la présente invention.
Les compositions selon la présente invention peuvent se présenter sous une
forme solide ou liquide quelconque habituelle pour (administration
pharmaceutique,
c'est-à-dire par exemple des formes d'administration liquide, en gel, ou tout
autre
support permettant par exemple la libération contrôlée. Parmi les compositions
utilisables, on peut citer notamment les compositions injectables plus
particulièrement
destinées aux injections dans la circulation sanguine chez (humain.
Une personne versée dans le domaine saura préparer des compositions
pharmaceutiquement acceptables et déterminer, en fonction de plusieurs
facteurs, le
mode d'administration privilégié et 1a quantité devant être administrée. Parmi
les
facteurs pouvant influencer ses choix fon retrouve: la nature exacte des
ingrédients,
actifs ou non, entrant dans la composition, le type de maladie virale, la
condition, (âge
et le poids du patient, etc.
Les exemples ci-après permettront de mettre en évidence d'autres
caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLES
Les exemples qui suivent servent à illustrer (étendue de (utilisation de la
présente invention et non à limiter sa portée. Des modii~cations et variations
peuvent y
être effectues sans que fon échappe à l'esprit et à la portée de (invention.
Bien que l'on
â0 puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équivalents à ceux que fon
retrouve ci-
dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les
méthodes préférés
sont décrits.
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Les systèmes de génétique inverse utilisés afin d'obtenir des virus grippaux
recombinants à partir d'ADNc clonés reposent tous sur la transfection de
plasmides
codant pour le.s AIT viraux (A~Nv) sous le contr~le du promoteur de l'UT
polymérase I humaine (Neumann et al., PNAS 96:9345-50, 1999 ; Fodor et al., J.
5jirol.
73:9679-82, 1999 ; Hoffman et al., PNAS 97:6108-13, 2000). L'utilisation de ce
promoteur se justifie par le fait que les extrémités du produit de
transcription ne doivent
pas contenir de nucléotides supplémentaires (si c'est le cas, les signaux de
transcription/réplication localisés au niveau des extrémités 5' et 3' non
codantes des
Al~Nv ne sont plus fonctionnels).
L'utilisation du promoteur de l'ARN polymérase I humaine assure l'initiation
de
la transcription à un site très précis, et donc l'exactitude de l'extrémité 5'
des ARNv
synthétisés dans les cellules transfectées. Mais ce type de système ne peut
être appliqué
que sur des cellules d'origine humaine ou simienne, du fait de la très étroite
spécificité
d'espèce des promoteurs des ARN polymérase I (Heix and Grummt, Curr. Op. Gent.
Dev. 5:652-56, 1995).
Or, disposer d'un système de génétique inverse applicable sur des cellules
aviaires pourrait ouvrir la voie à la production de vaccins grippaux
recombinants sur des
Tufs de poule embryonnés, seul support actuellement autorisé pour la
production du
vaccin grippal aux Etats-Unis. La vaccination constitue à ce jour l'unique
moyen de
prévention contre la grippe, et elle est fortement reconunandée chez certaines
catégories
de sujets à risque. La fabrication du vaccin repose sur la multiplication de
souches
vaccinales sur neufs embryonnés, et nécessite, à chaque réactualisation de la
composition vaccinale, de sélectionner des virus réassortants possédant les
segments
HA et NA représentatifs des souches circulantes, les autres segments dérivant
d'une
souche donneuse adaptée à la croissance sur neuf. Il pourrait étre avantageux
de
remplacer ce processus long et aléatoire par la production de virus
réassortants par
génétique inverse sur neuf embryonné.
Ainsi, dans la perspective de mettre au point un système de production de
virus
grippaux recombinants par génétique inverse sur cellules aviaires, les
inventeurs ont
entrepris de cloner le promoteur de l'A1~N polynérase I de poulet. Un clonage
par PCI~
basé sur les homologies entre séquences nucléotidiques des promoteurs Poli
clonés à ce
jour n'était pas envisageable, car les systèmes de transcription PoII sont
extrémement
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divergents d'une espèce à l'autre. Ils ont donc procédé à un criblage de tout
ou partie du
génome de poulet.
~b~t~~atn~xn du ~o~de C~~3-~~
La cartographie du génome du poulet indiquait que les gènes codant les ARN
5 ribosomaux (locus NOR) étaient situés sur le chromosome 16, à proximité du
locus des
gènes du complexe d'histocompatibilité (Schmid et al., Cytogenet. Cell Genet.,
90:169
218, 2000). Le laboratoire du Pr. H. Auffray, dont une partie des travaux à
(Institut
Gustave Roussy de Villejuif portent sur le complexe majeur
d'histocompatibilité, a
publié en 1988 des données concernant un cosmide recombinant (C13-18)
contenant
10 30kb d'ADN génomique de poulet, parmi lesquelles les gènes du complexe
majeur
d'histocompatibilité, mais aussi plusieurs unités de transcription du locus
NOR, et par
conséquent au moins un exemplaire du promoteur Poli (Guillemot et al., EMBO
J.,
7:2775-85, 1988). Ce cosmide a été aimablement fourni par R. Zoorob.
2) Analyse du cosmide C13-18 par Southern blot
15 Le cosmide C13-18 a été analysé par Southern blot après digestion par les
enzymes de restriction NotI, PacI, et SfiI, isolément ou en combinaison, et en
utilisant
comme sonde des oligonucléotides choisis sur la base des données de séquençage
partiel
des ARN ribosomaux de poulet disponibles dans les banques
oligonucléotide 28S/+/2 : 5'-GAGTCAGCCCTCGACACAAGCTTTTG-3' (SEQ ID
NO: 3) ;
oligonucléotide 18S/-/1.5 : 5'-CTACTGGCAGGATCAACCAGGT-3' (SEQ ID NO:
4) ; et
oligonucléotide 18S/-/4 : 5'-TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC-3' (SEQ ID NO:
5).
Cette analyse a permis de reconstituer une carte de restriction grossière du
cosmide C13-18, et de positionner les ARN ribosomaux 18S et 28S par rapport
aux
divers sites de restriction localisés sur le cosmide. Elle a débouché sur
l'identification
d'un fragment PacI-NotI de 16 kb environ, correspondant à la majeure partie
d'une
région intergénique, et par conséquent très susceptible de contenir une copie
de la
â0 séquence du promoteur Poli.
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3) Clonage du fragment de restriction PacI-NotI dans un vecteur
'~rapp~rteur9~, et mise en évidence de la présence d9un promoteur
trarn~c~ripti~n~ael a~n seiaa du fragnae~at I~'acTl-I'Jotl
Afin dc tester la présence dc la séquence du promoteur PoII au sein du
fragment
de restriction PacI-NotI, les inventeurs ont cherché à cloner ec dernier en
amont d'une
séquence rapporteur.
Dans ce but, le cosmide pTCF (Grosvcld ct al., 192, Nucleic Acids Res., 10,
6715-32), qui possède un unique site de clonage Sali, a été modifié, par
insertion d'une
séquence synthétique contenant des sites dc clonages multiples (StuI-PacI-NotI-
PmeI)
au niveau du site SaII.
Le fragment PacI-NotI de 16 kb dérivé de C13-1~ a été cloné dans le cosmide
pTCF modifié, au niveau des sites PacI et NotI nouvellément introduits. Deux
clones de
cosmides recombinants pTCF-(PacI-NotI) ont été sélectionnés (n° 2.5 et
2.7). Puis un
fragment de restriction EaeI de SOOpb, dérivé du gène bactérien de la
chloramphénicol
acétyle transférase (CAT) a été cloné au niveau du site NotI des cosmides pTCF-
(PacI-
NotI), dans l'une et l'autre orientation. Quatre clones de cosmides
recombinants ont été
sélectionnés : n° 2.5.3 et n° 2.7.13 (CAT en orientation +),
n° 2.5.4 et n° 2.7.16 (CAT
en orientation -).
Afin de tester la présence de la séquence du promoteur PoII au sein du
fragment
de restriction PacI-NotI, des cellules de la lignée QT6 (fibrosarcome de
caille) ont été
transfectées avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(+) et pTCF-(PacI-NotI)-
CAT(-).
Les ARNs ont été extraits des cellules 24 heures après transfection à l'aide
du réactif
"TriZol" (Gibco-BRL) et traités à la DNase (RNase-free DNase, Ambion) afin
d'éliminer les molécules de cosmide contaminant les préparations d'ARN. Les
ARNs
ont été déposés sur une membrane de nylon (Hybond N+, Amersham) à raison de 5
~,g
par point, et hybridés avec une ribosonde marquée au 32P, correspondant à la
séquence
CAT(+). Des signaux positifs ont été obtenus avec les ARNs préparés à partir
des
cellules transfcctécs avec les cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n°
2.5.4 ct 2.7.16,
suggérant la présence d'un promoteur transcriptionnel dans le fragment de
restriction
PacI-NotI. Dans ces premières expériences, lc rapport signal/Uruit de fond
était
néanmoins assez faible. Il a été amélioré dans les expériences suivantes après
optimisation des conditions de traitement des ARNs à la DNase (durant 2 fois 1
heure à
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37°C en présence de 8 unités d'enzyme) et des conditions d'hybridation
et de lavage des
membranes (hybridation durant la nuit à 65°C dans un tampon formamide
50 ~/o, SSC
5~, Denhart 5~, SDS 0,5 ~/~ 9 2 lavages de 10 mn à température ambiante dans
un
tampon SSC '?~, SDS 0,1 °f~, suivis de 2 lavages de 10 nm à 65°C
dans un tampon SSC
0,2~, SDS 0,1 °/~). La méthodologie, qui a été appliquée ensuite de
maniére itérative
pour examiner la présence d'un promoteur transcriptionnel dans des fragments
de
restriction dérivés du fragment PacI-NotI, est récapitulée à la figure 3. Les
résultats
obtenus sont détaillés ci-dessous, et récapitulés à la figure 4~.
4) ~réatnon de délétions partielles au ~cin du fragment dc restriction Pacl-
l~otl
cloné dans le vecteur r apporteur, et mise en évidence de la présence d'un
promoteur transcriptionnel dans un fragment SfiI-NotI d'environ 6 kb
Afin d'identifier plus précisément la région du fragment PacI-NotI contenant
le
promoteur, des délétions partielles du fragment PacI-NotI ont été obtenues par
digestion
des cosmides pTCF-(PacI-NotI)-CAT(-) n° 2.7.16 et pTCF-(PacI-Notl)-
CAT(+)
n° 2.7.13 avec les combinaisons d'enzymes PacI-SfiI ou SfiI-NotI (le
site SfiI étant
situé au sein du fragment PacI-NotI), remplissage des extrémités à l'aide de
la sous-
unité I~leenow de l'ADN Poli d'E. Coli, et religation des molécules obtenues
sur elles-
mêmes. La présence d'un promoteur transcriptionnel au sein des cosmides
délétés a été
testée en utilisant la méthodologie décrite ci-dessus (transfection de
cellules QT6 et
analyse des ARN extraits des cellules transfectées par hybridation avec une
sonde
CAT). Les résultats obtenus ont suggéré qu'un promoteur transcriptionnel était
présent
dans les cosmides ayant retenu la portion SfiI-NotI (de 6 kb environ) du
fragment PacI-
NotI.
5) Analyse itérative de fragments de restriction dérivés du fragment Siii-
NotI,
et mise en évidence de la présence d'un promoteur transcriptionnel dans un
fragment AgeI-SacI de 1200 pb
A cette étape, et afin de poursuivre l'analyse de fragments de restriction
dérivés
du fragment SfiI-NotI selon la même méthodologie, un nouveau vecteur
rapporteur a été
construit. En effet, les fragments de restriction analysés avaient désormais
une taille
â0 suffisamment réduite pour pouvoir étre clou és dans un plasmide.
Ce nouveau vecteur rapporteur a été construit à partir du plasmide pGEM-5-zf+
(Promega), dans lequel le fragment EaeI de SOOpb dérivé du gène bactérien CAT
a été
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cloné en orientation (+) au niveau du site unique NotI. Seule cette
orientation de la
séquence CAT dans le vecteur rapporteur a été utilisée, car les expériences
précédentes
avaient indiqué que le couple séquence rapporteur CAT (+) / ribosonde C.AT (-)
donnait
des résultats plus spécifiques et reproductibles que le couple séquence
rapporteur CAT
(-) / ribosonde CAT (+).
Les fragments de restriction SfiI-SacI (dans la pratique, un fragment StuI-
SacI
incluant le fragment SfxI-SacI) et SacI-NotI dérivés du fragment SfiI-NotI ont
été sous-
clonés au niveau du site EcoRV du vecteur pGEM-CAT(+) (clone n° 9),
situé en amont
de la séquence rapporteur CAT. Par la méthodologie décrite ci-dessus, la
présence d'un
promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment StuI-SacI,
cloné
dans le plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (clone n° 12).
Uné carte de restriction du fragment StuI-SacI, reposant sur des digestions du
plasmide pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) n° 12 avec les enzymes de restriction
SmaI et
AgeI, a été établie. Deux fragments de restriction SmaI-SmaI, un fragment de
restriction
AgeI-AgeI, et le fragment StuI-SacI délété de ce fragment de restriction AgeI-
AgeI, ont
été sous-clonés dans le vecteur pGEM-CAT(+) n° 9 au niveau du site
EcoRV. La
présence d'un promoteur transcriptionnel a été mise en évidence dans le
fragment StuI-
SacI délété du fragment AgeI-AgeI, cloné dans le plasmide appelé par commodité
V12-
AgeI (clone n° 29).
Le fragment StuI-SacI délété a été découpé en deux fragments StuI-AgeI et
AgeI-SacI, obtenus par digestion du plasmide V12-AgeI n° 29 par les
enzymes de
restriction NcoI + AgeI d'une part (pour le fragment StuI-AgeI), et AgeI +
NotI d'autre
part (pour le fragment AgeI-SacI). Chacun des deux fragments a été sous-cloné
dans le
vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site EcoRV. La présence d'un promoteur
transcriptionnel a été mise en évidence dans le fragment AgeI-SacI de 1200 pb,
cloné
dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (clone n° 15).
6) Séquen~agc clu fr~grtmnt Agef-Sac~~ et eléte~aninati~n du p~int
d9inntiati0n
de lai t~an~~rilati~xa ~pa~ Ia tcehniquc d~e~~ten~i~n ci'aa~r~~g~c
Le fragment AgeI-SacI cloné dans le plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°
15 a été
séquencé. La séquence est représentée ~ la figure 1 (SES ID N~: 1).
Les 800 pb distales de cette séquence contiennent 8 répétitions d'une séquence
d'environ 90 nucléotides, ce qui est caractéristique des promoteurs Poli : en
effet la
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présence de séquences activatrices répétées en amont du site d'initiation de
la
transcription a été décrite pour plusieurs promoteurs Poli dérivés d'autres
espèces (Paule
M., 1995, Promoter Structure of Class I Genes. In
Tr°~!rrs~f°~~a~~~gT ~f IZâb~s~yrcc~l I~I~~1
CBe~es by E~cl~;~ray~ti~ ~~1 h~lyrazef~czse l: Edited by I~1. R. Paule:
Springer-élerlag and
IZ.G. Landes Company).
Le site précis de l'initiation de la transcription du promoteur PoII de poulet
a
donc été recherché dans les 400 pb proximales du fragment AgeI-SacI, par la
technique
d'extension d'amorce. Un oligonucléotide complémentaire de la séquence CAT
transcrite à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (séquence SEQ ID N~: 6
5'-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG-3') a été marqué avec du 32P à son extrémité
5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4 (Biolabs) et utilisé dans
deux
réactions en parallèle : 1) comme amorce pour l'extension d'un ADN
complémentaire
des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le plasmide pGEM-(AgeI-
SacI)-CAT(+) n° 15, en présence de transcriptase inverse (SuperScript
II, Invitrogen), et
2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+)
n° 15, à
l'aide du kit « T7 Sequencing I~it » (Pharmacie Biotech). Un produit de
transcription
unique a été détecté dans la réaction d'extension d'amorce, confirmant
l'existence d'un
site très précis d'initiation de la transcription. Ce dernier a été localisé
dans une région
riche en A et T, en accord avec les données disponibles pour les promoteurs
PoII dérivés
d'autres espèces, située à environ 200 pb de l'oligonucléotide utilisé comme
amorce.
En parallèle, l'analyse de fragments de restriction dérivés du fragment AgeI-
SacI
a été poursuivie afin de délimiter le promoteur minimal (qui correspond à une
région de
l'ordre de 250 pb pour les promoteurs Poli d'autres espèces) (voir figure 5).
Le
fragment AgeI-SacI a été découpé en trois fragments AgeI-BsaI, BsaI-BsaI et
BsaI-
SacI, obtenus par digestion du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) n° 15
par les
enzymes de restriction NcoI + BsaI d'une part (pour les fragment AgeI-BsaI et
BsaI-
BsaI), et BsaI + NotI d'autre part (pour le frag~.nent BsaI-SacI). Chacun des
deux
fragments a été sous-cloné dans le vecteur pGEM-CAT(+) au niveau du site
EcoIZéj.
Seul le fragment BsaI-SacI d'environ 600 pb (figure 2), cloné dans le plasmide
pGEM-
(BsaI-SacI)-CAT(+) (clone n° 16), permet la transcription de la
séquence rapporteur
CAT, ce qui est parfaitement cohérent avec le fait qu'il s'agit du fragment
proximal
dans lequel a été localisé le site d'initiation de la transcription.
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Le nucléotide +1 au site d'initiation de la transcription a été déterminé par
la
technique d'extension d'amorce, en utilisant un oligonucléotide situé à une
cinquantaine
de paires de bases en aval de la région d'initiation (voir figure 5). Cet
oligonucléotide de
séquence SEQ ID NO: 7 (5'-GGCCGGTCAACCCTGCTC-3') a été marqué avec du
5 32P à son extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase du phage T4
(Biolabs) et
utilisé dans deux réactions en paralléle : 1) comme amorce pour l'extension
d'un ADN
complémentaire des ARN CAT extraits de cellules QT6 transfectées avec le
plasmide
pGEIVI-(AgeI-SacI)-CAT(+) n°15, en présence de transcriptase inverse
(SuperScript II,
Invitrogen), et 2) comme amorce pour le séquençage du plasmide pGEIVI-(AgeI-
SacI)-
10 CAT(+) n° 15, à l'aide du kit « T7 Sequencing Kit » (Pharmacie
Biotech). Un produit
de transcription majoritaire a été détecté, correspondant à un site
d'initiation qui
possède un environnement nucléotidique caractéristique (nucléotides soulignés
ci-
dessous) de la séquence consensus établie d'après les séquence de promoteurs
Poli
d'autres espèces
15 +1
TTATATGTTCGTC T G T* A G G A G C G A G T G A G* G* ACTCGGCT (SEQ
ID NO: 8).
Il faut noter cependant que trois autres types de produits de transcription,
minoritaires, ont été détectés dans cette expérience d'extension d'amorce,
correspondant
20 à une initiation aux nucléotides -1, +13 et +14 (nucléotides marqués par
une étoile ci-
dessus).
Des plasmides destinés à exprimer un ARN pseudo-grippal porteur de la
séquence du gène rapporteur CAT sous contrôle du promoteur PoII de poulet ont
été
construits sur le modèle du plasmide pPolI-CAT-Rz conçu par Pleschka et al. à
l'aide
du promoteur PoII humain (1996, J. Virol., 70:4188-92) : ces plasmides (pPR7-
C16-
CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz) contiennent les séquences codant pour le gène CAT,
clonées en anti-sens, et flanquées des séquences 5' et 3' non codantes
dérivées du
segment génomique NS d'un virus grippal humain de type A ; le positionnement
de
l'extrémité 5' non codante exactement en aval du nucléotide -1 du promoteur
Poli de
~0 poulet, d'une part, et l'insertion de la séquence ribo~yme du virus de
(hépatite b à
(extrémité 3' non codante, d'autre part, sont destinés à assurer l'exactitude
des
extrémités du produit de transcription. Le plasmide pPR7-C16-CAT-Rz contient
les nt -
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1 à - 425 du promoteur Poli de poulet, alors que le plasmide pPR7-~C16-CAT-Rz
ne
contient que les rat - 1 à - 246 (pour d'autres espéces, la taille du
promoteur PoII
minimal a été estimée à 250 rat environ).
Les plasmides pPolI-CAT-R~ (promoteur Poli humain), pPR7-C16-CAT-R~ ou
pPR7-~C16-CAT-R~ (promoteur Poli aviaire) ont été transfectés dans des
cellules
aviaires QT6 ou dans les cellules de primate C~S-1, simultanément avec des
plasmides
codant pour les protéines PE 1, PE2, PA et NP d'un virus grippal. Si les
cellules
transfectées expriment des ARN pseudo-grippaux corrects au niveau des
extrémités 5'
et 3' non codantes, et simultanément les protéines PE 1, PE2, PA et NP, les
ARN
pseudo-grippaux peuvent être transcrits et répliqués, et l'efficacité du
processus de
transcription/réplication peut être estimée par la mesure du niveau de
protéine CAT
dans les cellules transfectées. Les niveaux de protéine CAT ont donc été
mesurés par
ELISA dans les extraits cytoplasmiques des cellules transfectées, préparés à
24 heures
post-transfection.
Les niveaux de CAT mesurés en présence du plasmide pPolI-CAT-Rz étaient de
l'ordre de 200ng/106 cellules transfectées lorsqu'il s'agissait de cellules
C~S-1, alors
qu'ils étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules transfectées) lorsqu'il
s'agissait de
cellules QT6 (figure 6).
A l'inverse, les niveaux de CAT mesurés en présence des plasmides pPR7-C16-
CAT-Rz et pPR7-~C16-CAT-Rz étaient très faibles (<0,06ng/106 cellules
transfectées)
dans les cellules COS-1, mais ils étaient de l'ordre de 200 et 100ng/106
cellules,
respectivement, dans les cellules QT6 (figure 6).
Ces résultats établissent que les séquences du promoteur PoII de poulet
clonées
dans les plasmides pPR7-C16-CAT-Rz et pPR7-OC16-CAT-Rz permettent, après
transfection dans des cellules d'origine aviaire, la transcription ifa vivo de
mirai-réplicons
comportant les signaux de réplication d'un virus grippal de type A. Ils
ouvrent donc la
voie au développement de systémes de génétique inverse permettant d'obtenir
des virus
grippaux recombinants sur des cellules aviaires en culture, ou directement sur
o~ufs
embryonnés de poule.
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1
LISTE DE SÉQUENCES
<110> INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
UNIVERSITÉ DE PARIS 7
<120> PROMOTEUR DE L'ARN POLYMERASE I DE POULET ET SON UTILISATION
<130> D21975
<150> CA 2 421 086
<151> 2003-02-28
<160> 8
<170> Patentln version 3.2
<210> 1
<211> 1261
<212> ADN
<213> Gallus gallus
<220>
<223> Séquence promotrice de l'ARN polymerase I de poulet
<400>
1
ccggtggtcccggccccgtccgactcggtcgcttcgcggaggtggctggaggtcgctgcc60
gtggcggctggggcacggcggaacggtctaaccggctccggcgggccccgtccgcctcgg120
tcgctgctcggcggctgctaggggtcgctgccggggtggctggggcacggcggaacggtc180
tacccgggtccggcgggcgccgtccggctcggtcgctccgcggaggaggctaggggtcgc240
tgccggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggccccgtccgcc300
tcggtcgctccgcgccggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcgg360
aacggtctacccggctccgacgggcgccgtccggctcggtagctccgcggcggcggctag420
aggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccggcgggcgcc480
gtccggctcggtctctccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacg540
gcggaacggtctacccgggtccgacgggcgccgtccggctcggtctctccgcggcggcgg600
ctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacccggctccgacggg660
ccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgccggggcgtctcgga720
aacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcggcggcggctagag780
gtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggtttcggattgtcttgg840
ccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagaggcgtcgctgtaat900
tttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagccgctgccggtagt960
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agtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagcagggttgaccggc1080
cggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgggcatcggttcgtt1140
cgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcagctctgtcctgggc1200
taaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcgatcactagtgcggc1260
c 1261
<210> 2
<211> 674
<212> ADN
<213> Gallus gallus
<220>
<223> Séquence promotrice de 1°ARDI polymerase I de poulet
<400> 2
CA 02517375 2005-08-26
WO 2004/078912 ~ PCT/FR2004/000460
tccgcggcggcggctagaggtcgctgccgtgtcggctcggaaacggcggaacggtctacc60
cggctccgacgggccccgtccggctcggtcgctccgcggcggcggctaggggtcgctgcc120
ggggcgtctcggaaacggcggaacggtctacccgggtgctaccgactcgcgctctccgcg180
gcggcggctagaggtcgctgccggggcggcttgcgatccgcgtccaggtctacccggttt240
cggattgtcttggccgctctggctgtgggggggggcgctacagctccggagctgccagag300
gcgtcgctgtaattttgtacctccagttacgtcgaggtaaacctcggctgccgtcggagc360
cgctgccggtagtcggcgcctatggggctagaacgtttttttcggatgccttatatgttc420
gtctgtaggagcgagtgaggactcggctccggtagtggcggtgagcgggcgctcgcgagc480
agggttgaccggccggccgcctagagaggggatcggcggcggcggcggcggctttctcgg540
gcatcggttcgttcgatcggtccggtcgcttcggtttgtccgtcgctcctcatcccgcag600
ctctgtcctgggctaaggcggttttgcaggcgagcagcgaaaaaaagccggagaaggcga660
tcactagtgcggcc 674
<210> 3
<211> 26
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet
<400> 3
gagtcagccc tcgacacaag cttttg 26
<210> 4
<211> 22
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN ribosomal de poulet
<400> 4
ctactggcag gatcaaccag gt , 22
<210> 5
<211> 24
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> 0ligonucléotide dérivé d'ARN rilaosomal de poulet
<400> 5
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<210> 6
<211> 23
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> 0ligonucléotide complémentaire de la séquence CAT transcrite
à partir du plasmide pGEM-(AgeI-SacI)-OAT(+)
<400> 6
CA 02517375 2005-08-26
WO 2004/078912 3 PCT/FR2004/000460
atgttcttta cgatgcgatt ggg 23
<210> 7
<211> 18
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Amorce dérivée du promoteur de l'ARN pol~rmérase I de poulet
<400> 7
ggccggtcaa ccctgctc 18
<210> 8
<211> 38
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Oligonucléotide dérivé d'un produit de transcription
correspondant à un site ,d'initiation du promoteur de
l'ARN polymérase I de poulet
<400> 8
ttatatgttc gtctgtagga gcgagtgagg actcggct 38
