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MÉTHODE DE DÉTECTION DU STAPHYLOCOQUE DORÉ
RÉSISTANT A LA MÉTHICILLINE (SARM)
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie
résistante à
un antibiotique. De préférence, la méthode cherche à détecter le Staphylocoque
doré,
résistant à la méthicilline.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR
Depuis l'apparition de la première souche de Staphylocoque doré résistante à
la
méthicilline (SARM) en milieux hospitalier en 1961, on observe une
augmentation
accrue des cas d'infections dû à ce micro-organisme autant en milieux
hospitalier que
dans la communauté en général. La méthode standard de culture sur milieu
sélectif
MSA4 nécessite entre 24 et 72 heures et ne permet pas un diagnostic rapide et
efficace.
Il est connu par une personne versée dans l'art que la résistance du
Staphylocoque
doré à la méthicilline est signalée par la présence d'une séquence d'ADN
spécifique,
le transposon mccA, à un endroit spécifique du gène orfX de cette bactérie. Le
transposon mccA est effectivement une cassette d'ADN qui s'insère de façon
préférentielle dans le gène orfX à un endroit spécifique. II est connu qu'il
existe cinq
(5) variantes du transposon mccA. Toutefois, il faut savoir que quelque soit
la
variante du transposon mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque
doré,
l'endroit où le transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère
dans le
gène orfX demeurera le même.
De plus, la technique d'amplification en chaîne par la polymérase (PCR)
développée
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récemment a permis de réduire le temps à quelques heures mais les coûts reliés
à
cette nouvelle technologie sont encore dispendieux.
Il existe donc un besoin pour de nouveaux tests ou méthodes pour le dépistage
de
bactéries résistantes aux antibiotiques telle que le SARM.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 est un histogramme obtenu à partir des valeurs de fluorescence
médiane
1 o des résultats rapportés à l'Exemple 1.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
De façon générale, l'invention concerne une méthode de détection d'une
bactérie
résistante à un antibiotique comme par exemple, le Staphylocoque doré
résistant à la
méthicilline, la présente méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une
région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la
région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la
méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le
produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde
est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
De préférence, deux régions d'ADN d'une bactérie sont ciblées. Une première
région
génique est caractéristique de la bactérie elle-même, la bactérie étant le
Staphylocoque doré. Une deuxième région génique est associée à la résistance à
un
antibiotique, ledit antibiotique étant la méthicilline.
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Ainsi, de préférence, la première région génique ciblée est une partie du gène
orfX.
La deuxième région génique ciblée est une séquence d'ADN correspondant à une
partie de la séquence d'un transposon appelé mccA.
Il vaut bien également noter que l'invention décrit également une méthode peu
coûteuse, exportable, modulable et applicable au dépistage de bactéries
résistantes
à un antibiotique et plus particulièrement au SARM.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
Les coûts des tests de dépistage étant très élevés, un moyen de mettre au
point un
test peu coûteux à partir des outils présentement disponibles dans le domaine
des
nanotechnologies est visé, surtout dans le cadre d'une augmentation accrue des
cas
d'infections dues à certains micro-organismes autant en milieux hospitalier
que dans
la communauté en général. La présente invention permettra donc de diminuer les
coûts des analyses et minimisera les délais pour l'obtention des résultats.
La présente invention concerne une méthode de détection d'une bactérie
résistante à
un antibiotique, ladite bactérie étant de préférence le Staphylocoque doré
résistant à
la méthicilline, et la méthode comprenant les étapes suivantes:
- Amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) d'au moins une
région d'ADN du Staphylocoque doré pour obtenir un produit PCR, la
région ciblée signalant la résistance du Staphylocoque doré à la
méthicilline;
- Hybridation du produit PCR à des sondes couplées à des microsphères;
- Détection de la présence ou l'absence d'un complexe comprenant le
produit PCR avec les sondes couplées à des microsphères;
et dans laquelle la détection de la présence d'un complexe produit PCR/sonde
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est indicatif que ladite bactérie est résistante à ladite méthicilline.
L'invention vise donc à pouvoir détecter la présence d'au moins une région du
génome d'une bactérie, le Staphylocoque doré, afin d'identifier si la bactérie
est
résistante à un antibiotique, cet antibiotique étant la méthicilline.
Une personne versée dans l'art comprendra également qu'un antibiotique est
toute
substance chimique produite par des micro-organismes ayant le pouvoir
d'inhiber et
même de détruire les bactéries et autres micro-organismes en solution diluée.
Il aussi
lo connu par une personne versée dans l'art qu'un antibiotique peut être
obtenu en
laboratoire par synthèse ou semi-synthèse. D'une part, un antibiotique
synthétique
est obtenu soit à partir de dérivés artificiels, soit en recréant des
substances
primitivement extraites de micro-organismes. D'autre part, un antibiotique
semi-
synthétique est obtenu en modifiant en laboratoire une substance produite par
un
micro-organisme. Il est aussi connu par une personne de l'art que l'étendue de
l'activité antibactérienne d'un antibiotique définit son spectre. Ainsi, plus
un
antibiotique détruit de types de bactéries différentes, plus son spectre est
large.
Toutefois, pour les fins de la présente invention, l'antibiotique qui sera
considéré est
la méthicilline.
Il est entendu que les échantillons à partir desquels l'étape d'amplification
du génome
de la bactérie visée est effectuée sont obtenus à partir d'un échantillon
d'ADN,
prélevé de préférence à partir des canaux nasaux d'un sujet étudié. Ce
spécimen est
préférentiellement traité afin d'isoler l'ADN génomique et de préférence
purifié par
lyse cellulaire à l'aide d'une solution de lyse à base de détergents
anioniques. Une
personne versée dans l'art connaîtra d'autres méthodes d'isolement et de
purification
d'ADN et ces dernières peuvent bien sûr s'appliquer.
Selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au moins une
région
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d'ADN du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces spécifiques à
ce
génome (voir Table 2). Les régions géniques bactériennes ciblées pour
l'amplification
par PCR se retrouvent de préférence sur deux régions d'ADN, tels sur une
première
et une deuxième région géniques. La première région génique ciblée pour la
5 détection du SARM est celle qui est caractéristique du Staphylocoque doré et
correspond à une partie de la séquence d'ADN du gène orfX. La deuxième région
génique ciblée pour la détection du SARM est celle qui signalera la résistance
du
Staphylocoque doré à un antibiotique, cet antibiotique étant la méthicilline.
Or, la
deuxième région génique ciblée correspond à une partie de la séquence d'ADN du
lo transposon mccA.
Il est connu par une personne versée dans l'art que les transposons sont des
séquences d'ADN qui peuvent se déplacer à différentes positions dans le génome
d'une seule cellule à travers le mécanisme de la transposition. Pour les fins
de la
présente invention, il faut savoir que le transposon mccA peut avoir au moins
cinq (5)
variantes (qui seront appelées "MAl", "MA2", "MA3., "MA4. et "MA5" dans la
description de la présente invention). Ainsi, quelque soit la variante du
transposon
mccA se retrouvant dans le génome du Staphylocoque doré, l'endroit où le
transposon mccA, ou une variante de cette dernière, s'insère dans le gène orfX
2 o demeurera le même et cette caractéristique permettra ainsi de détecter la
présence
de la résistance du Staphylocoque doré à la méthicilline
Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, le transposon mccA peut se
déplacer d'un
Staphylocoque doré à un autre et lorsque le transposon mccA est à un endroit
ou à
une position qui chevauche le gène orfX, la résistance du Staphylocoque doré à
la
méthicilline est signalée.
Ainsi, selon un mode préféré de l'invention, l'étape d'amplification d'au
moins une
région du génome du Staphylocoque doré se fait par PCR à l'aide d'amorces
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spécifiques aux régions ciblées du génome (voir Table 2), et de préférence,
aux
première et deuxième régions géniques soit celles correspondant respectivement
aux
parties des gènes orfX et mccA. Ainsi, lors de la réaction PCR, les amorces
spécifiques aux régions déterminées contribuent à l'amplification d'au moins
une
région du génome du Staphylocoque doré, et ce, dans des conditions
d'amplification
favorisant la production de grandes quantités de fragments d'ADN, soient les
produits
du PCR. Chaque produit du PCR peut être d'une longueur d'environ 200
nucléotides.
De préférence, les amorces utilisées pour la réaction PCR peuvent servir à
amplifier
1o plus une séquence d'ADN correspondant à plus d'une variante du transposon
mccA.
Par conséquent, les amorces créées pour amplifier des séquences correspondant
à
une partie de chacune des séquences des variantes MAl, MA2, MA3, MA4 et MA5
peuvent participer ensemble à la réaction PCR afin de détecter la présence du
SARM.
Aussi, selon un mode préféré de l'invention, au moins une des amorces
utilisées a
également été modifiée afin de comprendre une modification terminale à
l'extrémité
5'. Selon un mode préféré de l'invention, l'extrémité 5' de l'amorce est liée
à une
molécule terminale, comme par exemple la biotine. La molécule terminale est
choisie
parmi des molécules qui ont une affinité particulière et connue à une autre
protéine. Il
est connu par une personne versée dans l'art que la vitamine biotine a une
très forte
affinité pour une protéine bactérienne, la streptavidine. La combinaison
streptavidine-
biotine peut être utilisée pour lier deux molécules, telles que des ligands à
des
récepteurs, par exemple. Une personne versée dans l'art comprendra que
d'autres
modifications terminales peuvent être apportés aux amorces afin de leur
accorder, à
leur terminaison 5', un élément d'une telle combinaison. Aussi selon un mode
préféré
de l'invention, la modification terminale à l'extrémité 5' sera effectuée sur
l'amorce
ciblant la première région génomique ainsi que sur l'amorce spécifique à la
deuxième
région génomique.
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Selon un mode préféré de l'invention, l'étape de l'hybridation des produits
PCR est
précédée par la liaison des sondes spécifiques à des microsphères. Les sondes
sont
spécifiques en ce qu'elles correspondent à des sous-régions déterminées à
partir de
la première et de la deuxième région géniques du Staphylocoque doré. La
première
et la deuxième sous-région génique sont comprises de préférence dans la
séquence
du gène orfX. Ainsi, préférentiellement, une première sonde comprend une
séquence
pour identifier la première sous-région génique. Cette première sonde est
listée à la
Table 3 comme étant OXSAS-1. Une deuxième sonde comprend une séquence pour
lo identifier la deuxième sous-région génique correspondant à une partie du
produit
PCR dérivé de la séquence du transposon mccA et à une partie du gène orfX. De
préférence, cette deuxième sonde est listée à la Table 3 comme étant MASS-2.
Les sondes comportent également, de préférence, une modification à l'extrémité
5'.
Cette modification est préférablement de type "5'Uni-link amino" afin de
permettre à
la sonde de se lier aux groupements hydroxyles à la surface des microsphères,
mais
une personne versée dans l'art comprendra que d'autres types de modifications
peuvent réaliser le même objectif. Ainsi, une fois qu'elles seront liées aux
microsphères, les sondes spécifiques auront pour tâche d'identifier les
produits du
PCR obtenus lors de l'étape de l'amplification et de s'y lier par hybridation.
Selon un autre mode préféré de l'invention, chacune des microsphères peut se
définir
généralement comme étant un excipient sous forme de petite sphère dont le
diamètre
est compris entre quelques microns et un millimètre, solide et pleine, ayant à
sa
surface une substance adhésive, de préférence le polystyrène, et dans laquelle
des
principes actifs, de préférence au nombre de deux, sont dissous ou dispersés.
Les
principes actifs sont généralement ajoutés selon une quantité prédéfinie,
selon la
technique de marquage de la microsphère qui s'ensuivra. Les microsphères sont
disponibles chez de nombreux fournisseurs et sont choisies parmi 100
microsphères
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disponibles. Le choix des microsphères est déterminé de façon aléatoire car
elles
sont pratiquement toutes identiques ou similaires. De plus, il est à noter
qu'une
personne versée dans l'art saura que la substance adhésive à la surface de la
microsphère peut être d'un autre type de molécule, comme par exemple un
ligand, un
anticorps ou une protéine.
Selon un mode préféré de l'invention, les principes actifs qui sont dissous ou
dispersés dans chacune des microsphères sont des chromophores. Les
chromophores sont généralement des molécules colorées, pouvant faire partie de
la
lo famille des nitrés, des monoazoiques, des diazoiques, des
triphenylméthanes, des
quinoneimines, des xanthènes et des anthraquinones. La liste de ces familles
de
chromophores n'est pas exhaustive. Les principes actifs, de préférence des
chromophores rouge et orange sont mélangés dans la microsphère et excités à
l'aide
d'un laser diode à 635 nM-10mW lors de l'étape de la détection par l'appareil
cytofluorométrique. La couleur qui sera observée lors de l'étape de la
détection et de
la quantification des microsphères est due à un phénomène de résonance entre
une
double liaison chimique et la lumière d'excitation du chromophore choisi.
L'utilisation d'un chromophore pour la détection d'une microsphère n'est pas
l'unique
moyen de marquer ces microsphères. Effectivement, si un appareil de détection
le
permet, un autre type de principe actif pourra être utilisé. Par exemple, une
personne
versée dans l'art reconnaîtra qu'un principe actif de nature radioactive,
magnétique,
thermique ou autre, par exemple, peut être utilisé afin de détecter un produit
PCR/sonde.
Ainsi, encore selon un mode préféré de l'invention, les sondes sont couplées
aux
microsphères choisies. L'étape de l'hybridation des produits du PCR aux sondes
couplées à des microsphères peut ensuite être complétée afin de produire des
complexes comprenant les produits du PCR liées aux sondes couplées à des
microsphères. Après l'hybridation, ces complexes sont récupérés par
centrifugation et
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re-suspendues dans une solution contenant un agent combiné.
De préférence, cet agent combiné comprend deux éléments, un premier et un
deuxième élément. Le premier élément est généralement une protéine, ayant une
forte affinité complémentaire à la molécule terminale se retrouvant sur les
produits du
PCR, et est de préférence la streptavidine. Le deuxième élément est lié au
premier
élément. Le deuxième élément est un autre chromophore de longueur d'onde
distincte des chromophores utilisés comme agents actifs dans la microsphère.
De
préférence, le deuxième élément est la R-phycoérythine (aussi connu sous le
nom
lo d"'Alexa 532" ou "Cy3") qui est excité à une longueur d'onde de 532 nm-13
mW par
un laser yttrium aluminium garnet ("YAG"). Ainsi, lorsque l'agent combiné se
lie au
complexe produit PCR/sonde par le lien d'affinité très puissant entre la
première
partie de l'agent combiné et la modification terminale 5' du produit PCR, il
est
possible d'effectuer la détection et la quantification des complexes afin de
déterminer
la présence ou l'absence d'un produit du PCR, ce qui permet de déterminer la
présence ou l'absence du SARM.
Selon un mode préféré de l'invention, la détection des complexes produit
PCR/sonde
s'effectue dans un appareil permettant la détection simultanée par laser d'un
complexe lié à un agent combiné. Cet appareil est de préférence un
cytofluoromètre.
Ainsi, l'étape de la détection permet d'identifier, de préférence par mesure
de la
fluorescence des chromophores, la présence des microsphères et la présence ou
l'absence du deuxième élément de l'agent combiné. Plus précisément, la
fluorescence des chromophores, ces derniers comprenant, de préférence, les
principes actifs dissous dans la microsphère d'une part et le chromophore
constituant
le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part, signalera la présence des
régions d'ADN ciblées La présence de la première région génique et de la
deuxième
région génique seront ainsi identifiées et la présence du SARM pourra être
déterminée.
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Une personne dans le domaine comprendra que l'étape de détection de la
présente
méthode implique une étape de quantification des complexes, laquelle peut être
calculée, par exemple, par une valeur médiane de la fluorescence des
5 chromophores. Dans le cas où l'invention est réalisée à l'aide d'un
cytofluoromètre de
marque LUMINEXO, la réalisation simultanée, dans une seule réaction, de 100
tests
sur 96 échantillons différents, sera permise, ce qui en fait un calibre idéal
pour les
besoins de dépistage d'un nombre restreint de gènes ou régions géniques. Une
personne versée dans l'art comprendra qu'un autre type d'appareil peut
réaliser le
10 même objectif et que le type d'appareil utilisé dépendra de la nature de la
modification terminale à l'extrémité 5' effectuée sur les amorces et sur le
premier
élément de l'agent combiné.
Selon un mode préféré de l'invention, la quantification des complexes produit
PCR/sonde permet d'établir rapport de la fluorescence entre les complexes qui
ont
comme produit du PCR le produit de l'amplification de la première région
génique et
de la deuxième région génique et ainsi d'identifier a présence du SARM.
L'invention
s'étend à la méthode exécutée dans des plaques de différentes grandeurs et ne
se
limite pas à son exécution sur une plaque de 96 puits.
De préférence, ce ratio permet, à son tour, d'établir un rapport qui traduira
la
présence ou l'absence du SARM.
EXEMPLE 1: MÉTHODE DE DÉPISTAGE DU SARM A L'AIDE DE SONDES
COUPLÉES A DES MICROSPHERES
MATÉRIELS ET MÉTHODES:
1. Extraction de l'ADN bactérien à partir de spécimens nasaux
a. Transférer les écouvillons dans 1.0 mL d'une solution saline stérile
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Pour un contrôle optionnel, inoculer une gélose MSA4.
b. Transférer la solution saline dans un tube de 1.5 mL
c. Centrifuger à 13000 x g pendant 5 minutes
d. Resuspendre les culots dans 100 uL de tampon de lyse
Triton X-100 1.0%
Tween 20 0.5%
Tris-HCI pH8.0 10 mM
EDTA pH8.0 1 mM
e. Transférer la solution dans un tube de 0.2 mL
f. Incuber à 95 C pendant 10 min
g. Centrifuger à 5800 X g pendant 5 min
h. Garder 80 uL de surnageant
2. Préparation du mastermix pour la réaction d'amplification dans le
thermocycleur:
a. Dégeler les réactifs (tampon, dNTPs, amorces) et conserver à 4 C.
b. Diluer et combiner les amorces (voir Table 2)
c. Calculer le volume requis selon le nombre de réaction à effectuer en
utilisant une valeur de 20 uL (ou de 25uL) par réaction de PCR.
Réactifs volume concentration finale acceptable
Tampon 10X 2.0 uL lx
mM dNTP's 0.2 uL 200 à 250 uM
25 mM MgC12 2.0 uL 2.5 mM
25 20 uM amorces bio 0.8 uL 0.3 à 0.5 uM
10 uM amorces std 0.8 uL 0.1 à 0.3 uM
H20 12.0 uL
Taq polymérase 0.2 uL 0,5-1,0 unité
Total 18.0 uL
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d. Déposer 18 uL de mastermix par puit
e. Ajouter 2 uL d'ADN purifié, mélanger et sceller la plaque
f. Déposer les réactions dans un thermocycleur.
3. Programmation du thermocycleur
Étape T temps standard temps rapide
1. 94 C 10 à 15 min 10 min
2. 94 C 30 sec 10 sec
3. 60 C 40 sec 15 sec
4. 72 C 60 sec 10 sec
5. Répéter 44 fois les étapes 2 à 4
6. 72 C 5 min 5 min
7. 4 C conserver conserver
4. Hybridation
Selon un mode préféré de l'invention, l'hybridation des fragments amplifiés
aux sondes
qui ont été préalablement couplées à une microsphère spécifique sélectionnée
parmi
100 microsphères différentes est effectué. Ces sondes correspondent aux
séquences
listées à la Table 3. L'appareil Luminex possède un laser qui a pour fonction
de
détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100
sphères
disponibles.
a. Choisir les microsphères couplées aux sondes appropriées, et plus
précisément les sondes qui correspondent à une première sous-région
génique et à une deuxième sous-région génique, soient les sondes
OXSAS-1 et MASS-2 respectivement (voir Table 3).
b. Resuspendre les microsphères par vortex pendant 20 secondes et par
sonication pendant 20 secondes
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c. Diluer les microsphères à une concentration de 50 microsphères par uL
de solution TMAC à 1.5X (3M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH8.0, 4 mM
EDTA, pH8.0, 0.1% sarkosyl).
d. Mettre 13 uL de tampon TE par puit.
e. Ajouter 30 uL de la solution diluée de microsphères.
f. Ajouter 2 uL de la réaction de PCR et mélanger à l'aide d'une pipette
multipuits.
g. Sceller la plaque à l'aide d'une scelleuse.
h. Incuber à 95 C pendant 5 min et à 54 C pendant 15 min.
i. Centrifuger la plaque à 3000 x g pendant 5 min à la température
ambiante.
j. Enlever le surnageant par inversion en fouettant à trois reprises.
5. Marquage d'une molécule, la biotine, à un chromophore, la phycoérythrine.
Une fois l'hybridation complétée, les complexes comprenant les microsphères
couplées aux sondes avec les produits PCR, sont récupérés par centrifugation
et re-
suspendues dans une solution contenant une molécule, de préférence la biotine,
liée
à un chromophore, de préférence la phycoérythine. Cette étape de l'invention
se
2 o détaille comme suit:
a. Ajouter 75 uL d'une solution de TMAC 1X contenant de la streptavidine-
phycoérythrine à 4 ug par mL.
b. Resuspendre les culots à l'aide d'une pipette multipuits.
c. Incuber 5 min à la température ambiante dans l'obscurité.
6. Analyse:
a. Préparer le fichier d'exécution de l'appareil LUMINEX en utilisant, par
exemple un volume de 50 uL analysé pendant 45 secondes à la température
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ambiante afin de détecter un minimum de 100 microsphères pour chacune
des sondes utilisées.
b. Déposer la plaque dans l'appareil.
c. Démarrer l'analyse.
L'appareil cytofluorométrique de marque Luminex possède un laser qui a pour
fonction
de détecter les chromophores et donc d'identifier avec précision une des 100
microsphères disponibles. Le plateau d'échantillonnage propre à l'appareil
LuminexO a
été retenu parce qu'il permet simultanément la réalisation dans une seule
réaction de
100 tests sur 96 échantillons différents, ce qui en fait un calibre idéal pour
les besoins
de dépistage. De plus, les coûts d'acquisition de l'appareil et celui des
réactions sont
inférieurs à ceux déjà utilisés. Les conditions expérimentales sont uniques,
rapides et
spécifiques à un coût nettement inférieure à ce qui existe présentement. Cet
appareil
permet donc de mesurer la présence de deux éléments fluorescents
simultanément.
Ainsi, la présence des principes actifs dissous dans la microsphère d'une
part, et le
chromophore constituant le deuxième élément de l'agent combiné d'autre part,
signalera
la présence des régions d'ADN ciblées, correspondant à la séquence d'ADN d'une
partie de la première région génique caractérisant une espèce bactérienne, et
à la
séquence d'ADN d'une partie de la deuxième région génique, soit une partie de
la
séquence d'ADN du transposon mccA.
L'appareil de détection produit donc les données brutes qu'il faut ensuite
analyser. Le
transfert et l'enregistrement des données peuvent se faire dans un fichier de
type Excel.
L'interprétation des résultats et leur validation permettront d'établir la
présence du
SARM.
Ainsi, le ratio de la fluorescence entre les complexes qui ont comme produit
du PCR
le produit de l'amplification de la séquence de la première région génique,
correspondant à une partie de la séquence d'ADN du gène orfX, et les complexes
qui
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ont comme produit PCR le produit de l'amplification de la séquence d'une
partie du
transposon mccA, permet d'établir un ratio selon lequel la présence du SARM
peut
être déterminée.
5 RÉSULTATS:
Table 1: Résultats des mesures d'intensité de fluorescence médiane de
l'Exemple 1
Spécimen Median MFI MFI Diagnostique
Sample orfX mccA orfX mccA SARM
1 1 105 64 + - -
2 2 117 58 + - -
3 3 140 78 + - -
Souche
contrôle ATCC
43300 4 146 284 + + +
Souche
contrôle ATCC
25923 5 139 44 + - -
6 6 193 412 + + +
7 7 122 527 + + +
8 8 142 430 + + +
9 9 217 527 + + +
10 10 184 449 + + +
11 11 181 82 + - -
12 12 199 499 + + +
13 13 293 480 + + +
14 14 254 461 + + +
15 15 254 488 + + +
16 16 24 58 - - -
17 17 17 60 - - -
18 18 30 62 - - -
lo La méthode de l'invention permet donc de mettre au point un test de
détection du
SARM qui est aussi rapide et efficace et ce, à coût nettement inférieur à ce
qui existe
présentement sur le marché.
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Un kit pour permettre le dépistage ou la détection du SARM est aussi envisagé
par
l'invention.
Même si un mode de réalisation préférentiel de la présente invention a été
décrit en
détail ci-dessus et illustré dans les dessins accompagnant la demande, il doit
être
compris que l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation particulier
et que
plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués sans
s'éloigner de la
portée ou l'esprit de la présente invention.
lo TABLE 2. Liste des amorces utilisées dans l'Exemple 1 pour l'amplification
en
multiplexe par PCR
Nom des Séquences (5'--> 3') Modification Fragment
amorces (pbs)
RX5'bio TGGGAATGTCATTTTGCTGA 5' biotine
157
FX3' GCTATCTTCCGAAGGATTG
FMA3'bio AAATGATGCGGGTTGTGTTA 5' biotine
RMA1 GACTGCGGAGGCTAACTATG
218
RMA2 AAACATCGTATGATATTGCAAGG 178
RMA3 CAAATATTATCTCGTAATTTACCTTGT 136
RMA4 CTCTGCTTTATATTATAAAATTACGGC 117
RMA5 CACTTTTTATTCTTCAAAGATTTGAGC 135
CA 02569552 2006-11-23
17
Table 3. Liste des sondes couplées aux microsphères
Nom Séquence Modification Ensemble de
microsphères
OXSAS-1 TCGTCATTGGCGGATCAA 5'Uni-link amino 022
MASS-2 CGCATAATCTTAAATGCTCT 5'Uni-link amino 063
