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UTILISATION DES N-ALKANOLS COMME ACTIVATEURS
DU CANAL CFTR
La présente invention est relative à une nouvelle utilisation des n-
alkanols comme activateurs du canal CFTR (cystic fibrosis transmembrane conduc-
tance regulator) et à l'application de ladite utilisation aux traitements des
pathologies
dans lesquelles on observe un dysfonctionnement dudit canal, telles que la
mucovisci-
dose.
La protéine CFTR, localisée dans la région apicale des cellules
épithéliales, est un canal chlorure contrôlé par le niveau d'AMPc et impliqué
dans
l'hydratation des fluides sécrétés par les glandes sous-muqueuses. Un
dysfonctionne-
ment de ce canal CFTR est responsable de la mucoviscidose, maladie génétique
auto-
somique récessive.
Dans les cellules épithéliales, les transports d'eau et d'électrolytes
sont associés à une augmentation des perméabilités membranaires pour les ions
K+,
Na+ et Cl-. Ces mouvements d'eau et d'électrolytes sont liés à l'activité de
protéines
membranaires spécialisées (canaux ioniques, transporteurs) ayant une
localisation
précise dans la membrane plasmique de la cellule (pôle apical ou muqueux ;
baso-
latéral ou séreux). Les techniques d'électrophysiologie moléculaire (patch-
clamp) et
de mesure de flux ioniques rendent possible l'étude des transports ioniques
transépi-
théliaux, de leurs régulations et de leurs dérèglements pathologiques.
Un dysfonctionnement des cellules épithéliales et notamment celui
des transports d'électrolytes est à l'origine de nombreuses physiopathologies,
telle que
la mucoviscidose ou fibrose kystique (Cystic Fibrosis (CF), dans la
terminologie
anglo-saxonne), qui est considérée comme une génopathie des glandes exocrines.
Le gène appelé CF impliqué dans la mucoviscidose a été identifié,
cloné et localisé sur le bras long du chromosome 7 (Riordan et al., 1989). La
muco-
viscidose est la maladie génétique autosomique récessive la plus commune dans
les
populations caucasiennes. Aux Etats-Unis et dans la plupart des pays d'Europe,
la
fréquence des porteurs hétérozygotes du gène CF muté est de 1 sur 20 à 1 sur
30, ce
qui représente une naissance d'un enfant malade sur 2500 à 3000 environ. Les
progrès
réalisés dans le domaine de la recherche médicale et biologique ont fait,
depuis les
années 60, considérablement progresser l'espérance de vie des patients
atteints de
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mucoviscidose, qui atteint aujourd'hui 30 ans environ. Le gène CF est
constitué de
250.000 paires de bases définissant 27 exons et code pour la protéine CFTR
(Cystic
Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), qui comporte 1480 acides aminés
(Riordan et al., 1989). La mucoviscidose est une canalopathie, c'est-à-dire
une patho-
logie liée à un dysfonctionnement de canaux ioniques, dans la mesure où la
protéine
CFTR a été caractérisée comme un canal chlorure. A l'heure actuelle, il a été
déjà
rapporté plus de 1300 mutations dans le gène CF, qui altèrent les propriétés
et la fonc-
tion du canal CFTR.
La protéine CFTR est exprimée dans de nombreux organes dont le
pancréas exocrine, les poumons, les glandes sudoripares, l'intestin, le tissu
hépatique,
l'appareil reproducteur, le rein et le tissu cardiaque.
L'intérêt porté à la mucoviscidose a eu des conséquences impor-
tantes pour la compréhension des mécanismes sécrétoires des cellules
épithéliales
normales. Les cellules épithéliales des glandes exocrines de différents
organes, tels
que l'intestin, le pancréas ou les poumons, contrôlent le transport de sel et
d'eau dans
les tissus. La protéine CFTR, qui est surtout localisée au pôle apical des
cellules épi-
théliales, est un canal chlorure, de faible conductance, activé par la voie de
l'AMPc.
La CFTR est impliquée dans l'hydratation des fluides sécrétés par
les glandes sous-muqueuses et influencerait la sécrétion des mucines,
glycoprotéines
qui participent notamment à la formation du mucus bronchique.
Dans la mucoviscidose, le dysfonctionnement du canal CFTR
affecte la sécrétion apicale d'ions Cl, activée par l'AMPc. Le transport
électrolytique,
devenu anormal, provoque l'épaississement du mucus extracellulaire et entraîne
ainsi
des obstructions au niveau des lumières des différents tissus. Ces
obstructions sont la
cause de bronchites chroniques dues à des infections bactériennes pulmonaires
opportunistes, des insuffisances pancréatique et hépatique, d'une sécrétion
sudoripare
anormalement concentrée et de l'infertilité masculine.
La protéine CFTR est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de
170 kD comportant cinq domaines (Riordan et al., 1989) : deux domaines
transmem-
branaires avec chacun 6 segments transmembranaires ou hélices a (numérotées de
1 à
12, comportant chacun de 21 à 22 acides aminés), deux domaines
intracellulaires de
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fixation des nucléotides (NBD1 et 2 pour Nucleotide Binding Domain) et un
large
domaine intracellulaire de régulation (domaine R).
La régulation de la CFTR a été particulièrement étudiée. Deux
processus complexes contrôlent l'activité du canal CFTR : la phosphorylation
du
domaine R par des protéines kinases et la fixation et l'hydrolyse d'ATP sur
les deux
domaines NBD. La déphosphorylation du canal CFTR entraîne une perte d'activité
du
canal jusqu'à sa fermeture (Tabcharani et al., 1991 ; Becq et al., 1994).
Plusieurs études ont montré que la protéine CFTR a, en plus de son
activité canal chlorure, de nombreuses autres fonctions cellulaires non encore
éluci-
dées. Elle régulerait d'autres canaux ioniques tels que le canal chlorure
rectifiant
sortant ORCC (Schwiebert et al., 1995), le canal sodium épithélial ENaC
(Quinton et
al., 1999) ou le canal chlorure dépendant du calcium CaCC (Wei et al., 1999).
Elle
aurait aussi une activité régulatrice sur la libération d'ATP de l'intérieur
vers
l'extérieur de la cellule (Schwiebert et-al., 1995).
La CFTR partage une homologie de séquence et de structure, avec
les transporteurs ABC (pour "ATP-binding cassette") qui constituent une grande
famille de protéines membranaires très conservées dans l'évolution. Ces
transporteurs
sont impliqués dans la translocation de substrats variés à travers les
membranes cellu-
laires. Cependant, alors que chez les procaryotes de nombreux couples transpor-
teurs/substrats ont été définis, ces informations sont plus rares chez les
eucaryotes.
Chez les mammifères, on dénombre actuellement 48 transporteurs ABC dont les
dysfonctionnements pourraient être associés à une pathologie. La glycoprotéine
P (ou
MDR pour Multi Drug Resistance) est impliquée dans le rejet de drogues cyto-
toxiques. La CFTR contrôle le transport de chlorure transépithélial et
l'hydratation des
compartiments muqueux, alors qu'une des isoformes de la MDR serait plutôt
impli-
quée dans la translocation de la phosphatidylcholine.
Parmi les quelques 1300 mutations du gène CF recensées jusqu'à
aujourd'hui et qui provoquent la mucoviscidose, la plus fréquemment retrouvée
est
une délétion de trois paires de bases dans une région codante (exon 10) du
gène CF.
Cette mutation correspond à la délétion, dans la protéine, d'une phénylalanine
en
position 508 (AF508) dans le domaine NBD1. La fréquence d'apparition de cette
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mutation est de 70 % des allèles mutés en moyenne dans les analyses génétiques
(Tsui
et al., 1991) et 50% des patients sont homozygotes pour cette mutation. Les
consé-
quences de cette mutation sont dramatiques car la protéine anormale issue de
la trans-
cription du gène muté (AF508) n'est plus capable d'assurer ses fonctions dans
le
transport de chlorure des cellules épithéliales affectées. L'absence de
courant chlorure
après stimulation des cellules épithéliales des glandes exocrines par l'AMPc
est la
principale caractéristique montrant la présence d'une anomalie sur le gène CF
et
notamment de la mutation (AF508). La densité de mutations la plus élevée se
trouve
dans les deux domaines de fixation des nucléotides (NBD 1 et NBD2). Sept
autres
mutations importantes sont présentes avec des fréquences supérieures à 1 %. La
mutation G551D correspond à la substitution d'un résidu glycine (G) en
position 551
de la protéine par un acide aspartique (D). Les patients CF porteurs de ce
mutant ont
une pathologie sévère avec une insuffisance pancréatique et des troubles
pulmonaires
.graves (Cutting et al., 1990). La fréquence d'observation de cette mutation
atteint 3 à
5 % chez certaines populations de patients atteints de mucoviscidose. A
l'inverse de la
délétion AF508, la protéine CFTR portant la mutation G551D est mature et est
incor-
porée dans la membrane (Gregory et al., 1991). Cependant, la mutation entraîne
une
imperméabilité membranaire et la stimulation de la voie de l'AMPc n'ouvre pas
le
canal associé à l'expression de ce mutant (Gregory et al., 1991 ; Becq et al.,
1994).
D'autres mutations comme R117H, R334W et R347P apparaissent avec des
fréquences basses de 0,8, 0,4 et 0,5% respectivement et sont associées à des
patho-
logies moins sévères (Sheppard et al., 1993). Ces trois mutants expriment une
protéine
CFTR mature, glycosylée permettant son insertion dans la membrane. Cependant
l'amplitude du courant, la conductance unitaire et la probabilité d'ouverture
du canal,
associées avec chacune des trois mutations, sont modifiées (Sheppard et al.,
1993 ;
Becq et al. 1994). La régulation par la voie de l'AMPc semble toutefois
normale pour
ces trois différents mutants, y compris pour AF508 (Becq et al., 1994).
Les porteurs hétérozygotes du gène CF, c'est-à-dire ayant une copie
du gène normal et une copie du gène muté, sont généralement sains et
représentent
environs 5 % de la population caucasienne. Un avantage sélectif est suggéré
pour
expliquer le pourcentage relativement élevé de cette mutation à l'état
hétérozygote au
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cours de l'évolution. Les personnes hétérozygotes auraient été plus
résistantes à des
épidémies de fièvre typhoïde, de choléra, de tuberculose ou de diarrhées
sécrétoires.
Cependant une corrélation entre porteurs hétérozygotes pour le gène
CF et susceptibilité à développer des pathologies diverses, telles que
l'asthme, des
5 polyposes nasales, des sinusites et bronchites chroniques, des
bronchectasies, des
aspergilloses bronchopulmonaires allergiques ou des pancréatites a été établie
par
certains travaux (Griesenbach et al., 1999). Des mutations survenant dans des
régions
flanquantes entre exons-introns du gène CF ont également été décrites. Par
exemple, il
existe des variants polymorphiques 9-, 7- ou 5- thymidines entre l'intron 8 et
l'exon 9.
Le variant polymorphique 5T diminue la synthèse de la protéine CFTR, au
demeurant
normale. L'association du variant 5T sur un allèle avec une mutation de CFTR
sur
l'autre allèle conduit à une agénésie congénitale de canaux déférents (ACCD),
se
caractérisant chez le patient masculin par une infertilité sécrétoire sans
aucun autre
trouble classique de mucoviscidose. Une certaine proportion d'hommes stériles
pourrait en fait être porteurs de ces mutations dans le gène CF, sans
développer la
mucoviscidose proprement dite.
Cette découverte ouvre un débat sur le diagnostic et la classification
de la mucoviscidose, lié aux désordres physiologiques répertoriés chez des
individus
hétérozygotes. On pourrait ainsi définir, à côté des cas de mucoviscidose
classique,
des cas atypiques :
- Dans le cas classique, les patients homozygotes malades, (e.g.
AF508/AF508) ou hétérozygotes composites (e.g. AF508/G551D) présentent la majo-
rité des troubles caractérisés par cette maladie.
- Dans les cas atypiques, les patients, hétérozygotes composites
(AF508/5T...) ou hétérozygotes vrais, montrent des troubles divers : ACCD,
asthme,
sinusites chroniques, etc..., tels que précisés ci-dessus.
Afin de pallier le déficit en protéines CFTR fonctionnelles, aussi
bien dans les cas classiques de mucoviscidose que dans les cas atypiques
marqués par
différents troubles (asthme, bronchectasies, sinusites...), il peut être
envisagé d'activer
pharmacologiquement la protéine CFTR sauvage encore présente (hétérozygotes),
et
les mutants, tels que AF508 ou G551D, insérés dans la membrane, mais inactifs.
Malgré un défaut d'adressage de la protéine AF508 dans les membranes de
cellules
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épithéliales affectées par la mucoviscidose, plusieurs groupes ont montré que
cette
protéine pouvait être fonctionnellement présente, en petit nombre, dans les
membranes
(Dalemans et al., 1991 ; Drumm et al., 1991 ; Becq et al., 1994).
Ainsi, l'utilisation d'activateurs du canal CFTR et notamment
d'ouvreurs du canal CFTR peut optimiser les chances de succès d'une pharmaco-
thérapie des maladies liées à un dysfonctionnement du canal CFTR.
Malgré les progrès réalisés dans la génétique de la mucoviscidose et
dans la biologie et la biochimie de la protéine CFTR, la pharmacologie des
ouvreurs
du canal CFTR est peu développée.
Plusieurs études ont montré qu'en plus des agents généraux bien
connus pour activer la protéine CFTR par la voie de l'AMPc, tels que la
forskoline
(FSK), il était possible d'utiliser d'autres molécules pour activer les canaux
CFTR. Le
mode d'action de ces activateurs est encore peu connu et leurs effets limités.
On peut citer les quelques familles de molécules aujourd'hui
connues pour leurs propriétés d'activateurs ou d'ouvreurs du canal CFTR :
- Les phénylimidazothiazoles (lévamisole et bromotétramisole)
(Becq et al., 1994). Il a été montré que le lévamisole et le bromotétramisole
permet-
tent de contrôler l'activité et le niveau de phosphorylation du canal CFTR.
Toutefois,
ces molécules ne semblent pas pouvoir agir dans toutes les cellules. De plus,
dans un
modèle de souris transgéniques présentant la mutation G551D/GS51D, le bromo-
tétramisole n'a pas eu l'effet activateur attendu.
- Les benzimidazolones (NSOO4) (Gribkoff et al., 1994). Ces
composés, dérivés du noyau imidazole comme le lévamisole peuvent, dans
certaines
conditions, et notamment lorsque le canal CFTR a été phosphorylé, ouvrir le
canal.
Les benzimidazolones sont toutefois également activateurs de nombreux canaux
potassium (Olesen et al., 1994) et sont, de ce fait, peu spécifiques du canal
CFTR.
- Les xanthines substituées comme l'IBMX (3-isobutyl-l-méthyl-
xanthine) ou la théophylline sont d'abord connus comme des inhibiteurs des
phospho-
diesterases intracellulaires (enzymes de dégradation de l'AMPc), de
phosphatases
ainsi que des antagonistes des récepteurs membranaires fixant l'adénosine ;
elles
agissent en outre sur la mobilisation du calcium intracellulaire.
Indépendamment de
ces propriétés ce sont des activateurs du canal CFTR (Chappe et al., 1998). Le
méca-
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nisme d'action des xanthines sur le CFTR est encore mal connu mais pourrait
impli-
quer leur fixation sur les domaines de fixation des nucléotides (NBD1 et
NBD2).
- Les benzo(c)quinolizinium (Demande internationale PCT WO
98/05642 ; Becq et al., 1999) qui sont davantage spécifiques du CFTR mais
peuvent
induire des effets indésirables ; en effet, ces molécules activent le canal
CFTR par une
voie indépendante de l'AMPc. Cependant, à l'heure actuelle, les tests de
toxicité rela-
tive à cette famille de molécules n'ont pas encore été effectués et il n'est
pas impro-
bable que ces molécules puissent se révéler avoir des effets toxiques sur
l'animal.
Ainsi, l'ensemble des traitements actuellement préconisés, soit
manquent de spécificité, soit entraînent trop d'effets indésirables.
C'est pourquoi la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à
des médicaments qui activent spécifiquement le canal chlorure CFTR, tout en ne
modifiant pas le taux de base de l'AMPc, destinés au traitement de pathologies
asso-
ciées à des troubles des flux ioniques transmembranaires, notamment de
chlorure, et
notamment dans les cellules épithéliales chez l'homme ou l'animal.
La présente invention a plus particulièrement pour but de fournir de
nouveaux médicaments susceptibles d'être utilisés dans le cadre du traitement
de la
mucoviscidose, des cas de "mucoviscidose atypiques" (asthme, sinusites
chroniques,
bronchectasies...), de la prévention ou du traitement des obstructions des
voies
bronchiques ou des voies digestives (notamment pancréatique ou intestinale),
de
maladies cardio-vasculaires ou encore rénales.
Les Inventeurs ont en effet trouvé, de manière surprenante, que
certains n-alkanols activent spécifiquement le canal chlorure CFTR (cystic
fibrosis
transmembrane conductance regulator). L'activité du canal CFTR est mesurée à
l'aide de la technique d'efflux d'iodure radioactif (1251) ou de la technique
de patch-
clamp. L'ordre d'activation de CFTR par les n-alkanols est hexanol-1 <heptanol-
t<octanol-1<octanol-2<decanol-1 (1 mM).
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7a
La présente invention telle que décrite de façon large ci-après a,
en conséquence, pour objet l'utilisation des alkanols à chaînes hydrocarbonées
linéaires, ramifiées ou non, ou cycliques en C6-C10, pour la préparation d'un
médicament destiné au traitement des pathologies associées à des troubles des
canaux chlorure CFTR (flux chlorures transmembranaires), notamment dans les
cellules épithéliales, chez l'homme ou l'animal.
L'invention telle que revendiquée exclut toutefois les alkanols à
chaînes hydrocarbonées ramifiés ou cycliques. Elle vise donc uniquement
l'utilisation des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires.
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Le fait que les n-alkanols en C6-C10 ne modifient pas le niveau
d'AMPc des cellules est un avantage pour au moins deux raisons :
- cela est en faveur d'une spécificité d'interaction entre les n-
alkanols et le canal CFTR
- cela permet d'éviter des effets secondaires et non spécifiques qui
peuvent être induits par une augmentation d'AMPc dans les cellules.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, lesdits
n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées linéaires, ramifiées
ou non,
dans lesquels le groupe OH est en position 1 (alcool primaire) ou en position
2 (alcool
secondaire).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation,
lesdits n-alkanols sont des n-alkanols à chaînes hydrocarbonées cycliques
portant un
ou plusieurs groupements alcool (cyclohexane, par exemple).
Les n-alkanols présentent, dans cette application, un certain nombre
d'avantages:
- aucune activation par les n-alkanols n'est détectée dans des cellules
CHO contrôles qui n'expriment pas de CFTR, alors que l'activation de CFTR par
les
n-alkanols dans des cellules CHO Chinese Hamster Ovary) exprimant le canal
CFTR
est bloquée par l'ajout de glibenclamide (100 M), utilisé pour bloquer
spécifique-
ment le canal CFTR.
- les n-alkanols ne modifient pas le niveau de base d'AMPc ; les n-
alkanols activent ainsi spécifiquement le canal CFTR par une voie indépendante
de
1AMPc. L'activation du CFTR par les n-alkanols est indépendante de l'effet
potentiel
de ces molécules sur le découplage cellulaire.
- les n-alkanols agissent par un mécanisme indépendant de la
protéine kinase C.
Parmi les n-alkanols, c'est surtout l'octanol qui a déjà été proposé
dans de nombreuses applications :
1. comme molécules anesthésiques ; il exerce des effets complexes
sur les membranes biologiques. Une théorie physico-chimique avait été avancée
pour
expliquer la puissance effectrice des anesthésiques. L'efficacité des
anesthésiques
augmenterait en fonction de leur solubilité dans les graisses et serait une
fonction
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linéaire du coefficient de partition octanol-eau (la loi de Meyer-Overton sur
l'anesthésie). En fait les mécanismes impliqués dans les effets des n-alkanols
ne sont
pas élucidés. Cependant, deux hypothèses générales ont été proposées pour
expliquer
les effets des n-alkanols sur les protéines associées aux membranes
biologiques :
- La première suggère que les n-alkanols altèrent les propriétés
physiques de la membrane, propriétés nécessaires au fonctionnement normal des
protéines membranaires.
- La deuxième suggère que les n-alkanols se fixent directement dans
des régions hydrophobes spécifiques des protéines (Mascia et al., 2000).
Il est probable que les deux mécanismes interviennent. Cependant,
c'est actuellement la deuxième hypothèse qui retient l'intérêt, la première
ayant été
contredite par des expériences qui montrent que les perturbations de la
fluidité
membranaire, engendrées par les n-alkanols, étaient mimées par une
augmentation de
température corporelle (fièvre), sans pour autant observer les mêmes effets
sur
l'activité électrique.
Une caractéristique commune de l'action de ces molécules est la
modulation du signal électrique qui est due à l'altération de la conductance
membra-
naire par les canaux ioniques.
2. dans la régulation du récepteur-canal Cl- au GABA (acide
gamma-aminobutyrique) (Narahashi et al., 1998 ; Marszalec et al., 1994 ;
Nakahiro et
al., 1991). Ces récepteurs sont exprimés au niveau du système nerveux central.
3. comme broncho-dilatateurs : les n-alkanols interviennent dans la
relaxation des muscles lisses des voies aériennes en diminuant notamment la
concen-
tration intracellulaire de calcium ([Ca2+];) (Sakihara et al., 2002).
4. action au niveau des jonctions cellulaires en altérant la conduc-
tance des jonctions communicantes dans de nombreux tissus y compris le tissu
épithé-
lial (Weingart et al., 1998) ; cet effet concerne plus spécifiquement les
agents lipo-
philes, tels que les n-alkanols â longue chaîne. Le mécanisme moléculaire
résultant du
découplage cellulaire demeure obscur.
5. Les alcools tel que l'octanol, comme agents anti-émulsifiants, ont
déjà été utilisés, en aérosol, chez des patients souffrant d'oedèmes
pulmonaires
(Miller et al., 1973), mais leurs mécanismes d'action demeurent inconnus.
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L'utilisation de certains n-alkanols, dans le traitement des patho-
logies associées à des troubles des flux ioniques transmembranaires de
chlorure dans
les cellules épithéliales et notamment de la mucoviscidose et des
mucoviscidoses
atypiques vient d'être trouvé par les Inventeurs.
5 En effet, de manière surprenante, les n-alkanols en C6-Clo, notam-
ment nébulisées dans les bronches des patients sous forme d'aérosol ou de
nébulisat,
activent ou potentialisent l'activité de canaux CFTR sauvages ou mutés mais
présents
à la membrane des cellules notamment chez des patients atteints de
mucoviscidose.
L'activation du canal CFTR par les n-alkanols, pourrait en outre
10 favoriser un effet broncho-dilatateur au niveau des fibres musculaires
lisses des
bronches et bronchioles, et contribuer à l'amélioration de la fonction
respiratoire des
patients atteints de mucoviscidose aussi bien que des patients atteints
d'insuffisance
respiratoire, non liée à une mucoviscidose, telle que l'asthme.
De manière générale, lesdits n-alkanols peuvent être administrés par
voie parentérale : administration intradermique, intraveineuse,
intramusculaire ou
sous-cutanée ; par voie intra nasale et buccale : aspiration ou nébulisation
par aérosol ;
par voie orale ; par voie sublinguale.
De manière préférée, lesdits n-alkanols sont administrés sous une
forme adaptée à une administration intra nasale ou buccale, de manière à
obtenir un
contact direct entre lesdits n-alkanols et la surface des muqueuses broncho-
pulmo-
naires. Par exemple, lesdits n-alkanols sont présentés sous une forme liquide,
pour une
administration sous la forme d'un aérosol ou sous la forme d'un nébulisat, et
ce à
l'aide d'un dispositif de nébulisation, du type de ceux utilisés aussi bien
dans le
traitement de l'asthme que dans celui de la mucoviscidose.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits
n-alkanols sont associés à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable
adapté à ladite administration intra nasale ou buccale.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdits
n-alkanols sont de préférence administrés à une concentration comprise entre
0,001 %
et 0,1 % (v/v), correspondant à une valeur comprise entre 10 et 1000 ppm
(parties par
million), soit de 10 mg/kg à 1 g/kg.
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Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui
se réfère à
des exemples de mise en oeuvre de l'utilisation objet de la présente invention
ainsi
qu'aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre : (A) Comparaison de l'effet de l'octanol-1 et de
la FSK sur l'efflux de 125I (% en ordonnée) en fonction du temps (min, en
abscisse)
dans les cellules CHO-CFTR(+). (B) Effet de l'octanol-1 et de la FSK sur
l'efflux de
125I (% en ordonnée) en fonction du temps (min en abscisse) dans les cellules
contrôles CHO-CFTR(-). (C) Effet de l'octanol-1 (0,25 à 5 mM) et de la FSK (5
M)
sur l'efflux de 125I (vitesse d'efflux en ordonnée) dans les cellules
contrôles CHO
CFTR(-) (D) Effet de l'inhibition spécifique de CFTR par 100 M de
glibenclamide
sur l'efflux de 125, (vitesse d'efflux en min-' en ordonnée) stimulé par
l'octanol-1, la
FSK ou l'octanol-1 et la FSK, dans les cellules CHO-CFTR(+).
--la figure 2 illustre l'effet de doses croissantes (en abscisse) de FSK
ou d'octanol-1 sur l'efflux de 125, (vitesse d'efflux en min -1 en ordonnée)
dans les
cellules CHO-CFTR(+).
- la figure 3 illustre : (A) Effet de la FSK (1 M) en présence et en
l'absence de glibenclamide (100 M) sur le courant enregistré en configuration
cellule
entière, représentant l'activation du canal CFTR. (B) Effet de l'octanol-1 (1
mM) sur
le courant induit par l'activation de CFTR, en présence et en l'absence de
glibenclamide (100 M) pour inhiber spécifiquement le canal CFTR.
L'enregistrement est effectué dans les cellules CHO-CFTR(+), n = 4.
- la figure 4 illustre : (A) Effet de la longueur de la chaîne hydro-
carbonée des n-alkanols (en abscisse) dans l'activation de l'efflux de 125I
(vitesse
d'efflux en min -1 en ordonnée). (B) Effet de l'octanol-2 sur l'activation de
l'efflux de
125, (vitesse d'efflux en min-' en ordonnée).
- la figure 5 illustre l'effet de l'octanol-1 (1 mM) et de l'acide 18-
alpha glycerrhetinique (a-GA 10 M) sur la réponse calcique induite par une
stimula-
tion d'ATP qui met en jeu la communication intercellulaire.
- la figure 6 illustre l'effet du découplage cellulaire dans l'activation
de l'efflux de 125I (% en ordonnée), par une application d'acide 18-alpha
glycerrheti-
nique (a-GA 10 et 100 M) (n = 12), en comparaison à l'effet de l'octanol-1.
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- la figure 7 illustre : (A) Effet de l'inhibition de la protéine kinase A
par du H-89 (30 M, 30 min) sur l'activation de l'efflux de 125I (taux
d'efflux en min-'
en ordonnée) induite par l'octanol-1 (1 mM), la FSK (1 M) ou une co-
stimulation
octanol-1 + FSK. (B) Effet de l'inhibition de la protéine kinase C (GF109203X,
100
nM, 30 min) sur l'activation de l'efflux de 1251 (taux d'efflux en min-' en
ordonnée)
induite par l'octanol-1 (1 mM).
- la figure 8 illustre l'effet des n-alkanols sur le niveau de l'AMPc
intracellulaire total en comparaison au niveau basal et à une stimulation par
de la FSK
(5 M).
- la figure 9 illustre : (A) Effet de l' octanol-1 (1 mM) sur l' efflux
d'iodure (miri 1) en fonction du temps (min) dans les cellules épithéliales
humaines
d'origine bronchiques Calu-3, avec (n = 8) ou sans prétraitement par du
glibenclamide
(100 M, 1 heure) (n = 8), et avec (n = 8) ou sans prétraitement par du DIDS
(500
M, 1 heure) (n = 8). La flèche représente le moment où l'octanol-1 (1 mM) est
ajouté, avec ou sans glibenclamide et avec ou sans DIDS. (B) L'effet maximum
de
l'octanol-1 est normalisé à 100 %. Effet du traitement par du DIDS (500 M, 1
heure)
ou du glibenclamide (100 M, 1 heure) sur la réponse maximale de l'octanol-l,
le
niveau basal est indiqué. (Test t : * * * P < 0.001 ;' ns : non significatif).
(C) Effet de
doses croissantes (en abscisse) d'octanol-1 en présence ou non de FSK (1 M)
sur
l'efflux de 125I (vitesse d'efflux en min-' en ordonnée) dans les cellules
Calu-3. (D)
Courbe dose-réponse d'octanol-1 (n = 8 pour chaque concentration testée) en
présence
ou en absence de FSK (1 M), représentée en % du maximum d'activation obtenue
pour 10 mM d'octanol-l. La concentration de demi-effet (EC50) de l'octanol-1
est de
512 M en présence de FSK (1 M) et de 1,14 mM en absence de FSK (1 M).
- la figure 10 illustre : (A) Effet de l'octanol-1 (1 mM) (n = 8) ou
d'un cocktail de drogues utilisé pour activer de façon maximale le canal muté
CFTR-
AF508 (FSK 10 M plus génistéine (GST) 30 M) (n = 8) sur l'efflux d'iodure
(min-
') en fonction du temps (min) dans les cellules épithéliales bronchiques
humaines
JME/CF 15 extraites à partir de patients atteints de mucoviscidose. La flèche
repré-
sente le moment où l'octanol-l (1 mM) ou la FSK 10 M + GST 30 M sont
ajoutés.
(B) Représentation du pourcentage d'activation de CFTR-AF508 obtenu avec
l'octanol-1 (1 mM) par rapport à l'activité maximale obtenue avec le cocktail
FSK
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M + GST 30 M, qui est normalisée à 100 % de la réponse maximale. (C) Effet
du prétraitement par du glibenclamide (100 M, 1 heure) (n = 8) ou du
prétraitement
par du DIDS (500 M, 1 heure) (n = 8) sur la réponse maximale (normalisée à
100 %
d'activation) obtenue avec 1 mM d' octanol-1 (Test t : * * * P < 0.001 ; ns :
non signi-
5 ficatif).
- la figure 11 illustre la réversibilité de l'effet de l'octanol-1 (1 mM)
sur l'activation de CFTR étudiée par patch-clamp en configuration cellule
entière dans
les cellules CHO-BQI. Famille de courants évoquée dans une cellule CHO-BQI par
des dépolarisations successives entre -80 et +15 mV à partir d'un potentiel de
maintien
10 de -60 mV et par incrémentation de 5 mV, en absence (contrôle), en présence
d'octanol-1 (1 mM) et après 15 min de lavage de l'octanol-1 par un milieu
salin
physiologique de rinçage.
- la figure 12 illustre la structure des n-alkanols en C2-CIO-
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés
uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne
constituent en
aucune manière une limitation.
Exemple : Mise en évidence des propriétés des n-alkanols comme ouvreurs ou
activateurs de CFTR
1) Méthodes expérimentales.
1.1) Cellules en culture.
Les études sur la CFTR sont d'une 'part réalisées sur des cellules
CHO (Chinese Hamster Ovary tells) qui expriment la protéine CFTR humaine
recombinante (CHO-CFTR(+)) (Riordan et al., 1989). Ces cellules sont cultivées
à
37 C dans une étuve saturée en eau contenant 5% de C02 dans du milieu aMEM
additionné de sérum de veau foetal (7,5 %), de 2 mM glutamine, de 50 I.U/ml de
pénicilline et de 50 g/ml de streptomycine. Les cellules qui n'expriment pas
la CFTR
sont notées CHO-CFTR(-) et sont cultivées dans du milieu DMEM/F12 dans les
mêmes conditions que précédemment.
Les études de CFTR sont aussi réalisées sur les cellules Calu-3
(ATCC n HTB-55) qui sont des cellules épithéliales pulmonaires humaines expri-
mant de façon endogène le canal CFTR. Ces cellules sont cultivées dans les
mêmes
conditions de culture que les cellules CHO. L'étude du canal CFTR muté est
réalisée
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sur les cellules JME/CF 15, cellules épithéliales extraites de voies aériennes
respira-
toires de patients atteints de mucoviscidose (homozygote AF508) (Jefferson et
al.,
1990). Ces cellules expriment donc le canal CFTR muté AF508. Ces cellules sont
cultivées dans les mêmes conditions que précédemment mais le milieu de culture
est
supplémenté avec un mélange hormonal contenant : adénine (180 M), insuline (5
g/ml), transférine (5 pg/ml), hydrocortisone (1,1 M), triiodothyronine (2
nM),
épinéphrine (5,5 M), facteur de croissance épidermique (1,64 nM).
1.2) Technique du Patch-clamp, appliquée à l'étude des cellules en
culture.
La technique du patch-clamp consiste à appliquer une pipette ou une
microélectrode de verre à la surface d'une cellule. En aspirant légèrement, il
est
possible de faire adhérer la membrane au verre. Un petit morceau de membrane
(Patch) est ainsi isolé au bout de la pipette : c'est le principe du Patch-
clamp (O.P.
Hamill et al. Pflügers Arch., 1981-, 391, 85-100; R. Penner, A Practical Guide
to
Patch Clamping, 1995, In Single Channel Recording, 2ème édition (Eds. B.
Sakamnn et
al.) Plenum Press, New York, 3-30). Pour ce faire, la pipette de patch-clamp
doit avoir
une pointe de l'ordre de 1 m de diamètre et une résistance de l'ordre de 1-5
M. La
résistance d'une pipette ou d'une microélectrode permet d'apprécier la finesse
de la
pointe : plus la résistance est grande, plus la pointe est fine ou l'électrode
est bouchée.
Le diamètre de la pipette de patch-clamp ne permet pas de pénétrer dans la
cellule
mais par contre, il permet effectivement d'emprisonner un morceau de membrane
dans la pointe. Des interactions entre la membrane et le verre vont se former,
aidées
par une légère succion ou pression négative de la pipette. La qualité de cette
interaction (ou scellement) est également appréciée en mesurant la résistance
entre le
verre et la membrane. Pour mesurer des courants globaux en configuration
cellule
entière, une résistance de scellement de 1 GS2 est suffisante.
De manière générale, on mesure des enregistrements de courant
électrique à travers un patch contenant, par exemple, un canal. Le potentiel
de
membrane imposé (Eciarnp) est généralement en millivolts. Lorsque le canal est
fermé
le courant oscille faiblement autour d'un niveau de base (état F). Cet infime
courant
de base circule dans les fuites entre le Patch et l'extrémité de la
pipette. Lorsque le
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canal s'ouvre (état O), le courant saute à un autre niveau, puis revient au
niveau de
base quand le canal se ferme et ainsi de suite.
Les mesures peuvent être réalisées dans l'une des configurations
suivantes : cellule attachée (cell-attached), cellule entière (whole-tell),
patch excisé
5 intérieur-extérieur (inside-out) ou patch excisé extérieur-extérieur
(outside-out).
Les expériences de patch-clamp sont effectuées sur des cellules
confluentes.
De manière plus précise, les boîtes de culture (support des cellules)
sont placées dans une cuve d'expérimentation (volume 1 ml) sur la platine d'un
10 microscope inversé (Nikon) équipé avec un éclairage en contraste de phase.
La confi-
guration cellule entière (whole-tell) est utilisée pour l'enregistrement des
courants
cellulaires (Hamill et al., 1981). Les expériences sont réalisées à
température ambiante
(20-22 C). Les courants sont amplifiés avec un amplificateur Axopatch 200B
(Axon
Instrument LTd) possédant un filtre passe-bas de 2-5 kHz (filtre Bessel à 6
pôles) et
15 enregistrés sur le disque dur d'un ordinateur PC après digitalisation à 10-
25 kHz. La
fabrication des pipettes s'effectue à partir de tubes de verre de 1 mm de
diamètre
(Clark Electromedical Instrument) en quatre étapes avec une étireuse
horizontale
(Bruwn Flaming 97, CA).
Les pipettes, remplies d'une solution intracellulaire contenant en
mM : 60 KCI; 80 NMDG (N-méthyl-G-glucamine); 10 HEPES ; 5 EGTA ; CaC12 1;
MgATP 4; Na3GTP 0,2; pH 7,4 titré avec KOH), ont une résistance de 5 M52. Les
potentiels sont exprimés comme la différence entre le potentiel de l'électrode
de patch
et celui du bain. En configuration cellule entière, ils représentent le
potentiel de la
membrane de la cellule. Les potentiels de jonction qui se forment entre
l'électrode
d'enregistrement et le milieu extracellulaire sont annulés avant le contact de
l'électrode avec la cellule. Le potentiel d'inversion du courant chlore est
obtenu à
partir de l'équation de Nernst (Erev = (RT/F) log ([Cl]i/[Cl]e)) ; i et e
concentration
ionique intracellulaire et extracellulaire, R, T et F ont leur signification
habituelle. Les
relations courant-voltage à l'état stationnaire sont déterminés en utilisant
des rampes
lentes (20 mV/.s) de voltage en condition de voltage imposé.
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La solution extracellulaire d'enregistrement est constituée (en mM) :
110 NaCI ; 23 NaHCO3 ; 3 KCl ; 1,2 MgCl2; 2 CaC12 ; 5 HEPES ; 1 l D-glucose;
gazée avec du C02 5 % - 02 95 %; pH 7,4.
1.3) Mesure des flux de traceurs radioactifs appliquée à l'étude des
cellules épithéliales en culture.
Le canal CFTR étant perméable aux halogénures (Br-> CI-> F > F),
la mesure d'efflux d'iodure radioactif 125I s'est révélé être une technique
efficace pour
mesurer l'activité du canal CFTR (Chang et al., 1998). Cette technique permet
de
suivre la cinétique de sortie de l'iodure radioactif 125I. Les cellules sont
cultivées dans
des plaques 24 puits avec une dilution au 1/10 après passage. Le quatrième
jour de
culture, les drogues à tester sont mises en solution en fonction de la
concentration
voulue, à 37 C, dans du milieu B à pH 7,4, contenant en mM : 137 NaCI, 5,36
KCI,
0,8 mM MgCl2 1,8 mM CaC12, 5,5 glucose et 10 HEPES-NaOH. Les puits sont lavés
4 fois avec 500 l de milieu B. La solution est ensuite remplacée par 500 l
de solu-
tion de charge contenant 1 M KI et 0.5 Ci de i25INa/ml pendant 30 min. La
cinétique de sortie de 125i est réalisée après avoir éliminé la solution de
charge et lavé
4 fois les puits par 500 l de milieu B. Pour la cinétique de sortie de
125I5500 l de
milieu B contenant ou non les molécules à tester sont incubés 30 sec dans le
puits et
récupérés dans un tube à hémolyse pour être remplacés par 500 l de milieu B
conte-
nant ou non les molécules à tester. L'opération est répétée toutes les 30 s
pendant 2 à 6
min. A la fin de l'efflux, les ions intracellulaires sont extraits en ajoutant
1 ml d'acide
trichloracétique (7,5 %) sur la couche cellulaire. Tous les échantillons sont
comptés
dans un compteur gamma (Kontron). Les protéines précipitées sont solubilisées
dans
0,1 N NaOH et quantifiées en utilisant un test colorimétrique.
1.4) Analyse des données
Le traceur contenu dans la couche cellulaire au début de l'efflux est
calculé comme la somme des échantillons et des extraits comptés. Les courbes
d'efflux sont construites en exprimant le pourcentage du contenu restant dans
la
couche cellulaire (1%) par rapport au temps. Les constantes de taux d'efflux
(k, min -1)
stimulé ou non sont déterminés en lissant les courbes d'efflux en une fonction
mono-
exponentielle 1% = 100*exp(-kt) en utilisant une régression linéaire du
logarithme
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népérien des données, k est utilisé pour calculer l'iodure libéré dans le
milieu par
rapport au temps. L'hypothèse est faite que, en présence d'un stimulateur,
l'efflux est
la somme de deux efflux d'iodure survenant en parallèle : un efflux basal et
un efflux
stimulé caractérisé respectivement par les constantes kb et ks. L'efflux net
total est
alors décrit par l'équation It%=100*(1-exp(-ktt)) où kt est la somme de kb et
ks. Fina-
lement, ks calculée comme kt-kb est utilisée pour établir une relation dose-
réponse
pour des antagonistes. Les données sont exprimées comme des moyennes + SD, et
le
test-t est utilisé pour déterminer les significativités. Les courbes
concentration-réponse
d'agonistes ou d'antagonistes sont lissées en utilisant l'équation
hyperbolique Y =
Ymax* X/(EC50 + X), où Y est la réponse. Y commence au basal et va jusqu'au
plateau
(Ymax), X est la concentration et les valeurs de demi-effet (EC sont calculées
en utili-
sant GraphPad Prism v3.0 (GraphPad Software).
1.5) Dosage de l'AMPc intracellulaire total
Les -cellules CHO sont cultivées _ pendant quatre jours dans une
plaque de culture de 24 puits. Au quatrième jour de culture, chaque puits est
rincé
deux fois avec 500 l de milieu B, et 500 l de ce tampon contenant la
molécule à
tester sont ajoutés à chaque puits. Après 5 min d'incubation à 37 C, la
réaction est
arrêtée en ajoutant un tampon de lyse cellulaire. La lyse cellulaire est
vérifiée au bleu
Trypan. La quantité d'AMPc contenue dans les cellules est déterminée en
utilisant le
kit de dosage Enzyme hnmuno Assay (Amersham Biotechnology). Le niveau d'AMPc
est exprimé en pmoles/puits + SD.
1.6) Imagerie cellulaire et mesure de la concentration intracellulaire
de Ca2+ (rCa2+1;1
Les mesures de Ca2+ sont réalisées en présence de fura-2 (sonde
fluorescente imperméante) qui lie le Ca2+. Les cellules sont incubées dans du
milieu
de culture DMEM/F 12 sans sérum en présence de la forme perméante du fura-2
(fura-
2/AM, 2,5 M) pendant lh à 37 C. Les cellules placées sur la platine d'un
microscope
(Olympus) à épifluorescence (objectif 20 X), sont perfusées avec les solutions
à tester
(e.g ATP, octanol). Elles sont séquentiellement illuminées à 340 nm et 380 nm
et la
fluorescence émise (F) est mesurée à 510 nm. Elle est détectée via une caméra
CCD
12-bits (Sony) connectée à une unité informatique pour le traitement des
données
(TILL Photonics). La concentration de Ca2+ intracellulaire [Ca2+]; est
calculée en utili-
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sant l'équation de Grynckiewicz (Grynckiewicz et al., 1985) : [Ca2+]; Kd*(R-
Rmin/Rmax-R, à partir de l'analyse ratiométrique R (340/380 Mn) de la
fluorescence
(TILL Vision) ; Rma,, et Rmin désignent le rapport de fluorescence mesuré en
présence
ou en l'absence de Cal+.
2) Résultats
Les concentrations des n-alkanols mises en oeuvre vont de 0,1 à 10
mM. Ces concentrations représentent des proportions finales (v/v) de 0,001 %
(pour
0,1 mM d'alcools) à 0,1 % au maximum (pour 10 mM d'alcools).
2.1) L'octanol active spécifiquernent le canal CFTR
Les molécules testées sont les n-alkanols et notamment doctanol-l,
qui ont été testées pour leur capacité à activer le canal CFTR.
Le criblage des molécules en tant qu'ouvreurs du canal CFTR a été
réalisé en mesurant leur effet sur l'efflux d'iodure radioactif 125I et sur
les courants de
chlorure transmembranaires. Ces données ont été complémentées par la mesure du
taux d'AMP cyclique (AMPc) intracellulaire et de ses variations dans diverses
situa-
tions expérimentales
L'évaluation de l'effet d'activation du CFTR par les n-alkanols est
tout d'abord réalisée sur la lignée cellulaire CHO-CFTR(+). Les cellules CHO-
CFTR(-) n'exprimant pas la protéine CFTR ont été utilisées comme cellules
contrôles.
L'A23187 (2 M) (un ionophore de calcium) est sans effet sur l'efflux de 125I
aussi
bien dans les cellules CHO-CFTR(+) que CHO-CFTR(-), montrant qu'il n'y a pas
de
canaux Cl" dépendants du calcium intracellulaire (Chappe et al., 1998). Le
canal
CFTR étant principalement régulé par des protéines kinases A, les expériences
contrôles ont fait appel à la FSK pour stimuler le taux d'AMPc
intracellulaire.
La figure 1 A montre une activation de CFTR obtenue par une appli-
cation soit de 1 M de FSK (FSK), d'octanol-1 (1 mM) ou une application
combinée
de FSK. (1 M) et d'octanol-1 (1 mM) dans des cellules CHO-CFTR(+).
L'activation
du canal CFTR, mesurée par l'efflux de 125I induit une augmentation de
l'amplitude de
l'efflux d'iodure (exprimé en % de 1251 libéré dans le milieu) et de la
vitesse de sortie
de 1251.
Sur la figure 1B, les expériences contrôles permettant d'évaluer la
spécificité des molécules testées sur l'activité du canal CFTR ont été
réalisées sur des
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cellules CHO-CFTR(-), en présence ou non d'activateurs (FSK 1 M, octanol-l 1
mM). Dans ces cellules CHO-CFTR(-), l'octanol-1(0,1 à 5 mM) et la FSK (5 M)
ne
modifient pas significativement le niveau basal de l'efflux de 125I (figure
1C).
L'effet activateur de l'octanol-1 aussi bien que de la FSK (1 M) ou
d'une application combinée de FSK et octanol-1 sur CFTR est complètement
inhibé
par l'addition de glibenclamide (100 M) communément utilisé pour inhiber
spécifi-
quement le canal CFTR (Figure 1D). Ces résultats confirment la spécificité de
l'octanol-1 sur l'activité de CFTR.
Les cellules CHO-CFTR(+) sont ensuite stimulées avec des concen-
trations croissantes de FSK ou d'octanol-l, et les constantes de vitesses
d'efflux de 1251
sont mesurées. La figure 2 représente une courbe dose-réponse d'octanol-1 (0,1
à 5
mM) ou de FSK (0,1 à 5 M) sur l'activation de CFTR. On peut voir sur la
figure 2
que l'activation de CFTR par la FSK ou par l'octanol-l est dépendante de la
concen-
tration avec une EC50 d'environ 0,5 M pour la FSK et de 0,5 mM pour l'octanol-
1.
Les effets de l'octanol-1 sur l'activation du CFTR sont observables pour des
concen-
trations d'octanol-1 de 0,3 mM à 5 mM, avec un plateau atteint à 1 mM et une
dose de
demi-activation de 0,5 mM.
De même, l'activation de CFTR par la FSK ou l'octanol-1 est obser-
vée en patch-clamp, en configuration cellule entière. Les figures 3A et 3B
montrent
respectivement que la FSK (1 M) et I'octanol-l (I mM) produisent une
augmentation
d'environ 10 fois de la conductance membranaire par rapport au contrôle. Le
potentiel
de réversion du courant induit par la FSK ou par l'octanol-l est de 1 0,6
mV, mon-
trant que le Cl- est l'ion principal qui contribue à ce courant. Ce courant
induit par la
FSK ou par l'octanol-I est complètement inhibé par l'application de
glibenclamide
montrant que c'est bien le canal CFTR qui est impliqué dans le courant induit
soit par
la FSK soit par l'octanol-1. La figure 3B montre qu'une application d'octanol-
1 seul
(1 mM), c'est-à-dire sans FSK, induit une pleine activation du canal CFTR.
2.2) L'octanol-1 stimule spécifiquement le canal CFTR dans des
cellules épithéliales bronchiques humaines (Calu-3).
La capacité de l'octanol-l à stimuler CFTR dans une lignée de
cellules épithéliales bronchiques humaines (Calu-3) a également été testée.
Comme le
montre la figure 9A 1'octanol-1 active la sortie d'iodure dans les cellules
Calu-3. Cet
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efflux activé par l'octanol-1 est fortement bloquée par un traitement (1
heure) par le
glibenclamide (100 M), un inhibiteur du canal CFTR, alors qu'un traitement (1
heure) par 500 M de DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbène-2,2'-acide
disulfonique),
utilisé pour bloquer les canaux Cl- sauf le canal CFTR qui y est insensible,
est sans
5 effet (Figure 9B). L'ensemble de ces résultats montre que l'octanol-1 active
spécifi-
quement le canal CFTR humain endogènement exprimé dans les cellules
épithéliales
bronchiques humaines Calu-3. De plus, comme observé dans les cellules CHO-
CFTR(+) (voir figure 1), l'octanol-1 active le canal CFTR humain d'une manière
dose-dépendante (0,1 à 10 mM) dans les cellules Calu-3 (Figures 9C, D). Enfin,
une
10 courbe dose-réponse d'octanol-1 réalisée en présence de FSK (1 M) déplace
vers la
gauche la courbe dose-réponse d'octanol-1, indiquant une potentialisation par
la
forskoline de l'activation de CFTR par l'octanol-l. En outre, l'activation du
canal
CFTR par de l'octanol-1 pour des concentrations supérieures à 0,5 mM est
supérieure
à celle obtenue par la FSK (1 M), puisque l'octanol-1 potentialise l'activité
du canal
15 CFTR stimulé par la FSK (1 M) (Figures 9C, D).
2.3) L'octanol-1 active spécifiquement le canal CFTR muté AF508
dans des cellules épithéliale d'origine pulmonaire (CF15) de patients atteints
de
mucoviscidose homozygotes zF508.
La capacité de l'octanol-1 à activer le canal CFTR muté AF508 a été
20 testée. La mutation AF508 est retrouvée chez plus de 70 % des patients
atteints de
mucoviscidose. Une grande majorité du canal CFTR muté AF508 est dégradée par
le
système ubiquitine-prôtéasome à l'intérieur de la cellule, et seulement une
très faible
quantité de canal muté arrive à la surface de la membrane où il peut être
activé. Des
cellules épithéliales bronchiques humaines JME/CF 15 extraites à partir de
patients
atteints de mucoviscidose et homozygotes pour la mutation AF508 ont été
utilisées. La
molécule MPB-91, connue pour adresser un certain nombre de canaux CFTR-AF508 à
la membrane plasmique, (Donner et al., 2001) a également été utilisée. Les
canaux
CFTR mutés AF508, présents à la membrane plasmique ont été stimulés, par
l'octanol-l (1 mM). La figure lOA montre que l'octanol-1 active spécifiquement
le
canal CFTR muté AF508. Un cocktail de stimulateurs (FSK 10 M + génistéine 30
M) permet d'obtenir l'activité maximale pour le canal muté CFTR-AF508.
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L'octanol-1 (1 mM) est capable, à lui seul, d'activer environ 50 % de
l'activité maxi-
male du canal CFTR-AF508 muté (Figure 1OB). Cette activation de CFTR-AF508 est
inhibée par le glibenclamide (100 M) alors qu'elle est insensible au DIDS
(500 M)
(Figure 10C), démontrant que l'octanol-1 stimule spécifiquement le canal CFTR
muté
AF508. De plus, l'octanol-l n'a aucun effet sur le niveau basal, lorsque le
canal muté
n'est pas présent à la membrane plasmique, montrant qu'il n'active pas
d'autres
conductances chlorure et qu'il est bien spécifique du canal CFTR. L'ensemble
de ces
résultats démontre que l'octanol-1 est capable d'activer le canal CFTR muté
AF508
dans des cellules épithéliales pulmonaires humaines de patients atteints de
mucovisci-
dose. L'octanol-1 est ainsi d'un grand intérêt pour envisager un traitement
pharmaco-
thérapeutique de la mucoviscidose.
2.4) L'effet activateur de l'octanol-1 sur CFTR est réversible
Nous avons enfin examiné à l'aide de la technique de patch-clamp en
configuration
cellule entière sur les cellules CHO-BQ 1 qui expriment le canal CFTR humain,
si
l'effet de l'octanol-1 (1 mM) sur les canaux CFTR était réversible. Comme
indiqué
dans la figure 11, on voit que l'octanol-1 (1 mM) entraîne une augmentation de
courant due à l'activation de CFTR. Après 15 min de lavage de octanol-1 (1 mM)
par
une solution saline physiologique, l'activation des canaux CFTR disparaît,
indiquant
que l'effet activateur de 1'octanol-1 sur CFTR est réversible.
2.5) Les n-alkanols à chaîne hydrocarbonée longue (C6 à Cio)
activent le canal CFTR (voir figure 12 pour la structure des n-alkanols)
L'effet d'autres n-alkanols que l'octanol-1 sur l'activation de CFTR
a également été testé. La figure 4A montre que l'utilisation de n-alkanols
ayant des
longueurs de chaînes hydrocarbonées égales ou supérieures à celles de
l'hexanol-l
(C6) jusqu'au décanol-1 (C10), active significativement le canal CFTR.
L'activation
de CFTR augmente en fonction de la longueur de la chaîne hydrocarbonée (c'est-
à-
dire en fonction de l'hydrophobicité) de l'alcool. La figure 4 montre une
activation
croissante de la CFTR suite à l'application d'hexanol-1 (C6), d'heptanol-l
(C7),
d'octanol-1 (C8), ou de décanol-1 (CIO). Pour des n-alkanols ayant des chaînes
hydro-
carbonées courtes (éthanol, butanol-1), l'efflux de 125I n'est pas
significativement
différent de l'efflux non stimulé, indiquant que l'éthanol et le butanol
n'activent pas le
canal CFTR.
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Sur la figure 4B, on peut voir que l'octanol-2 active aussi la protéine
CFTR. Ce qui montre que la position du radical OH sur la molécule en position
1 ou
en position 2 n'est pas critique pour l'activation du canal CFTR.
2.6) L'activation de CFTR par les n-alkanols n'est pas due au
découplage cellulaire
L'octanol et les autres n-alkanols peuvent modifier le découplage
cellulaire dû aux jonctions communicantes (jonction gap). Un tel découplage
est mis
en évidence dans des cellules CHO, en mesurant la réponse calcique induite par
une
application d'ATP. Pour ce faire, une molécule totalement différente des n-
alkanols
mais connue pour découpler les cellules, l'acide 18-alpha glycerrhetinique (a-
GA), a
été utilisée. Les figures 5A-C montrent que l'application d'a-GA (10 à 100 M)
ou
d'octanol-1 (1 mM) découple bien les cellules comme le montre la réponse
calcique
induite par l'ATP. Mais aucun effet de (a-GA) sur l'activité du canal CFTR
n'est
observé (Fig. 6). L'activation de CFTR par les n-alkanols n'est donc pas due à
leur
propriété de découplage cellulaire.
2.7) L'activité de la protéine kinase A est nécessaire à l'activation
de CFTR par l 'octanol-1
La phosphorylation du canal CFTR notamment par la protéine
kinase A (PKA) a été montrée comme nécessaire pour la fonction et l'activation
du
canal. L'activation du canal CFTR par les n-alkanols est inhibée par le
traitement avec
du H-89 (30 M), utilisé pour inhiber les PKA (Figure 5A), ce qui montre
qu'une
phosphorylation constitutive du canal CFTR est nécessaire à son activation par
l' octanol-1.
De récentes études ont montré qu'une phosphorylation de CFTR par
la protéine kinase C (PKC) pouvait être un pré-requis pour une activation de
CFTR.
L'octanol a été montré comme pouvant activer certains sous-types de PKC. Un
inhi-
biteur puissant des PKC en présence d'octanol-1 a donc été utilisé. Dans ces
condi-
tions, l'activation de CFTR par l'octanol-1 n'est pas inhibée (figure 7). Ces
résultats
montrent que l'octanol-1 active bien CFTR par un mécanisme indépendant des
PKC.
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L'octanol et les n-alkanols peuvent interagir directement avec le
canal CFTR au niveau des sites hydrophobes de la protéine, afin d'induire une
modifi-
cation de conformation favorable à son activation.
Les n-alkanols n'induisent pas d'augmentation d'AMPc, l'activation
de CFTR par les n-alkanols n'est donc pas due à une élévation du taux d'AMPc
induite par les n-alkanols.
La littérature indique que les n-alkanols à chaîne longue ne sont pas
des activateurs potentiels de l'adénylate cyclase et donc du niveau d'AMPc
intra-
cellulaire mais auraient plutôt un effet inhibiteur. La figure 8 présente les
taux
d'AMPc intracellulaire dans la cellule CHO-CFTR(+), mesurés après 5 min en
présence de 5 M ou 1 M de FSK (activateur de l'enzyme de synthèse de l'AMPc
;
adénylate cyclase), de 1 mM d'octanol-1, d'hexanol-1 ou d'éthanol. Alors que
la FSK
1 M ou 5 M augmente significativement le niveau d'AMPc, ni l'octanol-l,
l'hexanol-1 ou l'éthanol ne modifient le niveau basal d'AMPc. Appliqué seul,
l'octanol-1 déclenche l'activation du canal CFTR sans augmenter le niveau
d'AMPc.
Ces résultats montrent que l'octanol- et les autres n-alkanols à chaîne
hydrocarbonée
longue en C6 à C10 stimulent le canal CFTR par une voie indépendante de la
voie de
l'AMPc.
Références Bibliographiques
Becq et al., (1994). PNAS 91 : 9160-9164
Becq et al., (1999). J.Biol.Chem. 274: 27415-27425
Chang et al., (1998). Methods Enzymol. 92: 616-629
Cutting et al., (1990). Nature. 346: 366-369
Dalemans et al., (1991). Nature. 354: 526-528
Dormer et al., (2001), J. Cell Sei., 114: 4073-4081
Drumm et al., (1991). Science. 254:1797-1799
Eidelman et al., (1992). PNAS 89: 5562-5566
Gregory et al., (1991). Mol. Cell. Bio 11 : 3886-38931
Gribkoff et al., (1994). J Biol. Chem. 269: 10983-10986
CA 02530882 2005-12-28
WO 2005/011659 PCT/FR2004/001662
24
Griesenbach et al., (1999). Thorax. 54: S 19-S23
Hamill et al., (1981). Pflugeys Arch. 391 : 85-100
Marzalec et al., (1994). J. Pharmacol.Exp. Ther. 269: 157-163
Mascia et al., (2000). PNAS 97: 9305-9310
Miller & Dallas, (1973). Arch. Intern. Med. 131: 148-155
Nakahiro et al., (1991). J Pharmacol. Exp. Ther. 259: 235-240
Narahashi et al., (1998). Toxicol lettes. 100-101: 185-191
Reddy et al, (1999). Nature. 402: 301-304
Riordan et al., (1989). Science. 245: 1066-1073
Sakihara et al., (2002). Anesthesiology. 96 : 428-437
Schwiebert et al., (1995). Cell. 81 :1063-1073
Sheppard et al., (1993). Nature. 362: 160-164
Tabcharani et al., (1991). Nature. 352 : 628-631
Tsui & Buchwald, (1991). Advances in huran genetic 20: 153-266
Wei et al., (1999) Pflügers Arch. 438: 635-641
Weingart & Bukauskas, (1998). Pflügers Arch. 435: 310-319
