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WO 2005/040221 PCT/FR2004/002686
CORRÉLATION DU RATIO TAUX DE FUCOSE / TAUX DE GALACTOSE D'ANTICORPS ANTI
RHÉSUS
D ET ANTI HLA-DR AVEC L'ACTIVITÉ ADCC
ANTICORPS PRÉSENTANT UN TAUX
DE FUCOSE ET DE GALACTOSE OPTIMISE
La présente invention se rapporte à des compositions d'anticorps monoclonaux
ayant
une forte activité ADCC et dont le ratio taux de fucose/taux de galactose des
structures
glycanniques présentes sur leurs sites de glycosylation de la région Fc, est
inférieur ou
égal à 0,6. L'invention porte également sur des compositions pharmaceutiques
comprenant lesdits anticorps monoclonaux ayant une forte activité effectrice.
L'immunothérapie passive, très répandue, est fondée sur l'administration
d'anticorps,
en particulier d'immunoglobulines de type IgG, dirigés contre une cellule ou
une
substance donnée. L'immunothérapie passive au moyen d'anticorps monoclonaux a
donné des résultats encourageants. Toutefois, si l'utilisation d'anticorps
monoclonaux
possède plusieurs avantages, comme par exemple une assurance de sécurité du
produit
quant à l'absence de contamination infectieuse, il peut en revanche s'avérer
difficile
d'obtenir un anticorps monoclonal efficace.
Les immunoglobulines de type G (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2
chaînes
lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts Bisulfures.
Chaque chaîne
est constituée, en position N-terminale, d'une partie variable spécifique de
l'antigène
contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une partie
constante,
médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps.
L'association des parties variables et des domaines CH1 et CL des chaînes
lourdes et
légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc (partie
constante de la
chaîne lourde) par une région d'une exceptionnelle flexibilité (région
charnière)
permettant ainsi à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la
région Fc
reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcyR et
le Clq.
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La région Fc est constituée de 2 domaines globulaires nommés CH2 et CH3. Les 2
chaînes lourdes interagissent étroitement au niveau des domaines CH3 tandis
qu'au
niveau des domaines CH2, la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N
glycanne
biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297, contribue à un écartement
des 2
domaines.
De nombreuses études ont montré que la glycosylation de la région Fc est
essentielle
pour l'activité biologique des IgG, particulièrement pour la lyse cellulaire
médiée par
le complément (CDC) et la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps
(ADCC).
Ainsi, il a été démontré que les IgG aglycosylées, obtenues soit par
mutagénèse dirigée
soit par culture des cellules produisant l'anticorps en présence de
tunicamycine,
perdent leur capacité à activer le complément et à fixer les récepteurs FcyR
(Nose et
Wigzell, 1983 ; Tao et Morrison, 1989).
Des études plus précises sur le rôle de chaque monosaccharide ont montré que
l'attachement d'un résidu de N acétylglucosamine (GlcNac) en position
bissectrice
conduit à améliorer l'activité ADCC des IgG (Umana et al., 1999 ; Davies,
2001).
Par contre, l'effet de la présence ou non de résidus de galactose dans
l'oligosaccharide
lié à l'Asn297 est plus controversé. Si la présence de résidus de galactose a
été décrite
comme essentielle pour la fonction effectrice des IgG (Tsuchiya et al., 1989 ;
Furukawa et Kobata, 1991 ; Kumpel et al., 1994), d'autres auteurs ont montré
que
l'absence de résidus de galactose ne modifiait pas l'activité fonctionnelle
des IgG
(Boyd et al., 1995 ; Wright et Mornson, 1998).
Dans la demande de brevet WO 01/77181, nous avons démontré que la
glycosylation
de la région Fc est essentielle pour l'activité biologique des IgG,
particulièrement pour
les activités CDC et ADCC. Nous montrons qu'un N glycanne biantenné de type
lactosaminique caractérisé par des chaînes courtes, une faible sialylation,
une faible
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fucosylation, des résidus de mannose terminaux et/ou des résidus de GlcNac
terminaux
non intercalaires est le dénominateur commun des structures glycanniques
conférant
une forte activité ADCC aux anticorps monoclonaux. Par la suite, notre
découverte a
été corroborée par les études de Shields et al.(2002) et Shinkawa et al.
(2003).
Dans le cadre de la présente invention, nous avons observé que des anticorps
polyclonaux anti-D thérapeutiques (NATEAD, WinRho) présentent une activité
ADCC
très forte compte tenu de leur forte teneur en fucose.
Cette observation implique que le faible taux de fucose n'est pas en soi le
seul facteur
qui influence la capacité des anticorps à activer les récepteurs FcyR, et
notamment le
FcyRIII.
En étudiant le profil glycosidique complet des anticorps polyclonaux, nous
avons
découvert une relation inverse entre le rapport [taux de fucose / taux de
galactose] et
l'activité effectrice des anticorps.
En effet, si l'anticorps est fortement fucosylé, il faut qu'il soit fortement
galactosylé
pour avoir une activité efFectrice optimale. A contrario, si l' anticorps est
faiblement
fucosylé, le taux de galactose présent doit être tel que le ratio taux de
fucose / taux de
galactose est inférieur à 0,6 mais préférentiellement inférieur à 0,5 ou même
inférieur à
0,4 pour avoir une activité effectrice optimale.
A la lumière de ces résultats expérimentaux, nous avons donc mis en place un
procédé
de préparation d'anticorps présentant un ratio taux de fucose / taux de
galactose
optimisé, ce qui permet l'obtention d'anticorps ayant une forte activité
effectrice. En
d'autres termes, nous proposons de nouveaux anticorps monoclonaux présentant
une
structure oligosaccharidique précise, notamment en ce qui concerne les résidus
de
fucose et de galactose, conférant une forte activité effectrice. D'autre part,
nous
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proposons également des anticorps dont la structure gl~cannique ne permet pas
l'activation de l'activité cytotoxique ainsi que les procédés permettant de
les obtenir.
Description
Ainsi, dans un premier aspect, l'invention se rapporte à un procédé de
préparation
d'un anticorps monoclonal chimérique, humanisé ou humain ayant une forte
activité
effectrice, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) production et purification d'anticorps monoclonaux obtenus à partir de
différentes sources, notamment de cellules, plantes ou animaux non humains,
éventuellement génétiquement modifiés ou transformés,
b) mesure du taux de fucose et du taux de galactose des structures
glycanniques
portées par les sites de glycosylation de la région Fc desdits anticorps,
c) sélection des anticorps dont le ratio taux de fucose / taux de galactose
est
inférieur ou égal à 0,6, préférentiellement à 0,5 ou à 0,4.
On entend par « un anticorps monoclonal », une composition comprenant des
anticorps
monoclonaux ayant une structure primaire identique, excepté la faible
proportion
d'anticorps présentant des mutations survenues naturellement, une spécificité
identique
et des modifications post-traductionnelles, notamment des modifications de la
glycosylation, qui peuvent varier d'une molécule à l'autre. Aux fins de la
présente
invention, les expressions « anticorps monoclonal » ou « composition d'un
anticorps
monoclonal » sont synonymes.
Les anticorps monoclonaux de l'invention peuvent être préparés à l'aide de
méthodes
conventionnelles, telles que la production d'hybridomes coxmne décrit par
Kôhler et
Milstein (1975), l'immortalisation de lymphocytes B humains par le virus
d'Epstein-
Barr (EBV), ou plus récentes, comme la technologie du~"phage display",
l'utilisation de
librâirie combinatoire d'anticorps humains ou d'animaux transgéniques,
notamment la
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sourïs Xenomouse~ ; les anticorps monoclonaux peuvent également être préparés
par
ingénerie moléculaire, notamment pour chimériser ou humaniser les anticorps.
Aux fins de l'invention, l'analyse des glycannes peut être effectuée par
exemple par
HPCE-LIF (High-Performance Capillary Electrophoresis with Laser-Induced
5 Fluorescence), ou grâce à toute autre méthode d'analyse des glycannes connue
de
l'homme du métier.
Le procédé selon l'invention permet l'obtention d'un anticorps monoclonal
possédant
une forte activité effectrice, et plus particulièrement une forte activité
fonctionnelle de
type ADCC. A ce titre, on entend par activité efFectrice les activités
biologiques
attribuables à la région Fc d'un anticorps. Des exemples de ces fonctions
effectrices
incluent, sans y être limitées, l'activité ADCC (Antibody-Dependent Cell-
mediated
Cytotoxicity), l'activité CDC (Complement-Dependent Cytotoxicity), l'activité
de
phagocytose, l'activité d'endocytose ou encore l'induction de la sécrétion de
cytokines.
Par « forte » activité effectrice on entend une activité effectrice au moins
20 fois, 50
fois, 60 fois, 70 fois, 80 fois, ou 90 fois, et de préférence jusqu'à 100
fois, ou de
manière préférentielle 500 fois supérieure à l'activité effectrice d'anticorps
de même
spécificité mais dont le ratio taux de fucose/taux de galactose est supérieur
à 0,6.
De manière préférentielle, le ratio taux de fucose/taux de galactose se situe
entre les
valeurs 0,6 et 0,3, préférentiellement ï entre 0,5 et 0,35. En effet, au vu
des
expérimentations menées dans le cadre de l'invention, il apparaît qu'un ratio
limite
existe, c'est-à-dire un ratio taux de fucose/taux de galactose en dessous
duquel
l'activité fonctionnelle, notamment l'ADCC, n'augmente plus de manière
linéaire à la
diminution dü ratio. Il est donc particulièrement avantageux de réaliser le
procédé
selon l'invention de manière à se situer entre ces limites.
Par exemple, si le taux de fucose se situe entre 35% et 45%, le taux de
galatose peut
être compris entre 70 et 99%. Si le taux de fucose se situe entre 20% et 35%,
le taux
de galatose est compris entre 55% et 70% ou même entre 60% et 99%.
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Aux fins de l'invention, la valeur du « ratio inférieur ou égal à 0,6 »
s'entend aussi
d'une valeur supérieure à 0,6 de quelques centièmes d'unité, par exemple 4 à 5
centièmes.
Dans un aspect particulier de l'invention, les anticorps obtenus par le
procédé selon
l'invention sont produits dans des cellules modifiées génétiquement par
introduction
d'au moins un vecteur permettant l'expression des anticorps, ces cellules
étant des
cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des cellules de mammifères,
d'insectes,
de plantes, de bactéries ou de levures.
De manière avantageuse, l'anticorps obtenu est une immunoglobuline humaine de
type
IgG.
De manière particulièrement avantageuse, ces cellules peuvent être modifiées
génétiquement par introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression
d'au
moins un polypeptide possédant une activité glycosyltransférasique.
Préférentiellement, cette activité glycosyltransférasique est une activité
galactosyltransférasique, et notamment une activité beta(1,4)-
galactosyltransférasique
ou beta(1,3)-galactosyltransférasique.
Aux fins de l'invention, on entend par « polypeptide possédant une activité
galactosyltransférasique » tout polypeptide capable de catalyser l'addition
d'un résidu
de galactose à partir de l'UDP-galactose vers le résidu de GlcNAc en position
non
réductrice d'un N glycanne.
Aux fins de l'invention, on entend par « vecteur permettant l'expression d'un
polypeptide possédant une activité beta(1,4)-galactosyltransférasique » tout
vecteur
comprenant un polynucléotide permettant l'expression d'un polypeptide capable
de
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synthétiser le motif disaccharidique Galbeta(1,4)-GlcNac, ce polynucléotide
pouvant
provenir d'espèces comme l'homme, la souris, le hamster, la vache, le mouton,
la
chèvre, le cochon, le cheval, le rat, le singe, le lapin, le poulet par
exemple. De telles
séquences, comme par exemple NM 001497, AB 024434, NM 003780, BC 053006,
XM 242992, NM 177512, cette liste n'étant pas exhaustive, sont disponibles
dans des
banques de séquences nucléotidiques et/ou protéiques comme Genbank.
Aux fins de l'invention, on entend par « vecteur permettant l'expression d'un
polypeptide possédant une actïvité beta(1,3)-galactosyltransférasique » tout
vecteur
comprenant un polynucléotide permettant l'expression d'un polypeptide capable
de
synthétiser le motif disaccharidique Galbeta(1,3)-GlcNac, ce polynucléotide
pouvant
provenir d'espèces comme l'homme, la souris, le hamster, la vache, le mouton,
la
chèvre, le cochon, le cheval, le rat, le singe, le lapin, le poulet par
exemple.
Notamment, les séquences codant pour une beta(1,3)-galactosyltransférase
provenant
d'espèces comme l'homme, la souris, le hamster, la vache, le mouton, la
chèvre, le
cochon, le cheval, le rat, le singe, le lapin, le poulet par exemple sont
particulièrement
adaptées. De telles séquences sont disponibles sur Genbank, comme par exemple
NM020981, AB084170, AY043479, cette liste n'étant pas limitative.
Par « site de glycosylation de la région Fc des anticorps » on entend
généralement les
deux résidus d'Asn297 selon la numérotation de Kabat (Kabat database,
http://immuno.bme.nwu.edu), mais l'invention vise également les anticorps dont
les
séquences en acides aminés ont été modifiées.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les cellules possèdent
en outre
une activité relative à la synthèse et/ou au transport du GDP-fucose et/ou
l'activité
d'une enzyme impliquée dans l'addition de fucose à l'oligosaccharide du site
de
glycosylation des anticorps diminuée ou délétée. De manière avantageuse,
l'enzyme
impliquée dans la synthèse du GDP-fucose est la GMD (GDP-D-mannose 4,6-
déhydratase), la Fx (GDP-keto-6-déoxymannose 3,5-épimérase, 4-réductase) ou la
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GFPP (GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase), cette liste n'étant pas
exhaustive.
Avantageusement, l'enzyme impliquée dans .l'addition du fucose est une
fucosyltransférase. La protéine impliquée dans le transport du GDP-fucose peut
avantageusement être le GDP-fucose tansporter 1 humain.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est possible, si
les taux de
fucose et de galactose mesurés à l'étape b) donnent un ratio supérieur à 0,6,
de dé-
fucosyler etlou d'ajouter des résidus de galactose aux anticorps avant l'étape
c), de
manière à ce que ledit ratio devienne inférieur à 0,6 mais préférentiellement
inférieur à
0,5 et même à 0,4 afin d'augmenter l'activité fonctionnelle des anticorps.
Cette dé-
fucosylation peut être effectuée par l'addition d'une fucosidase dans le
milieu
contenant l'anticorps, qui peut être le milieu de conservation. L'ajout de
résidus de
galactose peut être effectué par tout moyen approprié y compris l'addition
d'une
galactosyltransférase dans le milieu contenant l'anticorps ou dans une
solution
contenant l'anticorps et un substrat donneur comme l'UDP-galactose, par
exemple.
De manière avantageuse, les cellules utilisées pour mettre en oeuvre le
procédé selon
l'invention proviennent de lignées cellulaires animales ou humaines, ces
lignées étant
sélectionnées notamment parmi les lignées de myélomes de rat, notamment YB2/0
et
IR983F, de myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine
humaine comme PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO-
Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr-, CHÖ Lecl3, ou d'autres lignées choisies parmi Wil-
2,
Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP210-Ag 14 et
P3X63Ag8.653.
Avantageusement, (anticorps est un anti- Rhésus D (anti-D), anti-CD, anti-
tumeurs,
anti-virus, anti-CD20 ou un anti-HLA-DR, plus particulièrement parmi les
anticorps du
Tableâu 0 ci-après
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Tableau 0
Nom et marqueSocit cible indication
commerciale
de
l'anticorps
Edrecolomab Centocor anti Ep-CAMcancer colorectal
PANOREX
Rituximab Idec anti CD20 B cell lymphoma
RITUXAN Licensi thrombocytopenia
purpura
Genentech/
Hoffinan la
roche
Trastuzumab Genentech anti HER2 cancer ovarien
HERCEPTIN Licensi Hoffinari
la
roche/Immunogen
Palivizumab Mednmune RSV
SYNAGIS Licensi Abott
Alemtuzwnab BTG anti CD52 leukemia
CAMPATH Licensi Schering
ibritumomab IDEC anti CD20 NHL
tiuxetan Licensi Schering
ZEVAL1N
Cetuximab Merck /BMS / anti EGFR cancers
IMC-C225 Imclone
Bevacizumab Genentech/ anti VEGFR cancers
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Epratuzumab hnmumedics/ anti CD22 cancers:
Amgen lymphome non hogkinien
Hu M195Mab Protein Design Anti CD33 cancers
Labs
MDX-210 hnmuno-DesignedND cancers
Molcules
BEC2 Imclone anti GD3 cancers
Mitumomab
Oregovomab Altarex anti CA125cancer ovarien
O UAREX
Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD3 melanome malin
KW-2971
ABX-EGF Abgenix EGF cancers
MDXO10 Medarex Anti CD4R Cancers
XTL 002 XTL ND anti-viral : HCV
biopharmaceuticals
H11 SCFV viventia biotechND cancers
4B5 viventia biotechanti GD2 Cancers
XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV
biopharmaceuticals
MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA cancer de la Prostate
TNX-901 TANOX anti IgE Allergies
IDEC-114 IDEC inhibition lymphome non-Hodgkinien
ProteinC
Cette liste n'est toutefois pas limitative.
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Un deuxième objet de l'invention est de fournir un procédé pour augmenter
l'activité
effectrice, notamment l'activité ADCC, d'une composition de molécules
immunologiquement fonctionnelles, comprenant l'augmentation du taux de
galactose
et/ou la diminution du taux de fucose de la composition de molécules.
Par « molécules immunologiquement fonctionnelles » on entend désigner des
molécules capables de réagir à tout contact avec un immunogène quelconque en
manifestant une capacité immunologique. Ces molécules peuvent présenter à
l'état
natif une bonne activité effectrice, par exemple ADCC, ou une mauvaise
activité
effectrice. Elles possèdent une région Fc comportant un site de glycosylation.
A cet effet, ces molécules fonctionnellement immunologiques sont
préférentiellement
des anticorps, avantageusement monoclonaux ou polyclonaux.
Les molécules peuvent posséder à l'état natif un fort taux de fucose. Plus
particulièrement, il est avantageux dans ce cas d'effectuer une augmentation
du taux de
galactose de ces molécules ou anticorps.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la diminution du taux de fucose
est
réalisée par une dé-fucosylation des molécules de la composition par action
d'une
fucosidase. Cette dé-fucosylation peut être effectuée par une a1,6 fucosidase.
Les
fucosidases extraites de rein de bovin ou de Cha~onia lampas ont cette
spécificité.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'augmentation du taux de
galactose
des molécules de la composition est due à une galactosylation de la
composition par
action d'une galactosyltransférase.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on fait agir à la fois
des
enzymes permettant la dé-fucosylation et des enzymes permettant la
galactosylation.
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De manière alternative au traitement enzymatique, on peut purifier la
composition de
molécules immunologiquement fonctionnelles grâce à une série de
chromatographies
sur lectines qui enrichissent la composition en anticorps faiblement fucosylés
et/ou en
anticorps fortement galactosylés.
A titre d'exemple, la solution comprenant la composition de molécules
immunologiquement fonctionnelles, qui sont de manière avantageuse des
anticorps, est
passée sur une colonne de lectine (par exemple une colonne LA-LCA, ou LA-
AAL,Shimadzu Corporation ) 'connectée à un système HPLC. La solution est
séparée
en une fraction non-adsorbée et une fraction adsorbée. ). Une analyse des
glycannes des
fractions non-adsorbée et adsorbée est effectuée : les oligosaccharides,
clivés de la
partie protéique par action enzymatique, sont marqués avec l'APTS et sont
séparés par
HPCE-LIF et quantifiés. . Les aires des pics sont calculés : les anticorps
possédant des
glycannes dépourvus de fucose peuvent être ainsi séparés et sélectionnés. On
passe
ensuite la fraction sélectionnée (qui peut être issue de la fraction non-
adsorbée ou de la
fraction adsorbée) soit sur une colonne hydrophobe de type Phenyl-SPW
(préparée par
Tosoh Corporation) soit sur une seconde colonne de lectine ( LA-RCA 120 ou LA-
WGA, Seikagaku America). On peut ainsi sélectionner de manière précise les
fractions
dont le ratio taux de fucose/taux de galactose est inférieur ou égal à 0,6.
Un troisième objet de l'invention est une cellule, de manière préférentielle
dérivée de
la lignée cellulaire YB2/0, dans laquelle au moins un vecteur codant pour une
molécule
d'anticorps est introduite, ladite cellule produisant un anticorps monoclonal
possédant
un ratio taux de fixcose/taux de galactose des oligosa:ccharides du site de
glycosylation
de la région Fc inférieur ou égal à 0,6. Préférentiellement, ce ratio est
inférieur à 0,5 ou
encore à 0,4. Dans un aspect préféré de l'invention, ce ratio est compris
entre 0,6 et
0,3.
Dans un aspect préféré de l'invention, cette cellule est transfectée par un
vecteur
d'expression çodant pour une galactosyltransférase, notamment pour une
beta(1;4)-
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galactosyltransférase ou une beta(1,3)-galactosyltransférase. Avantageusement,
cette
cellule exprime ou sur-exprime une galactosyltransférase recombinante.
La lignée YB2/0 exprime naturellement des galactosyltransférases de la famille
des
beta(1,4) et beta(1,3). Par ailleurs, cette lignée cellulaire est connue pour
produire des
anticorps possédant un faible taux de fucose (WO 01/77181, LFB). Toutefois, la
cellule selon l'invention a pour avantage de sur-exprimer la
galactosyltransférase, ce
qui a pour effet de faire varier le ratio taux de fucose / taux de galactose
des anticorps
produits par la cellule modifiée par rapport aux anticorps produits par la
lignée non
modifiée. Par conséquent, l'anticorps étant naturellement faiblement fucosylé,
une
augmentation de son taux de galactose baisse encore son ratio taux de fucose /
taux de
galactose, ce qui a pour effet d'optimiser encore son activité ADCC.
De manière avantageuse, la galactosyltransférase est codée par une séquence
ayant
pour origine l'homme, la souris, le hamster, la vache, le mouton, la chèvre,
le cochon,
le cheval, le rat, le singe, le lapin ou le poulet, cette liste n'étant pas
limitative. Plus
particulièrement, la séquence codante est la séquence NM 001497, AB 024434, NM
003780, BC 053006, XM 242992 ou NM 177512.
Ainsi, l'invention se rapporte également à un procédé de préparation
d'anticorps
monoclonal dont les siructures glycanniques portées par le site de
glycosylation de la
région Fc possèdent un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur ou
égal à 0,6,
préférentiellement inférieur à 0,5 ou encore à 0,4 comprenant la culture de la
cellule
précédemment décrite dans un milieu de culture et à des conditions permettant
l' expression desdits vecteurs.
Alternativement, on peut préparer des compositions d'anticorps telles que
définies ci-
dessus au moyen d'une ou plusieurs étapes de chromatographie en utilisant
toute
molécule capable de pièger avec spécificité le fucose, le galactose ou les
oligosaccharides les comprenant. A ce titre, on peut utiliser la séparation
sur lectine,
comme illustrée ci-avant.
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De même, l'invention se rapporte à des anticorps thérapeutiques ayant une
forte
activité effectrice, susceptibles d'être obtenus à partir des procédés
précédexmnent
décrits, ou encore obtenus à partir des procédés décrits, ces anticorps étant
caractérisés
en ce qu'ils présentent sur leur site de glycosylation de la région Fc, des
structures
glycanniques possédant un ratio taux de fucose / taux de galactose inférieur à
0,6,
préférentiellement inférieur à 0,5 ou encore à 0,4.
De manière particulièrement avantageuse, il s'agit d'anticorps monoclonaux
thérapeutiques susceptibles d'être obtenus à partir du procédé précédent,
lesdits
anticorps présentant une activité ADCC renforcée, à titre d'exemple des anti-D
monoclonaux présentant une activité ADCC égale ou supérieure à celle des
anticorps
polyclonaux. Cette activité ADCC renforcée est au moins égale mais
préférentiellement supérieure à celle de l'anticorps thérapeutique polyclonal
ou
monoclonal (de même spécificité) exprimé dans une lignée CHO DG44 ou DxBl 1.
Avantageusement, il peut s'agir d'IgG, par exemple des IgG1 ou des IgG3,
chimériques, humanisées ou humaines ou d'IgG ayant une région Fc humaine.
Préférentiellement, ces anticorps sont des IgG humaines ou toute molécule
chimérique
comportant une région Fc humaine.
Dans le même ordre d'idée, l'invention se rapporte à une composition
pharmaceutique
comprenant un anticorps précédemment décrit.
De même, l'invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant
au
moins 50%, préférentiellement 60%, 70%, 80% ou encore 90% ou 99% d'un
anticorps
monoclonal ou polyclonal dont les structures glycanniques portées par le site
de
glycosylation de la région Fc possèdent un ratio taux de fucose / taux de
galactose
inférieur à 0,6 préférentiellement inférieur à 0,5 ou encore à 0,4. De manière
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préférentielle, le ratio se situe entre les valeurs 0,6 et 0,3, et plus
particulièrement entre
0,5 et 0,35.
Les compositions selon l'invention comportent préférentiellement un anticorps
dirigé
5 contre un antigène normal non ubiquitaire, notamment un facteur Rhésus,
comme le
facteur Rhésus (D) du globule rouge humain, ou un antigène d'une cellule
pathologique ou d'un organisme pathogène pour ~ (homme, en particulier contre
un
antigène d'une cellule cancéreuse. Les anticorps sont de plus-
préférentiellement des
IgG.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps selon
l'invention
pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de l'allo-
immunisation,
notamment la maladie hémolytique du nouveau-né.
Un autre objet de l'invention se rapporte à l'utilisation d'un anticorps selon
l'invention
pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies auto-
immunes,
des cancers et des infections par des agents pathogènes, notamment pour le
traitement
des maladies échappant à la réponse immune notamment choisie parmi le Syndrome
de
Sézary, les cancers solides, notamment dont les cibles antigéniques sont
faiblement
exprimées, notamment le cancer du sein, les pathologies liées à l'
environnement visant
notamment les personnes exposées .aux biphényles polychlorinés, les maladies
infectieuses, notamment la tuberculose, le syndrome de la fatigue chronique
(CFS), les
infections parasitaires comme par exemple les schistosomules, et les
infections virales.
De plus, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé pour la préparation
d'un
médicament destiné au traitement des cancers des cellules HLA classe II
positives
comme les mélanomes, les leucémies lymphoïdes àiguës des cellules B et T, les
leucémies myéloïdes chroniques et aiguës , le lymphome de Burkitt, le lymphome
de
Hodgkin, les lyrnphomes des cellules T et les lymphomes non hodgkiniens.
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Les anticorps de (invention peuvent être sélectionnés parmi les anticorps
figurant dans
le tableau 0.
Avantageusement, (anticorps est un anti-HLA-DR ou un anti-CD20.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps selon l'invention est utilisé
pour la
fabrication d'un médicament destiné à induire l'expression d'au moins une
cytokine
choisie parmi IL-la, IL-1[3, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-18 , IL-
21, TGF(31,
TGF(32, TNFa, TNF(3, IFN~y, et IP 10 par les cellules efFectrices naturelles
du système
immunitaire, ledit médicament étant utile notamment pour le traitement du
cancer et
des infections virales, bactériennes ou parasitaires.
Dans un autre aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention
est utilisé
pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de patients
présentant un des
polyrnorphismes du CD16, en particulier V/F158 ou F/F158, notamment des
patients
se trouvant en échec thérapeutique avec _les anticorps actuellement
disponibles ou
subissant des effets secondaires indésirables.
Dans un aspect supplémentaire, l'invention se rapporte également à un procédé
de
préparation d'un anticorps monoclonal chimérique, humanisé ou humain ayant une
faible activité effecirice, notamment une faible activité fonctionnelle de
type ADCC,
caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes
a) production et pul-ification d'anticorps monoclonaux obtenus à partir de
différentes sources, notamment de cellules, plantes ou animaux non humains,
éventuellement génétiquement modifiés ou transformés,
b) mesure du taux de fucose et du taux de galactose des structures
glycanniques
portées par le site de glycosylation de la région Fc desdits anticorps,
c) sélection des anticorps dont le ratio taux de fucose / taux de galactose
est
supérieur à 0,6, préférentiellement supérieur à 1,2.
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A ce titre, les définitions de l'activité effectrice d'un anticorps monoclonal
sont les
mêmes que celles données précédemment.
De plus, par « faible activité effectrice » on entend une activité effectrice
au moins 20
fois, 50 fois, 60 fois, 70 fois, 80 fois, ou 90 fois, et de préférence jusqu'à
100 fois, ou
de manière préférentielle 500 fois inférieure à l'activité effectrice,
notamment à
l'activité fonctionnelle de type ADCC d'anticorps de même spécificité mais
dont le
ratio taux de fucose/taux de galactose est inférieur à 0,6.
Dans un aspect complémentaire, (invention vise donc des anticorps ayant une
faible
activité ADCC, et les compositions les comprenant, caractérisés en ce que leur
site de
glycosylation (Asn 297) de la région Fc présente un ratio taux de fucose /
taux de
galactose supérieur à 1,2.
Ces anticorps sont utiles pour préparer des médicaments pour traiter et/ou
prévenir les
maladies auto-immunes, notamment le purpura thrombopénique immunologique (PTE,
les alto-immunisations, le rejet de greffe, les allergies, l'asthme, les
dermatites, les
urticaires, les érythèmes, et les maladies inflammatoires.
Dans un aspect particulier de l'invention, les anticorps sont produits dans
des cellules
modifiées génétiquement par introduction d'au moins un vecteur permettant
l'expression desdits anticorps, lesdites cellules étant des cellules
eucaryotes ou
procaryotes, notamment des cellules de mammifères, d'insectes, de plantes, de
bactéries ou de levures.
Dans un mode de réalisation de l'invention, les cellules sont modifiées
génétiquement
par introduction d'au moins un vecteur permettant l'expression d'au moins un
polypeptide possédant une activité glycosyltransférase, préférentiellement une
activité
fucosyltransférase et notamment a 1,6-fucosyltransférase.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules possèdent une
activité
relative à la synthèse et/ou au transport de l'UDP-galactose et/ou l'activité
d'une
enzyme impliquée dans l'addition de galactose à l'oligosaccharide du site de
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glycosylation des anticorps est diminuée ou délétée. Avantageusement, cette
enzyme
impliquée dans l'addition de galactose est une (31,4-galactosyltransférase.
Avantageusement, les cellules possèdent à la fois une activité
glycosyltransférasique,
préférentiellement une activité fucosyltransférasique et une activité relative
à la
synthèse et/ou au transport de l'UDP-galactose et/ou l'activité d'une enzyme
impliquée
dans l'addition de galactose à l'oligosaccharide du site de glycosylatioil des
anticorps
diminuée ou délétée.
Dans un mode de réalisation de l'invention, on peut prévoir que si à l'étape
b), le ratio
mesuré est inférieur à 0,6, on fucosyle et/ou on enlève des résidus de
galactose audit
anticorps avant l'étape c), de manière à ce que le ratio taux de fucose/taux
de galactose
devienne supérieur à 0,6.
Avantageusement, la dé-galactosylation est effectuée par l'addition d'une
galactosidase
dans le milieu contenant l'anticorps.
Avantageusement, l'ajout de résidus de fucose est effectué par l'addition
d'une
fucosyltransférase dans le milieu contenant l'anticorps.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps est une immunoglobuline
humaine de type IgG. De manière avantageuse, l'anticorps est dirigé contre un
CD,
marqueur de différenciation des cellules sanguines humaines ou contre un agent
pathogène ou sa toxine listée comme étant particulièrement dangereuse dans les
cas de
bioterrorisme, notamment Bacillus anthYacis, Clost~idium botulium, Yersi~cia
pestis,
Tlariola naajo~, Franzcisella tularensis, Filoviruses, Arenaviruses,
Bf°ucella species,
Clost~~idium per f -ingens, Salmonella, E. coli, Shigella, Coxiella burtaetü,
la toxine de
ricin , Rickettsia, Viral encephalitis viruses, Tlib~~io claolerae ou
Hantavirus .
Un autre objet de l'invention se rapporte à un procédé pour diminuer
l'activité d'une
composition de molécules immunologiquement fonctionnelles, comprenant
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l'augmentation du taux de fucose et/ou la diminution du taux de galactose de
ladite
composition.
Avantageusement, les molécules immunologiquement fonctionnelles sont des
anticorps
monoclonaux ou polyclonaux.
Dans un aspect particulier, l'augmentation du taux de fucose est due à une
fucosylation
de ladite composition par action d'une fucosyltransférase, préférentiellement
d'une
a1,6-fucosyltransférase.
Dans un autre aspect particulier, la diminution du taux de galactose de ladite
composition est due à une dé-galactosylation de la composition par action
d'une
galactosidase, préférentiellement d'une ou plusieurs (3-galactosidase.
De manière particulièrement avantageuse, on effectue à la fois une
fucosylation et une
dé-galactosylation de cette composition.
Ainsi, un objet de l'invention se rapporte à une composition d'anticorps
susceptible
d'être obtenue à partir des procédés selon l'invention décrits ci-dessus, ou
une
composition d'anticorps obtenue à partir de l'un de ces procédés.
Un objet supplémentaire de l'invention est l'utilisation de cette composition
d'anticorps pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à
la
prévention des maladies auto-immunes et notamment le PTI, de l' allo-
immunisation,
des rejets de greffe, des allergies, de (asthme, des dermatites, des
urticaires, des
érythèmes, ou des maladies inflammatoires, cette liste n'étant pas exhaustive.
Enfin, l'invention se rapporte à un procédé pour contrôler l'activité d'une
composition
de molécules immunologiquement fonctionnelles, comprenant la régulation du
ratio
taux de fucose / taux de galactose des oligosaccharides du site de
glycosylation de la
région Fc des anticorps .
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples
qui
suivent montrant la modulation de « l'effet fucose » par le galactose, qui
doivent être
considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
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Descriution des figures
5 Figure 1 : Structures glycanniques présentes sur le site de glycosylation de
la région Fc
de différents anticorps anti-Rh(D).
Cette figure représente les pourcentages des différentes formes glycanniques
portées
par les résidus Asn297 de 3 anticorps anti-Rh(D) : IgG1 anti-D de WinRho
(histogrammes noirs), anticorps.monoclonal EMAB2 (histogrammes blancs) et Anti
10 D 1 (histogrammes hachurés).
Figure 2 : Droite de corrélation entre le rapport taux de fucose / taux de
galactose et
l'activité ADCC des anticorps anti-Rh(D).
15 Figure 3 : Effet du taux de galactose sur l'activité ADCC des anticorps
polyclonaux
anti-Rh(D).
Cette figure représente le pourcentage de lyse des hématies Rh(D+) induite par
les
anticorps polyclonaux anti-Rh(D) dégalactosylés (Dégal.) ou non (Témoin) en
présence
d'IgG polyvalentes (Tégéline, LFB) à la concentration de 0,5 et 2,5 mg/ml.
Figure 4 : Activation CD16 des anticorps monoclonaux anti-Rh(D)
dégalactosylés.
Cette figure représente le % d'activation CD16 induit par la présence des
anticorps
monocloaux anti-Rh(D) EMAB2 et HHO1, dégalactosylés (histogrammes blancs) ou
non (Témoin, histogrammes noirs).
Figure 5 : Activation CD16 des anticorps monoclonaux anti-Rh(D) galactosylés.
Cette figure représente l'activation CD16 induite par les anticorps
monoclonaux anti-
Rh(D), EMAB2 et EMAB3, avant (Témoin, histogrammes noirs) et après
galactosylation in vitro par la (31,4-galactosyltransférase bovine
(histogrammes blancs).
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Figure 6 : Courbes de clairance des hématies radiomarquées, sensibilisées ou
non par
des anticorps anti-Rh(D).
Cette figure représente le suivi de la radioactivité, exprimée en %, contenu
dans le sang
de volontaires auxquels ont été réinjectées un volume d'hématies radiomarquées
au
Crsl soit non sensibilisées (~, O) soit sensibilisées par la préparation
thérapeutique
d'anticorps polyclonaux RhophylacTM (~) ou par -l'anticorps monoclonal EMAB2 (
~ ,
1, D). L'anticorps EMAB2 a été testé chez 3 volontaires (008, 009 et 010)
Figure 7 : Effet de la dégalactosylation des anticorps monoclonaux anti-HLA DR
exprimés dans les lignées cellulaires YB2/0 et CHO-DG44 sur l'activation CD16.
Cette figure représente la quantité, exprimée en pg/ml, d'Il-2 sécrétée par
les cellules
Jurkat CD 16 dont le récepteur CD 16 a été activé, en présence de cellules
Raji portant
sur leur membrane des molécules de HLA DR, par des anticorps chimériques anti-
HLA
DR, natifs (traits pleins) ou dégalactosylés (traits pointillés).
Exemples
Exemple 1. Corrélation entre le rapport taux de fucose/taux de galactose et
l'activité ADCC d'une cohorte d'anticorps anti- Rh(D).
Nous avons procédé à la mésure du taux de fucose, puis du taux de galactose de
divers
anticorps monoclonaux et polyclonaux dirigés contre l'antigène Rhésus (Rh)
(D). Nous
en avons déduit le rapport entre les deux, et mesuré l'activité ADCC relative
à chaque
anticorps.
1. Production des anticorps monoclonaux anti-Rh(D)
Les anticorps monoclonaux sont issus de la transformation par EBV, de
lymphocytes B
d'un donneur humain Rh(D) négatif, immunisé avec des hématies portant
l'antigène
Rh(D). De cette transformation ont été sélectionnés 2 clones:
1) l'un des clones a été fusionné avec l'hétérom~élome homme/souris K6H6-BS ;
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de cette fusion a été sélectionné le clone HH01.
2) à partir de l'autre clone, ont été extraits les ARN codant l'anticorps anti-
Rh(D)
pour la préparation d'un vecteur d'expression de la chaîne lourde et de la
chaîne légère de l'anticorps.
Ce vecteur d'expression a été utilisé pour transfecter, d'une part la lignée
cellulaire
YB2/0 donnant naissance aux anticorps EMAB1, EMAB2, EMAB3 et EMAB4 et,
d'autre part, les lignées CHO suivantes : DG44, K1 et Lecl3 qui synthétisent
les
anticorps Anti-D 1, Anti-D2 et Anti-D3, respectivement.
2. Purification des anticorps polyclonaux.
Les anticorps polyclonaux anti-Rh(D) ont été imlnunopurifiés à partir d'un
produit
thérapeutique, WinRho (Cangène), par sélection positive sur hématies Rh(D+)
puis par
sélection négative sur hématies RhD(-) ; enfin, une étape de chromatographie
d'affinité
utilisant le gel de Sépharose-protéine A a permis d'une part d'éliminer les
contaminants récupérés au cours de l'immunopurification sur hématies et,
d'autre part,
de séparer les IgGl des IgG3, étant donné que seules les IgGl ont été
utilisées dans les
essais suivants.
3. Analyse des glycannes par HPCE-LIF
Les anticorps monoclonaux et polyclonaux anti-Rh(D) sont déssalés sur une
colonne
de Sephadex G-25 (HiTrap Desalting, Amersham Biosciences), séchés par
évaporation
et remis en suspension dans le tampon d'hydrolyse de la PNGase F (Glyko) en
présence de 50 mM ~3-mercaptoéthanol. Après 16 h d'incubation à 37°C,
la partie
protéique est précipitée par l'ajout d'éthanol absôlu et le surnageant, qui
contient les
N-glycannes, est séché par évaporation. Les oligosaccharides ainsi obtenus
sont soit
marqués directement par un fluorochrome, l'APTS (1-amino-pyrène-3,6,8-
trisulfonate)
soit soumis à l'action d'exoglycosidases spécifiques avant marquàge par
l'APTS. Puis
les oligosaccharides marqués sont injectés sur un capillaire N CHO et séparés
et
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quantifiés par électrophorèse capillaire à détection de fluorescence induite
par laser
(HPCE-LIF).
L'évaluation du taux de fucose est réalisée soit par l'addition des formes
fucosylées
isolées, soit plus spécifiquement après action simultanée de la neuraminidase,
la [3-
galactosidase et la N acétylhexosaminidase, permettant d'obtenir, sur
l'électrophorégramme, 2 pics correspondant au pentasaccharide [GlcNac2-Man3]
fucosylé ou non.
Le taux de fucose, exprimé en %, est calculé en utilisant la formule suivante
[GlcNac2-Man3] fucosylé x 100
Taux de fucose = [GlcNac2-Man3+ GlcNac2-Man3
fucosylé]
Le taux de galactose, exprimé en %, est calculé en additionnant les
pourcentages des
formes oligosaccharidiques contenant du galactose en position terminale. La
formule
utilisée est la suivante
Taux de galactose = [(G1+G1B+G1F+G1FB) + 2x(G2+G2F+G2B+G2FB)]
Le rapport taux de fucose/taux de galactose est obtenu en divisant le taux de
fucose par
le taux de galactose, les taux étant calculés comme décrit ci-dessus.
4. Activité fonctionnelle des anticorps : ADCC
La technique ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) permet
d' évaluer la capacité des anticorps à induire la lyse des hématies Rh(D+), en
présence
de cellules effectrices (cellules mononuclées ou lymphocytes).
Brièvement, les hématies d'un concentré globulaire RhD(+) sont traitées à la
papaïne
(lmg/ml, 10 min à 37°C) puis lavées en NaCI 0,9%. Les cellules
effectrices sont
isolées à partir d'un pool d'au moins 3 buffy-coat, par centrifugation sur
Ficoll
(Amersham), suivi d'une étape d'adhérence en présence de 25% de SVF, de façon
à
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obtenir un ratio lymphocytes/monocytes de l'ordre de 9. Dans une plaque de
microtitration (96 puits) on dépose par puits : 100 ~,l d'une dilution
d'anticorps anti-
Rh(D) purifié (de 9,3 à150 ng/ml), 25 p.l d'hématies papaïnées Rh(D+) (soit
1.106), 25
~.1 de cellules effectrices (soit 2.106) et 50 ~.1 d'IgG polyvalentes
(Tégéline, LFB) aux
concentrations usuelles de 2 et 10 mg/ml. Les dilutions sont faites en IMDM
0,25% de
sérum de veau fétal (SVF). Après une nuit d'incubation 1 nuit à 37°C,
les plaques sont
centrifugées, puis4 l'hémoglobine libérée dans le surnageant est mesurée par
l'intermédiaire de son activité peroxydasique en présence d'un substrat
chromogénique, le 2,7-diaminofluorène (DAF). Les résultats sont exprimés en
pourcentage de lyse, 100% correspondant à la lyse totale des hématies en NH4Cl
(témoin 100%) et 0% au mélange réactionnel sans anticorps (témoin 0%). La lyse
spécifique est calculée en pourcentage selon la formule suivante
(DO échantillon-DO témoin 0%) X100 = % ADCC
DO témoin 100% - DO témoin 0%
L'analyse, par HPCE-LIF, des oligosaccharides portés par le site de
glycosylation de la
région Fc des IgGl anti-Rh(D) a été réalisée.
TABLEAU I
om Anticorps , Taux Taux Ratio ADCC
de de Fucose/ (%)
Fucose GalactoseGalactose
(%) (%)
EMAB1 42,3 75,3 0,56 85
EMAB2 25,6 72,9 0,35 100
EMAB3 82,1 56,1 1,46 25
EMAB4 40 60,6 0,66 73
O1 38,1 79,3 0,48 89
ti-D WinRho* 76,1 120 0,63 70
ti-Dl 100 88,8 1,13 0
ti-D2 95,7 71,8 1,33 0
ti-D3 24,3 58,4 0,42 70
* Anti-D polyclonaux immunopurifiés
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. Les valeurs des ratios [taux de fucose/taux de galactose] et des
pourcentages d'ADCC,
contenus dans le tableau I, sont reportées respectivement en abscisse et en
ordonnée de
la Fig.2. Le coefficient de corrélation.de la droite de régression linéaire
tracée est égal à
0,92.
5 Ainsi, il existe une corrélation entre le ratio [taux de fucose / taux de
galactose] et
l'activité ADÇC des anticorps anti-Rh(D) monoclonaux et polyclonaux. Les
anticorps
qui ont une activité ADCC importante présentent un ratio taux de fucose / taux
de
galactose inférieur à 0,6.
10 EXEMPLE Z. Comparaison de l'activité ADCC des anticorps polyclonaux anti-
Rh(D) avant et après dégalactosylation
1. Dégalactosylation des anticorps polyclonaux anti-Rh(D).
Les anticorps polyclonaux immunopurifiés sont dialysés contre le tampon
d'hydrolyse
15 (Acétate de sodium 50 mM, pH 5,5 contenant 4 mM chlorure de calcium). Les
anticorps sont désialylés et dégalactosylés par incubation en présence de 5 mU
de
neuraminidase (EC 3.2.1.18) de T~ibrio cholerae (Calbiochem) et 9 mU de (3-
galactosidase (EC 3.2.1.23) produite par E.coli (Roche). Le contrôle, désigné
sous le
nom de « témoin », est constitué de la même préparation d'anticorps traité
comme
20 indiqué ci-dessus mais en absence de neuraminidase et de (3-galactosidase.
Après 24h
d'incubation à 37 °C, les anticorps sont stockés à 4°C.
Les anticorps générés dans cet exemple sont séparés en deux fractions ; l'ixne
des
fractions est utilisée pour l'analyse glycannique, et l'autre fraction est
réservée à la
mesure de l'activité ADCC.
2. Analyse des glycannes par HPCE-LIF
La procédure consiste en un dessalage sur colonne de Sephadex-G25 de la
fraction d'
anticorps polyclonaux anti-Rh(D) dégalactosylés afin d'éliminer les sels mais
aussi les
oses libres qui pourraient être présents dans la préparation. Après
dénaturation et
réduction des anticorps, les glycannes sont libérés par action de
l'endoglycosidase
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PNGase F (Glyko) . Après 16~ h d'incubation à 37°C, la partie protéique
est précipitée
par l'ajout d'éthanol absolu et le surnageant, qui contient les N glycannes,
est séché par
évaporation. Pour évaluer les taux de galactose et de fucose contenus dans les
oligosaccharides ainsi obtenus, l'échantillon est soumis à l'action simultanée
de
sialidase et de fucosidase ou de sialidase, (3-galactosidase et N
acétylhexosaminidase,
respectivement, avant marquage par l'APTS. Puis les oligosaccharides marqués
sont
injectés sur un capillaire N CHO et séparés et quantifiés par électrophorèse
capillaire à
détection de fluorescence induite par laser (HPCE-LIF).
3. Mesure de l'activité ADCC.
La mesure de l'activité ADCC des anticorps polyclonaux avant et après
traitement par
la (3-galactosidase est réalisée selon la méthode décrite dans l'exemple 1.
Ainsi, après action de la (3-galactosidase, les glycannes de la région Fc des
anticorps
polyclonaux anti-Rh(D) présentent un taux de galactose résiduel de 17,7 % et
un taux
de fucose égal à 68,5%. Le ratio taux de fucose / taux de galactose des
anticorps
polyclonaux dégalactosylés est donc égal à 3,8.
La présence, dans le test ADCC, d'IgG polyvalentes comme Tégéline dans
l'exemple
présent, bloque les récepteurs de haute affinité (c'est-à-dire FcyRI ou CD64),
rendant
ainsi la lyse des hématies Rh(D+) plus spécifique de l'interaction des
anticorps anti-
Rh(D) avec les récepteurs FcyRIII présents sur les cellules effectrices.
Les résultats présentés Fig. 3 montrent d'une part que l'activité ADCC des
anticorps
polyclonaux anti-Rh(D) est dose dépendante et d'autre part, que l'augmentation
de la
quantité d'IgG polyvalentes dans le mélange réactionnel provoque une
diminution de
l'activité lytique des anticorps polyclonaux. De plus, les anticorps
polyclonaux
dégalactosylés ont une activité ADCC diminuée par rapport aux anticorps
témoins.
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TABLEAU II.
Anticorps polyclonauxActivit ADCC
(%)
dgalactosyls (ng/ml)Tgline 0,5 mg/mlTgline 2,Smg/ml
75 72 42
37,5 65 . 46
18,75 47 40
9,4 23 0
Le pourcentage d'activité ADCC des anticorps polyclonaux anti-Rh(D)
dégalactosylés
par rapport aux anticorps témoins, c'est-à-dire ayant subi la même incubation
mais en
absence de neuraminidase et de (3-galactosidase, sont présentés dans le
tableau II.
Ainsi, la diminution de l'activité ADCC des anticorps polyclonaux
dégalactosylés par
rapport aux anticorps témoins est d'autant plus importante que la quantité
d'anticorps
est faible. De plus, la diminution d'activité des anticorps polyclonaux
dégalactosylés
est plus importante en présence d'une concentration d'IgG polyvalentes de 2,5
mg/ml.
Exemple 3. Mesure de l'activation du récepteur CD16 induite par les anticorps
monoclonaux anti-Rh(D) dégalactosylés
l.Dégalactosylation des anticorps monoclonaux anti-Rh(D)
Les anticorps sont dialysés contre le tampon d'hydrolyse (Acétate de sodium 50
mM,
pH 5.5 contenant 4 mM chlorure de calcium). Les anticorps sont désialylés et
dégalactosylés par une incubation. en présence de 5 mU de neuraminidase (EC
3.2.1.18) de T~ibrio cholerae (Calbiochem) et 9 mU de (3-galactosidase (EC
3.2.1.23)
produite par E. coli (Roche). Le contrôle, désigné sous le nom de « témoin »,
est
cônstitué de la méme préparation d'anticorps traitée comme indiqué ci-dessus
mais en
absence de neuraminidase et de (3-galactosidase. Après 24h d'incubation à
37°C, les
anticorps sont stockés à 4°C.
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Les anticorps générés dans cet exemple sont séparés en deux fractions ; l'une
des
fractions est utilisée pour l'analyse glycannique et l'autre fraction est
réservée à la
mesure de l' activité fonctionnelle.
2. Mesure de l' activation du récepteur CD 16
Le test d'activation des cellules Jurkat CD16 mesure la sécrétion de
l'interleukine-2
(IL-2) induite par la fixation du Fc des anticorps sur le CD16 (FcyRIIIA)
après liaison
du Fab à son antigène, présent sur la cellule cible. Le taux d'IL-2 sécrété
par les
cellules Jurkat CD16 est proportionnel à l'activation du récepteur CD16.
Dans une plaque de microtitration de 96 puits, on dépose successivement 50 ~.l
de
dilutions d'anticorps, 50 ~l d'une suspension d'hématies à 6.105/ml, 50 ~,1
d'une
suspension de cellules Jurkat CD16 à 1.106/ml et 50 p.l d'une solution de PMA
à 40
ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture IMDM
contenant 5%
SVF.
Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de C02, la plaque de
microtitration est
centrifugée et la quantité d'IL-2 contenue dans le surnageant est dosée par un
kit
commercial (Duoset, R&D). Les taux d'IL-2 sécrétée sont,exprimés en pg/ml.
Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activation CD16, le taux d'IL-2
sécrétée
en présence de l'anticorps monoclonal témoin étant considéré égal à 100%.
Les résultats d'analyse des glycannes réalisée par HPCE-LIF comme décrit dans
l'exemple 2, sont réunis dans le tableau III.
TABLEAU III
Anticorps EMAB2 HHO1
Glycanne Tmoin DgalactosylTmoin Dgalactosyl
Fucose (%) 25,6 26,8 38,1 41,9
Galactose 72,9 0 79,3 17,3
(%)
Ratio Fuc/Gal0,35 N.A. 0,48 2,42
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Ainsi, il apparaît que l'anticorps monoclonal EMAB2 est totalement
dégalactosylé
alors que l'anticorps HHOl contient encore 17,3 % de formes monogalactosylées.
Après action de la (3-galactosidase, le ratio taux de fucose / taux de
galactose des
anticorps EMAB2 et HHO1 devient donc très supérieur à 0,6.
Les anticorps monoclonaux anti-Rh(D) dégalactosylés présentent une activation
CD16
très diminuée par rapport aux anticorps témoins (Fig. 4). Ainsi les anticorps
monoclonaux EMAB2 et HHO1 présentent une diminution de leur capacité à induire
l'activation du CD16 de 52 et 47 %, respectivement.
Exemple 4. Mesure de l'activation CD16 induite par des anticorps monoclonaux
anti-Rh(D) galactosylés
l.Galactosylation des anticorps.
Les anticorps sont dialysés contre du tampon HEPES 50 mM, pH 7.20. Le mélange
réactionnel est constitué de la solution d'anticorps monoclonal à laquelle
sont ajoutés
10 mM MnCl2, 20 mM UDP-galactose et 40 mU de (31,4-galactosyltransférase
bovine
(Calbiochem). Après incubation à 37°C pendant 24 heures, les tubes sont
conservés à
4°C avant utilisation.
Le contrôle est constitué du même anticorps incubé dans les mémes conditions
excepté
l'absence d' UDP-Gal dans le milieu réactionnel.
Les anticorps générés dans cet exemple sont séparés en deux fractions ; l'une
des
fractions est utilisée pour l'analyse glycannique et l'autre fraction est
réservée à la
mesure de l'activité ADCC.
2. Dosage du galactose par ELISA lectine
De part leur spécificité de reconnaissance, les lectines ont été utilisées
dans de
nombreuses applications de biologie et de médecine et notamment dans l'analyse
des
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glycannes par technique ELISA. La lectine RCA1, qui reconnaît le galactose lié
en
(31,4, a été utilisée pour doser le galactose présent dans les N-glycannes des
anticorps.
Les anticorps monoclonaux sont immobilisés dans les puits d'une plaque de
5 microtitration. Après 20 minutes.de chauffage à 100°C pour dénaturer
les molécules
d'IgG afin de rendre les N-glycannes de la région Fc accessibles, les puits
sont incubés
2 h. à tempérautre ambiante et sous agitation douce en présence d'une solution
de
RCAI biotinylée (Vector). Après lavage pour éliminer la lectine n'ayant pas
réagi, la
streptavidine-peroxidase est ajoutée dans chaque puits, incubée 1 h et la
lectine fixée
10 est mesurée à 492 nm après addition d'O-phénylènediamine.
Parallèlement, la quantité d'anticorps fixée dans les puits de la plaque de
microtitration
est mesurée par un anticorps anti-IgG humaine marquée à la peroxidase.
Puis la quantité de lectine fixée est corrigée par la quantité d' anticorps
fixé dans les
puits de microtitration.
3 . Mesure de l' activation du récepteur CD 16
Les conditions opératoires utilisées pour mesurer l'activation du récepteur
CD16 des
anticorps monoclonaux galactosylés sont identiques à celles décrites ci-
dessus.
Les anticorps monoclonaux décrits dans l'exemple présent sont des anticorps
anti-
Rh(D) ayant la même séquence primaire et produits par la cellule YB2/0. Ils
diffèrent
par leur activité fonctionnelle, en liaison avec leur taux de fucosylation en
a1,6 qui est
de 25% pour EMAB2 et 53% pour EMAB3.
Après action in vitro de la [3-1,4-galactosyltransférase, l'activation CD16
induite par
les anticorps monoclonaux EMAB2 et EMAB3 est augmentée de 10 et 54%,
respectivement (Fig. 5). Ainsi, l'augmentation de la galactosylation de
l'anticorps
EMAB2, qui à l'origine possède une très bonne activité efFectrice, n'induit
qu'une très
faible amélioration de l' activation CD 16 tandis que l' augmentation de la
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galactosylation de l'anticorps EMAB3, fortement fucosylé, se traduit par une
amélioration très significative de l' activité CD 16.
EXEMPLE 5 : Etude de la clairance des hématies sensibilisées par l'anticorps
monoclonal anti-Rh(D) EMAB2.
L'anticorps monoclonal anti-Rh(D) EMAB2 a été évalué dans un essai clinique de
phase I afin de comparer la clairance des hématies sensibilisées par cet
anticorps avec
celle des hématies sensibilisées par RhophylacTM, préparation thérapeutique
d'anticorps polyclonaux anti-Rh(D) utilisée en clinique.
Les hématies de volontaires sains sont marquées ex-vivo au chrome 51 (SICr) et
sensibilisées, c'est-à-dire incubées, en présence d'anticorps anti-Rh(D),
EMAB2 ou
RhophylacTM, pour obtenir un niveau de saturation de 25% des sites
antigéniques avant
d' être ré-inj ectées aux volontaires.
La disparition dans la circulation sanguine des hématies marquées au SICr a
été suivie
par mesure de la radioactivité au compteur gamma sur des prélèvements sanguins
réalisés à 3, 15, 30 minutes et 1, 2, 4, 6, 8, 10, 24, 48, 72, 96 heures après
la transfusion
des hématies marquées et sensibilisées. L'échantillon de sang prélevé à 3
minutes après
la transfusion des hématies représente le 100% de survie des globules rouges.
Les résultats présentés à la figure 6 montrent qu'en absence de
sensibilisation des
hématies radiomarquées par un anticorps, la diminution de la radioactivité
mesurée sur
une période supérieure à 100 h, est inférieure à 20%. Par contre, lorsque les
hématies
sont sensibilisées par une préparation thérapeutique d'anticorps polyclonaux
ou par
l'anticorps monoclonal EMAB2, la radioactivité sanguine décroît rapidement ;
dix
heures après l'injection, il reste moins de 10% de la radioactivité injectée.
Ainsi, la
courbe de disparition des hématies sensibilisées par l'anticorps monoclonal
EMAB2 a
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un profil similaire à celle des hématies sensibilisées par la préparation
thérapeutique
d'anticorps polyclonaux RhophylacTM.
L'anticorps monôclonal EMAB2 dont le rapport taux de fucose / taux de
galactose est
égal à 0,4, possède une activité in vivo, vis à vis de la clairaface des
laéf~aaties Rh(D+)
pré-sensibilisées, au moins comparable à celle d'une préparation d' anticorps
polyclonaux thérapeutique.
Des études cliniques réalisées dans les mêmes conditions mais avec un autre
anticorps
monoclonal, appelé MonoD, avaient donné des résultats très différents ; à 25%
de
saturation des site antigéniques membranaire, la clairance induite par MonoD
n'était
que partielle. L'analyse glycannique de l'anticorps MonoD avait révélé la
présence
d'un taux de fucose de 80% et de galactose de 86%, soit un ratio égal à 0,93.
La comparaison de ces résultats cliniques montre donc que les anticorps
monoclonaux
anti-D, ayant un ratio taux de fucose / taux de galactose inférieur ou égal
0,6,
présentent une efficacité sur la clairance des hématies supérieure à celle des
antiçorps
dont le ratio est proche de 1.
Exemple 6 : Modification du taux de galactose d'un anticorps monoclonal anti-
HLA DR exprimé par les lignées cellulaires CHO et YB2/0
1. Production de l'anticorps monoclonal anti-HLA DR
1.1. Construction des vecteurs d'expression
L'anticorps anti-HLA DR utilisé dans cette étude provient de la chimérisation
de
L'anticorps de souris, d'isotype IgG2a, exprimé par l'hybridome Lym-1 (ATCC Hb
8612).
L'ARN extrait de l'hybridome producteur de l'anticorps murin a été converti en
cDNA. La région VK murine a été amplifiée à l'aide des amorces K-Lym-Notl et K-
Lym-Dra3 puis clonée dans le vecteur de chimérisation CK-Hu, préalablement
digéré
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par Notl et Dra3, qui contient la séquence CK d'un anticorps anti-D humain et
le gène
de sélection DHFR.
La région VH marine a été amplifiée à l'aide des amorces H-Lym-Not 1 et H-Lyrn-
Apa
1 puis clonée dans le vecteur de chimérisation G1-Hu, préalablement digéré par
Not 1
et Apa 1, qui contient la séquence G1 d'unanticorps anti-D humain et le gène
de
sélection NEO.
Le promoteur hEF-la et la région 5'UTR du gène hEF-la, contenant l'exon 1 non
codant et le premier intron, a été isolé à partir du plasmide commercial
pEF/Bsd
(Invitrogen) par double digestion Nhe I et Acc 65 I. Parallèlement, le
promoteur RSV,
présent dans les vecteurs d'expression décrits ci-dessus, a été délété par
double
digestion Bgl II et Spe I puis remplacé par le fragment Nhe I- Acc65 I.
1.2. Obtention de lignées productrices stables
Les vecteurs d'expression pEF-Lym-dhfr-K-10 et pEF-Lym-neo-H-12 codant,
respectivement, pour la chaine légère et la chaîne lourde de l'anticorps
chimérique
anti-HLA DR, ont été utilisés pour co-transfecter, par électroportation, les
lignées
CHO-DXBl 1 (ATCC n°CRL-11397) et YB2/0 (ATCC n°CRL-1662).
Après transfection, les cellules en culture ont été soumises à une double
pression de
sélection comprenant d'une part, la délétion en nucléosides du milieu de
culture et
d'autre part l'addition de 6418. Les transformants résistant à cette double
pression de
sélection ont ensuite été clonés par dilution limite.
Les 2 clones sélectionnés sont YB2/0-DR-4B7 pour la lignée cellulaire
d'expression
YB2/0 et DXB11-DR-22A10 pour la lignée cellulaire d'expression CHO-DXB11.
1.3. Production et purification de l'anticorps chimérique anti-
HLA DR'-
. Le clone YB2/0-DR-4B7 a été cultivé dans un cytoculteur de 10 litres
(Biolafitte) en
milieu EM-SF1.1, milieu de base EMS supplémenté par Insuline (l~,g/ml),
Citrate de
fer ( 50 ~.g/ml), HEPES (4 mg/ml) et Pluronic F68 ( 0,5 mg/ml).
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Le clone DXB11-DR-22A10 a été cultivé en cytoculteur de 10 litres (Biolafitte)
en
milieu CHO SFM4 utility (Perbio) supplémenté par 2% d'hypoxanthine.
Lorsque la viabilité cellulaire est inférieure à 50 %, les milieux de culture
'sont
collectés, centrifugés pour éliminer les cellules et les anticorps chimériques
contenus
dans les surnageants sont purifiés par chromatographie d'affinité sur
Sépharose
protéine A.
2. Dégalactosylation
Les anticorps chimériques anti-HLA DR ont été dialysés contre un tampon
Acétate de
sodium 50 mM, pH 5,50 contenant 4 mM CaCl2. Les anticorps sont dégalactosylés
par
incubation en présence de 5 mU de neuraminidase (EC 3.2.1.18) de Vib~io
c7aole~~ae
(Calbiochem)et 9 mU de (3-galactosidase (EC 3.2.1.23) produite par E.coli
(Roche).
Le contrôle est constitué du même anticorps traité comme indiqué ci-dessus
mais en
absence de neuraminidase et de [3-galactosidase. Après 24h d'incubation à
37°C, les
anticorps sont stockés à 4°C.
Les anticorps générés dans cet exemple sont séparés en deux fractions ; l'une
des
fractions est utilisée poûr l'analyse glycannique et l'autre fraction est
réservée à la
mesure de l' activité fonctionnelle.
3. Mesure de l' activation CD 16
La lignée cellulaire Raji est utilisée comme cible car elle porte à sa surface
le
déterminant antigènique du complexe majeur d'histocompatibilité HLA-DR.
Dans une plaque de microtitration de 96 puits, sont déposés successivement 50
~,l de
dilutions d'anticorps, 50 ~,l d'une suspension de cellules Raji à 6.105/ml, 50
~.1 d'une
suspension,de cellules Jurkat CD16 à 1.106/ml et 50 ~,1 d'une solution de PMA
à 40
ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture EMS
contenant 5%
SVF.
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Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de CO2, la plaque de
microtitration est
centrifugée et la quantité d'IL-2 contenue dans le surnageant est dosée par un
kit
commercial (Duoset,'R&D). Les taux d'IL-2 sécrétée sont exprimés en pg/ml.
Les résultats sont exprimés en % d'activation CD16, le taux d'IL-2 sécrétée en
5 présence de l'anticorps monoclonal témoin étant considéré égal à 100%.
Les anticorps chimériques anti-HLA DR ont des structures glycanniques très
différentes selon qu'ils 'sont exprimés par la lignée YB210 ou CHO DXB 11.
Ainsi, le
ratio taux de fucose / taux de galactose de l'anticorps exprimé par YB2/0 est
égal à
10 0,37 alors que le ratio de l'anticorps exprimé dans CHO est très augmenté,
puisqu'égal
à 1,3.
L'activation CD16 des anticorps natifs est en accord avec les valeurs des
ratio taux de
fucose / taux de galactose ; ainsi, la sécrétion d'IL-2 induite par
l'anticorps anti-HLA
DR synthétisé par YB2/0 et qui a un ratio de 0,37 est 2 fois plus importante
que celle
15 induite par le méme anticorps synthétisé par CHO DXB11 mais dont le ratio
est égal à
1,3.
Après action de la (3-galactosidase, le taux de galactose restant sur les N
Glycannes de
la région Fc a été déterminé par HPCE-LIF. La dégalactosylation est presque
totale, les
20 taux de formes G1 pour l'anticorps produit par CHO et G1B pour l'anticorps
produit
par YB2/0, étant respectivement de 7% et 4,4%. Cette baisse du taux de
galactose se
traduit par une diminution significative de l'activation CD16 par rapport aux
anticorps
témoin, comme présenté Figure 7.
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