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COMPLEXES IMMUNOGENES, LEUR PROCEDE DE PREPARATION ET
LEUR UTILISATION DANS DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES
La présente invention concerne un procédé permettant d'améliorer
l'immunogénicité d'un immunogène, antigène ou haptène, par couplage avec un
peptide
support de petite taille. Plus particulièrement, la présente invention
concerne un procédé
de préparation d'un complexe immunogène ainsi que les complexes susceptibles
d'être
obtenus par un tel procédé, et l'utilisation de tels complexes à titre de
médicament pour
augmenter l'immunogénicité d'un immunogène. L'invention comprend notamment un
peptide support couplé avec un peptide issu de la protéine G du Virus
Respiratoire
Syncytial (VRS) et son utilisation à titre vaccinal pour le traitement des
infections
respiratoires liées au VRS.
Le système immunitaire est un réseau de composants de nature humorale et
cellulaire qui interagissent pour permettre à l'hôte de différencier le soi du
non-soi afin
de l'éliminer, ainsi que les agents jugés pathogènes. Pour ce faire, le
système
immunitaire a développé deux mécanismes qui agissent de concert : immunité
innée et
immunité acquise.
Sous le tenne d'immunité innée sont regroupés les barrières physiques (peau,
muqueuse, ...), les cellules (monocytes/macrophages, polynucléaires, cellules
NK, ...)
et les facteurs solubles (complément, cytokines, protéines de la phase aiguë,
...) mis en
jeu ou produits en réponse à une agression. Les réponses de l'immunité innée
sont
rapides mais ne sont ni spécifiques ni mémorisées.
Les médiateurs cellulaires de l'immunité acquise sont les lymphocytes T et B.
Leur interaction permet notamment la production d'immunoglobulines par ces
derniers.
A l'inverse des réponses de l'immunité innée, celles de l'immunité acquise
sont
spécifiques, adaptables et mémorisables. En effet, la pénétration d'un
antigène dans un
organisme neuf instaure une réponse immunitaire dite réponse primaire, au
cours de
laquelle se multiplieront des lymphocytes (T et B) à vie longue, appelés
lymphocytes à
mémoire. Grâce à ces cellules, lors d'une deuxième pénétration du même
antigène, la
réaction immunitaire, dite secondaire, sera plus rapide et plus intense. Pour
qu'une
réponse primaire ait lieu, il faut tout d'abord que l'antigène soit capté et
apprêté par les
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cellules présentant l'antigène, pour être présenté aux lymphocytes T.
Les vaccins ont pour but de protéger l'hôte en empêchant ou limitant
l'invasion
d'agents pathogènes. A l'heure actuelle, tous les vaccins commercialisés
remplissent ce
rôle en suscitant la production d'anticorps.
Lorsque l'antigène vaccinant n'est pas à même de déclencher une réponse
immunitaire ou que celle-ci est trop faible, son association physique à une
protéine, dite
protéine porteuse, possédant des épitopes T capables d'interagir avec les
lymphocytes T
permet d'y suppléer. Les protéines porteuses vaccinales les plus connues sont
les
anatoxines diphtériques et tétaniques.
Parmi ces protéines porteuses, on peut également citer la protéine dénommée
BB , fragment de la protéine G des Streptocoques, capable de lier l'albumine,
fragment correspondant aux résidus 24 à 242 de la séquence SEQ ID N 1. Cette
protéine permet de déclencher une réponse anticorps primaire plus précoce et
plus
intense vis-à-vis de l'antigène vaccinant qui lui est associé (Libon et al.,
Vaccine, 17(5):
406-41,1999). A ce titre, on pourra également se référer à la demande
internationale de
brevet publiée sous le numéro WO 96/14416.
La présente invention a pour but de fournir une alternative aux protéines
porteuses qui permettrait, comme il ressortira de la description ci-après, de
remédier à
l'ensemble des inconvénients liés à l'utilisation d'une telle protéine
porteuse. Plus
particulièrement, la présente invention permet de limiter les effets
secondaires liés à la
présence d'une protéine porteuse de relativement grande taille tout en
permettant
l'obtention de rendements de productions élevés.
Dans un souci de clarté, les avantages de la présente invention seront mis en
évidence en comparaison avec une protéine porteuse de l'état de la technique,
à savoir la
protéine porteuse BB.
De manière tout à fait inattendue, et contrairement aux connaissances
actuelles et
adinises de l'homme de l'art, les inventeurs ont mis en évidence une
alternative à
l'utilisation de protéines porteuses. Plus particulièrement, les inventeurs
ont caractérisé
un procédé d'amélioration de l'immunogénicité d'un immunogène reposant sur
l'identification d'un peptide, appelé ci-après peptide support, de très petite
taille et par
conséquent non immunogène, facilitant leur synthèse et/ou la synthèse des
complexes
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immunogènes-peptide support auxquels ils participent.
Pour ce faire, la présente invention concerne un procédé de préparation d'un
complexe immunogène dans lequel on associe un immunogène, antigène ou haptène,
à
un peptide support pour former ledit complexe immunogène, caractérisé en ce
que ledit
peptide support consiste en un peptide de moins de 10 acides-aminés comprenant
au
moins le fragment peptidique de 3 résidus d'acide aminé de séquence SEQ ID N
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(Met-Glu-Phe).
Par immunogène, il faut comprendre toute substance capable d'entraîner une
réponse immunitaire. A titre d'exemple non limitatif, l'immunogène est de
préférence
une protéine, une glycoprotéine un lipopeptide, ou tout composé immunogène
comprenant dans sa structure un peptide d' au moins 5 acides aminés, de
préférence d' au
moins 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, composé capable d'entraîner une
réponse
immunitaire, notamment capable d'induire la production d'anticorps spécifiques
dirigés
contre ce peptide après son administration chez un mammifère.
Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences
polypeptidiques, peptides et protéines sont interchangeables.
Au regard de ce qui a été décrit plus haut, il faut bien comprendre que
l'expression peptide support est à différencier de l'expression protéine
porteuse. En
effet, une protéine porteuse se caractérise par une taille importante (218
acides aminés
pour la protéine BB) et surtout la présence d'épitopes T capables de se lier
aux
récepteurs T pour l'antigène présents à la surface des lymphocytes T. Le
peptide support
objet de la présente invention diffère d'une protéine porteuse du fait de sa
taille très
réduite (moins de 10 acides aininés) et également du fait qu'il ne présente
pas d'épitopes
T.
Selon un premier aspect avantageux, le procédé objet de la présente invention
permet d'obtenir des coinplexes immunologiques permettant d'améliorer
l'immunogénicité d'un immunogène dont la production est plus aisée ou avec des
rendements de production plus importants. En effet, le complexe comprenant le
peptide
support objet de l'invention étant de bien plus petite taille que des
coinplexes
comprenant des protéines porteuses de l'art antérieur, il est plus facile à
produire par
synthèse peptidique/chimique ou toute autre technique connue de l'homme de
l'art.
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Selon un deuxième aspect avantageux, les complexes immunogènes selon
l'invention objet de l'invention permettent d'éliminer, à tout le moins de
limiter, les
effets indésirables liés à la nature même de la protéine porteuse. Il est
admis de l'homme
de l'art qu'une protéine porteuse, comme BB, de taille relativement importante
a de
fortes chances d'être à la base de réponses immunitaires non souhaitées. Par
exemple, il
a été montré pour l'anatoxine tétanique que la sensibilisation préalable de
l'hôte à cette
protéine porteuse pouvait empêcher le développement d'une réponse anticorps
contre
l'antigène associé à l'anatoxine tétanique lors de la vaccination avec un
conjugué
(Kaliyaperumal et al., Eur. J. Immunol., 25(12) : 3375-80, 1995). Ce phénomène
est
connu sous le terme de suppression épitopique.
Par conséquent, il ressort clairement de la présente description que
l'invention
apporte une alternative avantageuse à l'utilisation de protéines porteuses. En
effet, de
par sa taille réduite, le peptide support n'a aucune, à tout le moins très
peu, de chance
d'être à l'origine d'effets secondaires ou indésirables.
Selon une forme d'exécution préférée de la présente invention, le peptide
support de moins de 10 acides aminés comprend au moins le peptide codé par la
SEQ
ID N 2 et est constitué d'au plus 8 acides aminés, préférentiellement d'au
plus 5 acides
aminés, et encore mieux 4 acides aminés.
Selon encore une forme d'exécution plus préférée, le peptide support de moins
de 10 acides aminés objet de la présente invention consiste en le peptide de
séquence
SEQ ID N 2.
L'association entre ledit peptide support et l'immunogène peut être effectuée
par
toute technique de couplage connue de l'homme de l'art permettant de préserver
l'intégrité ainsi que les propriétés immunogéniques de l'immunogène. Plus
particulièreinent, le procédé objet de l'invention est caractérisé en ce que
ladite
association consiste en un couplage covalent. Par couplage covalent, il faut
comprendre
couplage chimique ou encore fusion protéique par la technique dite de l'ADN
recombinant (protéine de fusion obtenue après traduction d'un acide nucléique
codant
pour la protéine de fusion (complexe immunogène) par une cellule hôte
(eucaryote ou
procaryote) transformée avec ledit acide nucléique.
Ledit peptide support peut être couplé à l'extrémité N-terminale ou C-
terminale
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dudit immunogène lorsque ledit imtnunogène est un peptide. De préférence ledit
peptide
support est couplé à l'extrémité N-terminale dudit immunogène.
Le complexe entre le peptide support et le composé dont on souhaite améliorer
l'immunogénicité peut être produit par les techniques d'ADN recombinant,
notamment
5 par insertion ou fusion dans la molécule d'ADN codant pour le support, de
l'ADN
codant pour l'immunogène.
Selon un autre mode de mise en oeuvre le couplage covalent entre le peptide
support et l'immunogène est réalisé par voie chimique, selon des techniques
connues de
l'homme du métier.
L'invention a également pour objet un procédé selon l'invention dans lequel
ledit complexe immunogène est obtenu par recombinaison génétique (protéine
recombinante) à l'aide d'un acide nucléique résultant de la fusion de (ou de
l'insertion
dans) la molécule d'ADN codant pour le peptide support avec l'ADN codant pour
l'immunogène, le cas échéant avec un promoteur.
Dans ce procédé, il pourra être mis en oeuvre un vecteur contenant un tel
acide
nucléique de fusion, ledit vecteur pouvant avoir notamment pour origine un
vecteur
d'ADN qui provient d'un plasmide, d'un bactériophage, d'un virus et/ou d'un
cosmide,
et l'acide nucléique de fusion codant pour ledit complexe peut être intégrée
dans le
génome d'une cellule hôte pour y être exprimé.
Ainsi le procédé selon l'invention comprend, dans l'un de ses modes de mise en
oeuvre, une étape de production du complexe, par génie génétique, dans une
cellule
hôte.
La cellule hôte peut être de type procaryote et être notamment choisie dans le
groupe coinprenant : E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Staphylococcus et
Streptococcus ;
il peut également s'agir d'une levure.
Selon un autre aspect, la cellule hôte est une cellule eucaryote, telle qu'une
cellule de mammifère ou une cellule d'insecte (type Sf9).
L'acide nucléique de fusion codant pour le complexe immunogène peut
notamment être introduit dans la cellule hôte par l'intermédiaire d'un vecteur
viral.
L'immunogène utilisé provient de préférence de bactéries, de parasites, de
virus
ou d'antigènes associés aux tumeurs, comme les antigènes associés aux
mélanomes ou
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dérivés de la béta hCG.
Le procédé selon l'invention est particulièrement approprié pour un
polypeptide
de surface d'un agent pathogène. Lorsque celui-ci est exprimé sous forme de
protéine de
fusion, par les techniques d'ADN recombinant, la protéine de fusion est
avantageusement exprimée, ancrée et exposée à la surface de la membrane des
cellules
hôtes. On utilise des molécules d'acides nucléiques qui sont capables de
diriger la
synthèse de l'antigène dans la cellule hôte.
Elles comprennent des séquences promoteur, signal de sécrétion liée de façon
fonctionnelle et séquence codant pour une région d'ancrage membranaire, qui
seront
adaptées par l'homme du métier.
L'immunogène peut notamment dériver d'une glycoprotéine de surface du VRS
humain de type A ou B, ou du VRS bovin, notamment choisie parmi les protéines
F et
G.
Des résultats particulièrement avantageux sont obtenus avec des fragments de
la
protéine G du VRS humain, sous-groupes A ou B, ou bovin.
De manière préférée, l'immunogène consiste en un polypeptide codé par une
séquence comprise entre les résidus 130-230 de la séquence peptidique de la
protéine G
du VRS ou par toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite
séquence
peptidique, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence
comprise entre les résidus 130-230 de la séquence peptidique de ladite
protéine G, ou
l'un de ses fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence
d'au
moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production
d'anticorps
spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration chez un
mammifère.
Par pourcentage d'identité ou pourcentage d'homologie (les deux
expressions étant utilisées indifféremment dans la présente description) entre
deux
séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente
invention, on
entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés
identiques
entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement
(alignement
optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre
les deux
séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les
comparaisons de
séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont
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traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir
alignées de
manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par
fenêtre
de comparaison . L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut
être
réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de
Smith et
Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie
locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la
méthode
de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP,
BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de
comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides
aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière
optimale
dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer
peut
comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de
référence pour
un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est
calculé
en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide
ou le
résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce
nombre de
positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de
comparaison et
en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage
d'identité entre ces
deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences
(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and
nucleotide
sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.htm1, les paramètres utilisés étant ceux
donnés
par défaut (en particulier pour les parainètres open gap penaltie : 5, et
extension
gap penaltie : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM
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proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences
à
comparer étant calculé directement par le programme.
Par séquence d'acides aminés présentant au moins 80 %, de préférence 85 %,
90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquence d'acides aminés de référence,
on
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préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines
modifications,
en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide
aminé, une
troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou
plusieurs acide(s)
aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans
lesquelles
les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés
équivalents .
L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide
aminé
susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base
sans
cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps
correspondants. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en
s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils
se
substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique
entre les
différents anticorps susceptibles d'être effectués.
Selon encore une autre forme d'exécution préférée, le procédé selon
l'invention
se caractérise par le fait que l'immunogène est le polypeptide de séquence SEQ
ID N 3,
ou de séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID N 3, de
préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence comprise entre
les
résidus 130-230 de la séquence peptidique de ladite protéine G, ou l'un des
fragments
de la séquence SEQ ID N 3 d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de
préférence
d'au moins 15, 20, 25, 30 ou 50 acides aminés, capable d'induire la production
d'anticorps spécifiques dirigés contre ce fragment après son administration
chez un
mammifère.
D'autres immunogènes adaptés à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention
comprennent un dérivé de la protéine de surface du virus de l'hépatite A, B et
C, une
protéine de surface du virus de la rougeole, une protéine de surface du virus
parainfluenza 3, en particulier une glycoprotéine de surface telle que
hémaglutinine,
neuraminidase HN et la protéine de fusion F.
Selon une autre forme d'exécution, la présente invention concerne un complexe
immunogénique obtenu par la mise en aeuvre du procédé selon l'invention.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un
complexe
immunogène, comprenant un immunogène, un antigène ou un haptène, caractérisé
en ce
que ledit immunogène est associé à un peptide support de moins de 10 acides
aminés
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comprenant au moins le fragment peptidique de 3 résidus d'acide aminé de
séquence
SEQ ID N 2.
De préférence, dans ledit complexe immunogène selon l'invention, ledit peptide
support comprenant au moins le peptide codé par la SEQ ID N 2 est constitué
d'au plus
8 acides aminés, préférentiellement d'au plus 5 acides aminés, et encore
inieux de 4
acides aminés.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit peptide support du complexe
immunogène selon l'invention consiste en le peptide codé par la SEQ ID N 2.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit peptide support du complexe
iinmunogène selon l'invention est caractérisé en ce que ladite association
consiste en un
couplage covalent entre ledit peptide support et ledit immunogène.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon
l'invention est caractérisé en ce que ledit peptide support est couplé à
l'extrémité N- ou
C-terminale dudit immunogène lorsque ledit immunogène est un peptide, de
préférence
N-terminale.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit coinplexe immunogène selon
l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est un antigène issu de
bactéries, de
parasites et/ou de virus.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon
l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est une protéine ou
glycoprotéine de
surface, notamment F ou G, du virus respiratoire syncytial (VRS), ou de
séquence ayant
au moins 80 %d'identité avec la séquence de ladite protéine F ou G, de
préférence 85 %,
90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence de ladite protéine F ou G, ou
l'un de
leurs fragments d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au
moins 15,
20, 25, 30 ou 50 acides asninés, capable d'induire la production d'anticorps
spécifiques
dirigés contre ce fragment après son administration chez un mammifère.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon
l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est la protéine G du VRS
humain de
type A ou B, la protéine G du VRS bovin.
Selon une forme d'exécution préférée, ledit complexe immunogène selon
l'invention est caractérisé en ce que l'immunogène est le polypeptide de
séquence
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comprise entre les résidus 130-230 de la protéine G du VRS, extrémités
comprises, ou
de séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence 130-230,
ou l'un
des fragments d'au moins 10 acides aminés de ladite séquence 130-230 de la
protéine G
du VRS.
5 De préférence l'immunogène dudit complexe immunogène selon l'invention est
le polypeptide de séquence SEQ ID N 3.
Selon encore une autre fonne d'exécution préférée, le complexe selon
l'invention est le complexe MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4, ou un complexe
immunogène analogue dont la séquence présente en position 1 à 3 la séquence
MEF de
10 séquence SEQ ID N 2 suivie :
- soit d'une séquence ayant au moins 80 % d'identité avec la séquence SEQ ID
N 3, de préférence 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec la séquence SEQ
ID
N 3;ou
- soit d'une séquence de l'un des fragments de la séquence SEQ ID N 3.d'au
moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 25, 30 ou
50
acides aminés, capable d'induire la production d'anticorps spécifiques dirigés
contre ce
fragment après son administration chez un mammifère.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un acide nucléique,
de
préférence isolé et/ou purifié, codant pour les complexes immunogènes selon
l'invention, notamment pour le complexe immunogène MEFG2Na de séquence SEQ ID
N 4.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide,
oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes
qui seront
employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un
enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un
fragment
ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non
naturels, et
pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que
des
produits de transcription desdits ADNs.
Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet les complexes
immunogènes selon l'invention ou les acides nucléiques codant pour les
complexes
immunogènes selon l'invention à titre de médicament, notamment le complexe
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immunogène MEFG2Na de séquence SEQ ID N 4 ou l'acide nucléique tel qu'un ADN
ou ARN, codant pour ce complexe MEFG2Na.
Les compositions pharmaceutiques comprenant les complexes immunogènes
selon l'invention ou tels que définis précédemment, ou un acide nucléique, ARN
ou
ADN, codant pour de tels complexes immunogènes, associés avec des excipients
physiologiquement acceptables font également partie de l'invention. Ils sont
particulièrement adaptés à la préparation d'un vaccin.
L'immunisation pourra être obtenue par l'administration dudit polynucléotide
codant pour les complexes immunogènes tels que définis précédemment, seul ou
par
l'intermédiaire d'un vecteur viral comprenant un tel polynucléotide. On peut
également
utiliser une cellule hôte, notamment une bactérie inactivée, transformée avec
un tel
polynucléotide selon l'invention.
La présente invention vise également l'utilisation d'un complexe immunogène
selon l'invention, dans lequel complexe ledit immunogène est une protéine ou
un
peptide dérivé de la protéine G ou F du VRS telle que définie précédemment,
notamment le complexe MEFG2Na ou l'un de ses analogues selon l'invention, ou
un
acide nucléique selon l'invention codant pour ledit complexe immunogène, pour
la
préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au
traiteinent
des infections respiratoires liées au VRS.
Les avantages de la présente invention seront mis en évidence à la lumière des
exemples et des figures ci-après dans lesquels :
- la figure 1 représente le taux d'IgG anti-RSV-A chez des souris immunisées
avec BBG2Na ou MEFG2Na ;
- la figure 2 représente également, selon une autre présentation, le taux
d'IgG
anti-RSV-A chez des souris immunisées avec BBG2Na ou MEFG2Na après 2
immunisations ;
- la figure 3 représente le taux d'IgG anti-G2Na chez des souris immunisées
avec
BBG2Na ou MEFG2Na ; et
- la figure 4 représente également, selon une autre présentation, le taux
d'IgG
anti-G2Na chez des souris immunisées avec BBG2Na ou MEFG2Na.
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Exemple 1= Comparaison des activités in-vivo induites par l'utilisation de la
protéine porteuse BB ou du peptide support MEF
Des souris BALB/c femelles IOPS âgées de 8 semaines sont infectées par voie
nasale avec du RSV-A souche Long (105 pfu) à J-20. A JO, après confirmation de
la
séroconversion pour le RSV-A, les souris reçoivent une seule injection intra-
musculaire
de 20 g de BBG2Na adsorbé sur Adju-Phos (soit 6 g équivalent G2Na) ou 6 g
de
MEFG2Na adsorbé sur Adju-Phos. Le taux d'IgG anti-RSV-A (antigène viral
purifié) et
d'anti-MEFG2Na est suivi par ELISA.
Les figures 1 et 2 montrent qu'il n'y a pas de différence significative entre
le
1o taux d'IgG anti-RSV-A déclenché par 6 g de MEFG2Na ou 20 g de BBG2Na, et
ceci
en aucun point de la cinétique. II en est de même pour le taux d'IgG anti-G2Na
(figures
3 et 4).
Exemple 2 : Préparation des complexes BBG2Na et MEFG2Na
Préparation de BBG2Na :
La protéine BBG2Na est produite en utilisant Escherichia coli RV308 comme
cellule hôte et un plasmide où la transcription du gène d'intérêt est sous le
contrôle du
promoteur trytophane. L'étape de fermentation est un procédé de type batch
avec un
milieu de culture synthétique semi-défini et du glycérol comme source de
carbone et
d'énergie. Deux étapes de culture sont nécessaires pour préparer l'inoculum
qui est
utilisé pour ensemencer le fermenteur de production. Dans ce fermenteur, les
microorganismes sont cultivés jusqu'à une densité optique à 620 nm de 50, puis
l'expression est induite par addition d'un analogue du tryptophane (IAA). La
culture est
poursuivie jusqu'à ce que la pression partielle d'02 dans le fermenteur
remonte
subitement, ce qui signale l'épuisement de la source de carbone. A ce stade la
densité
cellulaire moyenne est de 40 g de cellules sèches/litre avec un taux
d'expression de
9,5 %, soit une productivité de 3,8 g de BBG2Na/litre de culture. La culture
est refroidie
à+4 C, les micro-organismes sont récupérés par centrifugation et congelés à-
15/-25 C.
L'extraction de BBG2Na nécessite une solubilisation du culot de
microorganismes décongelé avec un tampon contenant de la guanidine, HC1 et du
1,4-
3o dithiothreitol (DTT) pour réduire les ponts disulfures. La renaturation de
la protéine et
l'oxydation des ponts disulfures sont obtenues par dilution de la suspension
dénaturée et
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agitation à température ambiante pendant une nuit dans un réacteur ouvert. La
suspension contenant la protéine renaturée est clarifiée par centrifugation
puis filtrée.
Ensuite, du PEG 6000 est ajouté au filtrat et le précipité qui en résulte est
récupéré par
centrifugation. Le précipité contenant BBG2Na est solubilisé de nouveau dans
un
tampon contenant de l'urée. L'extrait obtenu est filtré sur un support 0,22 m
et
conservé à -15/-25 C.
La purification de BBG2Na à partir de l'extrait décongelé comporte cinq étapes
qui sont : (1) une chromatographie d'échange de cations sur une colonne de SP-
Sepharose fast flow, (2) une chromatographie d'interaction hydrophobe sur une
colonne
de methyl Macroprep, (3) une gel filtration sur une colonne de Superdex S200,
(4) une
chromatographie d'échange d'anions sur une colonne de DEAE-Sepharose et
finalement
(5) une étape de dessalage sur une colonne de Sephadex G25. La solution de
protéine
purifiée est filtrée stérilement et répartie dans des poches stériles et
apyrogènes.
Préparation de MEFG2Na :
La protéine MEFG2Na est produite en utilisant Escherichia coli ICONE 200
comme cellule hôte et un plasmide ou la transcription du gène d'intérêt est
sous le
contrôle du promoteur trytôphane. E. coli ICONE 200 est un mutant de E. coli
RV308
qui a été développé pour améliorer le contrôle de l'expression pendant la
phase de
croissance. L'étape de fermentation est un procédé de type fed-batch avec un
milieu de
culture chiiniquement défini et du glycérol comme source de carbone et
d'énergie. Deux
étapes de culture sont nécessaires pour préparer l'inoculum qui est utilisé
pour
ensemencer le fermenteur de production. Dans ce fermenteur, les
microorganismes sont
cultivés jusqu'à une densité optique à 620 nm de 110, puis l'expression est
induite par
addition d'un analogue du tryptophane (IAA). La culture est poursuivie jusqu'à
ce que
la pression partielle d'02 dans le fermenteur remonte subitement, ce qui
signale
l'épuisement de la source de carbone. A ce stade la densité cellulaire moyenne
est de
56 g de cellules sèches/litre avec un taux d'expression de 5,4 %, soit une
productivité de
3 g de MEFG2Na/litre de culture. La culture est refroidie à+4 C, les micro-
organismes
sont récupérés par centrifugation et congelés à-15/-25 C.
L'extraction de MEFG2Na nécessite une solubilisation du culot de micro-
organismes décongelé avec un tampon contenant de la guanidine, HCI. La
suspension
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contenant la protéine dénaturée est clarifiée par centrifugation puis filtrée.
La guanidine
étant incompatible avec l'étape de purification subséquente une étape de
concentration
dialyse, sur un support d'ultrafiltration en polyéthersulfone avec un seuil de
coupure à
kDa, est mise en place pour effectuer le changement de tampon. L'extrait
obtenu est
5 filtré sur un support 0,22 m et purifié dans la foulée.
La purification de MEFG2Na comporte trois étapes qui sont : (1) une
chromatographie d'échange de cations sur une colonne de Fractogel EMD SE
Hicap, (2)
une gel filtration sur une colonne de Superdex 75 Prep Grade, (3) une
chromatographie
d'échange d'anions sur une colonne de DEAE Sépharose Fast Flow. Le vrac de
protéine
10 purifiée est filtré stérilement et réparti dans des poches stériles et
apyrogènes.
Rendements d'expression :
Les données d'expression de MEFG2Na et de BBG2Na sont regroupées dans le
tableau 1 suivant.
Tableau 1 : Quantité de protéine MEFG2Na et de BBG2Na obtenue exprimée en
Mol/100g de cellules sèches
Mol. de protéine/ 1 00g de cellules sèches
BBG2Na 2,46.10"4
MEFG2Na 4,54.10-4
Il apparaît que le taux d'expression du complexe MEFG2Na est supérieur
d'environ deux fois au taux d'expression du complexe BBG2Na.
Bien que la présente description, ainsi que les exemples, sont basés
uniquement
sur l'antigène G2Na, il faut comprendre que tout immunogène peut également
être
couplé au peptide support objet de la présente invention.
DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
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PLUS D'UN TOME.
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