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Nouvelles IgG3 utiles pour stimuler la phagocytose
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'anticorps monoclonaux
chimériques,
humanisés ou humains de classe IgG3, produits dans une lignée cellulaire de
myélome
de rat, notamment YB2/0 (ATCC n° CRL 1662) ou une lignée dérivée ou
modifiée de
YB2/0, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de
différentes
pathologies cancéreuses et infectieuses. Ces anticorps présentent une forte
activité de
phagocytose et peuvent être administrés pour traiter les cancers et les
infections.
A ce jour, la grande majorité des anticorps monoclonaux thérapeutiques
commercialisés ou en cours d'essais cliniques appartiennent à la classe des
IgGl.
Cependant, en dehors des IgGl, d'autres sous-classes d'anticorps pourraient
également
présenter un intérêt pour le traitement de certaines pathologies.
Les IgG3 possèdent notamment des capacités effectrices particulières et jouent
certainement un rôle important i~ vivo. Bien que ne représentant que 7% des
IgG dans
les plasma humains, leur proportion est augmentée au cours de certaines
réponses
immunitaires, par exemple aprés certaines infections virales (Basic and
clinicat aspects
of IgG subclasses. Volume editor, F. Shakib. Basel; New York : Karger, 1986
(Monographs in Alllergy; Vol 19. Pages 122-133), parasitaires (J Infect Dis.
2003 Mar
1;187(5):862-5, 2003. Immunoglobulin G (IgG) responses to Plasmodium
falciparum
glycosylphosphatidylinositols are short-lived and predominantly of the IgG3
subclass.
Boutlis CS, Fagan PK, Gowda DC, Lagog M, Mgone CS, Bockarie MJ, Anstey NM)
ou à la suite d'immunisations contre l'antigène Rh(D) (Iyer YS, Kulkarni SV,
Gupte
SC. Distribution of IgG subtypes in maternal anti-D sera and their prognostic
value in
Rh haemolytic disease of the new-born. Acta Haematol. 1992;88(2-3):78-81).
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L'utilisation thérapeutique d'IgG3 reste jusqu'à présent très limitée. Elles
sont utilisées
en particulier dans le traitement préventif de la maladie hémolytique du
nouveau-né,
puisque d'une part, les anticorps polyclonaux anti-D actuellement utilisés
sont
constitués d'environ 20 à 30% d'IgG3 et d'autre part, des études cliniques
utilisant un
anticorps monoclonal anti-D IgG3 ont déjà été réalisées avec des résultats
encourageants en terme de clairance d'hématies Rh positif (Clin Exp Immunol.
2003
Apr;l32(1):81-6. Clearance of red cells by monoclonal IgG3 anti-D in vivo is
affected
by the VF polylnorphism of Fc gamma RIIIa (CD16). Kumpel BM, De Haas M,
Koene HR, Van De Winkel JG, Goodrick MJ.)
Bien que le mécanisme d'action des anticorps polyclonaux anti-D conduisant à
l'absence d'immunisation de la mère ne soit pas connu, de nombreuses études se
sont
attachées à démontrer les rôles respectifs des IgGl et des IgG3 anti-D. Il a
par exemple
été montré que la formation de rosettes enhe les cellules effectrices comme
les
monocytes, les lymphocytes T CDB, les lymphocytes B et les cellules NK avec
des
hématies Rhésus D positif, était plus rapide et plus importante avec des IgG3
anti-D en
comparaison avec des IgGl. Ces différences peuvent s'expliquer par la plus
longue
région charnière (Hinge) des IgG3 par rapport aux IgGl. Cette structure
favoriserait la
formation de ponts entre les hématies chargées négativement et les cellules
effectrices.
(Vox Sang. 1989;56(2):101-3. Rate of interaction of IgGl and IgG3 sensitized
red
cells with monocytes in the phagocytosis assay, Brojer E, Merry AH, Zupanska
B;
Immunology. 1992 Ju1;76(3):446-51. The functional activity of Fc gamma RII and
Fc
gamma RIII on subsets of human lymphocytes. Hadley AG, Zupanska B, Kumpel BM,
Leader KA).
L'existence d'une compétition entre des IgGl et des IgG3 suggérant ainsi que
ces deux
sous-classes d'IgG pourraient reconnaître et activer le même récepteur Fc a
été
mentionnée dans d'autres études (Immunology. 1989 Apr;66(4):491-8. Distinctive
role
of IgGl and IgG3 isotypes in Fc gamma R-mediated fonctions. Rozsnyay Z, Sarmay
G, Walker M, Maslanka K, Valasek Z, Jefferis R, Gergely J).
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Au cours d'infections parasitaires comme Plasmodium falciparum, ainsi qu'au
cours
des infections bactériennes, une réponse de type IgG3 est observée et elle est
associée
à la production d'IgGl contre des antigènes protéiques. De même, dans le cas
de la
réponse anti-polysaccharidique d'origine bactérienne (anti-LPS), même si les
IgG2
forment la sous-classe prédominante, il y a une forte réponse de type IgG1 et
de façon
plus limitée d'IgG3.
Pour les pathologies cancéreuses, il n'y a pas de données sur la production
d'IgG3
chez des patients, bien que des traitements anti-tumoraux utilisant des IgG3
couplées
ou non à des cytokines aient été utilisés à titre expérimental (Kemminer SE,
Conradt
HS, Nimtz M, Sagi D, Peter-I~atalinic J, Diekmann O, Drmic I, Muthing J
Biotechnol
Prog. 2001 Sep-Oct;17(5):809-21. Production and molecular characterization of
clinical phase I anti-melanoma mouse IgG3 monoclonal antibody R24). (Peng LS,
Penichet ML, Dela Cruz JS, Sampogna SL, Morrison SL. J Interferon Cytokine
Res.
2001 Sep;21(9):709-20. Mechanism of antitumor activity of a single-chain
interleukin-
12 IgG3 antibody fusion protein (mscIL-l2.her2.IgG3)).
La lignée YB2/0 a été sélectionnée depuis plusieurs années pour sa capacité à
conférer
aux IgG1 produites des propriétés fonctionnelles améliorées. Nous avions
montré dans
notre demande WO 01/77181 l'importance de sélectionner des lignées cellulaires
permettant de produire des anticorps présentant une forte activité ADCC via le
récepteur Fc~yRIII (CD16). Nous avions trouvé que la modification de la
glycosylation
de la partie constante des anticorps produits dans des lignées de myélomes de
rat telle
que YB2/0 conduisait à améliorer l'activité ADCC.
Les structures glycanniques desdits anticorps sont de type biantennées,
caractérisés par
des chaînes courtes, une faible sialylation et une faible fucosylation.
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Nous avons également découvert que le fait de présenter une forte interaction
avec le
CD16 a l'avantage d'induire également la production de cytokines, notamment la
production d'IFN~y et/ou autres cytokines ou chémokines.
Les deux caractéristiques précitées se complémentent. En effet, la production
d' IFN~y
ou autres cytokines et/ou chémokines par des cellules efFectrices induite par
les
anticorps sélectionnés peut renforcer l'effet thérapeutique en stimulant des
mécanismes
effecteurs du système immunitaire autres que l'ADCC chez les patients traités.
Le
mécanisme d'action d'une telle stimulation tient probablement à une régulation
positive
autocrine des cellules effectrices. On peut postuler que les anticorps se
liant au CD16
induisent une activité cytotoxique ainsi que la production d'IFN~y ou autres
cytokines/chémokines qui au final conduit à augmenter encore davantage
l'activité
cytotoxique.
Dans le cadre de la présente invention, une IgG3 anti-D a été ea~primée dans
une lignée
de myélome de rat afin d'évaluer si cette lignée, notamment YB2/0, peut
conférer aux
anticorps produits des propriétés fonctionnelles améliorées, comme c'est le
cas pour
les IgGl.
Nos résultats indiquent que les IgG3 ainsi produites présentent une capacité
de fixation
au CD16 comparable à celle des IgGI. Néanmoins, cette augmentation de fixation
au
CD16 n'est pas corrélée à une sécrétion de cytokines et induit une
potentialisation de
l'ADCC plus faible que celle qui est observée avec les IgGl. Cependant, dans
certaines conditions « in vitro », c'est à dire en présence d'hématies fixées
et
uniquement à forte concentration d'anticorps, les IgG3 produites dans YB2/0
apparaissent capables d'induire la sécrétion de cytokines. En revanche, nous
avons
observé de manière tout à fait inattendue que la phagocytose est augmentée.
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Description
Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux
chimériques, humanisés ou humains de classe IgG3 caractérisés en ce qu'ils
sont
5 produits dans une lignée cellulaire de myélome de rat. De préférence,
lesdites IgG3
sont produites dans la lignée YB2/0 (ATCC n° CRL 1662) ou une lignée
dérivée ou
modifiée de YB2/0.
Dans de tels anticorps, la structure glycannique de la région Fc correspond à
un type
biantenné, avec des chaînes courtes, une faible sialylation et une faible
fucosylation.
De plus, le taux de GlcNac intermédiaire est non nul.
De tels anticorps sont plus particulièrement sélectionnés parmi les formes
G0, GOF, Gl et G1F.
GlcNAc Mannose ~ Galactose Fucose
Ainsi, (invention porte sur des anticorps monoclonaux de classe IgG3 dans
lesquels la
teneur en fucose est inférieure à 65%, 60%, 50%, 40%, ou 35%. De préférence,
la
teneur en fucose est comprise entre 20% et 45% ou encore entre 25% et 40%. A
titre
d'exemple, la teneur en fucose est inférieure à 35%.
L'invention porte également sur des anticorps de classe IgG3 présentant le
profil de
glycosylation indiqué ci-dessus produits dans des systèmes biologiques
équivalents,
notamment dans des cellules, plantes ou animaux non humain génétiquement
modifiés
ou transformés, par exemple par introduction de séquence exprimant une ou
plusieurs
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glycosyl transférase(s) de sorte à obtenir des anticorps ~ présentant un
profil
essentiellement similaire au profil de glycosylation obtenu chez YB 2/O.
Les IgG3 produites dans la lignée YB2/0 présentent par rapport à celles
produites dans
des lignées comme CHO par exemple, des caractéristiques fonctionnelles
particulières
a) une forte fixation au CD16 qui est comparable à celle des IgGl produites
dans la
même lignée cellulaire.
b) une capacité à induire une inhibition de sécrétion de cytokines induite par
les IgGI.
c) une capacité plus importante des IgG3 produits dans YB2/0 à induire la
sécrétion
d'IFN gamma, d'IL6 et de TNF alpha que les IgG3 produits dans CHO ; et une
plus
faible capacité des IgG3 YB2/0 à induire la sécrétion de TNF alpha et d'IFN
gamma
que les IgGl YB2/0.
d) une potentialisation de la phagocytose.
L'anticorps de classe IgG3 de l'invention peut être sélectionné à titre
d'exemple parmi
les anticorps dirigés contre : CD2, CD3, CD4, CDS, CD7, CDB, CD11, CD18, CD19,
CD20, CD25, CD45 et CD52 comme Campath-1H~, CD30, CD33, CD38 ou CD44.
D'autres anticorps peuvent être sélectionnés parmi les anti Ep-CAM, anti HER2,
anti
HERl, anti GD3, anti CA125, anti GD, anti GD2, anti CD-23 et anti ProteinC ;
anti-
KIR3DL2, anti-EGFR, des anti-idiotypes spécifiques d'inhibiteurs par exemple
de
facteurs de coagulation, les anti-viraux : HIV, HBV, HCV et RSV.
Dans un deuxième aspect, l'invention vise un procédé de production d'anticorps
monoclonaux chimériques, humanisés ou humains de classe IgG3 présentant les
caractéristiques fonctionnelles mentionnées ci-dessus comprenant la
transfection d'une
lignée cellulaire de myélome de rat de préférence, la lignée YB2/0 (ATCC
n° CRL
1662) ou une lignée dérivée ou modifiée de YB2/0, avec un ou plusieurs
vecteurs)
comprenant les séquences codantes pour les chaînes lourdes et légères
d'anticorps de
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classe IgG3, l'expression desdits anticorps dans la lignée cellulaire
transfectée,
fexiraction et la purification des anticorps.
De préférence, on utilise un système à deux vecteurs d'expression (par exemple
des
vecteurs dérivés du RSV), fun codant pour les chaînes lourdes et l'autre
codant pour
les chaînes légères. Avantageusement, un marqueur de sélection différent est
présent
dans chaque vecteur. Des constructions spécifiques sont présentées à la figure
1.
L'invention porte également sur le système décrit ci-dessus dans lequel les
chaînes
lourdes et légères sont produites en quantité équimolaire.
La consiruction de vecteurs d'expression peut être mise en oeuvre selon les
procédures
connue de l'homme du métier (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, Maniatis et al, Cold Spring Harbor).
La co-transfection dans la lignée de myélome de rat des deux vecteurs peut
être
réalisée au moyen de quantité équimolaire par les procédures standard du type
précipitation au phosphate de calcium or par la lipofectine. Ensuite, les
lignées
transfectées sont sélectionnées dans les milieux de culture adéquats.
Bien entendu, d'autres stratégies, notamment (utilisation d'un seul vecteur
codant pour
l'ensemble des chaînes de (anticorps, peuvent être employées.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne des lignées cellulaires de
myélome de
rat, notamment YB2/0 et des lignées dérivées, transfectées par un ou plusieurs
vecteurs) permettant l'expression d'une IgG3 fonctionnelle. L'invention porte
également sur les cellules ayant été transfectées par un ou plusieurs
vecteurs) décrits)
ci-dessus. Ces cellules sont caractérisées en ce qu'elles produisent des IgG3
présentant
le profil de glycosylation mentionné plus haut et au moins l'une des
propriétés a) à d)
décrites précédemment. Une cellule dérivée d'une lignée décrite plus haut est
également objet de l'invention.
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Dans un quatrième aspect, l'invention porte sur l'utilisation d'IgG3 décrites
précédemment, notamment d'IgG3 exprimées dans YB2/0, pour la préparation d'un
médicament.
Plus spécifiquement, l'invention vise (utilisation d'anticorps monoclonaux
chimériques, humanisés ou humains de classe IgG3, produits dans une lignée
cellulaire
de myélome de rat, notamment YB2/0 (ATCC N° CRL 1662) ou une lignée
dérivée ou
modifiée de YB2/0, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement
de
différentes pathologies cancéreuses, ou de différentes pathologies
infectieuses
d'origines virales, bactériennes ou parasitaire infectieuses.
Dans un aspect particulier de l'invention, ces anticorps peuvent être utilisés
pour la
préparation d'un médicament destiné à la prévention de l'alloimmunisation
foeto-
maternelle.
Préférentiellement, les patients concernés sont les patients faibles
répondeurs au
traitement avec une IgG1 ou une IgG3 exprimée dans CHO.
On entend par "patients faibles répondeurs", des patients traités ayant un
état dit stable,
avec moins de 50% de réduction et moins de 25% d'augmentation des lésions, et
pas de
nouvelles lésions. Ce groupe de patients comprend également les patients pour
lesquels
aucune réponse n'est observée (progression de la maladie pouvant conduire à la
mort).
Pour les maladies infectieuses, ces patients correspondent à des patients pour
lesquels
la charge virale ou bactérienne est diminuée de moins de 50% par un traitement
conventionnel.
De manière avantageuse, on peut utiliser l'anticorps chez les patients
diagnostiqués
tardivement.
Les pathologies cancéreuses pouvant être traitées de manière particulièrement
avantageuse au moyen des anticorps selon l'invention sont choisies parmi le
groupe
comprenant les tumeurs neuroectodermiques, les cancers colorectaux, les
mélanomes,
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le cancer du sein, les leucémies, en particulier la HCL (Hairy Cell Leukemia),
les
lymphomes tels que les DLBCL (Primary Diffuse Large B-Cell Lymphomas), les
leucémies aigües, les ostéosarcomes, le cancer, notamment le cancer du
potunon, cette
liste n'étant pas exhaustive.
Dans un aspect particulier de l'invention, les pathologies cancéreuses
traitées selon
l'invention sont associées à des infections d'origine virale ou bactérienne,
comme le
cancer de la prostate (Lightfoot N, Conlon M, Kreiger N, Sass-Kortsak A,
Purdham J,
Darlington G. Medical history, sexual, and maturational factors and prostate
cancer
risk. Ann Epidemiol. 2004 Oct;14(9):655-662; Huycke MM, Gaskins HR. commensal
bacteria, redox stress, and colorectal cancer: mechanisms and models. Exp Biol
Med
(Maywood). 2004 Ju1;229(7):586-97), les leucémies, ou le sarcome de Kaposi.
Les
agents infectieux trouvés dans les maladies infectieuses associées au cancer
peuvent
être Candida, Achromobacter ou Alcaligenes (Aisenberg G, Rolston KV, Safdar A.
Bacteremia caused by Achromobacter and Alcaligenes species in 46 patients with
cancer (1989-2003). Cancer. 2004 Sep 23 ; Boktour MR, Kontoyiannis DP, Hanna
HA, Hacheur RY, Girgawy E, Bodey GP, Raad II. Multiple-species candidemia in
patients with cancer. Cancer. 2004 Aug 31; ) ou encore le virus d'Epstein
Sarr.
Parmi les pathologies infectieuses avantageusement traitées avec l'anticorps
selon
l'invention, on peut citer la diphtérie, les fièvres hémorragiques virales, la
fièvre
typhoïde, la grippe, les hépatites B et C, les infections respiratoires dues
au RSV, les
infections au VIH et au CMV, la Légionellose, la Leishmaniose, la lèpre, la
rage, le
sida ou encore la tuberculose, cette liste n'étant pas limitative.
Les IgG3 de l'invention présentent à l' égard de ces utilisations un intérêt
en raison de
leur forte fixation sur le récepteur Fc de basse affinité (CD16) et/ou de leux
capacité à
induire une phagocytose.
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Dans un aspect particulier de l'invention, le médicament, selon l'invention
est destiné à
être utilisé en combinaison avec une IgGl. L'utilisation selon l'invention des
IgG3
telles que décrites précédemment est particulièrement avantageuse dans cet a
pect de
l'invention pour la capacité de ces IgG3 à moduler négativement la sécrétion
de
5 cytokines induite par les IgGl, notamment les taux d'IFN gamma, de 'TNF
alpha et/ou
d'IL6.
Ainsi, dans un aspect particulier de l'invention, les IgG3 tels que décrits
précédemment sont utilisées pour la préparation d'un médicament pour le
traitement
10 des pathologies cancéreuses chez les patients ayant un « cytokine release
syndrome »,
notamment chez les patients traités par une IgGl produite dans ~B2/0. Cette
application met à profit la capacité desdites IgG3 à moduler négativement la
sécrétion
de cytokines. Par exemple, on peut citer (apparition d'hypothermie, de nécrose
rénale
aiguë et des maladies du foie dues au « cytokine release syndrome » induit par
l'administration d'un anticorps monoclonal anti-CD3, par exemple le 145-2C11
(Alegre
ML et al, J Trrmmunol. 1991 Feb 15;146 (4):1184-91; Chatenoud L. Anti-CD3
antibodies: towards clinical antigen-specific immunomodulation. Curr Opin
Pharmacol. 2004 Aug;4(4):403-7; Yamada-Ohnishi Y, Azuma H, Urushibara N,
Yamaguchi M, Fujihara M, Kobata T, Ikeda H. Cytotoxic Difference of T Cells
Expanded with Anti-CD3 Monoclonal Antibody in the Presence and Absence of Anti-
CD28 Monoclonal Antibody. Stem Cells Dev. 2004 Jun;l3(3):315-22.).
Alternativement, l'invention vise l'utilisation d'une IgG3 décrite ci-dessus,
qui peut être
un anti-CD20, pour prévenir (apparition du « cytokine-release syndrome » chez
les
patients traités avec le Rituximab~ (IDEC-C2B8) ; Wiï~kler U et al, Cytokine-
release
syndrome in patients with B-tell chronic lymphocytic leukemia and high
lymphocyte
counts alter treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody, Blood. 1999 Oct
1;94
(7):2217-24.
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Alternativement, l'IgG3 de l'invention est utile pour prévenir les effets
indésirables de
l'anticorps CAMPATH~ ou d'OKT3.
En effet, l'administration de CAMPATH 1-H, qui se lie au CD52 sur les
lymphocytes
et monocytes, induit la libération de TNF, d'IFN et d'IL-6 conduisant au «
cytolcine-
release syndrome », Mark G. Wing et al, Mechanism of First-Dose Cytokine-
Release
Syndrome by CAMPATH 1-H: Involvement of CD 16 (FcRIII) and CD 11 a/CD 18
(LFA-1) on NK Cells, J. Clin. Invest, Volume 98, Number 12, December 1996,
2819-
2826. De même, OKT3, qui se lie au CD3 a également été décrit comme induisant
le
syndrome de sécrétion de cytokines (First MR, Schroeder TJ, Hariharan S. OI~T3-
induced cytokine-release syndrome: renal effects (cytokine nephropathy).
Transplant
Proc. 1993 Apr;25(2 Suppl 1):25-6).
Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé pour moduler la
sécrétion de
cytokines induite par une IgGl en ajoutant au système biologique contenant
lesdites
IgGl des IgG3 produites dans une lignée cellulaire de myélome de rat,
notamment
YB2/0.
L'association d'une IgGl et d'une IgG3 est en effet d'un intérêt thérapeutique
important puisqu'elle permet de diminuer les effets secondaires dus à l'IgG1
sans
affecter significativement ses capacités cytotoxiques, et d'accroître l'effet
thérapeutique via la phagocytose.
Dans un aspect particulier de l'invention, les IgGl dont la sécrétion de
cytokines est
modulée sont produites dans une lignée cellulaire de myélome de rat, notamment
dans
YB2/0.
Dans un dernier aspect, l'invention a pour objet une composition
pharmaceutique
d'anticorps thérapeutiques comprenant des IgGl, des IgG3 et au moins un
excipient.
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De manière âvantageuse, l'.une au moins de ces IgG (IgGl ou IgG3) est produite
dans
une lignée cellulaire de myélome de rat, notamment YB2/0.
Légendes et titres des figures
Figure 1: Schéma des vecteurs d'expression
Figure 2 : Illustration des anticorps produits
Figure 3 : Interaction avec les cellules Jurkat CD16 des anticorps coatés sur
les
hématies fixées dans la plaque de microtitration.
L'axe des x représente la fixation des anticorps sur les hématies et l'axe des
y
représente la fixation sur le CD 16.
Figure 4 : Fixation des IgG3 aux cellules Jurkat CD16 en absence de cibles.
Figure 5 : Sécrétion d'IL-2 induite par les IgG1 et les IgG3 exprimés dans
YSB/0
après interaction avec les cellules Jurkat CD16.
Figure 6 : Activité ADCC des anticorps anti-D IgG1 et IgG3 en présence de
PBMC et d'immunoglobulines polyvalentes
Figure 7 : Activité ADCC en présence de cellules NK et d'anticorps anti-D IgG1
et IgG3
Figure 8 : Sécrétion d'IL-2 par les cellules Jurkat CD16 induite par les IgGl
et
IgG3 anti-Rhésus (hématies en suspension). Effet de l'ajout des différentes
IgG3
sur la sécrétion d'IL21 induite par les IgGl YB2/0.
Figure 9 : Sécrétion de cytokines induites par les anticorps en présence de
cellules
NK ou de monocytes
Figure 10 : Pourcentage de cellules THP 1 ayant phagocytés une ou plusieurs
hématies
Exemples
Exemple 1 : Obtention de différents anticorps anti-D de classe IgG3.
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La construction des vecteurs d'expression pour produire deux anticorps
recombinants
est présentéè à la figure 1. Après la construction de ces vecteurs
d'expression, des
transformants producteurs d'IgG3 D29' de spécificité anti-D ont été obtenus
dans les
lignées YB2/0 et CHO.
Les différents anticorps ainsi produits sont schématisés à la figure 2
- Anticorps 1: IgG3 D29 dans la lignée YB2/0, D29-YB2/0
- Anticorps 2: IgG3 exprimée dans la lignée CHO (lignée de référence pour la
production industrielle de protéines recombinantes), D29-CHO.
- Anticorps 3: IgG3 (D29, produite par un lymphocyte B fusionné avec P3x229),
D29-
P3X229
Exemple Z : Etude de la fixation des trois anticorps de l'exemple 1 sur les
cellules Jurkat CD16 (CFC).
Ce test a été mis en place pour évaluer la capacité des anticorps anti-D à se
fixer sur le
récepteur CD 16 (Fc gamma RIIIa) exprimé sur les cellules Jurkat CD 16.
La première étape consiste à faire réagir l'anticorps anti-D avec les
antigènes Rhésus
exprimés à la surface de membranes d'hématies Rhésus positif préalablement
coatées
sur des plaques de 96 puits à fond rond (fixation par le Fab). Cette fixation
est
parallèlement détectée par un anticorps anti-IgG humaine marqué à la
phosphatase
alcaline.
La deuxième étape (après la fixation de l'anticorps sur son antigène),
consiste à ajouter
des cellules Jurkat CD16 qui vont pouvoir interagir avec la partie Fc des
anticorps_
Après centrifugation, un score (index de fixation de 1 à 3) correspondant aux
cellules
Jurkat CD 16 qui se sont fixées sur les anticorps est estimé visuellement.
Les résultats sont présentés figure 3.
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On peut conclure des résultats que l'expression d'une IgG3 dans la lignée
cellulaire
YB2/0 lui confère une meilleure capacité à se fixer sur les CD16 via son Fc,
tandis que
la même séquence exprimée dans la lignée CHO ou exprimée par le lymphocyte 8
fusionné (D29-P3X229) se fixe moins bien.
Par ailleurs, l'expression d'une IgG3 dans la lignée YB2/0 lui confère une
capacité à se
fixer sur CD16 qui est comparable à celle d'une IgGl exprimée dans la même
cellule
(R297 exprimé dans YB2/0) et aussi comparable à celle d'une IgG3 purifiée à
partir
d'anticorps polyclonal anti-D.
Exemple 3 : Mesure par compétition de la fixation des trois anticorps de
l'exemple 1 sur les cellules Jurkat CD16 par cytométrié de flux.
Différentes dilutions des anticorps sont incubés en présence des cellules
Jurkat CD 16
et de l'anticorps anti-CD16 3G8 marqué PE. La réactivité des anticorps à
évaluer avec
CD16 est inversement proportionnelle à la fixation du 3G8 marqué PE qui
reconnaît le
site de fixation des IgG sur le récepteur Fc CD 16. Ainsi, la fixation sur le
CD 16 des
anticorps non marqués à évaluer va induire une diminution de la fixation de
l'anticorps
3G8 marqué PE. Les données sont interprétées et les résultats finaux donnés en
pourcentage de fixation sur CD16. La figure 4 que les anticorps IgGl et IgG3
produits
dans YB2/0 se fixent d'une façon comparable sur CD16 mais plus fortement que
les
anticorps IgG3 produits dans CHO ou par le lymphocyte B (D29-P3X229).
Exemple 4 : Mesure de l'activation des cellules Jurkat CD16 (suite
expérimentale
de l'exemple 2).
Après l'évaluation de la fixation des anticorps sur Jurlcat CD16, les plaques
sont
ensuite incubées une nuit à 37°C, puis centrifugées. La quantité d'IL2
secrétée par
Jurkat CD 16 dans les milieux de culture est évaluée par une technique ELISA.
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Les résultats sont donnés en quantité d'IL2 en fonctiôn de la fixation sur ÇD
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déterminée (exemple 2). La figure 5 montrent que l'interaction des IgG3 avec
Jurkat
CD16 induit une sécrétion d'IL2 beaucoup plus faible qu.'en présence des IgGl.
Ainsi
l'IgGl YB2/0 à l'opposé de l'IgG3 YB2/0 induit dès les premiers indices de
fixation
5 une sécrétion d'IL2 ; cependant, la courbe dose réponse obtenue avec les
IgG3 est
inférieure à celle obtenue avec les IgGl. Seule une forte interaction des IgG3
YS2/0
avec CD16 (indice de fixation maximal de 3) induit une sécrétion d'IL2
comparable à
celle obtenue avec les IgGl produites par YB2/0.
Exemple 5 : Etude de la cytotoxicité induite par des anticorps anti-D contre
des
hématies Rh positif en présence de PBMC ou de cellules NK purifiées.
Le test de cytolyse PBMC, quantifie la capacité des anticorps à lyser des
hématies
Rhésus positif en présence de cellules mononucléées humaines (PBMC) et
d'immunoglobulines polyvalentes (Tégéline).
Les résultats sont présentés à la Figure 6.
L'activité cytolytique de l'IgG3 exprimée dans CHO, est comparable à celle
obtenue
avec l'anticorps exprimé par le lymphocyte B fusionné D29-P3X229.
Par contre, l'expression d'une IgG3 dans YB2/0 potentialise ses capacités à
induire
une lyse des hématies en présence de cellules mononucléées (PBL) par
comparaison au
même anticorps produit dans CHO ou par l'hétéromyélome.
Par rapport à l'activité de l'IgG3 produite dans CHO, l'augmentation de
l'activité
cytolytique de l'IgG3 exprimée dans YB20 est 2,8 fois plus importante et
également
comparable à celle induite par la fraction polyclonale IgG3 de WinRho.
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Néanmoins, l'activité cytolytique des IgG3 produites dans YB2/0 est inférieure
à celle
des IgGl produites dans YB2/0 et de l'anticorps polyclonal anti-D (Poly-D
WinRho).
En présence de cellules NIA purifiées (figure 7), l'IgG3 YB210 induit une lyse
des
hématies (55%) 5,5 fois plus importante que celle obtenue avec le même
anticorps
produit dans CHO (10%). L'anticorps produit par l'hétéromyélome P3X229 donne
la
valeur la plus faible (4%).
Néanmoins, l' activité cytolytique des IgG3 produites dans YB210 est
inférieure à celle
des IgG1 produites dans YB2/0 et de l'anticorps polyclonal WinRho.
Exemple 6 : Mesure de sécrétion d'IL-2 par Jurkat CD16 après fixation des
anticorps sur hématies en suspension..
Etude de l'inhibition de l'activation induite par les IgGl YB2/0 par addition
d'IgG3.
Sécrétion d'IL2 : Les cellules Jurkat CD16 sont incubées avec des hématies'
Rhésus
positif, l'IgGl YB2/0 ou l'anticorps IgG3 D29 exprimédans les différents
systèmes
d'expression (YB2/0, CHO, B-P3 X229). La sécrétion d'I12 est mesurée dans les
surnageants après une nuit d'incubation par technique ELISA.
Résultats
Les IgG3 exprimées dans YB2/0 et CHO n'induisent pas de sécrétion d'IL2.
contrairement aux IgGl YB2/0, cela à concentration d'anticorps identique
(figure 8).
Nous pouvons en déduire que contrairement aux IgGl exprimées dans YB2/0, la
fixation sur le CD16 d'une IgG3 exprimée dans YB2/0 n'induit pas de sécrétion
d'IL2
en présence d'hématies en solution et de cellules Jurkat CD16. Ainsi,
l'exemple 4,
dans lequel les hématies étaient coatées en microplaques, montrait que seule
une forte
interaction avec CD16 permettait d'induire une sécrétion d'IL2. L'utilisation
de
conditions plus physiologiques dans cet exemple, confirment le très faible
potentiel des
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IgG3 ~'B2/0 à induire une sécrétion d'IL2 à partir de Jurkat CD16,
contrairement aux
IgG1 YB210.
Etude d'inhibition Les cellules Jurkat CD16 sont incubées avec des hématies
Rhésus
positif et un mélange IgGl YB2/0 avec les différentes IgG3 D29 exprimées dans
les
différents systèmes d'expression (YB2/0, CHO, B-P3 X229). La sécrétion d'Il2
est
mesurée dans les surnageants après une nuit d'incubation par technique ELISA.
Résultats
Les IgG3 produites dans CHO et P3X229 n'ont pas d'effet sur la sécrétion d'IL2
induite par l'IgGl YB2/0. Par contre, l'IgG3 produite dans YB2/0 induit une
diminution de l'induction d'IL2 (figure 8).
L'expression d'une IgG3 dans YB2/0 induit donc une modulation négative de
l'activité
.activatrice des IgGl.
Exemple 7 : Induction de la sécrétion de cytokines par les anticorps anti-D.
Les cellules NK ou les monocytes sont incubés avec des hématies Rhésus
positif,
l'IgGl YB2/0 ou l'anticorps IgG3 D29 exprimés dans YB2/0 ou CHO. La sécrétion
de
différentes cytokines (IL1 béta, IL6, IFN gamma, TNF alpha) est mesurée dans
les
surnageants après une nuit d'incubation par technique ELISA.
Les résultats sont présentés sur la figure 9. En présence de cellules NK, les
taux d'ILl
béta et d'IL6 sont comparables pour. tous les anticorps. Par contre, les taux
de 'TNF
alpha et d'IFN gamma produits par les cellules NIA en présence de l'IgG3
exprimée
par YB2/0 sont inférieurs à ceux induits par l'IgGl exprimée dans YB2/0
(figure 9).
Néanmoins, cette sécrétion est supérieure à celle observée avec l'IgG3
produite par
CHO.
En présence de monocytes, les taux d'IL1 béta et d'IFN gamma (nuls) sont
identiques
pour tous les anticorps. Les taux d'ILfi produits par les monocytes sont
comparables
pour les IgG1 et IgG3 produites dans YB2/0 mais inférieurs pour l'IgG3
produite dans
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CHO. Pour le TNF alpha, on observe une légère baisse en présence de l'IgG3
produite
par CHO.
Exemple 8 : Capacité des IgG3 anti-D à induire une phagocytose d'hématies
Rhésus positif par les cellules THP-1.
Test de phagocytose : les cellules THP-1 sont incubées en présence d'hématies
Rhésus
positif et d'anticorps. Le nombre de cellules ayant phagocyté au moins une
hématie est
évalué par comptage au microscope. Les résultats sont exprimés en pourcentage
de
cellules ayant phagocyté au moins une hématie (voir figure 10).
Les IgG de l'anticorps polyclonal anti-D WinRho ont la capacité (43.4%) la
plus forte
à induire la phagocytose des hématies Rhésus positif par la cellule THP-1.
L'IgGl
YB2/0 est peu active (14.6%). Au niveau des IgG3, l'IgG3 YB2/0 induit une
phagocytose de 34.5%, supérieure aux IgG3 polyclonales purifiées (IgG3
WinRho).
Les plus faibles activités de phagocytose sont obtenues avec les IgG3
produites par le
lymphocyte B fusionné (D29 P3 X229) et l'IgG3 produite dans CHO.
On peut conclure que l'expression d'une IgG3 dans YB2/0 potentialise ses
capacités à
induire la phagocytose, cette propriété pouvant être particulièrement
intéressante dans
les maladies infectieuses ainsi que dans la maladie d'Alzeimer (McGeer PL,
McGeer
E. T_m_m__unotherapy for Alzheimer's disease. Sci Aging Knowledge Environ.
2004 Jul
07;2004~et ceci en comparaison avec une IgG3 exprimée dans CHO ou secrétée par
un hétéromyélome.
Conclusion
Les profil glycanique particulier de l'IgG3 produite dans YB2/0, c'est à dire,
des
formes courtes, non sialylées, et avec un taux de fucose inférieur à 35% lui
confère des
propriétés originales comme démontrées ci-dessus
- une forte fixation au CD16 qui est comparable à celle des IgGl,
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une potentialisation de la phagocytose
une augmentation de l'activité ADCC en présence de PBMC ou cellules NK
par rapport aux IgG3 produites dans CHO.
une capacité à entrer en compétition avec les IgGl au niveau de leur fixation
au
les CD16 et ainsi moduler négativement la sécrétion de cytokines.
