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DEMANDES OU BREVETS VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE I)E CETTE DEMANDE OU CE BREVETS
COMPRI~:ND PLUS D'UN TOME.
CECI EST ~.E TOME 1 DE 2
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Brevets.
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THAN ONE VOLUME.
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PROCEDE POUR IDENTIFIER DES COMPOSES MODULANT
LE TRANSPORT INVERSE DU CHOLESTEROL
La présente invention concerne des méthodes et composés susceptibles de
moduler
le transport inverse du cholestérol chez un mammifère ainsi que des méthodes
de
criblage permettant de sélectionner, d'identifier et/ou de caractériser des
composés
capables de moduler le transport inverse du cholestérol. Elle concerne
également des
cellules, vecteurs et constructions génétiques utilisables pour la mise en
oeuvre de ces
méthodes, ainsi que des compositions pharmaceutiques destinées au traitement
de
l'athérosclérose.
L'athérosclérose est une cause majeure de morbidité, de mortalité, d'infarctus
du
myocarde, d'ischémie cérébrale, de maladies cardiovascula.ires et de la
vascularisation périphérique. L'hypercholestérolémie et la surcharge en
cholestérol
des macrophages, impliquées dans l'inflammation vasculaire, sont des facteurs
majeurs qui contribuent à l'athérosclérose. L'hypercholestérolémie est
actuellement
traitée grâce à la combinaison d'un régime alimentaire et d'une intervention
médicamenteuse avec, par exemple les statines ou des agents séquestrant les
acides
biliaires. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques est
cependant
nécessaire pour pallier aux limites des thérapies existantes.
Le transport inverse du cholestérol, mis en oeuvre par les HDL (« High Density
Lipoproteins » ou Lipoprotéines de Haute Densité), permet de décharger le
cholestérol qui s'accumule dans les tissus périphériques et assure son
élimination
métabolique via le foie. Il contribue ainsi à la protection de l'organisme
côntre
l'athérosclérose. L'apolipoprotéine A-I (apo AI) est un constituant
fondamental des
HDL, responsable de leur efficacité. A cet égard, l'augmentation de
l'expression de
l'apo AI a un effet protecteur contre l'athérosclérose. L'expression de l'apo
AI est
régulée par des hormones ou des agents thérapeutiques tels que les fibrates.
Le rôle
crucial des récepteurs nucléaires tels que HNF4, PPARoc ou RORa dans le
contrôle
de la transcription du géne apo AI a été démontré. PPARa est notamment
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responsable de l'augmentation de l'expression de l'apo AI par les fibrates
observée
chez l'homme et utilisée en clinique humaine pour le traitement des
dyslipidémies.
L'identification de nouvelles voies de signalisation intracellulaire
impliquées dans le
contrôle de l'expression de l'apo AI permettrait donc de définir de nouvelles
stratégies thérapeutiques susceptibles d'augmenter l'efficacité du transport
inverse
du cholestérol et donc de protéger contre l'athérosclérose.
Les récepteurs nucléaires aux hormones forment une grande famille de facteurs
de
transcription dont l'activité est modulable par des ligands naturels et/ou
artificiels.
Ces facteurs de transcription contrôlent l'expression de leurs gènes-cibles en
se liant
généralement à des éléments de réponse spécifiques agissant en cis et en
recrutant
des protéines accessoires nécessaires à l'activation de la machinerie
transcriptionnelle.
Le récepteur nucléaire LRH-1 (Liver Receptor Homolog-1), également connu sous
les noms NRSA2, CPF, hBlF, PHR ou FTF est un récepteur orphelin pour lequel
aucun ligand n' a été identifié [ 1 ] . LRH-1 est un homologue du récepteur
FTZ-F 1 de
drosophile dont le paralogue chez l'homme est le récepteur SF-1. Au moins deux
isoformes, issues probablement d'une utilisation alternative de certains sites
de poly-
adénylation, ont été identifiées [2]. L'expression de LRH-1 est confinée au
foie, au
pancréas exocrine et à l'intestin ainsi qu'aux ovaires [3] et aux pré-
adipocytes. LRH
1 est exprimé précocement lors de l'embryogenèse [4, 5].
LRH-1 ne forme pas d'hétérodimère avec RXR mais se lie, en tant que monomère,
sur un élément de réponse de l'ADN de séquence YCAGGGYCR dans laquelle Y=
T ou C, R= G ou A. Plusieurs gènes cibles ont été identifiés dans le contrôle
de la
synthèse ou du transport [6] des acides biliaires, du métabolisme des
stéroïdes [3] et
des lipoprotéines [7, ~] ainsi que dans le contrôle de la transcription ou du
développement. LRH-1 semble également impliqué dans le développement de
l'endoderme [1].
La présente invention est fondée sur l'observation du rôle de LRH-1 dans
l'expression du gène humain codant pour l'apolipoprotéine AI (apo AI) ainsi
que sur
l'interaction directe qui se produit entre LRH-1 et un fragment du promoteur
de ce
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gène. Elle est fondée également sur l'observation originale d'une stimulation
de
l'activité du promoteur de l'apo AI humain par la sur-expression de LRH-1.
Elle se
fonde également sur l'identification d'un élément de réponse fonctionnel à LRH-
1 à
la jonction des régions B et C du promoteur du gène de l'apo AI humaine
(définies
selon [16]) et la caractérisation de sa séquence.
La présente invention démontre ainsi pour la première fois une modulation, de
la
production de l'apo AI par le récepteur nucléaire LRH-1. La présente invention
fournit ainsi de nouvelles cibles et de nouvelles approches pour la recherche
de
composés capables de réguler l'expression de cette protéine, l'activité des
HDL ou le
transport inverse du cholestérol.
L'invention fournit également des méthodes pour accroître le transport inverse
du
cholestérol basées sur l'utilisation de composés qui modulent la liaison de
LRH-1 au
promoteur de l'apo AI et/ou l'effet de celui-ci sur la transcription du gène
humain de
l'apo AI.
L'invention fournit aussi des méthodes de criblage destinées à sélectionner,
identifier
ou caractériser des substances thérapeutiques capables de moduler l'expression
du
gène humain de l'apo AI et/ou l'activité des HDL et/ou le transport inverse du
cholestérol.
Selon un mode de réalisation particulier, les méthodes de criblage selon
l'invention
incluent plus particulièrement les étapes suivantes
- la mise en contact d'un ou de plusieurs composés avec une construction
d'acide nucléique comprenant au moins un élément de réponse à LRH-1 du
promoteur du gène humain de l'apo AI ou un variant fonctionnel de celui-ci,
- la détermination de la liaison éventuelle desdits composés sur le ou les
éléments) de réponse, et
- éventuellement la comparaison de la mesure précédente avec une mesure
réalisée dans les mêmes conditions mais avec une construction d'acide
nucléique comprenant au moins une copie mutée d'un élément de réponse à
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LRH-1 du promoteur de l'apo AI humaine.
Généralement, ladite mise en contact est réalisée dans des conditions
susceptibles de
permettre auxdits composés de se fixer sur ledit élément de réponse.
Préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend
- la mise en contact d'un composé test avec une construction d'acide nucléique
comprenant, comme unique élément de réponse à LRH-l, au moins une copie
de l'élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène humain de
l'apolipoprotéine AI constitué de la séquence (SEQ ID NO : 1) suivante
S'-CTGATCCTTGAAC-3', et
- la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur l'élément
de
réponse, et
- éventuellement, la comparaison de la mesure précédente avec une mesure
réalisée dans les mémes conditions mais avec une construction d'acide
nucléique comprenant au moins une copie mutée d'un élément de réponse à
LRH-1 du promoteur de l'apo AI humaine.
Selon une forme particulière de réalisation du procédé de l'invention, les
conditions
susceptibles de permettre aux dits composés de se fixer sur le ou lesdits
éléments)
de réponse à LRH-1 comprennent la présence du récepteur LRH-1, en général
exogène, (par exemple sous forme de monomère) ou d'un équivalent fonctionnel,
et
la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur l'élément de
réponse
à LRH-1 et/ou sur le complexe formé par la liaison de LRH-1 à son élément de
réponse.
Selon un autre mode de réalisation particulier (test d'activité
transcriptionnelle), on
mesure l'effet d'un ou de plusieurs composés tests, éventuellement en présence
du
récepteur LRH-1 exogène ou d'un équivalent fonctionnel de celui ci, sur
l'activité
transcriptionnelle d'un promoteur comprenant au moins un élément de réponse à
LRH-1 selon l'invention. Un tel test est préférentiellement réalisé en système
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cellulaire, par détermination de l'expression d'un gène rapporteur placé sous
le
contrôle d'un tel promoteur, notamment dans une cellule comprenant du LRH-1
exogène ou un équivalent de celui-ci et/ou comprenant un ligand de LRH-1 ou un
équivalent fonctionnel de celui-ci. Selon un autre mode de réalisation, le
test est
5 réalisé dans une cellule comprenant (e.g., exprimant, de mânière naturelle
ou
recombinante) le récepteur LRH-1 ou un équivalent fonctionnel de celui-ci.
Une forme préférée de mise en eeuvre de l'invention consiste à utiliser,
éventuellement en présence de LRH-1 exogène ou d'un équivalent de celui-ci,
une
cassette d'expression combinant un ou plusieurs éléments de réponse à LRH-1,
selon
l'invention, avec un gène rapporteur. Avantageusement, ledit gène rapporteur
est
placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant au moins une copie du ou
desdits
éléments de réponse, par exemple, le promoteur de l'apo AI ou des variants ou
fragments de celui-ci. Tout gène connu de l'homme du métier dont l'activité ou
la
présence dans des extraits biologiques est facilement mesurable peut être
utilisé
comme gène rapporteur pour la mise en oeuvre du procédé de criblage.
Selon une forme particulière de réalisation de l'invention, la méthode de
criblage
comprend les étapes de
- mise en contact d'un composé test avec une cellule hôte comprenant une
cassette d'expression d'un gène rapporteur, ladite cassette comprenant un
gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant, comme
unique élément de réponse à LRH-1, au moins une copie de l'élément de
réponse à LRH-1 du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine AI
constitué de la séquence (SEQ ID NO : 1) suivante : 5'-
CTGATCCTTGAAC-3', et
- détermination de l' effet de la présence du composé test sur la liaison de
LRH-1 à l'élément de réponse ou sur l'expression du gène rapporteur.
Préférentiellement, la cellule hôte comprend un récepteur LRH-1 exogène ou un
équivalent fonctionnel de ce dernier et/ou un ligand de LRH-1 ou un équivalent
fonctionnel de ce dernier.
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Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode
comprend
la détermination du niveau d'expression du gène rapporteur en présence du
composé
test et en l'absence dudit composé, une augmentation ou une diminution du
niveau
d'expression du gène rapporteur signalant l'aptitude du composé test à moduler
le
transport inverse du cholestérol.
Les composés susceptibles d'être identifiés par le procédé de l'invention
peuvent
être des composés de nature, structure et origine variées, notamment des
composés
biologiques, des facteurs nucléaires, des cofacteurs, des composés chimiques,
synthétiques, etc., capables de modifier l'activité de LRH-1. Il peut s'agir
également
de banques, notamment de banques combinatoires, de chimiothèques ou, de
banques
de protéines, peptides ou acides nucléiques, par exemple de clones codant une
ou
plusieurs protéines, peptides ou polypeptides liant l'ADN.
Les méthodes selon l'invention peuvent être utilisées pour sélectionner,
identifier ou
caractériser des composés capables de modifier la liaison, de LRH-1 et/ou des
ses
cofacteurs à l'un et/ou l'autre de ses éléments) de réponse et/ou de moduler
(i.e.
augmenter ou diminuer) l'expression du gène codant pour l'apo AI humaine et
ainsi
l'expression de l'apo AI humaine et/ou de moduler l'activité des HDL et/ou de
moduler le transport inverse du cholestérol.
L'invention décrit encore l'utilisation des composés ainsi sélectionnés, dans
la
préparation d'une composition destinée à moduler le transport inverse du
cholestérol
ou l'activité des HDL, ainsi que les méthodes de traitement correspondantes.
Dans le but de faciliter la compréhension de la présente demande, les
définitions
suivantes sont fournies, qui précisent ou complètént leur signification
habituelle.
"Apolipoprotéine AI" ou apo AI: L'apolipoproteine AI est une protéine de 243
acides aminés qui contient une extrémité amino-terminale globulaire et une
extrémité carboxy-terminale qui est capable de se lier aux lipides [9]. Cette
protéine
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est un constituant majeur des lipoprotéines de haute densité et joue un rôle
fondamental dans le transport inverse du cholestérol [10, 11]. Le gène, l'ADNc
et
l'ARNm de l'apo AI ont été clonés et séquencés [12-14], et sont accessibles
sur les
banques de données Genbank~ (par exemple sur Internet à l'adresse
http ://www.ncbi.nlm.nih.gov) sous les numéros d'accès : NM 000039, M20656
(Promoteur) et J00098.
"High Density Lipoprotein (HDL)" : Les particules HDL sont des lipoprotéines
de
haute densité (1,063-1,21g/ml) réputées pour avoir un rôle protecteur contre
l'athérosclérose principalement du fait de leur capacité à extraire le
cholestérol des
cellules périphériques et à promouvoir son retour vers le foie où il est
éliminé [10].
L'apo AI est le constituant protéique majeur des HDL, représentant jusqu'à 70%
des
protéines. Elles comportent également de l'apo AII, de l'apo CI, de l'apo CII,
de
l'apo CIII et de l'apo E en plus faible proportion.
"LRH-1" : Le récepteur LRH-1 a été isolé, caractérisé et séquencé chez.l'homme
et
chez le rat. La séquence de l'ARNm est disponible également sur les banques de
données Genbank~, sous les numéros d'accès NM 003822, NM 030676 et
NM 021742 pour l'homme, la souris et le rat, respectivement. La région de LRH-
1
impliquée dans la liaison à l'ADN (« DNA Binding Domain » ) est principalement
comprise entre les résidus Glu3 8-Asp 113 de la protéine humaine
(correspondant à
319-546 dans NM 003822) ou entre les résidus G1u105-Asp180 de la protéine de
souris.
L'expression « équivalent fonctionnel » qui fait référence au récepteur LRH-1,
désigne tout polypeptide dérivé de la structure du récepteur LRH-1 et
conservant la
capacité de liaison à l'élément de réponse notamment tout élément de. réponse
de
séquence SEQ ID NO : 1 ou des variants fonctionnels de celle-ci. Les
équivalents
fonctionnels peuvent être des variants naturels (polymorphisme, épissage,
etc.), des
fragments, mutants, délétants, etc. Préférentiellement, il s'agit de
polypeptides
comprenant au moins une région d'acides aminés identique à 60% au moins à
celle
du récepteur LRH-1, de manière préférentielle à 75% au moins et de manière
encore
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plus préférentielle à 90-95% au moins. L'expression inclut également les
fragments
du récepteur LRH-l, notamment les fragments contenant le site de liaison à
l'ADN
du récepteur LRH-1.
Le terme "transport inverse" est employé pour désigner le mécanisme
physiologique,
parfois défaillant, par lequel le cholestérol en excès dans les tissus
périphériques est
pris en charge par des lipoprotéines de haute densité, les HDL (High Density
Lipoprotein), puis transporté vers le foie pour être éliminé.
A. Identüication d'un élément de réponse à LRI3-1.
La présente invention démontre l'implication et le mécanisme d'action de LRIi-
1
dans la régulation de l'expression de l'apo AI et, ce faisant, dans la
régulation du
transport inverse du cholestérol. La sur-expression de LRIi-1 se traduit par
une
augmentation de l'activité du promoteur de l'apo AI. L'invention révèle, pax
ailleurs,
la séquence précise de l'élément de réponse à LRH-1, au sein du promoteur du
gène
codant pour l'apo AI humaine.
L'invention porte également sur des constructions particulières, notamment des
acides nucléiques comprenant des éléments de réponse à LRH-1, ainsi que des
cassettes, vecteurs et cellules recombinantes les contenant.
Ainsi l'invention fournit la séquence (SEQ ID NO : 1) de l'élément de réponse
à
LRH-1, identifié initialement au sein du promoteur du gène humain de l'apo AI,
responsable d'une interaction entre LRH-1 et le promoteur apo AI et de la
régulation
par LRH-1 de l'expression de l'apo AI.
3 régions fonctionnelles différentes ont été identifiées au sein du promoteur
de l'apo
AI [15]. Dans le document présent, les régions fonctionnelles du promoteur du
gène
de l'apolipoprotein A-I sont nommées A, B et C selon la nomenclature définie
précédemment [ 16].
Ainsi, la présence des régions B et C (SEQ ID NO : 3 et 4) provoque une
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augmentation par LRH-1 de l'expression d'un gène rapporteur (cf. : exemples 1,
2, 5
et 6).
Un objet particulier de l'invention réside dans un acide nucléique comprenant
la
séquence SEQ ID NO : 1 suivante
5'-CTGATCCTTGAAC-3', ou un variant fonctionnel de celle-ci (« élément de
réponse LRH-1 »).
Un autre objet de l'invention réside dans une construction d'acide nucléique
comprenant un élément de réponse LRH-1 tel que défini ci-dessus. Il peut
s'agir
notamment d'une cassette d'expression comprenant au moins une copie d'un
élément de réponse tel que défini ci-avant.
L'invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant au
moins
une copie du fragment d'acide nucléique comprenant ou de préférence
caractérisé
par la séquence SEQ ID NO : 1 suivante
5'-CTGATCCTTGAAC-3', ou un variant fonctionnel de celle-ci, et un promoteur,
choisi parmi le promoteur immédiat du CMV et le promoteur PGI~, associé à un
gène rapporteur placé sous le contrôle dudit promoteur.
Une telle cassette d'expression peut notamment être utilisée pour le criblage
in vitro
de composés capables de moduler l'activité des HDL.
L'invention concerne encore tout promoteur artificiel ou chimérique comprenant
un
élément de réponse à LRH-1 tel que défini ci-avant.
Les variants fonctionnels de l'élément de réponse selon l'invention, peuvent
être tout
dérivé ou fragment de la séquence native conservant la capacité de lier le
récepteur
LRH-1. Généralement, les variants conservent au moins 50% des résidus de la
séquence native décrite dans la présente demande. Classiquement, les variants
possèdent des modifications affectant moins de 5 nucléotides dans la séquence
considérée. Préférentiellement, il s'agit d'un séquence identique à 60% au
moins, de
manière préférentielle à 75% au moins et de rrianière encore plus
préférentielle à
90% au moins à la séquence native décrite dans la présente demande.
Les variants peuvent comporter différents types de modifications tels qu'une
ou
plusieurs mutations ponctuelles ou non, additions, délétions et/ou
substitutions.
Ces modifications peuvent être introduites par les méthodes classiques
physiques,
chimiques ou de la biologie moléculaire, telles que notamment la mutagenèse
dirigée
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ou, plus pratiquement, par synthèse artificielle de la séquence dans un
synthétiseur.
Les variants peuvent être testés pour leur capacité de liaison à LRH-1 de
différentes
façons, et notamment
5
(i) par mise en contact de la séquence test avec le récepteur LRH-1 (par
exemple dans un test acellulaire), et détection de la formation d'un complexe
(par
exemple par retard de migration sur gel) ;
(ü) par insertion de la séquence test dans une cassette d'expression
10 comprenant un promoteur minimal et un gène rapporteur, introduction de la
cassette dans une cellule, et détection (le cas échéant dosage) de
l'expression du
gène rapporteur en présence et en l'absence de LRH-1 ;
(iii) par toute autre technique connue de l'homme du métier, permettant de
mettre en évidence l'interaction entre un acide nucléique et une protéine, par
exemple.
L'invention a encore pour objet des variants inactifs des éléments de réponse
définis
ci-dessus, notamment des variants essentiellement incapables de lier le
récepteur
LRH-1. Des exemples de tels variants sont notamment la séquence SEQ ID NO : 2.
Ces variants inactifs peuvent être préparés et testés dans les conditions
décrites ci-
dessus pour les variants fonctionnels.
Les variants selon l'invention possèdent avantageusement la capacité
d'hybrider
avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou une partie de celle-ci.
B. Méthodes de sélection, d'identification et de caractérisation de composés
qui modulent le transport inverse du cholestérol.
L'invention décrit des méthodes d'identification de composés qui modulent
(i.e.,
augmentent ou diminuent) le transport inverse du cholestérol. Ces composés
peuvent
agir en altérant la liaison de LRH-1 à son ou ses ligands ou à son ou ses
corépresseurs et coactivateurs, etc.. Ils peuvent encore modifier, voir
supprimer, la
liaison de LRH-1 seul ou de LRH-1 et de ses cofacteurs, à son ou ses éléments)
de
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réponse et ainsi modifier l'expression du gène humain de l'apo AI. La fixation
de
LRH-1 à l'élément de réponse présent à la jonction des régions B et C du
promoteur
de l'apo AI (SEQ ID NO: 3 et 4) augmente ainsi la transcription du gène humain
de
l'apo AI et stimule le transport inverse du cholestérol. L'utilisation de
composés
capables d'augmenter la fixation de LRH-1 à cet élément de réponse, où LRH-I
joue
le rôle d'activateur permet donc d'augmenter la transcription du gène humain
de
l'apo AI et de stimuler le transport inverse du cholestérol.
La présente invention décrit ainsi de nouvelles méthodes pour la sélection,
l'identification ou la caractérisation de composés capables d'augmenter le
transport
inverse du cholestérol.
1. Méthodes basées sur un criblage d'expression.
La présente invention concerne une méthode pour la sélection, l'identification
ou la
caractérisation de composés capables de moduler le transport inverse du
cholestérol,
qui comprend
(i) la mise en contact d'un composé test avec une cellule hôte comprenant une
cassette d'expression d'un gène rapporteur, ladite cassette comprenant un gène
rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur contenant au moins une copie
d'un élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène humain de l'apo AI ou
d'un variant fonctionnel de celui-ci, et
(ü) la détermination de l'expression du gène rapporteur.
Préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend
(i) la mise en contact d'un composé test avec une cellule_hôte comprenant une
cassette d'expression d'un gène rapporteur, ladite cassette comprenant un gène
rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant, comme unique
élément de réponse à LRH-1, au moins une copie de l'élément de réponse à
LRH-1 du promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine AI constitué de la
séquence (SEQ ID NO : 1) suivante : 5'-CTGATCCTTGAAC-3', et
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(ü) la détermination de l'effet de la présence du composé test sur la liaison
de
LRH-1 à l'élément de réponse ou sur l'expression du gène rapporteur.
La présente invention concerne par ailleurs une méthode pour la sélection,
l'identification ou la caractérisation de composés capables de moduler le
transport
inverse du cholestérol, qui comprend : '
(i) la mise en contact, en présence du récepteur LRH-1 exogène ou d'un
équivalent fonctionnel de celui ci, d'un composé test avec une cellule hôte
comprenant une cassette d'expression d'un gène rapporteur, ladite cassette
comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur contenant
au moins une copie d'un élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène
humain de l'apo AI ou d'un variant fonctionnel de celui-ci, et
(ü) la détermination de l'effet de la présence du composé test sur la liaison
de
LRH-1 à l'élément de réponse ou sur l'expression du gène rapporteur.
Encore plus préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend
(i) la mise en contact, en présence du récepteur LRH-1 exogène ou d'un
équivalent fonctionnel de celui ci, d'un composé test avec une cellule hôte
comprenant une cassette d'expression d'un gène rapporteur, ladite cassette
comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur
comprenant, comme unique élément de réponse à LRH-1, au moins une copie de
l'élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène humain de
l'apolipoprotéine AI constitué de la séquence (SEQ ID NO : 1) suivante : 5'-
CTGATCCTTGAAC-3', et
(ü) la détermination de l'effet de la présence du composé test sur la liaison
de
LRH-1 à l'élément de réponse ou sur l'expression du gène rapporteur.
Les méthodes selon l'invention, prévoient plus spécifiquement la mise en
contact
d'un composé test avec une construction d'acide nucléique ou une cassette
d'expression comprenant au moins une copie d'un. élément de réponse à LRH-1
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(SEQ ID NO : 1).
Un objet particulier de l'invention concerne une cassette d'expression
comprenant au
moins une copie du fragment d'acide nucléique SEQ ID NO : l, et un promoteur
associé à un gène rapporteur placé sous le contrôle dudit promoteur.
Un autre objet particulier de l'invention concerne une cassette d'expression
comprenant au moins une copie mutée du fragment d'acide nucléique SEQ ID NO
1, et un promoteur associé à un gène rapporteur placé sous le contrôle dudit
promoteur.
Selon un mode d'exécution particulier des méthodes de l'invention, il est en
outre
prévu de comparer les effets éventuels, déterminés grâce à l'une de ces
méthodes
avec ceux, éventuels, déterminés grâce à une méthode réalisée dans les mêmes
conditions mais avec une construction d'acide nucléique comprenant au moins un
variant inactif (par exemple, une copie mutée) d'un élément de réponse à LRH-1
du
promoteur du gène codant pour l'apo AI humain (SEQ ID NO : 2) ou d'un variant
fonctionnel de ce dernier.
Selon un autre mode d'exécution particulier des méthodes de l'invention, la
cellule
hôte comprend un ligand de LRIi-1 ou un équivalent fonctionnel de celui-ci.
Les procédés de l'invention peuvent être mis en aeuvre avec différents types
de
cellules, de promoteurs, de gènes rapporteurs, et dans différentes conditions,
comme
il est décrit ci-après.
a) Mise en contact des composés avec la cellule hôte
Certaines méthodes de criblage, décrites par l'invention, prévoient une étape
de mise
en contact du composé test, éventuellement en présence du récepteur LRH-1
exogène ou d'un équivalent fonctionnel de celui ci, avec des cellules hôtes,
dans des
conditions particulières qui permettent de déterminer l'expression dans
lesdites
cellules d'un gène rapporteur et d'obtenir ainsi une information concernant
l'effet du
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composé test.
Préférentiellement, Le récepteur LRH-1 est introduit ou ajouté
artificiellement de
manière à avoir au moins 2 fois la quantité de LRH-1 endogène. Il peut s'agir
d'un
équivalent de LRH-1 à savoir toute séquence d'acides aminés identique à 60% au
moins à celle du récepteur LRH-1, de manière préférentielle à 75% au moins et
de
manière encore plus préférentielle à 90-95% au moins.
Classiquement, l'effet du composé test est comparé au niveau d'expression du
gène
rapporteur déterminé en l'absence dudit composé (et/ou avec un élément de
réponse
muté).
Les méthodes selon l'invention comprennent, selon un mode particulier de
réalisation, la détermination du niveau d'expression du gène rapporteur en
présence
du composé test et en l'absence dudit composé, une augmentation ou une
diminution
du niveau d'expression du gène rapporteur signalant l'aptitude du composé test
à
moduler le transport inverse du cholestérol.
Ces cellules, dans un mode préféré de l'invention, peuvent être des cellules
de
mammifères (hépatocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, musculaires,
etc.). De
manière encore plus préférée, ces cellules peuvent être des cellules humaines.
Il peut
également s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. Dans un autre
mode de
mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules procaryotes
(bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.), des
cellules végétales, etc.
Les composés peuvent être mis au contact des cellules à différents moments,
selon
leurs) effet(s), leur concentration, la nature des cellules et l'appréciation
technique.
Le contact peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une
plaque,
dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est réalisée
dans une
plaque multipuits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux
et
variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et
plus
particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à manipuler et
sur
lesquels la révélation peut âtre obtenue grâce à une stimulation classique.
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Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de
cellules
peuvent être utilisées lors de la mise en oeuvre des méthodes décrites. De
manière
classique, 103 à 106 cellules sont mises en contact avec un type de composé
test, dans
5 un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 104 ~et
105 cellules.
A titre d'exemples, dans une plaque de 96 puits, 105 cellules peuvent être
incubées
dans chaque puit avec une quantité voulue d'un.composé test. Dans une plaque
de
384 puits, moins de 105 cellules et typiquement entre 1x104 et 4x104 cellules
sont
généralement incubées dans chaque puit avec le composé test.
La quantité (ou la concentration) de composé test peut être ajustée par
l'utilisateur
selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire,
etc.), le
nombre de cellules, la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement,
les
cellules sont exposées à des quantités de composés test qui varient de 1nM à
lmM. Il
est bien sûr possible de tester d' autres concentrations sans dévier de la
présente
invention. Chaque composé peut de plus être testé en parallèle à différentes
concentrations.
Différents adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration
des
composés dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques,
des
polymères, de la pénétratine, du Tat PDT, des peptides issus d'adénovirus
(penton ou
fibres) ou d'autres virus, etc. peuvent en outre être utilisés si nécessaire.
Le contact est maintenu entre 5 et 72 heures, généralement entre 12 et 48
heures. En
effet, les cellules et les divers réactifs doivent de préférence rester en
contact
suffisamment longtemps pour permettre la synthèse de novo du produit
d'expression
du gène rapporteur. De manière préférée, l'incubation dure environ 36 heures.
.
b) Détermination de l'activité des composés.
La méthode proposée par l'invention pour sélectionner, identifier ou
caractériser des
composés capables de moduler le transport inverse du cholestérol prévoit la
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transformation des cellules hôtes avec une cassette d'expression d'un gène
rapporteur.
Ledit gène rapporteur peut être notamment tout gène codant et exprimant un
produit
dont l'activité ou la présence, dans des extraits biologiques, peut être
mesurée, i.e.,
détectée ou dosée, ou dont le produit de transcription peut être mesûré. Il
peut s'agir,
par exemple, du gène codant pour l'apo AI humaine lui-même, ou encore du gène
codant pour la luciférase et plus particulièrement pour la luciférase de
luciole ou
pour celle de Renilla, pour la phosphatase alcaline sécrétée, la
galactosidase, la
lactamase, la Chloramphenicol acetyl transferase (CAT), l'hormone de
croissance
humaine (hGH), la ~i-glucuronidase (Gluc), la Green fluorescent protein (GFP)
etc. Il
est entendu que le terme « gène » désigne, au sens large, tout acide
nucléique,
notamment un ADNc, un ADNg, un ADN synthétique, un ARN, etc.
Le gène rapporteur, quel qu'il soit, est placé sous le contrôle d'un promoteur
comprenant au moins une copie d'un élément de réponse à LRH-1 tel que défini
ci-
avant.
Le gène rapporteur peut donc être placé sous le contrôle de tout promoteur
dont la
séquence comprend la séquence SEQ ID NO : 1 ou un variant fonctionnel de celle-
ci. Cette séquence particulière peut être présente à raison d'une ou de
plusieurs
copies dans le promoteur (préférentiellement 1 à 10 et encore plus
préférentiellement
1 à 6), en amont, en aval ou en interne, dans la même orientation ou dans
l'orientation opposée.
Préférentiellement, le promoteur selon l'invention comprend, comme unique
élément
de réponse à LRH-1, au moins une copie de l'élément de réponse à LRH-1 du
promoteur du gène humain de l'apolipoprotéine AI constitué de la séquence (SEQ
ID NO : 1) suivante : 5'-CTGATCCTTGAAC-3'ou un variant fonctionnel de celle
ci.
Préférentiellement, il s' agit d'un promoteur dont le différentiel d' activité
en
l'absence et en présence de LRH-1 ou d'un équivalent fonctionnel peut être
détecté.
Pour la réalisation d'un promoteur de l'invention, l'élément de réponse à LRH-
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peut être associé à un promoteur minimal transcriptionnel. Le promoteur
minimal est
un promoteur transcriptionnel ayant une activité basale faible ou inexistante,
et
susceptible d'être augmentée en présence d'un activateur transcriptionnel
(l'interaction de LRH-1 avec la jonction des régions B et C). Un promoteur
minimal
peut donc être un promoteur naturellement faible dans les cellules de
mammifère,
c'est-à-dire produisant une expression non toxique et/ou non suffisante pour
obtenir
un effet biologique prononcé. Avantageusement, un promoteur minimal est une
construction préparée à partir d'un promoteur natif, par délétion de régions)
non
essentielles) à l'activité transcriptionnelle. Ainsi, il s'agit de préférence
d'un
promoteur comprenant essentiellement une boîte TATA, généralement d'une taille
inférieure à 160 nucléotides, centrée autour du codon d'initiation de la
transcription.
Un promoteur minimal peut ainsi être préparé à partir de promoteurs viraux,
cellulaires, forts ou faibles, tels que par exemple le promoteur du gène de la
thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès (HSV-TK), le promoteur immédiat du
CMV, le promoteur PGK, le promoteur du gène codant pour l'apolipoprotéine AI
humaine, le promoteur SV40, etc. Le promoteur minimal peut avoir une açtivité
suffisamment élevée pour permettre d'identifier des composés qui augmentent
l'activation par LRH-1, via les régions B et C par exemple.
Le promoteur (P), l'élément de réponse à LRH-1 .(ER) et le gène rapporteur
(GR)
sont agencés de manière fonctionnelle dans la cassette d'expression, c'est-à-
dire de
sorte que le promoteur minimal contrôle l'expression dudit gène et que son
activité
soit régulée par LRH-1. Généralement, ces régions sont donc disposées dans
l'ordre
suivant, dans l'orientation 5'->3' : ER-P-GR. Toutefois, tout autre agencement
fonctionnel peut être envisagé par l'homme du métier sans départir de la
présente
invention.
En outre, les différents domaines fonctionnels ci-dessus peuvent être liés
directement
les uns aux autres, ou séparés par des nucléotides_n'affectant pas
significativement le
caractère fonctionnel de la cassette d'expression ou permettant de conférer
des
caractéristiques ou performances améliorées au système (amplificateur,
silencer,
intron, site d'épissage, etc.).
La méthode de sélection, d'identification et de caractérisation de composés
capables
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de moduler le transport inverse du cholestérol prévoit une étape de
détermination de
l'expression du gène rapporteur. Il peut s'agir d'une détermination de
l'activité
transcriptionnelle. A cette fin, l'ARN total est extrait des cellules en
culture dans des
conditions expérimentales d'une part et dans une situation témoin d'autre
part. Cet
ARN est utilisé comme sonde pour analyser, par exemple, lés changements dans
l'expression du ou des gènes) rapporteur(s).
Il peut également s'agir d'une révélation de l'expression du gène rapporteur à
l'aide
d'un substrat adapté. Cette révélation peut être obtenue à l'aide de
techniques variées
dont la nature dépend du type de gène rapporteur utilisé. La mesure peut, par
exemple, correspondre à une densité optique, à une émission fluorescente ou
luminescente dans le cas d'une utilisation comme gène rapporteur du gène
codant
pour la (3-galactosidase ou la luciférase.
Dans un mode particulier, l'expression du géne rapporteur est mesurée à
travers le
niveau d'hydrolyse d'un substrat du produit d'expression du gène rapporteur.
Par
exemple, de nombreux substrats peuvent être utilisés pour évaluer l'expression
de la
(3-lactamase. Il peut notamment s'agir de tout produit contenant un noyau [3-
lactame
et dont l'hydrolyse peut être contrôlée. Les substrats préférés sont ceux
spécifiques
de la (3-lactamase (i.e., ils ne sont généralement pas hydrolysés dans les
cellules de
mammifères en l'absence de [3-lactamase), ceux qui ne sont pas toxiques à
l'égard
des cellules de mammifères et/ou dont le produit d'hydrolyse peut être
contrôlé
facilement, par exemple par des méthodes basées sur la fluorescence, la
radioactivité, une activité enzymatique ou toute autre méthode de détection.
Des substrats encore plus préférés sont les substrats ratiométriques.
L'hydrolyse de
ces substrats peut être directement reliée à l'activité du produit
d'expression du gène
rapporteur par le nombre de cellules. Un substrat ratiométrique spécifique et
non
toxique utilisable dans la présente invention est le CCF2-AM.
La concentration du substrat peut être ajustée par l'homme du métier en
fonction du
nombre de cellules, par exemple. Les cellules sont généralement maintenues en
contact avec le substrat pendant environ 60 minutes.
La présence du produit du gène rapporteur (ou du produit d'hydrolyse du
substrat)
peut être déterminée par des méthodes classiques connues de l'homme du métier
(fluorescence, D.O., luminescence, FRET (voir WO 0037077), SPA, biopuces,
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méthodes immunologiques, etc.).
Généralement, on détermine l'activité d'un composé test dans une cellule et
cet effet
est comparé au niveau d'activité en l'absence de composé test ou à une valeur
moyenne déterminée en l'absence de tout composé test.
La mesure de l'hydrolyse implique essentiellement une mesure (ou la
détermination
de la quantité relative) du produit d'hydrolyse contenu dans chaque
échantillon
réactionnel. Cette mesure peut être réalisée grâce à différentes techniques
connues de
l'homme du métier, incluant la détection d'une fluorescence, d'une
radioactivité,
d'une couleur, d'une activité enzymatique, d'un immun complexe antigène-
anticorps, etc. De manière préférée, le produit d'hydrolyse est détecté et
quantifié
grâce à une technique de détection de fluorescence. Des fluorochromes variés
peuvent ainsi être utilisés et contrôlés sur des échantillons de cellules.
Un test secondaire permettant de valider, chez l'animal, la sélection des
composés,
peut aussi être réalisé grâce à la détermination de la quantité d'HDL
exprimées ou
grâce' à la détermination d'une variation significative du transport inverse
du
cholestérol au niveau de cellules traitées avec lesdits composés par
comparaison
avec des cellules non traitées. Il est également possible de mesurer le taux
plasmatique de cholestérol et/ou de déterminer l'expression hépatique de l'apo
AI.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la cellule hôte comprend
également un ligand de LRH-1. La désignation « ligand de LRH-1 » s'applique
également aux facteurs de transcription, aux co-activateurs et co-répresseurs,
ainsi
qu'aux autres polypeptides impliqués dans la machinerie de régulation de
l'expression de gènes. Il peut s'agir, par exemple, d'autres récepteurs comme
R~~R
ou les récepteurs aux hormones nucléaires.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise dans les
méthodes selon l'invention, et comme indiqué précédemment, une cellule hôte
comprenant le récepteur LRH-1 ou un équivalent fonctionnel. La présence du
récepteur LRH-1 permet de reproduire une situation physiologique et permet
d'identifier, grâce aux méthodes précédemment décrites, des composés capables
de
moduler les interactions entre LRH-1 et l'un et/ou l'autre de ses éléments) de
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réponse, tells) que divulgués) par la présente invention, ou entre LRH-1 et un
ou
plusieurs ligands) de LRH-1.
Les méthodes selon l'invention permettent de déterminer le niveau d'expression
du
5 gène rapporteur, selon l'une des techniques connues de l'homme du métier
décrites
précédemment, en présence du composé test et/ou en l'absence dudit composé,
une
augmentation ou une diminution du niveau d' expression du gène rapporteur
signalant l'aptitude du composé test à moduler le transport inverse du
cholestérol.
10 L'invention peut donc être mise en oeuvre à l'aide d'une construction,
d'une cassette
ou d'une cellule selon l'invention utilisée pour le criblage in vitro de
composés
capables de moduler l'activité des HDL.
Comme indiqué précédemment, ces méthodes permettent le criblage, rapide et en
15 parallèle, de nombreux composés test sur une ou plusieurs populations
cellulaires
(cellules de mammifère, cellules humaines telles que, par exemple, des
hépatocytes,
cellules procaryotes, etc.). Ces méthodes sont prédictives, automatisables et
adaptées
à la sélection, l'identification et la caractérisation desdits composés.
LTne forme particulière de mise en oeuvre du procédé de criblage utilise les
méthodes
20 classiques d'identification de clones qui expriment des protéines qui lient
l'ADN. Il
peut s'agir par exemple de cribler des banques d'expression d'ADNc dans ~,gtl
1 ou
d'utiliser la méthode dite du « One Hybrid » ou du « Phage Display », ou
encore de
pratiquer une purification par chromatographie d'affinité. La ou les
protéines)
isolées) sont ensuite séquencées.
2. Méthodes basées sur un test de fiaison.
L'invention concerne également une méthode pour la sélection, l'identification
ou la
caractérisation de composés capables de moduler (i.e. augmenter ou diminuer)
le
transport inverse du cholestérol, basée sur la mesure de la liaison d'un
composé test
à l'un ou à plusieurs éléments de réponse. Cette méthode comprend plus
particulièrement
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- la mise en contact d'un composé test avec une construction d'acide nucléique
comprenant au moins une copie d'un élément de réponse à LRH-1 du
promoteur du gène humain de l'apo AI ou d'un variant fonctionnel de celui-
ci, et
- la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur l'élément
de
réponse.
Préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend
- la mise en contact d'un composé test avec une construction d'acide nucléique
comprenant, comme unique élément de réponse à LRH-1, au moins une copie
de l'élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène humain de
l'apolipoprotéine AI constitué de la séquence (SEQ ID NO : 1) suivante
5'-CTGATCCTTGAAC-3', et
- la détermination de la liaison éventuelle dudit composé test sur l'élément
de
réponse.
Une autre méthode selon l'invention comprend
- la mise en contact, en présence du récepteur LRH-1 exogène ou d'un
équivalent fonctionnel de celui-ci, d'un composé test avec une construction
d'acide nucléique comprenant au moins une copie d'un élément de réponse à
LRH-1 du promoteur du gène humain de l'apo AI ou d'un variant fonctionnel
de celui-ci, et
- la détermination de la liaison du composé test sur le et/ou les éléments) de
réponse à LRH-1 et/ou sur le complexe fôrmé par la liaison.de LRH-1 à son
et/ou ses éléments) de réponse.
Encore plus préférentiellement, la méthode selon l'invention comprend
- la mise en contact, en présence du récepteur LRH-1 exogène ou d'un
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équivalent fonctionnel de ce dernier, d'un composé test avec une construction
d'acide nucléique comprenant, comme unique élément de réponse à LRH-1,
au moins une copie de l'élément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène
humain de l'apolipoprotéine AI constitué de la séquence (SEQ ID NO : 1)
suivante
5'-CTGATCCTTGAAC-3', et
- la détermination de la liaison éventuelle dudit- composé test sur l'élément
de
réponse à LRH-1 et/ou sur le complexe formé par la liaison de LRH-1 à son
élément de réponse.
Un mode préféré de réalisation de l'invention consiste à établir la capacité
dudit
composé test à moduler la liaison de LRH-1 à l'élément de réponse, en
déterminant
la quantité de LRH-1 liée en présence du composé test par rapport à cette
quantité en
l'absence de composé test. Un test de compétition utilisant la technique FP
(Fluorescence Polarization), connue de l'homme du métier, peut ainsi
s'appliquer
efficacement dans le cadre de cette détermination.
Un composé test capable de moduler la liaison de LRH-1 à l'élément de réponse
pourra faire l'objet d'un test ultérieur de sa capacité à moduler l'expression
d'un
gène rapporteur et/ou le transport inverse du cholestérol, selon l'une des
méthodes
décrites précédemment.
La liaison du composé test sur l'un au moins des éléments de réponse à LRH-1
peut
être mise en évidence grâce à une migration sur gel, par électrophorèse des
hétérodimères formés suite à la mise en oeuvre de la méthode décrite ci-
dessus.
Certains composés tests sont effectivement susceptibles de porter un site de
liaison à
l'ADN en grande partie identique à celui de LRH-1 et d'exercer ainsi une
compétition avec celui-ci.
L'électrophorèse permet de distinguer directement les hétérodimères LRH-
1/élément
de réponse à LRH-1, des hétérodimères composé test/élément de réponse à LRH-1
et
des éléments de réponse à LRH-1.
D'autres méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer) bien connue de l'homme du métier ou
la
technique SPA (Scintillation Proximity Assay), peuvent être mises en oeuvre
dans le
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cadre de la présente invention pour déterminer la liaison éventuelle du
composé test
sur l'un et/ou l'autre éléments) de réponse à LRH-1.
Dans un mode particulier, la construction d'acide nucléique comprend au moins
1
copie, de préférence de 2 à 5 copies de la séquence SEQ ID NO :l ou d'un
variant
fonctionnel de celle-ci. Les composés tests capables d'activer (c'est-à-dire
d'augmenter au moins partiellement) la liaison de LRH-1 sur cette construction
permettent d' activer l' expression du gène rapporteur et constituent des
candidats
pour stimuler le transport inverse du cholestérol.
Selon un mode d'exécution particulier des méthodes de l'invention, il est en
outre
prévu de comparer les effets éventuels, déterminés grâce à l'une de ces
méthodes
avec ceux, éventuels, déterminés grâce à une méthode réalisée dans les mémes
conditions mais avec une construction d'acide nucléique comprenant au moins un
variant inactif (par exemple, une copie mutée) d'un élément de réponse à LRH-1
du
promoteur du gène codant pour l'apo AI humain (SEQ ID NO : 2) ou d'un variant
fonctionnel de ce dernier. De manière préférée, la construction d'acide
nucléique est
constituée d'au moins une copie mutée de l'élément de réponse à LRH-1 du
promoteur du gène codant pour l'apolipoprotéine AI humaine, constitué de la
séquence (SEQ ID NO :1) suivante : 5'-CTGATCCTTGAAC-3', ladite copie mutée
étant essentiellement incapable de lier le récepteur LRH-1.
C. Activité des HDL et de l'apolipoprotéine AI.
Les méthodes décrites précédemment pour la sélection, l'identification ou la
caractérisation de composés capables de moduler (i.e. augmenter ou diminuer)
l'expression d'un gène rapporteur et/ou le transport inverse, du cholestérol
sont
préférentiellement utilisées pour le criblage de composés capables d'augmenter
le
transport inverse du cholestérol et peuvent, selon un autre mode de
réalisation de
l'invention, être utilisées pour la sélection, l'identification ou la
caractérisation de
composés capables de moduler l'activité des HDL et/ou l'expression de l'apo
AI.
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D. Composés test.
La présente invention peut être appliquée à tout type de composé test. Ainsi,
le
composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou
en
mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de
structure
et/ou de composition ou ne pas être défini. Le composé peut, par exemple, être
un
produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure
indéfinie, un
mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie
comprenant
un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés,
en
mélange ou de manière séparée. De telles compositions indéfinies peuvent être,
par
exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants
cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être
des
produits inorganiques ou organiques et notamment un polypeptide (ou une
protéine
ou un peptide), un acide nucléique, un lipide, un polysaccharide, un composé
chimique ou biologique tel qu'un facteur nucléaire, un cofacteur ou tout
mélange ou
dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine naturelle ou
synthétique et
inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de clones d'acides
nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN, etc.
La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection,
l'identification ou
la caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et
efficace
peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites
peuvent en
particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage
efficace et
simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous
forme séparée.
E. Utilisation des composés identifiés.
Les composés identifiés selon l'invention présentent des propriétés
avantageuses
pour une utilisation thérapeutique, notamment dans le domaine de
l'athérosclérose.
L'invention prévoit ainsi l'utilisation d'un composé capable de moduler (i.e.,
augmenter ou diminuer) la liaison de LRH-1 et/ou de ses cofacteurs aux
éléments de
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réponse du promoteur du gène codant pour l'apo AI humaine ou d'un variant
fonctionnel de celui-ci (en particulier à la séquence SEQ ID NO :1 ou un
variant
fonctionnelle de celle-ci), pour la préparation d'une composition destinée à
moduler
(i.e., augmenter ou diminuer) le transport inverse du cholestérol. Selon un
autre
5 mode de réalisation de l'invention, cette utilisation peut étre destinée à
moduler (i.e.,
augmenter ou diminuer) l'activité des HDL ou à moduler l'expression de l'apo
AI.
Un autre mode de réalisation de l'invention prévoit l'utilisation d'un composé
capable de moduler (i.e. augmenter ou diminuer) l'effet de LRH-1 sur la
transcription du gène humain de l'apo AI ou d'un variant fonctionnel de celui-
ci,
10 pour la préparation d'une composition destinée à moduler (i.e. accroître)
le transport
inverse du cholestérol et/ou à moduler (i.e., augmenter ou diminuer)
l'activité des
HDL.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention il s'agit d'un composé
chimique
ou d'un composé biologique. Selon un autre mode préféré, il s'agit d'un
facteur
15 nucléaire ou d'un cofacteur. Selon un mode encore plus préféré, il s'agit
d'un clone
exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN. D'une manière générale,
il .
peut s'agir de tout composé sélectionné, identifié ou caractérisé selon l'une
des
méthodes précédemment décrites.
20 L'invention inclut l'utilisation de tout composé (ou dérivés desdits
composés)
sélectionné, identifié ou caractérisé selon l'une des méthodes précédemment
décrites, dans le cadre de la présente invention, comme cible de recherches
expérimentales ou pour la fabrication de compositions pharmaceutiques
destinées à
augmenter le transport inverse du cholestérol ou à traiter
l'hypercholestérolémie,
25 l'athérosclérose, les désordres lipidiques et/ou les affections cardio-
vasculaires, ainsi
que lesdites compositions pharmaceutiques.
D'autres avantages et applications de la présente invention apparaîtront à la
lecture
des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme purement
illustratifs et
non limitatifs.
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LÉGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Effet de la sur-expression de LRH-1 sur l'activité du promoteur de
l'apo
AI humaine dans les cellules HepG2 (URL : unité relative de
luminescence).
Figure 2 : Effet de la sur-expression de LRH-l .sur l'activité du promoteur de
l'apo
AI humaine dans les cellules RK13 (LTRL : unité relative de
luminescence).
Figure 3 : Retard sur gel montrant l'identification d'un élément de réponse à
LRH-1
situé à la jonction des régions B et C du promoteur de l'apo AI humaine.
Les complexes séparés, apparaissant sur le gel d'électrophorèse, sont
identifiés dans l' exemple 3.
Figure 4 A/B: Retard sur gel montrant l'identification d'un élément de réponse
à
LRH-1 compris dans le fragment -144/-122 du promoteur de
l'apoAI humaine.
Figure 5 : Effet de la surexpression de LRH-1 sur l'activité du promoteur de
l'apo
AI humaine muté ou non dans les cellules HuH7 (URL : unité relative de
luminescence).
Figure 6 : Effet de la surexpression de LRH-1 sur l'activité de différents
mutants du
promoteur de l'apo AI humaine dans les cellules HuH7.
Figure 7 A/B : Le site de fixation de LRH-1 du .promoteur du gène codant pour
l'Apo AI humaine est différent du site de fixation de FXR du
promoteur du gène codant pour l'Apo AI humaine.
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SÉQUENCES
SEQ ID NO : 1 (Elément de réponse à LRH-1 du promoteur du gène de l'Apo AI
humaine)5'-CTGATCCTTGAAC-3'
SEQ ID NO :2 (Elément de réponse à LRH-1 muté du promoteur du gène de l'apo
AI humaine)
5'-CTGATTGTTGAAC-3'
SEQ ID NO : 3 (Région B du promoteur du gène de l'apo AI humaine)
5'-
GCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACA
GAGCTGATCCTT -3'
SEQ ID NO: 4 (Région C du promoteur du gène de l'apoAI humaine):
5'-
GAACTCTTAAGTTCCACATTGCCAGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCG
GGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCTGGCT -3'
SEQ ID NO : 5 (Promoteur de l'apo AI - j04066 (apoAI gens) 1819-2167)
5'-
gggagacctgcaagcctgcagcactcccctcccgcccccactgaacccttgacccctgccctgcagcccccgcagcttg
ctgt
ttgcccactctatttgcccagccccagggacagagctgatccttgaactcttaagttccacattgccaggaccagtgag
cagcaa
cagggccggggctgggcttatcagcctcccagcccagaccctggctgcagacataaataggccctgcaagagctggctg
ctt
agagactgcgagaaggaggtgcgtcctgctgcctgccccggtcactctggctccccagctcaaggttcaggccttgccc
cagg
ccgggcctctgggtac-3'
SEQ ID NO : 6 (promoteur Tk - M80483 (pBLCATS) 38-204 ; J02224 (Herpes
simplex) 302-462)
5'-
tgccccgcccagcgtcttgtcattggcgaattcgaacacgcagatgcagtcggggcggcgcggtccaggtccacttcgc
atatt
aaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcagcgacccgcttaacagcgtcaacacgtgccgcagatcac
ga
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g-3'
SEQ ID NO : 7 (séquence sens de hCyp7a wt ):
5'-GATCTCTTAGTTCAAGGCCAGTTAG-3'
SEQ ID NO : 8 (séquence antisens de hCyp7a wt ):
5'-GATCCTAACTGGCCTTGAACTAAGA-3'
SEQ ID NO : 9 (séquence sens hCyp 7 a mut):
5'-GATCTCTTAGTTCAATTCCAGTTAG-3'
SEQ ID NO : 10 (séquence antisens hCyp 7 a mut):
5'-GATCCTAACTGGAATTGAACTAAGA-3'
SEQ ID NO : 11 (séquence sens LHRE ApoAl h 5):
5'-GATCCGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTA-3'
SEQ ID NO : 12 (séquence antisens LHRE ApoA1 h 5):
5'-GATCTACAGCAAGCTGCGGGGGCTGCG-3'
SEQ ID NO : 13 (séquence sens LHRE ApoAl h 6):
5'-GATCCTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCCAA-3'
SEQ ID NO : 14 (séquence antisens LHRE ApoAl h 6):
5'-GATCTTGGGGCTGGGCAAATAGAGTGGGCAAG-3'
SEQ ID NO : 15 (séquence sens LHRE ApoA1 h-7):
5'-GATCCGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTA-3'
SEQ ID NO : 16 (séquence antisens LHRE ApoAl h 7):
5'-GATCTAGTTCAAGGATCAGCTCTGTCCCG-3'
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SEQ ID NO : 17 (séquence sens LHRE ApoAl h 8):
5'-GATCCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATA-3'
SEQ ID NO : 18 (séquence antisens LHRE ApoAl h 8):
5'-GATCTATAGAGTGGGCAAACAGCAAGCTG-3'
SEQ ID NO : 19 (séquence sens utilisée pour la mutagénèse de ABCmutLuc+):
5'- ggacagagctgattgttgaactcttaagttccacattgcc -3'
SEQ ID NO : 20 (séquence antisens utilisée pour la mutagénèse de ABCmutLuc+);
5'- cttaagagttcaacaatcagctctgtccctggggctgg -3'
SEQ ID NO : 21 (séquence sens FXRRE ApoA1 h 1):
5'- CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTT-3'
SEQ ID NO : 22 (séquence antisens FXRRE ApoAl h 1):
5'- AACTTAAGAGTTCAAGGATCAGCTCTG-3'
SEQ ID NO : 23 (séquence sens FXRRE ApoAl h 1 mut):
5'- CAGAGCTGATCCTTGAAGTGTTAAGTT -3'
SEQ ID NO : 24 (séquence antisens FXRRE ApoAl h 1 mut):
5'- AACTTAACACTTCAAGGATCAGCTCTG -3'
SEQ ID NO : 25 (séquence sens LRHRE-ApoAl mut):
5'- GATCCGGGACAGAGCTGATTGTTGAACTA - 3'
SEQ ID NO : 26 (séquence antisens LRHRE-ApoAl mut):
5'- GATCTAGTTCAACAATCAGCTCTGTCCCG = 3'
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EXEMPLES
Exemule 1 : Effet de la sur-expression de LRI3-1 sur l'activité du promoteur
de
5 l'apo AI humaine dans les cellules ~epG2>
L'exemple 1 montre que la sur-expression de hLRH-1 augmente l'activité du
fragment -
254/+91 (qui comporte les régions A, B et C) du promoteur de l'apo AI, cloné
en amont
du gène rapporteur luciférase.
10 Des cellules HepG2 sont co-transfectées par la technique de lipofection
(JetPEI selon les
indications du fournisseur) avec 100 ng du vecteur pCI-hLltH-1 qui permet la
sur-
expression de LRH-1 ou du vecteur vide pCI utilisé comme contrôle négatif et
250 ng
d'un vecteur rapporteur noté ABCLuc+ qui permet l'expression du gène
rapporteur
luciférase sous le contrôle du fragment 254/+91 du promoteur de l'apo AI
(comprenant
15 les régions A, B, C du promoteur de hApo AI, noté ABCLuc+) ou 250 ng du
vecteur
rapporteur exempt de promoteur comme contrôle (noté Luc+). Ces constructions
sont
obtenues par l'échange du gène rapporteur CAT des constructions décrites
précédemment [ 16] avec le gène rapporteur Luciférase extrait du plasmide pGL3
de
Promega (Madison, WI, LJSA) comme décrit précédemment [17]. La quantité totale
20 d'ADN transfecté est établie à SOOng à l'aide du plasmide pBKS+. Après 3
heures de
transfection, les cellules sont incubées dans le milieu de culture pendant 36
heures.
L'activité Luciférase est ensuite mesurée comme décrit précédemment [17] en
présence
ou en absence de la protéine LRH-1.
25 La figure 1 montre une augmentation d'un facteur 2 de l'activité Luciférase
par la sur-
expressïon de LRH-1 lorsque les cellules HepG2 sont transfectées par la
construction
ABCLuc+ . Cette augmentation n'est pas observée lorsque les cellules sont
transfectées
avec la construction contrôle Luc+ dépourvue de promoteur.
30 Exemule 2 : Effet de la sur-expression de LRH-1 sur l'activité du promoteur
de
l'apo AI humaine dans les cellules RK13
L'exemple 2 montre que la sur-expression de hLRH-1 augmente l'activité des
fragments
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-254/+91 (qui comporte les régions A,B et C) et -192/+21 (qui comporte les
régions B et
C) du promoteur de l'apo AI mais pas des fragments -128/+91 (qui comporte la
région
C) et --40l+91 (qui ne comporte que le promoteur minimum), clonés en amont du
gène
rapporteur luciférase.
Des cellules RK13 sont co-transfectées par la technique de lipofection (JetPEI
selon les
indications du fournisseur) avec 100 ng du vecteur pCI-hLRH-1 .qui permet la
sur-
expression de LRH-1 ou du vecteur vide pCI utilisé comme contrôle négatif et
250 ng
d'un vecteur rapporteur qui permet l'expression du gène rapporteur luciférase
sous le
contrôle des fragments -254/+91 (comprenant les régions A, B et C, notées
ABCLuc+) ,
-192/+91 (comprenant les régions B et C, notées BCLuc+), -128/+91 (comprenant
la
région C, notée CLuc+) ou -40/+91 (comprenant le promoteur minimum purin, noté
purin) du promoteur de l'apo AI ou 250 ng du vecteur rapporteur dépourvu de
promoteur
comme contrôle (noté Luc+). Ces constructions sont obtenues par l'échange du
gène
rapporteur CAT des constructions décrites précédemment [16] avec le gène
rapporteur
Lucifërase extrait du plasmide pGL3 de Promega (Madison, WI, LTSA) comme
décrit
précédemment [17]. La quantité totale d'ADN transfecté est établie à 500 ng à
l'aide du
plasmide pBKS+. Après 3 heures de transfection, les cellules sont incubées
dans le
milieu de culture pendant 36 heures. L'activité Luciférase est ensuite mesurée
comme
décrit précédemment [17] en présence ou en absence de la protéine LRIi-1.
La figure 2 montre qu'en présence de LRH-l, l'expression du gène codant pour
la
luciférase placé sous le contrôle du promoteur de l'Apo AI humain comprenant
les
régions A, B, C et le promoteur minimum (ABCLuc+ - fragment -254/+91) est
augmentée d'un facteur 12 dans les cellules RK13 qui n'expriment pas le
récepteur LRH-
1 de manière endogène. L'expression de la luciférase contrôlée par une
construction
comprenant les régions B, C et le promoteur minimum (BCLuc+ -fragment -
192/+91) du
promoteur de l'Apo AI humain est augmentée d'un facteur 15. L'expression de la
luciférase contrôlée par une construction comprenant la région C et le
promoteur
minimum (CLuc+ - fragment -128/+91) du promoteur de l'Apo AI humain n'est pas
affectée. L'expression de la luciférase contrôlée pax une construction
comprenant
seulement le promoteur minimum (purin - fragment -40/+91) du promoteur de
l'Apo AI
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humain n'est que légèrement stimulée d'un facteur 2. ,
Nous n'observons également pas d'activation de l'expression de la luciférase
lorsque les
cellules RK13 sont transfectées avec le vecteur rapporteur Luc+ dépourvu de
séquence
promotrice.
L'expression du gène apoAI est donc bien régulée par la protéine LRH-1. Il
existe en cis
un site situé au niveau de la région B du promoteur du gène apoAI humain
permettant la
fixation en trans de la protéine LRH-1.
Exemple 3 : Identüication d'un site de fixation de LRH-1 dans le promoteur de
l'apo AI humaine
L'exemple 3 montre que LREI-1 se fixe sur le fragment -144/-122 du promoteur
du gène
humain de l' apo AI.
La protéine hLRH-1 est produite in vitro à l'aide du kit TNT-T7 lysat de
réticulocyte
de lapin de Promega (ref. L4610) et du vecteur pCI-LRH-1. Des,
oligonucléotides
doubles brins correspondants à l'élément de réponse à LRH-1 présent sur le
gène Cyp7a ,
noté hCyp7a wt, [sens: 5'-GATCTCTTAGTTCAAGGCCAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 7)
et anti-sens: 5'-GATCCTAACTGGCCTTGAACTAAGA-3' (SEQ ID NO:B)],
au même élément de réponse muté, noté hCyp 7 a mut, [sens: 5'-
GATCTCTTAGTTCAATTCCAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 9) et anti-sens: 5'-
GATCCTAACTGGAATTGAACTAAGA-3' (SEQ ID NO: 10],
au fragment -191/-171, noté LRHRE ApoAl h 5, [sens: 5'
GATCCGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTA-3' (SEQ ID NO: 11) et anti-sens: 5'
GATCTACAGCAAGCTGCGGGGGCTGCG-3' (SEQ ID NO: 12)], au fragment
-178/-145, noté LRHRE ApoAl h 6, [sens:
5'-GATCCTTGCCCACTCTATTTGCCCAGCCCC1~A-3' (SEQ ID NO: 13) et anti-
sens:
5'-GATCTTGGGGCTGGGCAAATAGAGTGGGCAAG-3' (SEQ ID NO: 14)], au
3 0 fragment
-144/-122 sauvage, noté LRHRE ApoAl h 7, ou muté, noté LRHRE ApoAl mut,
[respectivement sens: 5'-GATCCGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTA-3' (SEQ ID
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NO: 15) et anti-sens : 5'-GATCTAGTTCAAGGATCAGCTCTGTCCCG-3' (SEQ ID
NO: 16), sens 5'- GATCCGGGACAGAGCTGATTGTTGAACTA - 3' (SEQ ID NO
25) et antisens
5'- GATCTAGTTCAACAATCAGCTCTGTCCCG - 3' (SEQ ID NO : 26)] et au
fragment et au fragment -180/-158, noté LRHRE ApoAl h 8, [sens:
5'-GATCCAGCTTGCTGTTTGCCCACTCTATA-3' (SEQ ID NO: 17) et anti-sens:
5'-GATCTATAGAGTGGGCAAACAGCAAGCTG-3' (SEQ ID N0:18)] du promoteur
du gène humain de l'apo AI (SEQ ID NO: 5) ont été préparés corizme décrit
précédemment [16], et marqués avec du [y-32P]-ATP à l'aide de la
polynucléotide kinase.
2 ~.1 de lysat de réticulocyte de lapin programmés par hLRH-1 sont incubés
pendant 15
minutes à température ambiante dans un volume final de 20,1 de tampon qui
contient 10
mM HEPES, 2,5 mM MgCl2, 10% glycérol, 2,5 mg/ml BSA, 50 mM NaCI et 0,5 mM
DTT avec 2,5 ~,g de polydI-dC et 1 ~,g d'ADN de sperme de hareng en présence
des
oligonucléotides doubles brins marqués (0,5 ng). Les complexes sont ensuite
séparés par
électrophorèse sur gel non dénaturant dans du tampon TBE 0,25X.
La figure 3 montre un complexe LRH-1/ADN spécifique lorsque la protéine LRH-1
produite in vitro est incubée en présence d'un oligonucléotide double brin
marqué
correspondant à l'élément de réponse à LRH-1 présent au niveau du gène Cyp7a
(hCyp7a wt). Par contre, aucun complexe n'est détecté en présence de
l'oligonucléotide
double brin marqué correspondant dont l'élément de réponse est muté (hCyp7a
mut). La
figure 3 montre également qu'aucun complexe ADN/LRH-1 n'est détecté avec les
oligonucléotides doubles brins correspondant aux fragments -191/-171
(LRHRE ApoA1 h 5), -178/-145 (LRHRE ApoAl h 6), et -180/-158
(LRHRE ApoAl h 8), du promoteur du gène humain de l'apo AI. Par contre, la
figure
3 montre la présence d'un complexe ADN/LRH-1 spécifique lorsque
l'oligonucléotide
double brin marqué correspond au fragment -144/-122 (LRHRE ApoA1 h 7) du
promoteur du gène humain de l'apo AI. Ce fragment est situé à cheval sur les
régions B
et C du promoteur du gène humain de l'apo AI et comporte, sur le brin
antisens, la
séquence TCAAGGATC proche de la séquence consensus TCAAGGTCA d'un élément
de réponse à LRH-1. Cet élément est fonctionnel du fait que la figure 3 montre
que
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l'oligonucléotide double brin correspondant dont la séquence TCAAGGATC est
mutée
(TCAACAATC) est incapable de former un complexe avec LRH-1(LRHRE ApoAl
mut).
Exemple 4 : Le fragment -144/-122 du promoteui° du gène humain de l'apo
AI est
un élément de réponse de faible affinité à LRI3-1
L'exemple 4 montre que le fragment -144/-122 du promoteur du gène humain de
l'apo
AI est un site à faible affinité pour LRH-1.
La protéine hLRH-1 est produite in vitro à l'aide du kit TNT-T7 lysat de
réticulocyte de
lapin de Promega (ref. L4610) et du vecteur pCI-LRH-1. Des oligonucléotides
doubles
brins correspondants à l'élément de réponse à LRH-1 présent sur le gène Cyp7a
(noté
LRH-1-Sonde Cyp7a) ou au fragment sauvage -144/-122 (ApoA1 h 7) du promoteur
du
gène humain de l'apo AI (SEQ ID NO : 4 ) ont été préparés comme décrit
précédemment
[16], et marqués avec du [y-32P]-ATP à l'aide de la polynucléotide kinase. 2
w1 de lysat
de réticulocyte programmés par hLRH-1 sont incubés pendant 15 minutes à
4°C dans un
volume final de 201 de tampon qui contient 10 mM HEPES, 2,5 mM MgCl2, 10%
glycérol, 2,5 mg/ml BSA, 50 mM NaCI et 0,5 mM DTT avec 2,5 ~g de polydI-dC et
1
~.g d'ADN de sperme de hareng en présence des oligonucléotides doubles brins
non
marqués en excès (10X, 50 X et 100X) par rapport à la sonde marquée utilisée
(0,5 ng).
Les oligonucléotides doubles brins marqués (O,Sng) sont ensuite ajoutés au
mélange et
incubés à température ambiante pendant 15 minutes avant que les complexes
soient
ensuite séparés par électrophorèse sur gel non dénaturant dans du tampon TBE
0,25X.
La figure 4A montre qu'un oligonucléotide double brin non radioactif
correspondant au
fragment -144/-122 du promoteur du gène humain de l'apo AI déplace
partiellement le
complexe formé entre LRH-1 et un oligonucléotide double brin marqué
correspondant à
l'élément de réponse à LRH-1 présent au niveau du gène Cyp7a. Par contre, la
figure 4A
ne montre aucun déplacement du complexe formé entre LRH-1 et un
oligonucléotide
double brin marqué correspondant à l'élément de réponse à LRH-1 présent au
niveau du
gène Cyp7a par un oligonucléotide double brin non radioactif correspondant au
fragment
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-144/-122 muté du promoteur du gène humain de l'apo AI.
La figure 4B montre qu'un oligonucléotide double brin non radioactif
correspondant à
l'élément de réponse à LRH-1 présent au niveau du gène Cyp7a déplace
totalement le
complexe formé entre LRH-1 et un oligonucléotide double brin marqué
correspondant au
5 fragment -144/-122 du promoteur du gène humain de l'apo AI. Par contre, la
figure 4B
ne montre aucun déplacement du complexe formé entre LRH-1 et un
oligonucléotide
double brin marqué correspondant au fragment -144/-122 du promoteur du gène
humain
de l'apo AI par un oligonucléotide double brin non radioactif correspondant à
l'élément
de réponse muté à LRH-1 présent au niveau du gène Cyp7a. La comparaison des
10 résultats présentés dans les figures 4A et B indique que l'affinité pour
LRH-1 du
fragment -1441-122 du promoteur du gène humain de l'apo AI est inférieure à
celle de
l'élément de réponse à LRH-1 présent au niveau du gène Cyp7a.
Exemple 5: Effet de la surexpression de LRIi-1 sur l'activité du promoteur de
15 l'apo AI humaine muté ou non dans les cellules HuH7o
L'exemple 5 montre que la mutation du site TCAAGGATC présent dans le fragment -
144/-122 du promoteur du gène humain de l'apo AI réduit la sensibilité à LRH-1
d'une
construction qui comporte le fragment -254/+91 du promoteur du gène humain de
l'apo
20 AI.
Des cellules HuH7 sont co-transfectées par la technique de lipofection (JetPEI
selon les
indications du fournisseur) avec 100 ng du vecteur pCI-hLRH-1 qui permet la
sur-
expression de LRH-1 ou du vecteur vide pCI utilisé comme contrôle négatif et
50 ng
25 d'un vecteur rapporteur qui permet (expression du gène rapporteur
luciférase sous le
contrôle du fragment -254/+91 comprenant les régions A, B et C sauvage du
promoteur
de fapo AI (notées ABC Luc+), sous le contrôle du fragment -254/+91 comprenant
les
sites A, B et C du promoteur de fapo AI dont le site TCAAGGATC est muté (notés
ABCmutLuc+), sous le contrôle du fragment -192/+91 comprenant les régions B et
C du
30 promoteur de hApo AI (noté BCLuc+), sous le contrôle du fragment -128/+91
comprenant la région C du promoteur de fapo AI (noté Cluc+), sous le contrôle
du
fragment -40/+91 comprenant le promoteur minimum de l'apo AI (noté purin) ou
50 ng
du vecteur rapporteur dépourvu de promoteur comme contrôle (noté Luc+).
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La construction ABCmutLuc+ est obtenue par mutagenèse dirigée de la
construction
ABCLuc+ sauvage, à l'aide du kit Quick Change Site directed mutagenesis
(Stratagene)
correspondant aux séquences sens SEQ ID NO 19 et antisens SEQ ID NO 20.
La figure 5 montre une augmentation d'un facteur 5,8 de l'activité Luciférasé
par la sur-
expression de LRH-1 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction
ABCLuc+ et de 2,6 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction
BCLuc+. Cette augmentation n'est pas ou peu observée lorsque les cellules sont
transfectées avec les constructions comprenant les sites A, B et C du
promoteur de fapo
AI dont le site TCAAGGATC est muté (ABCmutLuc+), la région C du promoteur de
fapo AI (Cluc+), le promoteur minimum de l'apo AI (purin) ou la construction
dépourvue de promoteur (Luc+).
L'exemple 5 montre que le site TCAAGGATC présent dans le fragment -144/-122 du
promoteur du gène humain de l'apo AI sensibilise celui-ci à LRH-1.
Exemple 6: Effet de la surexpression de LRH-1 sur l'activité de différents
mutants du promoteur de l'apo AI humaine dans les cellules I3uH7.
L'exemple 6 montre que la mutation du site TCAAGGATC présent dans le fragment -
144/-122 réduit la sensibilité à LRH-1 d'une construction qui comporte le
fragment -
254/+91 du promoteur du gène humain de l'apo AI cloné en amont du gène
rapporteur
luciférase contrairement à la mutation de l'élément de réponse à FXR du
promoteur du
gène humain de l' apo AI adj acent.
Des cellules HuH7 sont co-transfectées par la technique de lipofection (JetPEI
selon les
indications du fournisseur) avec 100ng du vecteur pCI-hLRH-1 qui permet la sur-
expression de LRH-1 ou du vecteur vide pCI utilisé comme contrôle négatif et
50 ng
d'un vecteur rapporteur qui permet (expression du gène rapporteur luciférase
sous le
contrôle du fragment -254/+91 comprenant les régions A, B et C sauvage du
promoteur
de fapo AI (notées ABC Luc+ et ABCpGL3), sous le contrôle du fragment -254/+91
comprenant les sites A, B et C du promoteur de fapo AI dont le site TCAAGGATC
est
muté (notés ABCmutLuc+ - cf.exemple 5), sous le contrôle du fragment -254/+91
comprenant les sites A, B et C du promoteur de fapo AI dont l'élément de
réponse à
FXR est muté (notés ABCpGL3FXREKO), sous le contrôle du fragment -192/+91
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comprenant les régions B et C du promoteur de hApo AI (notées BCLuc+ et
BCpGL3),
sous le contrôle du fragment -192/+91 dont l'élément de réponse à FXR est muté
(noté
BCpGL3FXREKO), sous le contrôle du fragment -128/+91 comprenant la région C du
promoteur de fapo AI (noté Cluc+), sous le contrôle du fragment -40/+91
comprenant le
promoteur minimum de l'apo AI (noté purin) ou 50 ng des vecteur rapporteurs
dépourvus de promoteur comme contrôle (notés Luc+ et pGL3).
La construction ABCpGL3 a été obtenue par sous-clonage du fragment -254/+91 du
promoteur du gène de l'apoAI du vecteur ABCLuc+ (digestion par SaII/Sphl) dans
le
vecteur pGL3 de Promega (digéré par XhoI/SphI). La construction ABCpGL3FXREKO
a été obtenue par sous-clonage du fragment muté -254/+91 du promoteur du gène
de
l'apoAI du vecteur ABCLuc+FXREKO décrit précédemment [18] (digestion par
SaII/SphI) dans le vecteur pGL3 (digéré par XhoI/SphI). Les constructions
BCpGL3 et
BCpGL3FXREKO ont été obtenues par digestion partielle et re-ligation des
constructions ABCpGL3 et ABCpGL3FXREKO, respectivement.
La figure 6 montre une augmentation d'un facteur 4,8 de l'activité Luciférase
par la sur-
expression de LRH-1 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction
ABCLuc+, de 2.1 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction
BCLuc+, de 8.7 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la construction
ABCpGL3, de 11.5 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction
ABCpGL3FXREKO, de 1,9 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par la
construction BCpGL3 et de 2.4 lorsque les cellules HuH7 sont transfectées par
la
construction BCpGL3FXREKO. Cette augmentation n'est pas ou peu observée
lorsque
les cellules sont transfectées avec les constructions comprenant les sites A,
B et C du
promoteur de fapo AI dont le site TCAAGGATC est muté (ABCmutLuc+), la région C
du promoteur de fapo AI (Cluc+), le promoteur minimum de l'apo AI (purin) ou
les
constructions dépourvues de promoteur (Luc+ et pGL3).
L'exemple 6 montre que le site TCAAGGATC présent dans le fragment -144/-122 du
promoteur du gène humain de l'apo AI sensibilise celui-ci à LRH-1. La présence
de
l'élément de réponse à FXR adjacent à l'élément de réponse à LRH ne semble pas
nécessaire à la réponse à LRH.
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Bien que physiquement proches, ces éléments de réponse sont donc
fonctionnellement
distincts.
Exemple 7 : Le site de fixation de LRH-1 du promoteur du gène codant pour
l'Apo
AI humaine est différent du site de fixation de FXR dû promoteur du
gène codant pour l'Apo AI humaine.
L'exemple 3 montre que LRH-1 se fixe sur le fragment -144/-122 du promoteur du
gène
codant pour l'Apo AI humaine.
L'exemple 7 montre que le site de fixation de LRH-1 du promoteur du gène
codant pour
l'Apo AI humaine est différent du site de fixation de FXR du promoteur du gène
codant
pour l'Apo AI humaine.
Les protéines LRH-1 et FXR sont produites in vitro à l'aide du kit TNT-T7
(lysat de
réticulocyte de lapin de Promega ; ref. L4610) et des vecteurs pCI-LRH-1 et
pCDNA3-
FXR.
Des expériences de retard sur gel sont réalisées dans les mêmes conditions
expérimentales que dans l'exemple 3 avec des oligonucléotides doubles brins
correspondants
à l'élément de réponse à LRH-1 présent sur le gène Cyp7a , noté hCyp7a wt,
[sens: 5'-
GATCTCTTAGTTCAAGGCCAGTTAG-3' (SEQ ID NO: 7) et anti-sens: 5'-
GATCCTAACTGGCCTTGAACTAAGA-3' (SEQ ID NO:S)],
à l'élément de réponse de FXR du promoteur du gène humain de l'apo AI,
FXRRE ApoA1 h 1, [sens: 5'- CAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTT-3' (SEQ
ID NO: 21) et anti-sens: 5'- AACTTAAGAGTTCAAGGATCAGCTCTG-3' (SEQ ID
NO: 22)],
au même élément de réponse muté, noté FXRRF ApoAl h 1 mut, [sens: 5'-
AACTTAAGAGTTCAAGGATCAGCTCTG-3' (SEQ ID NO: 23) et anti-sens: 5'-
AACTTAACACTTCAAGGATCAGCTCTG-3' (SEQ ID NO: 24],
et au fragment -144/-122 du promoteur du gène humain de l'apo AI sauvage, noté
LRHRE ApoA1 h 7, ou muté, noté LRHRE ApoAl mut, [respectivement sens: 5'-
GATCCGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTA-3' (SEQ ID NO: 15) et anti-sens : 5'-
GATCTAGTTCAAGGATCAGCTCTGTCCCG-3' (SEQ ID NO: 16), sens 5'-
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GATCCGGGACAGAGCTGATTGTTGAACTA - 3' (SEQ ID NO : 25) et antisens
5'- GATCTAGTTCAACAATCAGCTCTGTCCCG - 3' (SEQ ID NO : 26)].
La figure 3 et la figure 7B montrent un complexe LRH-1/ADN spécifique lorsque
la
protéine LRH-1 produite in vitro est incubée en présence d'un oligônucléotide
double
brin marqué correspondant à l'élément de réponse à LRH-1 présent au niveau du
géne
Cyp7a (hCyp7a wt). Par contre, aucun complexe n'est détecté , en présence de
l'oligonucléotide double brin marqué correspondant dont l'élément de réponse
est muté
(hCyp7a mut) (figure 3).
La figure 3 montre également la présence d'un complexe ADN/LRH-1 spécifique
lorsque
la protéine LRH-1 est incubée en présence de l'oligonucléotide double brin
marqué
correspondant au fragment -144/-122 (LRIiRE ApoAl h 7) du promoteur du gène
humain de l'apo AI et ne montre plus.la présence de ce complexe avec
l'oligonucléotide
double brin correspondant dont la séquence TCAAGGATC est mutée (LRHRE ApoAl
mut).
La figure 7A montre qu'aucun complexe ADN/FXR n'est détecté lorsque la
protéine
FXR produite i~ vite~ est incubée en présence des oligonucléotides doubles
brins
marqués correspondant au fragment -144/-122 (LRHRE ApoAl h 7) du promoteur du
gène humain de l'apo AI et au même fragment muté (LRHRE ApoAl mut). En
revanche, la figure 7A montre la présence d'un complexe ADN/FXR spécifique
lorsque
la protéine FXR produite in vitro est incubée en présence d'un oligonucléotide
double
brin marqué correspondant à l'élément de réponse à FXR du promoteur du gène
humain
de l'apo AI (FXRRF ApoA1 h 1) et ne montre plus la présence de ce même
complexe
lorsque la protéine FXR est incubée avec ce même élément de réponse muté
(FXRRF ApoAl h 1 mut).
La figure 7B montre la présence d'un complexe ADN/LRH-1 spécifique lorsque la
protéine LRH-1 produite in vitro est incubée en présence d'un oligonucléotide
double
brin marqué correspondant à l'élément de réponse à FXR du promoteur du gène
humain
de l'apo AI (FXRRF ApoAl h 1) ou avec ce même élément de réponse muté
(FXRRF-ApoAl h 1 mut).
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Ainsi, des mutations affectant l'élément de réponse à FXR du promoteur du gène
humain
de l'apo AI n'affectent pas la liaison de LRH-1 à son élément de réponse
tandis que cette
même mutation affecte la fixation de FXR sur son élément de réponse situé sur
le
5 promoteur du gène humain de l'apo AI. L'exemple 7 montre donc que les site
de
fixation de LRH-1 et de FXR du promoteur du gène humain de l'apo AI sont
distincts.
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REFERENCES
1. Francis, G.A., et al., Nuclear receptors and the control of metabolism.
Annu Rev
Physiol, 2003. 65: p. 261-311.
2. Zhang, C.K., et al., Characterization of the genomic structure and tissue-
specific
promoter of the human nuclear receptor NRSA2 (hBIF) gene. Gene, 2001.
273(2): p. 239-49.
3. Sirianni, R., et al., Liver receptor homologue-1 is expressed in human
steroidogenic tissues and activates transcription of genes encoding
steroidogenic enzymes. J Endocrinol, 2002. 174(3): p. R13-7.
4. Ellinger-Ziegelbauer, H., et al., FTZ FI -related orphan receptors in
Xenopus
laevis: transcriptional regulators differentially expressed during early
embryogenesis. Mol Cell Biol, 1994. 14(4): p. 2786-97.
5. Lin, W., et al., Zebrafish ftz f1 gene has two promoters, is alternatively
spliced,
and is expressed in digestive organs. Biochem J, 2000. 348 Pt 2: p. 439-46.
6. Chen, F., et al., Liver Receptor Homologue-1 Mediates Species- and Cell
Line-
specific Bile Acid-dependent Negative Feedback Regulation of the Apical
Sodium- dependent Bile Acid Transporter. J Biol Chem, 2003. 278(22): p.
19909-16.
7. Schoonjans, I~., et al., Liver receptor homolog 1 controls the expression
of the
scavenger receptor class B type I. EMBO Rep, 2002. 3(12): p. 1181-7.
8. Le Goff, W., et al., A CYP7A promoter binding factor site and Alu repeat in
the
distal promoter region are implicated in regulation of human CETP gene
expression. J Lipid Res, 2003. 44(5): p. 902-10.
9. Segrest, J., et al., Structure and function of apolipoprotein A-I and high-
density
lipoprotein. Curr Opin Lipidol, 2000. 11(2): p. 105-15.
10. Fruchart, J. and P. Duriez, High density lipoproteins and coronary heczrt
disease.
Future prospects in gene therapy. Biochimie, 1998. 80(2): p. 167-72.
11. Leroy, A., J. Dallongeville, and J. Fruchart, Apolipoprotein A I
containing
lipoproteins and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol, 1995. 6(5): p. 281-5.
12. Breslow, J., et al., Isolation and characterization of cDNA clones for
human
apolipoprotein A-I. PNAS, 1982. 79(22): p. 6861-6865.
CA 02549948 2006-06-15
WO 2005/064014 PCT/FR2004/003373
42
13. Shoulders, C. and F. Baralle, Isolation of the human HDL apolipoprotein AI
gene. Nucleic Acids Res., 1982. 10(16): p. 4873-4882.
14. Karathanasis, S., et al., Lihkage of human apolipoproteins A I and C III
gehes.
Nature, 1983. 304(5924): p. 371-3.
15. Widom, R., et al., Synergistic interactions between transcription factors
control
expression of the apolipoprotein AI gene in liver tells. Mol. Cell. Biol.,
1991.
11(2): p. 677-687.
16. Vu-Dac, N., et al., Negative regulation of the human apolipoprotein A I
promoter by fibrates tan be attenuated by the interaction of the peroxisome
proliferator-activated receptor with its response element. J. Biol. Chem.,
1994.
269(49): p. 31012-31018.
17. Raspe, E., et al., Modulation of rat liver apolipoprotein Bene expression
and
serum lipid levels by tetradecylthioacetic acid (TTA) via PPAR~alpha~
activation. J. Lipid Res., 1999. 40(11): p. 2099-2110.
18. Claudel, T., et al., Bile acid-activated nuclear receptor FXR suppresses
apolipoprotein A I transcription via a negative F~ response element. J Clin
Invest., 2002. 109(7) : p.961-971
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