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GENES FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII DU PSORIASIS
La présente invention a pour objet l'utilisation des sondes relatives aux
gènes
FANCC, DAD1 GRIfVll9 et HI~DHII pour la caractérisation d'un échantillon
biologique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de ces sondes pour
l'identification
d'un composé destiné au traitement du psoriasis, un procédé d'identification
ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
Le psoriasis est une pathologie dermatologique fréquente qui touche de 3 à 5%
de la population européenne. Le psoriasis est couramment associé à d'autres
pathologies, telles que l'hypertension, l'arthrite, ou encore le SIDA (Farber
EM,
Nall L, In Roenigk HH, Maibach HI (Eds.): Psoriasis Third Édition, Revised and
Expanded (1998), chapitre 9:107-157; Duvic M., J Invest Dermatol (1990
Nov);95(5):38S-40S).
Sur la base de l'âge d'apparition des symptômes et de l'association avec
certains gènes du complexe majeur d'histocompatibilité de type I (CMH I), le
psoriasis a été classé en deux sous-types appelés I et II (Henseler T,
Christophers E, In Roenigk HH, Maibach HI (Eds.): Psoriasis Third Édition,
Revised and Expanded (1998), chapitre 10:159-166). Des études ont
également montré que 30 à 50% des patients atteints de psoriasis ont un
antécédent familial chez un des parents du 1e~ ou 2e degré. Ces observations
ont permis de suggérer que le psoriasis est une maladie génétique avec une
composante autoimmune (Bos, Br. J. Dermatol. (1988) 118:141; Baadsgaard et
al., J. Invest. Dermatol. (1990) 95:328).
Les principales composantes physiopathologiques du psoriasis incluent une
hyperprolifération associée à une différenciation anormale des kératinocytes
de
l'épiderme, une inflammation caractérisée par un infiltrat inflammatoire
(principalement de lymphocytes T helpers activés) au niveau du derme et de
l'épiderme et par le relargage de cytokines pro-inflammatoires, et enfin une
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vascularisation anormale du derme (Krueger JG, J Am Acad Dermatol (2002
Jan);46(1 ):1-23; quiz 23-6).
L'implication du processus inflammatoire dans la physiopathologie du psoriasis
est soutenue par le mécanisme d'action de certains agents ayant un effet
thérapeutique bénéfique pour la maladie. Par exemple, la cyclosporine utilisée
dans le traitement des formes sévères de psoriasis, exerce un effet inhibiteur
sur la synthèse de l'interleuleine-~, cytohine promouvant la prolifération des
lymphocytes T et la sécrëtion des cytoleines inflammatoires par ces cellules.
Par
1o conséquent, les modulateurs de l'inflammation permettent de limiter la
composante inflammatoire caractérisant en partie le psoriasis.
Cliniquement, le psoriasis se définit par une hyperplasie de l'épiderme, ainsi
que par une desquamation, un érythème et une inflammation cutanés.
Les méthodes actuellement disponibles pour le traitement incluent la thérapie
topique, la photothérapie, la photo-chimiothérapie et la thérapie systémique,
réservée aux formes plus sévères de la maladie. Néanmoins, ces thérapies
offrent uniquement des périodes de rémission aux patients, mais la pathologie
resurgit généralement après l'arrêt du traitement.
2o Les glucocorticoïdes administrés par voie topique sont le plus généralement
prescrits dans te traitement initial du psoriasis, et exercent des effets anti-
inflammatoires, antimitotiques et antipruritiques bénéfiques.
Le goudron brut de charban est un mélange complexe de milliers de composés
d'hydrocarbure. Son effet thérapeutique est lié à l'inhibition d'enzymes et à
des
propriétés antimitotiques. Bien qu'efficace, ce traitement est, de par son
odeur,
désagréable à utiliser pour le patient et peut induire des cancers cutanés.
La photothérapie et photo-chimiothérapie basées sur l'administration du
methoxsalen, principe actif photosensibilisant, sont seulement temporairement
efficaces. Le traitement doit être répété et offre une thérapie palliative,
mais non
3o curative. De plus, ces traitements ont des effets secondaires à long terme,
notamment des altérations immunologiques et un risque accru de
carcinogenèse.
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Le methotrexate est l'agent cytotoxique systémique le plus généralement
administré pour les formes sévères de psoriasis s'étendant sur une surface
importante du corps. Les contre-indications de ce traitement sont nombreuses
et !'errât du traitement peut s'accompagner d'une aggravation des sympt~mes.
L'hydroxyurée, i'etretinate, la cyclosporine, et l'AZT sont également les
médicaments systémiques utilisés pour lutter contre le psoriasis mais tous ont
des effets secondaires sérieux.
A ce jour, aucun traitement ne permet une rémission durable de cette
l0 pathologie sans engendrer des effets secondaires importants, car le
psoriasis
est une pathologie complexe d'origine multifactorielle. La compréhension du
mécanisme physiopathologique conduisant au phénotype psoriasique demeure
donc un défi important dans le traitement médical dermatologique. En effet,
beaucoup d'aspects de la maladie restent à élucider, comme par exemple la
réponse hétérogène à certains traitemenfis, de patients présentant des signes
cliniques semblables.
L'apoptose, est un phénomène de mort cellulaire (dëcrit entre autres par KERR
J.F.R. et al., J. Cancer (1972), 2&5, 239) qui est une forme hautement
sélective de
suicide cellulaire. Elle se caractérise par des phénomènes morphologiques et
biochimiques aisément observables. Ainsi, on observe une condensation de la
chromatine associée ou non à une activité endonucléasique, la formation de
corps
apoptotiques et une fragmentation de l'acide désoxyribonucléique (ADN) du fait
de
l'activation d'endonucléases, en fragments d'ADN de 180-200 paires de base
donnant un profrl facilement reconnaissable par électrophorèse sur gel
d'agarose.
L'apoptose est impliquée dans le développement, la différenciation et le
renouveNement tissulaire.
Au vu des connaissances du processus physiologique d'apoptose cellulaire,
rien ne permet à l'homme du métier de déduire une quelconque implication de
celle-ci dans le dérèglement physiologique menant au phénotype psoriasique.
L'analyse de l'expression génique dans la peau de patients psoriasiques
constitue une voie pour mieux comprendre le mécanisme physiopathologique
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de cette maladie (Bowcock AM, Shannon W, Du F, et al., Hum Mol Genet
(2001); 10(17):1793-805 ; Oestreicher JL, Walters IB, Kikuchi T, et al.,
Pharmacogenomics J (2001 ); 1 (4):272-8 7 ).
La technologie des filtres à R~DI~c (ee arrays ») (NGuyen C, Rocha D,
Granjeaud
S, et al., Genomics (1995)) est une des technologies permettant d'analyser
simultanément et rapidement l'expression de plusieurs centaines d'ARNm à
partir d'une biopsie cutanée prélevée cher le patient, par opposition à
d'autres
technologies plus lourdes à mettre en osuvre, comme le SAGE (e< Serial
Analysis of Gene Expression ») (Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler
l0 KW, Science (1995 Oct) 20;270(5235):484-7), ou le Differential Display
(Liang
P, Pardee AB, Science (1992); 257: 967-971; Zhang L, et al., Science (1997);
276: 1268-1272).
La Demanderesse a mis en évidence de nouveaux gènes marqueurs du
psoriasis.
La présente invention a pour objet des sondes relatives aux gènes FANCC,
DAD1, GRIM19 et HADHII pour la caractérisation d'un échantillon biologique, et
également un nouvel outil de caractérisation d'un composé destiné au
traitement du psoriasis, ainsi qu'un nouvel outil de recherche.
30
En particulier, l'invention se rapporte à l'utilisation d'au moins une sonde
polynucléotidique relative, respectivement, au gène FANCC, DAD1, GRIM19 et
HADHII ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant
complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout
ou partie, respectivement, du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1 ),
DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 ), GRIM19 (n° d'accession
NM 015965.3),
ou HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ) comme outil de recherche du
psoriasis.
L'utilisafiion d'au moins une sonde polynucléotidique selon l'invention permet
notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du
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niveau d'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi FANCC, DAD1,
GRIM19 et HADHII.
Selon la présente invention, un échantillon biologique correspond à tout
5 prélèvement ou échantillon d'organisme vivant, de préférence un mammifère,
en particulier un organisme humain, en quantité suffisanfie pour être
caractérisé.
~n peut citer comme échantillon biologique, à titre d'exemple non limitatif,
un
échanfiillon de peau, de cuir chevelu, de muqueuse, ou cellulaire.
1o Selon la présente invention, la caractérisation d'un échantillon biologique
consiste à mesurer le niveau d'expression d'un gène d'intérêt, c'est à dire
plus
précisément la quantité d'ARN messager ou de protéine correspondante à ce
gène qui est présente dans l'échantillon biologique.
Par sonde polynucléotidique, on entend un oligo- ou polynucléotide simple ou
double brin, d'ARN, ou ADN, dont la séquence est complémentaire d'une
séquence cible correspondant à une partie ou à la totalité dudit gène et
pouvant
aller de 10 à classiquement 500 paires de bases et dont la séquence est
complémentaire avec la séquence cible à au moins 80% et préférentiellement
2o d'au moins 90% (pourcentage de bases d'acide nucléiques appariées entre
deux séquences, voir les méthodes de calcul proposées par Atschul et al. J.
Molec. Biol. (1990), 215:403).
Les sondes polynucléotidiques pourront également présenter un squelette
modifié lui conférant, par exemple, une meilleure stabilité.
Par exemple, les liaisons phosphodiesters des brins d'ARN naturels peuvent
être modifiées pour inclure au moins un atome d'azote ou de soufre.
Par ailleurs, les sondes polynucléotidiques pourront être modifiées de telle
sorte
que leurs liaisons phosphodiesters sont remplacées par des séquences de
3o type peptidique (peptide nucleic acids).
De plus, les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent comprendre
des bases autres que les 4 bases classiques.
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Les sondes polynucléotidiques selon l'invention peuvent être synthétisées
selon
de nombreuses méthodes de synthése in vivo ou in vitro de façon manuelle ou
automatique.
Les méthodes de synthèse in vifro peuvent être chimiques ou enzymatiques.
Par exemple, une sonde d'ARNc simple brin peut-âtre obtenue par transcription
in vifro d'un modéle de séquence d'ADN d'intérêt servant de matrice, en
faisant
intervenir une ARN polymérase (à titre d'exemple la T3, T7 ou SP6 ARN
1o polymérase).
Une sonde d'ADNc simple brin peut-âtre générée par transcription inverse d'un
ARNm d'intérét en présence d'une reverse transcriptase (par exemple la M-
MLV (Moloney Murine Leukemia Virus) Reverse Transcriptase isolée
d'Escherichia coli).
De nombreuses méthodes de synthèse in vivo d'ARN double brin sont décrites
dans la littérature, elles peuvent être réalisées dans divers types
cellulaires de
bactéries ou d'organismes supérieurs On pourra également se référer aux
méthodes de synthèses décrites dans les demandes de brevet W001i36646 et
W001i75164. Ces ARN double brin peuvent âtre ensuite dénaturés pour servir
de polynucléotide simple brin.
Concernant son environnement, la sonde polynucléotidique peut être ou faire
partie d'un plasmide, d'un génome viral ou d'un autre type de vecteur. Elle
peut,
dans d'autres cas, faire partie du génome d'une cellule, ou bien d'une cellule
génétiquement modifiée pour comporter cette sonde dans son génome. Ii peut
s'agir aussi d'une molécule isolée.
Concernant les régions encadrant cette sonde, elle est de préférence sous le
contr~le de séquences régulatrices. Si la sonde est insérée dans un vecteur,
ledit vecteur comprend de préférence toutes les séquences nécessaires â la
transcription et éventuellement la traduction de la sonde. Cette sonde peut
aussi être entourée par des régions flanquantes permettant une étape de
recombinaison homologue avec un autre fragment polynucléotidique,
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conduisant éventuellement â l'insertion de la sonde de l'invention dans l'ADN
génomique d'une cellule cible.
L'invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde
polypeptidique relative au produit d'expression d'un gène choisi parmi FANCC,
DAD1, GRIM19 et HADHII comme outil de recherche du psoriasis.
L'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique selon l'invention permet
notamment la caractérisation d'un échantillon biologique par la mesure du
1o niveau d'expression du gène FANCC efilou DAD1 etlou GRIM19 et/ou HADHII.
Par sonde polypeptidique relative au produit d'expression du gène FANCC,
DAD1, GRIM19 ou HADHII, on entend un anticorps monoclonal ou polyclonal
spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression,
respectivement, du gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII, ou contre un
fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un
poiypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage. Ledit
anticorps peut être obtenu selon les procédés connus de l'homme de l'art
(Catty
D (Ed) : Antibodies, A Practical Approach, Volume I (1989), chapitres 2, 3 et
4 ;
ou encore Harlow E. et Lane D. Antibodies, A laboratory Manual (1988),
chapitres 6 et 7.) en utilisant ladite protéine sauvage ou ledit polypeptide
homologue.
II pourra, par exemple, s'agir d'anticorps mono- ou polyclonal, ou de leur
fragment biologiquement actif capable de reconnaître la protéine codée par le
gène d'intérêt. Ces anticorps pourront être marqués, par exemple immuno-
conjugués à des enzymes ou marqués à l'aide de composés fluorescents, de la
biotine ou encore radiomarqués.
3o Par polypeptides homologues, on entend des polypeptides dont les séquences
en acides aminés présentent au minimum 80%, et préférentiellement 90°/~
d'acides aminés en commun avec la protéine sauvage codée par le gène
d'intérêt.
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Par polypeptide variant, on entend désigner un polypeptide muté ou
correspondanfi à un polymorphisme pouvant exister, notamment chez l'âtre
humain et pouvant présenter une troncature, une substitution, une délétion
et/ou une addition d'au moins un acide aminé par rapport à la séquence du
polypeptide sauvage normal.
Par polypeptide modifié, on entend désigner un polypeptide obtenu par
recombinaison génétique ou par synthèse chimique, présentant une
1o modification par rapport à la séquence sauvage normale. Ces modifications
pourront notamment porter sur les domaines pré-, pro- ou mature des
polypeptides, sur les acides aminés à l'origine d'une spécificité de spectre
ou
d'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de
la
charge ou de l'hydrophobicité, et de la capacité de multimérisation et
d'insertion
membranaire des polypeptides. On pourra ainsi créer des polypeptides
d'activité équivalente, plus étroite ou plus large. Les modifications pourront
aussi porter sur les séquences impliquées dans la maturation, le transport et
l'adressage des polypeptides.
2o Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide, on entend désigner un
fragment polypeptidique ayant conservé au moins une activité du polypeptide
dont il est issu.
Une étude comparative de l'expression génique dans la peau psoriasique par
rapport à la peau saine, a permis à la Demanderesse d'identifier quatre gènes,
dénommés FANCC (Fanconi anemia, complementation group C), référence
Genbank (NCBI): NM 000136.1, DAD1 (Defender against cell death 1 )
référence Genbank (NCBI): NM 001344.1, GRIM19 (Gens associated with
retinoid-interferon-induced mortality 19) référence Genbank (NCBI):
NM 015965.3 efi HADHII (Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase, type II)
référence Genbank (NCBI): NM 004493.1, dont l'activité transcriptionnelle est
induite dans la peau malade.
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Ces gènes sont impliqués dans la régulation de l'apoptose et en partie
également dans la régulation de la prolifération cellulaire.
FANCC régule l'apoptose cellulaire induite par l'interféron gamma (Pang ~, et
al. EMBO J (2001 Aug) 15;20(16):4478-89; Rathbun RK et al. Blond (2000 Dec)
15; 96(13):4204-11 Comment in: Blond. (2002 Apr) 1;99(7):2627=8; discussion
2629-30) et le TNF alpha (Pang Q, et al. EMBO J (2001 Aug) 15; 20(16):4478-
89), qui Boni deux cytokines dont l'expression est augmentée dans le psoriasïs
(Chodorowska G. J Eur Acad Dermatol Venereol (1998 Mar) 10(2):147-51;
1o Uyemura K, Yamamura M, Fivenson DF et al. J lnvest Dermatol (1993 Nov)
101(5):701-5). FANCC régule également l'apoptose induite par un stress
oxydatif ou certains xenobiotiques en modulant l'activitë de la gluthatione-S-
transferase P1 (GSTP1 ), responsable de la détoxification de ces agents pro-
apoptotiques (Cumming RC et al. Nat Med (2001 Jul) 7(7):814-20 Comment in:
Nat Med. (2001 Dec) 7(12):1259-60; Pagano G. Carcinogenesis (2000 May)
21 (5):1067-8). Or, le stress oxydatif a été décrit comme un des facteurs
étiologiques potentiels du psoriasis avec notamment une augmentation de
l'activité anti-oxydante dans la maladie (Shilov VN, Sergienko VI. Bull Exp
Biol
Med (2000 Apr) 129(4):309-13). FANCC pourrait donc jouer un rôle dans le
mécanisme impliquant le stress oxydatif dans la maladie.
De plus, FANCC joue un rôle dans la prolifération cellulaire (Nadler JJ, Braun
RE. Genesïs (2000 Jul) 27(3):117-23; Haneline LS, Gobbett TA, Ramani R et
al. Blond (1999 Jul) 1;94(1):1-8).
DAD1 joue un rôle dans l'apoptose (Hong NA et al. Dev Biol (2000 Apr)
1;220(1 ):76-84; Nakashima T et al. Mol Cell Biol (1993 Oct) 13(10):6367-74),
et
module la prolifération des lymphocytes T (Hong NA et al. J Immunol (1999
Aug) 15;163(4):1888-93), qui sont des cellules importantes dans la
physiopathologie du psoriasis (I~rueger JG, J Am Acad ~erma~~I (2002 Jan)
46(1 ):1-23; quiz 23-6).
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GRIM19 est un modulateur de l'apoptose induite par l'interféron-beta et
l'acide
rétinoïque (Angell JE, Lindner DJ, Shâpiro PS et al. J Biol Chem (2000 Oct)
2~;2i5(43):33416-26).
5 HADHII, hydroxyacyl-CoA dehydrogenase de type II, fait partie de la famille
des
short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) (Oppermann UC, Salim S et al.
FERS Letfi (1999 May) 28;451 (3):238-42). HADHII est également impliquée
dans l'apoptose et la proliférafiion cellulaire. En effefi, HADHII lie le
pepfiide
amyloide A-beta, qui exerce des effefis régulateurs sur l'apoptose. De plus,
10 l'amyloide A-befia semble moduler la prolifération cellulaire, puisque son
expression est associée à un étafi sénescent des cellules (Adler MJ., Coronel
C., Shelton E. Proc Natl Acad Sci U S A (1991 Jan) 1;88(1):16-20).
En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins
une
sonde polynucléotidique relative au gëne FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII
telle que définié ci-dessus pour diagnostiquer le psoriasis ou une
prédisposition
au psoriasis par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène
FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII.
2o La présente invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une
sonde polynucléotidique relative au gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII
telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé destiné au
traitement du psoriasis.
Dans un premier mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde
polynucléotidique relative au gène FANCC est un fragment de 10 à 500 paires
de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %,
d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEC,i. ID. n°2
ou
avec la sonde ADNc double brin de séquence SECS. ID. n°3 ou eues la
sonde
ARN de séquence SEQ. ID. n°4.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier de l'invenfiion, la sonde
polynucléotidique relative au gène DAD1 est un fragment de 10 à 500 paires de
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bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %,
d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou
avec la sonde ADNc double brin de séquence SECS. ID. n°~ ou avec la
sonde
~4F~N de séquence SEQ. !D. n°8.
s
Dans un troisième mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde
polynucléotidique relative au gène GRIN119 est un fragment de 10 à 500 paires
de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90
°/~,
d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SEQD. ID. n°10
ou
l0 avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la
sonde
ARN de séquence SEQ. ID. n°12.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde
polynucléotidique relative eu gène HADHII est un fragment de 10 à 500 paires
15 de bases représentant au moins 80 %, et préférentiellement au moins 90 %,
d'homologie avec la sonde ADNc simple brin de séquence SED. ID. n°14 ou
avec la sonde ADNc double brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la
sonde
ARN de séquence SEQ. ID. n°16.
2o Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la sonde
polynucléotidique
selon l'invention sera utilisée dans le procédé décrit ci-dessous.
L'invention se rapporte ainsi à un procédé d'identification d'un composé
destiné
au traitement du psoriasis comprenant les étapes suivantes
2s a) préparation d'au moins deux d'échantillons biologiques ;
b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à
tester ;
c) mesure de la quantité d'ARN messager correspondant au gène FANCC
et/ou DAD1 et/ou GRIM19 et/ou HADHII dans les échantillons
3o biologiques à l'aide d'au moins une sonde polynucléotidique, ladite
sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant
complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible
correspondant à tout ou partie, respectivement, du gène FANCC (n°
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d'accession NM 000136.1 ) et/ou DAD1 (n° d'accession NM 001344.1 )
etlou GRIM19 (n° d'accession NM 015965,3) et/ou HADHII (N°
d'accession NM 004493.1 ) ;
d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de la
transcription des ARN messagers du gène FANCC etlou DAD1 etlou
GRIM19 etlou HADHII ou de l'expression des protéines correspondantes
esfi mesurée dans l'échantillon traité de l'étape b).
~n entend par modulation de la transcription d'un gène ou de l'expression des
1o protéines correspondantes, une augmentation ou une diminution de la
quantité
d'ARN messagers ou de la protéine correspondant audit gène dans un
échantillon testé.
En particulier, l'étape c) du procédé pourra étre mise en oeuvre avec
- une sonde polynuciéotidique relative au gène FANCC qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment
de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADNc
3o simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°12 ;
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- une sonde polynucléotidique relatïve eu gène HADHII qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEG. ID. n°1~. ou avec la sonde R~DI~c double
brin de séquence SECS. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
Selon le mode de réalisatïon donné dans l'exemple 1, la mesure de l'expression
du ou des gènes FANCG etlou DAD1 et/ou GRiMl9 et/ou HADHII dans un
l0 échantillon biologique peut être réalisée en utilisant la technologie des
filtres à
ADNc (« arrays ») sur support nylon, selon laquelle les ARNm extraits de
l'échantillon biologique sont transcrits en ADNc simple brin radiomarqués qui
sont ensuite déposés sur des flitres à ADNc.
Selon un autre made de réalisation possible, les ARNm totaux extraits de
l'échantillon biologique testé peuvent être analysés selon l'une des méthodes
de détection connues de l'homme de l'art (Sambrook et al. : Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, Volume I (1989) Second Edition, chapitre 7) comme la
technique d'hybridation par Northern-Blot utilisant une sonde cDNA double brin
2o dénaturée.
Selon un autre mode de réalisation possible, le marquage de sonde peut
comprendre un cycle de synthèse d'ADNc double brin, à partir des ARNm
totaux extraits de l'échantillon biologique, couplé à une transcription in
vitro en
présence de ribonuciéotides biotinylés, générant des ARN complémentaires
marqués, ces ARN antisens marqués servant de sonde lors de l'hybridation sur
une puce à ADN (Affymetrix, Gene Expression Monitoring, Technical Note ;
US 5 716 785, US 5 891 636, US 6 291 170).
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à
l'utilisation d'au moins une sonde polypeptidique relative au gène FANCC etlou
DAD1 et/ou GR1M19 et/ou HADHII telle que définie ci-dessus pour
diagnostiquer le psoriasis ou une prédisposition au psoriasis d'un échantillon
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biologique par la mesure du niveau d'expression, respectivement, du gène
FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 etlou HADHII.
La présenfie invenfiion se rapporte également à l'utilisation d'au moins une
sonde polypepfiidique relative au gène FANCC etlou DAD1 et/ou GRIM19 ei/ou
HADHII telle que définie ci-dessus pour l'identification d'un composé desfiiné
au
traitemenfi du psoriasis.
La présente invention se rapporte aussi à un procédé d'identification d'un
1o composé destiné au traitement du psoriasis comprenanfi les étapes suivantes
a) préparation d'au moins deux échantillons biologiques ;
b) mise en contact d'un des échantillons avec un ou plusieurs composés à
tester ;
c) mesure de la quantité de la protéine produite par l'expression d'au moins
un gëne choisi parmi FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 etlou HADHII
dans les échantillons biologiques à l'aide d'au moins une sonde
polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou polyclonal
spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de l'expression,
respectivement, du gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII, ou contre
2o un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un
polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage ;
d) sélection desdits composés pour lesquels une modulation de
l'expression de la ou lesdites protéines est mesurée dans l'échantillon
traité de l'étape b).
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention se rapporte à un
outil
de recherche comprenant une sonde polynucléotide, ladite sonde ayant une
séquence de 10 à 500 paires de bases et étant complémentaire à au moins
30°/~ avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène
FANCC
(n° d'accession NM 000136.1 ) ou DAD1 (n° d'accession NM
001344.1 ) ou
GRiMl9 (n° d'accession NM 015965.3) ou HADHII (N°
d'accession
NM 004493.1 ).
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En parfiiculier, la sonde polynucléotidique est
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 °/~, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADV~c
5 simple brin de séquence SEC.. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
C~. ID. n°4. ,
- une sonde polynucléotidique relative au géne DAD1 qui est un fragment
de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
1o préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID, n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un
15 fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellément au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
La présente invention se rapporte aussi à un outil de recherche comprenant
une sonde polypeptidique, ladite sonde étant un anticorps monoclonal ou
polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage issue de
3o l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, ou contre un
fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre un
polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
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L'outil de recherche pourra en outre permettre l'analyse des effets de
certains
traitements sur l'expression de ces gènes marqueurs du psoriasis, tels que
FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII, ou l'analyse de mutation de la séquence
de ces gènes cher des individus atteints de psoriasis.
s
L'outil de recherche pourra également permettre l'analyse du profil
d'expression
du gène FANCC efi/ou DAD1 eüou GRIM19 efi/ou HADHII dans les cellules
constituant l'épiderme, en particulier les kératinocytes, par exemple en
fonction
de leur état de prolifération ou de différenciation. L'outil de recherche
pourra
l0 également permettre l'expression constitutive, la surexpression ou
l'inhibition de
l'expression du gène FANCC et/ou DAD1 et/ou GRIM19 etlou HADHII, selon
des tests in vifiro ou in vivo connus de l'homme de l'art.
Par exemple, selon un outil de recherche envisagé, la sonde po(ynucléotidique
15 selon l'invention peut être utilisée, par exemple dans un test
d'hybridation par
Northern-blot, ou encore dans un test d'amplification par PCR (« Polymerase
Chain Reaction »), pour suivre l'expression d'au moins un gène choisi parmi
FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII ou d'une séquence homologue, variante,
modifiée ou partielle, dans des cellules constituant l'épiderme, en
particulier des
20 kératinocytes, exprimant in vitro au moins un gène choisi parmi FANCC,
DAD1,
GRiM19 et HADHII, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de
prolifération des cellules. En particulier, ladite expression peut être
constitutive
ou encore inductible, le gène FANCC, DAD1, GRIM19 ou HADHII pouvant être
placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif tel que ie promoteur SV40 ou
2s CMV, ou d'un promoteur inductible tel que le système Tet Off Gene
Expression
System (Invitrogen), sont utilisées les techniques classiques de génie
génétique
et de transfection (Gossen M, Bujard H. , Annu Rev Genet.(2002) 36:153-73).
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon
30 l'invention peut ëtre utilisée, par exemple dans un test d'hybridation par
Northern-bloc, ou encore dans un test d'amplificatiôn par PCR (« Polymerase
Chain Reaction »), pour suivre l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou
GRIM19 ou HADHII ou d'une séquence homoloque, variante, modifiée ou
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partielle, dans les cellules constituant l'épiderme d'une souche d'animaux de
laboratoire, en particulier dans les kératinocytes, surexprimant in vivo ledit
gène
ou séquence, par exemple sous le contr~le d'un promoteur spécifiquement
activé dans l'épiderme, tel que les promoteurs de Ivératine o~14, 115 ou de
l'Involucrine, par exemple en fonction de l'état de différenciation ou de
prolifération des cellules.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidiq~ae selon
l'invention peut être utilisée pour l'analyse par exemple par Southern-Blot
d'une
l0 inactivation par délétion du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, par
exemple dans des cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des
kératinocytes, cultivés in vitro ou encore in vivo dans les cellules d'une
souche
d'animaux de laboratoire. Cette inactivation peut être réalisée selon les
techniques classiques de recombinaison homologue.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polynucléotidique selon
l'invention peut être utilisée pour dessiner et synthètiser des siARN, selon
les
techniques connues de l'homme de l'art (Tuschl T, Borkhardt A, Mol Interv
(2002) Jun;2(3):158-67). Ces ARN antisens peuvent être utilisés pour
l'inhibition
2o de l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, par exemple
dans une lignée de cellules constitutives de l'épiderme, en particulier des
kératinoçytes, in vitro, ou encore in vivo, par exemple dans une souche
d'animaux de laboratoire.
2s L'outil de recherche pourra en outre permettre l'analyse des effets de
certains
traitements sur l'expression de ces gènes marqueurs du psoriasis, ou l'analyse
de mutation de la séquence de ces gènes chez des individus atteints de
psoriasis.
Par exemple, cet outil de recherche pourra être tel que la ou les sondes qu'il
30 comprend, sont mises en contact avec la ou les séquences) cibles)
correspondantes) déposées sur un support tel qu'un filtre en nylon.
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La sonde peut encore âtre utilisée dans un test d'hybridation (par exemple un
test de détection de mésappariement), un séquençage, un microséquençage.
Selon d'autres outils de recherche envisagés par la présente invention, la
sonde selon l'invention pourra être associée à une autre sonde détectable dont
la nature pourra âtre de préférence fluorescente, radioacfiive ou enzymatique.
Cette caractéristique peut permettre, entre autres, de suivre la localisation
de la
sonde, du milieu extracellulaire vers la cellule, ou du cytoplasme vers le
noyau,
ou bien de préciser son interaction avec l'ADN, ou l'ARN ou des protéines.
1o L'homme du métier saura quelle sonde détectable est la mieux adaptée en
fonction de la caractéristique qu'il veut pouvoir suivre.
Selon un outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique selon
l'invention
peut être utilisée pour des immunomarquages du polypeptide cible tel que
défini
précédemment, sur tissu, selon les techniques classiques connues de l'homme
de l'art, par exemple sur coupe d'épiderme d'animaux de laboratoire, par
exemple les animaux présentant une surexpression de la protéine FANCC ou
DAD1 ou GRIM19 ou HADHII ou d'un polypeptide homologue, variant, modifié
ou fragment actif de ladite protéine, ou encore in vitro sur des cellules
2o constituant l'épiderme, en particulier des leératinocytes, pouvant âtre
l'objet
d'une surexpression de la protéine ou dudit polypeptide, ou encore d'une
inhibition de cette expression, par exemple par l'utilisation de siRNA comme
envisagé précédemment.
Selon un autre outil de recherche envisagé, la sonde polypeptidique peut
également être utilisée pour purifier ladite protéine ou ledit polypeptide,
par
exemple selon des techniques d'immunoprécipitation classiquement connues
de l'homme de l'art.
3o Les techniques classiquement connues de l'homme de l'art peuvent âtre les
techniques décrites par Sambrool~ J, Fritsch EF et Maniatis T dans Molecular
Cloning, A Laboratory Manual.
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La découverte de la surexpression de FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII, dans
la peau psoriasique permet d'une part de diagnostiquer le psoriasis, et
d'autre
part, de développer de nouvelles thérapeutiques basées sur la modulation de
l'expression eï/ou de la fonction d'un ou plusieurs de ces génes, pour traiter
le
psoriasis en agissant sur la composante apoptotique en vue de limiter les
désordres de la prolifération cellulaire qui caractérisent en partie le
psoriasis.
Dans un aspect particuliérement préférable, la présente invention fournit une
méthode pour caractériser des échantillons de peau pour déterminer la
l0 prédisposition au psoriasis.
La Demanderesse a démontré que l'expression des gènes FANCC, DAD1,
GRIM19 et HADHII était induite dans la peau psoriasique lésionnelle présentant
une plaque de psoriasis, par rapport à la peau saine (expression moyenne
mesurée chez 13 sujets psoriasiques et 10 sujets sains).
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1.
La mesure de l'expression de l'un des gènes, et de préférence les quatre,
FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII permet de caractériser une peau
2o psoriasique lésionnelle indépendamment du type et de la localisation de la
plaque de psoriasis (tableaux 2 et 3). Le tableau 2 représente l'expression
des
gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII relative à une expression moyenne
chez les sujets sains, chez les patients présentant majoritairement des
plaques
au niveau du tronc et des plaques asymétriques. Le tableau 3 représente
l'expression des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII relative à une
expression moyenne chez les sujets sains, chez les patients présentant
majoritairement des plaques de type symétrique.
En outre, hormis la caractérisation d'une peau présentant une plaque de
3o psoriasis par rapport à une peau saine, la découverte de ces nouveaux
marqueurs du psoriasis permet également de discriminer une peau de patient
psoriasique non lésionnelle (cliniquement saine) mais déjà engagée vers le
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processus psoriasique, d'une peau non lésionnelle ayant les réelles
caractéristiques d'une peau saine.
La Demanderesse a découvert de faon surprenante, que certaines peaux non
5 lésionnelles surexprimaient aussi les génes FANCC, DAD1, GRIM19 et
HADHII. Sur la base de l'expression de ces gènes, le diagnostic du psoriasis
est réalisable trés précocemenfi puisque l'expression des génes FANCC, DAD1,
GRIM19 et HADHII permet de différencier au niveau moléculaire des peaux non
lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le permettent
pas.
1o Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 4.
Ainsi l'invention se rapporte également à un procédé de diagnostic du
psoriasis
ou d'une prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la
surexpression dans un échantillon biologique d'au moins un des gènes FANCC,
15 DAD1, GRIM19 ou HADHII par la mise en contact d'au moins une sonde
polynucléotidique avec les séquences cibles isolées à partir dudit échantillon
biologique, ladite sonde ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et
étant complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant
à tout ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1 ) ou DAD1
(n°
2o d'accession NM 001344.1 ) ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) ou
HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ).
En particulier, la sonde polynucléotidique est
- une sonde polynuclëotidique relative au gène FANCC qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment
de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 °/~, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double
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brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins ~0 °/~, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SECS. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SECS. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
L'invention se rapporte aussi à un procédé de diagnostic du psoriasis ou d'une
prédisposition au psoriasis comprenant une étape de mesure de la
surexpression dans un échantillon biologique de la protéine produite par
l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII par la mise en
2o contact d'une sonde polypeptidique telle que un anticorps monoclonal ou
polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage. issue de
l'expression, respectivement, du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou
HADHII, ou contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou
encore contre un polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine
sauvage.
Par surexpression d'un gène dans un échantillon biologique, on entend une
expression de l'ARN messager ou de la protéine correspondant à ce gène plus
élevée dans cet échantillon par rapport à un échantillon sain de référence.
Par ailleurs, l'invention se rapporte aussi à un lit de diagnostic comprenant
au
moins une sonde polynucléotidique ou polypeptidique relative à au moins un
des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII.
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L'objet de la présente invention se rapporte donc à un kit de diagnostic
comprenant au moins une sonde polynucléotidique, ladite sonde ayant une
séquence de 10 à 500 paires de tasses et étant complémentaire à au moins
80°/~ avec une séquence cible correspondant à tout ou partie du gène
FANCC
(n° d'accession NM 000136.1 ) eÜou DAD1 (n° d'accession NM
001344.1 ) et/ou
GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3) et/ou HADHII (N°
d'accession
NM 004493.1 ).
En particulier, ladite sonde polynucl~otidique du kit de diagnostic est
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment
de 10 à 500 pairës de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
2o simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène GR1M19 qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au .moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SECS. ID. n°12 ;
- une sonde polynucléotidique relative eu gène HADHII qui est un
3o fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double
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brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
L'objet de la présente invention se rapporte aussi à un leit de diagnostic
comprenant au moins une sonde polypeptidique telle que un anfiicorps
monoclonal ou polyclonal spécifiquement dirigé contre la protéine sauvage
issue de l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII, ou
contre un fragment biologiquement actif de ladite protéine, ou encore contre
un
polypeptide homologue, modifié ou variant de la protéine sauvage.
1o
Les observations décrites ci-dessus indiquent également que FANCC, DAD1,
GRIM19 et HADHII sont des cibles thérapeutiques pour le développement de
nouvelles thérapies visant à traiter le psoriasis chronique vulgaire en
plaques,
quelque soit le type prédominant de plaques chez le patient, et la
localisation de
la plaque de psoriasis sur le corps.
Ainsi, un autre objet de la présente invention se rapporte à l'utilisation
d'une
sonde polynucléotidique ou de l'un de ses analogues, complémentaire,
respectivement, au gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19 ou HADHII pour
moduler, respectivement, l'expression du gène FANCC ou DAD1 ou GRIM19
ou HADHII.
En particulier, la sonde polynucléotidique pourra étre un ARN antisens ou un
siRNA qui a pour rôle d'inhiber l'expression d'un gène spécifique (Fire A.,
Trends in Genetic (1999) 15 : 358-363).
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la sonde
polynucléotidique est
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de
3o séquence SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un firagment
de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
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préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de
séquence SEQ. ID. n°8 ;
une sonde polynucléotidique relative au gène GRIM19 qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant aga moins 80 °/~, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de
séquence SEQ. ID. n°12 ;
une sonde polynucléotidique relafiive eu gène HADHII qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 °/~, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ARN de
1o séquence SEQ. ID. n°16.
Enfin, l'invention se rapporte également à l'utilisation d'au moins une sonde
polynucléotidique ayant une séquence de 10 à 500 paires de bases et étant
complémentaire à au moins 80% avec une séquence cible correspondant à tout
Z5 ou partie du gène FANCC (n° d'accession NM 000136.1 ) et/ou
DAD1 (n°
d'accession NM 001344.1) et/ou GRIM19 (n° d'accession NM 015965.3)
et/ou
HADHII (N° d'accession NM 004493.1 ) pour la fabrication d'une
composition
pharmaceutique destinée au traitement du psoriasis.
20 La sonde polynucléotidique pourra plus particulïèrement être
- une sonde polynucléotidique relative au gène FANCC qui esfi un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moïns 80 %, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°2 ou avec ta sonde ADNc double
25 brin de séquence SEQ. ID. n°3 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°4 ;
- une sonde polynucléotidique relative au gène DAD1 qui est un fragment
de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 °l°, d'homologie avec la sonde
ADNc
30 simple brin de séquence SEQ. ID. n°6 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°7 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°8 ;
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- une sonde polynucléotidique relative au géne GRIM19 qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 %, et
préférentiellement au moins 90 °/~, d'homologie avec la sonde ADNc
simple brin de séquence SEQ. ID. n°10 ou avec la sonde ADNc double
5 brin de séquence SECS. ID. n°11 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°1~ ;
- une sonde polynucléotidique relative . eu gène HADHII qui est un
fragment de 10 à 500 paires de bases représentant au moins 80 °/~, et
préférentiellement au moins 90 %, d'homologie avec la sonde ADNc
1o simple brin de séquence SEQ. ID. n°14 ou avec la sonde ADNc double
brin de séquence SEQ. ID. n°15 ou avec la sonde ARN de séquence
SEQ. ID. n°16.
15 EXEMPLE 1 - MESURE D'EXPRESSION GENIQUE DANS LA PEAU SAINE
ET DANS LA PEAU PSORIASIQUE
Une étude clinique réalisée en présence de volontaires sains et de patients
atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques, a permis de mettre en
2o évidence l'implication des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII dans le
psoriasis. Des biopsies cutanées sont prélevées chez des volontaires sains,
ainsi que sur des plaques de psoriasis et sur des zones non lésionnelles
apparaissant cliniquement saines, chez des patients atteints de psoriasis. La
présence ou l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la
25 sévérité de la plaque de psoriasis, sont déterminées par l'évaluation de
paramètres cliniques locaux (scores d'érythème, de desquamation et
d'élévation de la plaque de psoriasis).
L'analyse de l'expression génique est ensuite réalisée à partir de chaque
biopsie individuelle. La comparaison des profils géniques correspondant à la
peau saine et la peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle, permet
d'identifier des génes dont l'expression est induite dans la maladie.
La détermination des profils géniques est basée sur l'hybridation d'une sonde
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complexe d'ADNc simple brin (générée par la rétro-transcription des ARNm
issus de chaque biopsie de peau) sur des fragments d'ADNc d'intérêt, qui sont
déposés sur un support tel qu'un filtre en nylon. Les signaux d'hybridation
obtenus sont proportionnels à la quantité de chaque ADI~c marqué dans la
sonde et reflétant le niveau d'expression de chaque ARNm au sein de
l'échantillon de peau analysé (Nguyen C ef al. Genomics (1995 Sep)
1;29(1 ):207-16).
Des filtres élaborés par la Demanderesse, spécifiques à la dermatologie ont
été
1o développés. Ces filtres sont constitués de 474 ADNc impliqués dans les
processus physiologiques de la peau humaine. En parallèle, des filtres
commerciaux à 4200 ADNc humains (Invitrogen GF211 ) ont été utilisés. Ces
filtres d'ADNc vont permettre de déterminer l'expression de gènes d'intérét
dans
la peau saine ainsi que dans la peau non lésionnelle et lésionnelle de
patients
atteints de psoriasis chronique vulgaire en plaques.
Méthode
La mesure de l'expression génique dans la peau saine et dans la peau
psoriasique est réalisée en utilisant la technologie des filtres à ADNc
(« arrays ») sur support nylon.
Le principe de cette technologie repose sur l'hybridation d'une sonde d'ADNc
simple brin radiomarquée sur des fragments d'ADNc cibles déposés à haute
densité sur des filtres de nylon (Nguyen C et al. Genomics (1995 Sep)
1;29(1 ):207-16). Dans cette étude, des filtres de nylon (GF211 )
commercialisés
par la société Invitrogen sur lesquels sont déposés 4200 ADNc humains
identifiés, ainsi que des filtres dédiés à la dermatologie à 474 ADNc humains,
développés par la Demanderesse, sont utilisés. Les sondes d'ADNc
radiomarquées sont générées par transcription inverse des ARN totaux
(protocole Invitrogen), isolés à partir des différentes biopsies prélevées
chez 10
volontaires sains et 13 sujets atteints de plaques chroniques de psoriasis
vulgaire (protocole RNEasy, Qiagen). Les signaux d'hybridation obtenus sont
proportionnels à la quantité de chaque ADNc marqué présent dans la sonde,
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qui s'est hybridé sur l'ADNc qui lui est complémentaire sur le filtre et
reflètent
ainsi l'activité transcriptionnelle des ARNm dans les biopsies analysées.
~anah'~~ d~ n~rmaüsati~n ~~s résultats ~'~~~~r~~si~n ~~ni~,ue
ç~m~arais~n des ~r~fils aéni~ues entre la peau saine et la peau
~s~riasie~ue
Les signaux d'hybridation sont mesurés par phospholuminescence, puis
quantifiés à l'aide du logiciel d'analyse d'image Imagen (Eiodiscovery).
Afin de discriminer les signaux d'hybridation spécifiques des gènes étudiés,
le
1o bruit de fond lié à une hybridation non spécifique est mesuré sur chaque
filtre
sur des zones vierges de dépôt d'ADNc (filtres GF211 ), ou au sein d'une
couronne entourant chaque spot (filfires dédiés). Après transformation des
données en log, un seuil de détection permettant de discriminer une mesure
relevant d'un signal réel ou du bruit, est déterminé automatiquement pour
chaque filtre en utilisant la méthode décrite précédemment par Fogel et al.,
2002.
En vue de comparer les résultats d'expression génique entre les différentes
biopsies analysées, les signaux d'hybridation sont normalisés par fa médiane
de
l'ensemble de signaux obtenus pour chaque biopsie (filtres GF211 ), ou par
l'expression d'un ARN messager exogène, servant de référence, dont
l'expression est invariante entre les échantillons analysés. Ce transcrït
exogène
est ajoufié en quantité constante dans les préparations d'ARN totaux issues
des
différents échantillons, avant synthèse de la sonde d'ADNc radiomarquée. La
séquence cible de ce transcrit exogène est déposée sur chaque filtre.
Pour chaque gène, une expression moyenne de référence est déterminée sur
l'ensemble des biopsies de sujets sains, puis soustraite à l'expression
obtenue
dans chaque biopsie de peau psoriasique non lésionnelle et lésionnelle
(valeurs
en log). Le ratio entre l'expression de chaque gène dans la peau psoriasique
par
rapport à la peau saine est alors obtenu en prenant l'exponentielle en base 10
3o de la valeur calculée précédemment (tableaux 1 â 4).
Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence la surexpression des
gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHII dans la peau humaine lésionnelle
présentant une plaque de psoriasis par rapport à la peau humaine saine
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(tableau 1 ).
Les résultats des tableaux 2 et 3 indiquent que ces surexpressïons sont
observées quelque soit le type prédominant de plaques exprimées chez le
patient (symétrique ou troncal) et également indépendamment de la localisation
des plaques de psoriasis. Les abréviations mentionnées dans ces tableaux
représentent la localisation des biopsies prélevées sur le corps pour chaque
sujet psoriasique (SP) et ont la signification suivante: JG: jambe gauche, J~:
jambe droite, S~: bras droit, S(3: bras gauche, T: tronc.
l0 Les résultats du tableau 4 montrent que l'expression de ces gènes est
également induite dans la peau psoriasique non lésionnelle. Les abréviations
ont la même signification que précédemment.
EXEMPLE 2 - MESURES DES PARAMETRES CLINIQUES LOCAUX LIES A
LA PLAQUE DE PSORIASIS : SCORES D'ERYTHEME, DE DESQUAMATION
ET D'ELEVATION DE LA PLAQUE
Les différents scores cliniques locaux permettant de définir la présence ou
l'absence de psoriasis sur la zone de peau biopsiée, ainsi que la sévérité de
la
plaque de psoriasis, sont les scores d'érythème, de desquamation et
d'élévation de la plaque. Ces scores sont classiquement mesurés grâce aux
classements suivants:
La mesure de l'érythème se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'érythème)
1 = léger (légère rougeur présente)
2 = modéré (rougeur facilement décelable)
3 = sévère (rougeur intense)
4 = très sévère (rougeur très intense)
La mesure de la desquamation se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence de desquamation)
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1 = léger (squames détectés, une seule couche de desquamation)
2 = modéré (squames de degré intermédiaire entre le léger et (e sévère)
3 = sévère (Plusieurs couches de squames)
4 = très sévère (plusieurs couches de squames épais)
La mesure de l'élévation de la plaque se fait à l'aide du classement suivant:
0 = aucun (absence d'élévation de l'épaisseur)
1 = léger (légère élévafiion détectable au toucher)
2 = modéré (épaisseur modérée)
l0 3 = sévère (fort épaississement)
4 = très sévère (très fort épaississement)
Cette étude démontre que les paramètres cliniques locaux obtenus avec la
peau psoriasique non lésionnelle ne sont pas différents de ceux obtenus pour
la
peau saine. Ils ne permettent donc pas de différencier une peau psoriasique
non lésionnelle d'une peau saine.
Par contre, les résultats du tableau 4 ont permis de mettre en évidence au
niveau moléculaire, une surexpression des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et
HADHII dans certaines peaux psoriasiques non lésionnelles.
2o La mesure de l'expression des gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADHI1,
permet donc de réaliser un diagnostic très précoce du psoriasis, puisque
l'expression de ces gènes permet de différencier au niveau moléculaire des
peaux non lésionnelles déjà atteintes, alors que les signes cliniques ne le
permettent pas.
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SEQUENCE LISTING
<110> Galderma Research & Development, SNC
<120> Gènes FANCC, DAD1, GRIM19 et HADEiII du psoriasis
<130> OA03148
<150> FR03/04773
<151> 2003-04-16
<160> 16
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 500
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400>
1
agacagguggcggccgggcaggcacucuuaagcccaccucccccucuuguugccuucgau60
uucggcaaagccugggcaggugccaccgggaaggaauggcaucgagaugcugggcgggga120
cgcggcguggcgagggggcuugacggcguuggcggggcugggcacaggggcagccgcagg180
gaggcagggauggcaaggcgugaagccacccuggaaggaacuggaccaaggucuucagag240
gugcgacagggucuggaaucugaccuuacucuagcaggaguuuuuguagacucucccuga300
uaguuuaguuuuugauaaagcaugcugguaaaaccacuacccucagagagagccaaaaau360
acagaagaggcggagagcgccccuccaaccaggcuguuauuccccuggacuccgugacau420
cuguggaauuuuuuagcucuuuaaaaucuguaauuuguugucuauuuuuucauucuaaau480
aaaacuucaguuugcaccua 500
<210> 2
<211> 500
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400>
2
taggtgcaaactgaagttttatttagaatgaaaaaatagacaacaaattacagattttaa60
agagctaaaaaattccacagatgtcacggagtccaggggaataacagcctggttggaggg120
gCgCtCtCCgCCtCttCtgtatttttggctctctctgagggtagtggttttaccagcatg180
ctttatcaaaaactaaactatcagggagagtctacaaaaactcctgctagagtaaggtca240
gattccagaccctgtcgcacctctgaagaccttggtccagttccttccagggtggcttca300
cgccttgccatCCCtgCCtCCCtgCggCtgCCCCtgtgCCCagCCCCg'CCaaCgCCgtCa360
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agccccctcg ccacgccgcg tccccgccca gcatctcgat gccattcctt cccggtggca 420
cctgcccagg ctttgccgaa atcgaaggca acaagagggg gaggtgggct taagagtgcc 480
tgCCCggCCg CCaCCtgtCt 500
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400>
3
agacaggtggCggCCgggCaggCaCtCttaagCCCa.CCtCCCCCtCttgttgCCttCgat
ttcggcaaagCCtgggCaggtgCCaCCgggaaggaatggcatcgagatgctgggcgggga120
cgcggcgtggcgagggggcttgacggcgttggcggggctgggcacaggggcagccgcagg180
gaggcagggatggcaaggcgtgaagccaccctggaaggaactggaccaaggtcttcagag240
gtgcgacagggtctggaatctgaccttactctagcaggagtttttgtagactctccctga300
tagtttagtttttgataaagcatgctggtaaaaccactaccctcagagagagccaaaaat360
acagaagaggCggagagCgCCCCtCCaaCCaggCtgttattCCCCtggaCtccgtgacat420
ctgtggaattttttagctctttaaaatctgtaatttgttgtctattttttcattctaaat480
aaaacttcagtttgcaccta 500
<210> 4
<211> 500
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 4
uaggugcaaacugaaguuuuauuuagaaugaaaaaauagacaacaaauuacagauuuuaa 60
agagcuaaaaaauuccacagaugucacggaguccaggggaauaacagccugguuggaggg 120
gcgcucuccgccucuucuguauuuuuggcucucucugaggguagugguuuuaccagcaug 180
cuuuaucaaaaacuaaacuaucagggagagucuacaaaaacuccugcuagaguaagguca 240
gauuccagacccugucgcaccucugaagaccuugguccaguuccuuccaggguggcuuca 300
CgCCUUgCCauCCCUgCCItCCCUgCggCUgCCCCUgugCCCagCCCCgCCaaCg'CCguCa360
agCCCCCCgCCaCgCC~'CguCCCCgCCCagcaucucgaugccauuccuucccgguggca 420
ccugcccaggcuuugccgaaaucgaaggcaacaagagggggaggugggcuuaagagugcc 480
ugCCCggCCgCCCCguCU 500
<210> 5
<211> 500
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 5
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gucuccucguggggaccuuccccuucaacucuuuucucucgggcuucaucucuugugugg 60
ggaguuucauccuagcgguuugccugagaauacagaucaacccacagaacaaagcggauu 120
uccaaggcaucuccccagagcgagccuuugcugauuuucucuuugccagcaccauccugc 180
accuuguugucaugaacuuuguuggcugaaucauucucauuuacuuaauugaggaguagg 240
agacuaaaagaauguucacucuuugaauuuccuggauaagaguucuggagauggcagcuu 300
auuggacacauggauuuucuucagauuugacacuuacugcuagcucugcuuuuuaugaca 360
ggagaaaagcccagaguucacugugugucagaacaacuuucuaacaaacauuuauuaauc 420
cagccucugccuuucauuaaauguaaccuuuugcuuuccaaauuaaagaacuccaugcca 480
cuccucaaaaaaaaaaaaaa 500
<210>6
<211>500
<212>DNA
<213>homo sapiens
<400> 6
ttttttttttttttgaggagtggcatggagttctttaatttggaaagcaaaaggttacat 60
ttaatgaaaggcagaggctggattaataaatgtttgttagaaagttgttctgacacacag 120
tgaactctgggcttttctcctgtcataaaaagcagagctagcagtaagtgtcaaatctga 180
agaaaatccatgtgtccaataagctgccatctccagaactcttatccaggaaattcaaag 240
agtgaacattcttttagtctcctactcctcaattaagtaaatgagaatgattcagccaac 300
aaagttcatgacaacaaggtgcaggatggtgctggcaaagagaaaatcagcaaaggctcg 360
ctctggggagatgccttggaaatccgctttgttctgtgggttgatctgtattctcaggca 420
aaccgctaggatgaaactccccacacaagagatgaagcccgagagaaaagagttgaaggg 480
gaaggtccccacgaggagac 500
<210>7
<211>500
<212>DNA
<213>homo sapiens
<400>
7
gtctcctcgtggggaccttccccttcaactcttttctctcgggcttcatctcttgtgtgg 60
ggagtttcatcctagcggtttgcctgagaatacagatcaacccacagaacaaagcggatt 120
tccaaggcatctccccagagcgagcctttgctgattttctCtttgCCagCaCCatCCtgC 180
accttgttgtcatgaactttgttggctgaatcattctcatttacttaattgaggagtagg 240
agactaaaagaatgttcactctttgaatttcctggataagagttctggagatggcagctt 300
attggacacatggattttcttcagatttgacacttactgctagctctgctttttatgaca 360
ggagaaaagccCagagttcactgtgtgtcagaacaactttctaacaaacatttattaatc 420
cagcctctgcctttcattaaatgtaaccttttgctttccaaattaaagaactccatgcca 480
ctcctcaaaaaaaaaaaaaa 500
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<210> 8
<211> 500
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 8
uuuuuuuuuuuuuugaggaguggcauggaguucuuuaauuuggaaagcaaaagguuacau 60
uuaaugaaaggcagaggcuggauuaauaaauguuuguuagaaaguuguucugacacacag 120
ugaacucugggcuuuucuccugucauaaaaagcagagcuagcaguaagugucaaaucuga 180
agaaaauccauguguccaauaagcugccaucuccagaacucuuauccaggaaauucaaag 240
agugaacauucuuuuagucuccuacuccucaauuaaguaaaugagaaugauucagccaac 300
aaaguucaugacaacaaggugcaggauggugcuggcaaagagaaaaucagcaaaggcucg 360
cucuggggagaugccuuggaaauccgcuuuguucuguggguugaucuguauucucaggca 420
aaccgcuaggaugaaacuccccacacaagagaugaagcccgagagaaaagaguugaaggg 480
gaagguccccacgaggagac 500
<210> 9
<211> 499
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 9
aacggaacuugccgcgucgaggacugucgggcuacagcaugcuggccauagggauuggaa 60
cccugaucuacgggcacuggagcauaaugaaguggaaccgugagcgcaggcgccuacaaa 120
ucgaggacuucgaggcucgcaucgcgcuguugccacuguuacaggcagaaaccgaccgga 180
ggaccuugcagaugcuucgggagaaccuggaggaggaggccaucaucaugaaggacgugc 240
ccgacuggaaggugggggagucuguguuccacacaacccgcugggugccccccuugaucg 300
gggagcuguacgggcugcgcaccacagaggaggcucuccaugccagccacggcuucaugu 360
gguacacguaggcccugugcccuccggccaccuggaucccugccccuccccacugggacg 420
gaauaaaugcucugcagaccuggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaaaaaaaaaaa 499
<210> 10
<211> 499
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400>
ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttccag60
gtctgcagagcatttattccgtcccagtggggaggggcagggatccaggtggccggaggg120
cacagggcctacgtgtaccacatgaagccgtggctggcatggagagcctcctctgtggtg180
CgCagCCCgtaCagctCCCCgatcaaggggggcacccagcgggttgtgtggaacacagac240
tCCCCCacCttCCagtCgggcacgtccttcatgatgatggCCtCCtCCtCCaggttCtCC300
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cgaagcatct gcaaggtcct ccggtcggtt tctgcctgta acagtggcaa cagcgcgatg 360
cgagcctcga agtcctcgat ttgtaggcgc ctgcgctcac ggttccactt cattatgctc 420
cagtgcccgt agatcagggt tccaatccct atggccagca tgctgtagcc cgacagtcct 480
CgaCgCggCa agttCCgtt 499
<210> 11
<211> 499
c212> DNA
<213> homo sapiens
<400>
11
aacggaacttgccgcgtcgaggactgtcgggctacagcatgctggccatagggattggaa 60
ccetgatctacgggcactggagcataatgaagtggaaccgtgagcgcaggcgcctacaaa 120
tcgaggacttcgaggctcgcatcgcgctgttgccactgttacaggcagaaaccgaccgga 180
ggaccttgcagatgcttcgggagaacctggaggaggaggccatcatcatgaaggacgtgc 240
ccgactggaaggtgggggagtctgtgttccacacaacccgCtgggtgCCCCCCttgatCg 300
gggagctgtacgggctgcgcaccacagaggaggctctccatgccagccacggcttcatgt 360
ggtacacgtaggccctgtgccctccggccacctggatccctgcccctccccactgggacg 420
gaataaatgctctgcagacctggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaaaaaaaaaaa 499
<210> 12
<211> 499
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 12
uuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuccag 60
gucugcagagcauuuauuccgucccaguggggaggggcagggauccagguggccggaggg 120
cacagggccuacguguaccacaugaagccguggcuggcauggagagccuccucuguggug 180
cgcagcccguacagcuccccgaucaaggggggcacccagcggguuguguggaacacagac 240
ucccccaccuuccagucgggcacguccuucaugaugauggccuccuccuccagguucucc 300
cgaagcaucugcaagguccuccggucgguuucugccuguaacaguggcaacagcgcgaug 360
cgagccucgaaguccucgauuuguaggcgccugcgcucacgguuccacuucauuaugcuc 420
cagugcccguagaucaggguuccaaucccuauggccagcaugcuguagcccgacaguccu 480
cgacgcggcaaguuccguu 499
<210> 13
<211> 500
<212> RNA
<213> homo sapiens
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<400> 13
guguggcugccuucgagggucagguuggacaagcugcauacucugcuuccaaggggggaa 60
uagugggcaugacacugcccauugcucgggaucuggcucccauagguauccgggugauga 120
ccauugccccaggucuguuuggcaccccacugcugaccagccucccagagaaagugugca 180
acuucuuggccagccaagugcccuucccuagccgacugggugacccugcugaguaugcuc 240
accucguacaggccaucaucgagaacccauuccucaauggagaggucauccggcuggaug 300
gggccauucguaugcagccuugaagggagaaggcagagaaaacacacgcuccucugcccu 360
uccuuucccugggguacuacucuccagcuugggaggaagcccaguagccauuuuguaacu 420
gccuaccagucgcccucugugccuaauaaagucucuuuuucucacaaaaaaaaaaaaaaa 480
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 500
<210>14
<211>500
<212>DNA
<213>homo sapiens
<400>
14
tttttttttttttttttttttttttttttttttttgtgagaaaaagagactttattaggc 60
acagagggcgactggtaggcagttacaaaatggctactgggcttcctcccaagctggaga 120
gtagtaccccagggaaaggaagggcagaggagcgtgtgttttctctgccttctcccttca 180
aggctgcatacgaatggccccatccagccggatgacctctccattgaggaatgggttctc 240
gatgatggcctgtacgaggtgagcatactcagcagggtcacccagtcggctagggaaggg 300
cacttggctggccaagaagttgcacactttctctgggaggctggtcagcagtggggtgcc 360
aaacagacctggggcaatggtcatcacccggatacctatgggagccagatcccgagcaat 420
gggcagtgtcatgcccactattccccccttggaagcagagtatgcagcttgtccaacctg 480
accctcgaaggcagccacac 500
<210>15
<211>500
<212>DNA
<213>homo sapiens
<400>
15
gtgtggctgccttcgagggtcaggttggacaagctgcatactctgcttccaaggggggaa60
tagtgggcatgacactgcccattgctcgggatctggctcccataggtatccgggtgatga120
CCattgCCCCaggtCtgtttggC3CCCC.Ctgctgaccagcctcccagagaaagtgtgca180
acttcttggccagccaagtgcccttccctagccgactgggtgaccctgctgagtatgctc240
acctcgtacaggccatcatcgagaacccattcctcaatggagaggtcatccggctggatg300
gggccattcgtatgcagccttgaagggagaaggcagagaaaacacacgctcctctgccct360
tcctttccctggggtactactetccagcttgggaggaagcccagtagccattttgtaact420
gcctaccagtcgccctctgtgcctaataaagtctctttttctcacaaaaaaaaaaaaaaa480
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 500
CA 02522120 2005-10-12
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<210>l6
<211>500
<212>RNA
<213>homo sapiens
<400>
16
uuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuuugugagaaaaagagacuuuauuaggc 60
acagagggcgacugguaggcaguuacaaaauggcuacugggcuuccucccaagcuggaga 120
guaguaccccagggaaaggaagggcagaggagcguguguuuucucugccuucucccuuca 180
aggcugcauacgaauggccccauccagccggaugaccucuccauugaggaauggguucuc 240
gaugauggccuguacgaggugagcauacucagcagggucacccagucggcuagggaaggg 300
cacuuggcuggccaagaaguugcacacuuucucugggaggcuggucagcaguggggugcc 360
aaacagaccuggggcaauggucaucacccggauaccuaugggagccagaucccgagcaau 420
gggcagugucaugcccacuauuccccccuuggaagcagaguaugcagcuuguccaaccug 480
acccucgaaggcagccacac 500
