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WO 2006/024772 PCT/FR2005/002009
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Dispositif de lecture pour lames portant des micro dépôts supports de réaction
biologique
La présente demande concerne un dispositif de lecture de lames portant des
dépôts fluorescents, tels qu'utilisés en sérologie ou en analyse de biologie
moléculaire.
Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, les
logiciels
spécifiques de mise en oeuvre, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou
dispositifs dans
des procédés d'analyse ou de diagnostic.
Arrière Plan de l'Invention
Depuis quelques années, sont apparus des dispositifs de test multiples sur
lames
de microscope, ou plus généralement sur support plan, où une série de dépôts
sont
alignés, qui sont les supports d'une réaction biochimique lors du contact avec
un
échantillon biologique. Après une éventuelle réaction par des révélateurs
fluorescents, on
doit procéder à la lecture du dispositif, c'est-à-dire à la quantification de
la réaction sur
chaque spot.
Les lames peuvent être en verre ou en matière plastique transparente. Le
nombre
de spots sur une lame peut aller de quelques unités à plusieurs milliers. Le
diamètre des
spots est généralement compris entre 50 et 250 microns. Ces dépôts sont
généralement
désignés sous le nom de microarrays, terme américain qui s'est imposé au plan
international.
Selon une première variante, les dépôts sont constitués de séquences d'acides
nucléiques (ADN, acide désoxyribonucléiques) et l'échantillon biologique à
tester
contient un mélange de séquences d'acides nucléiques, par exemple les formes
amplifiées
de ses ARN (acide ribonucléique) messagers appelées ADN complémentaires
(ADNc).
Chaque dépôt hybride l' ADNc qui lui correspond. La réaction d'hybridation
peut être
visualisée et quantifiée par fluorescence, soit que les ADNc soient eux-même
marqués,
soit que l'on marque les zones d'hybridation par un colorant spécifique.
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Dans une seconde variante (telle que par exemple les tests sérologiques),
l'échantillon biologique à tester contient un sérum ou un plasma, et réagit
avec une lame
portant des éléments réactifs, par exemple des protéines, cellules, fractions
sub-
cellulaires, bactéries, virus, etc., déposés au préalable sur la lame. Après
cette première
réaction, la lame est mise en contact avec un réactif révélateur.
Dans tous les cas, on est confronté à une opération de lecture du signal
propre à
chaque dépôt. Ce signal peut être une radioactivité, une réaction colorée
résultant d'une
amplification enzymatique, ou encore un signal de fluorescence. C'est dans ce
dernier cas
que l'on peut atteindre la résolution exigée par la densité de plus en plus
grande des
dépôts.
Tandis que les méthodes de dépôt se perfectionnent et l'utilité des mesures
multiples se confirme, avec plusieurs applications possibles dans le domaine
du
diagnostic, on ne dispose pas de lecteur de fluorescence ayant les
performances requises à
un coût acceptable pour un laboratoire d'analyse médicale. C'est dans cette
dernière
catégorie que se situe la présente invention.
Les appareils disponibles actuellement utilisent un balayage laser pour sonder
la
lame. En général, trois lasers différents sont nécessaires pour obtenir les
différents
signaux issus des spots. Ensuite, l'image est reconstituée sur un écran et
l'opérateur
déplace visuellement une grille de cadrage, en s'efforçant de faire coïncider
les mailles de
la grille avec les images des dépôts. Cette opération est loin d'être
parfaitement
satisfaisante car les dépôts sont irréguliers. De tels appareils sont
évidemment très
coûteux, de l'ordre de 100 000 US $. Ils sont conçus pour la recherche où l'on
traite un
petit nombre de lames portant un très grand nombre de dépôts et ne sont pas
adaptés au
travail de routine d'un laboratoire d'analyse médicale, où l'on traite de
nombreuses lames
portant un nombre limité de dépôts.
Il existe donc un besoin réel de dispositifs d'analyse de microarrays sur
lames
permettant une analyse rapide, fiable et automatisée. Dans le domaine
sérologique, il y a
en particulier un besoin non satisfait de lecteur de lame à accès aléatoire,
qui puisse
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traiter une lame dans des délais courts (typiquement en quelques secondes), et
répondre
au diagnostic d'urgence en matière de maladies infectieuses. La présente
invention
apporte une solution à ces besoins.
Résumé de l'Invention
La présente demande concerne un dispositif de lecture de fluorescence pour
lames
de sérologie ou d'hybridation de biologie moléculaire. Elle concerne également
tout
appareil comprenant un tel dispositif, ainsi que l'utilisation de ces
appareils et/ou
dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic. Dans ce qui suit les
termes
"éclairement" et "éclairage" sont synonymes. Ils font référence à la lumière
excitatrice de
la fluorescence.
L'objet de la présente invention est notamment de fournir un dispositif de
lecture
pour lames de sérologie ou d'hybridation de biologie moléculaire qui évite les
inconvénients mentionnés précédemment, en assurant l'enregistrement et le
traitement
des signaux de fluorescence, de manière fiable et automatique. Une
caractéristique
particulières des dispositifs de l'invention réside notamment dans
l'utilisation de diodes
électroluminescentes pour fournir une lumière excitatrice canalisée, et dans
l'agencement
de la source d'excitation et de l'optique de reprise, donnant une grande
fiabilité à la
lecture et à l'analyse.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans un dispositif de lecture
et/ou
d'analyse de lames comportant une zone réactive portant des micro dépôts
d'éléments
réactifs, ledit dispositif comprenant des moyens de mise en place d'une lame,
des moyens
d'éclairenient de la zone réactive et une optique de reprise, caractérisé en
ce que :
- les moyens d'éclairement de la zone réactive comprennent des diodes
électroluminescentes (LED) agencées en canaux pour permettre un éclairement de
manière oblique par rapport à l'axe optique, c'est-à-dire l'axe selon lequel
la lumière
fluorescente émise par les micro dépôts est captée par l'optique de reprise;
- le dispositif comprend au moins deux canaux de diodes émettant chacun une
lumière d'excitation propre; et
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- l'optique de reprise comporte un objectif formant l'image des micro dépôts
sur
un capteur.
De manière avantageuse,
- l'axe des canaux de diodes est oblique par rapport à l'axe optique avec un
angle
supérieur ou égal à 15 ; et de préférence supérieur ou égal à 20 et/ou ;
- le dispositif comprend au moins deux diodes, chaque diode émettant une
lumière d'éclairement propre ayant une longueur d'onde dans le proche UV ou
dans le
visible, les longueurs d'onde étant sufisamment écartées pour permettre
l'excitation
sélective des molécules fluorescentes; de préférence, les longueurs d'onde
d'excitation
sont écartées d'intervalles égaux ou supérieurs à 100 nm ; et/ou
- la lumière d'éclairement émise par chacune des diodes suit une direction
distincte; et/ou
- le dispositif comprend des éléments homogénéisant l'éclairement de la zone
des
dépôts sur la lame; et/ou
- chaque canal comporte successivement au moins une diode, une optique de
collimation, un filtre destiné à restreindre le spectre de la lumière
excitatrice émise par
cette diode et, éventuellement, un dispositif optique destiné à uniformiser la
répartion
spatiale de la lumière et/ou un condenseur orientant la lumière vers la zone
réactive de la
lame; et/ou
- l'optique de reprise comporte un premier objectif dont un foyer coïncide
avec la
zone réactive de la lame, un porte filtres, de préférence un carousel de
filtres, et un
deuxième objectif formant l'image; et/ou
- le dispositif comporte en outre une embase solide et/ou une console,
assurant le
maintien ensemble des moyens de mise en place de lame, des moyens
d'éclairement de la
zone réactive et de l'optique de reprise.
Dans un mode particulier de l'invention, trois diodes sont regroupées dans le
même canal, au voisinage de l'axe optique.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés de l'invention:
- Le dispositif est commandé ou exploité par un logiciel dédié, typiquement
qui
corrige le signal pour toutes les causes de perturbations : aléas de dépôt,
irrégularités
d'éclairement et variations dans la qualité des réactifs fluorescents. De
préférence, le
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logiciel est capable d'effectuer des comparaisons des niveaux de fluorescence
d'un même
dépôt à différentes longueurs d'onde et de dépôts différents à la même
longueur d'onde.
De préférence, le logiciel utilise des images pré-enregistrées de surfaces
uniformes,
fluorescentes ou simplement diffusantes, pour calculer une correction fine de
la
5 fluorescence des dépôts aux différentes longueurs d'onde ; et/ou
- le dispositif comporte trois canaux de lumière excitatrice dont les
longueurs
d'onde sont suffisament écartées pour permettre l'excitation sélective de
colorants
différents ; de préférence, il comprend trois canaux de lumière excitatrice,
l'un centré
autour de 365 nm, le deuxième autour de 470 nm, le troisième autour de 594 nm.
D'autres
combinaisons de longueur d'onde sont possibles, depuis le proche UV jusqu'à
l'infrarouge ; et/ou
- le dispositif d'uniformisation de la lumière excitatrice est un guide
optique de
diamètre adapté pour permettre des reflexions multiples de la lumière, ou
encore un
dispositif de type Kôhler. De préférence, le dispositif homogénéisant
l'éclairement est de
type Kôhler. Par ailleurs, l'homogénéisation peut être améliorée en ajoutant
un difFuseur,
par exemple de type holographique; et/ou
- Lorsque le support est une lame de microscope, ou tout autre support à faces
parallèles, la lumière excitatrice atteint l'échantillon à travers la lame;
et/ou
- L' objectif de l'optique de reprise côté capteur présente une distance
focale égale
ou inférieure à celle de l'objectif côté objet, réalisant un grandissement
inférieur ou
supérieur à 1, en fonction du capteur utilisé; et/ou
- Le carousel à filtres est motorisé et couplé au changement de la longueur
d'onde
d'excitation; et/ou
- l'optique de reprise forme l'image des dépôts sur un capteur matriciel, par
exemple de type CDD ("Charge Coupled Device") ; et/ou
- le dispositif comporte un lecteur d'identifiant de lames; et/ou
- le dispositif comporte un dispositif d'alimentation automatique en lames.
Ces caractéristiques sont particulièrement avantageuses et permettent la
lecture
des éléments réactifs de manière fiable et automatique, conduisant à des
résultats
reproductibles.
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Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'analyse sérologique
comprenant l'incubation d'une lame de sérologie comprenant une zone réactive
comportant une série de dépôts d'agents biologiques, par exemple infectieux,
pathogènes,
allergènes ou autoantigènes, avec un échantillon de sérum d'un patient, ou une
dilution de
celui-ci, puis la révélation des anticorps (par exemple IgG et/ou IgM) de
l'échantillon
fixés sur les dépôts au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que la
lecture et
l'analyse du marquage (e.g., de la fluorescence) sont réalisées au moyen d'un
dispositif tel
que défini précédemment. De préférence, le procédé d'analyse comporte trois
longueurs
d'onde d'analyse, excitant sélectivement trois colorants: le premier associé
aux dépôts,
préalablement à la réaction sérologique, le second associé au révélateur des
immunoglobulines de type G et le troisième associé au révélateur des
immunoglobulines
de type M. Dans un mode de réalisation préféré, le colorant associé aux dépôt
est
excitable autour de 365 nm, le colorant associé au révélateur des
immunoglobulines de
type G est excitable autour de 470 nm et le colorant associé au révélateur des
immunoglobulines de type M est excitable autour de 594 nm,
Un autre objet de l'invention sont les fonctionnalités du logiciel qui réalise
l'analyse et qui comprend de préférence :
- les trois prises de vues digitales aux trois longueurs d'onde, correspondant
respectivement à la fluorescence 1 témoin de la quantité déposée, la
fluorescence 2
mesurant les immunoglobulines de type G et la fluorescence 3 mesurant les
immunoglobulines du type M ;et/ou
- La normalisation de la fluorescence par rapport aux aléas du dépôt, à
l'inhomogénéité de l'éclairement et aux variations des réactifs de révélation
; et/ou
- La comparaison du signal par rapport à une échelle de positivité basée sur
des
sérum de contrôle ou basée sur des contrôles internes tels que décrits dans la
demande
FR2,864,624.
L'invention concerne donc un support comprenant un logiciel pour la mise en
oruvre d'un dispositif selon la présente invention, mettant en oeuvre les
formules de
l'exemple 3 ou d'autres formules similaires.
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L'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif tel que défini
précédemment pour l'analyse sérologique ou en biologie moléculaire. De
préférence,
l'analyse en biologie moléculaire comporte l'analyse des acides ribonucléique
ou
desoxyribonucléiques d'un échantillon biologique. Dans ce cas, la lame de
verre porte par
exemple des dépôts d'ADN simple brin, destiné à capter les ADNc fluorescents
provenant de l'échantillon. Par exemple, les longueurs d'onde d'excitations
peuvent être
choisies dans le voisinage de 543 nm pour les marquages endogènes avec la
cyanine 3,
dans le voisinage de 635 nm pour les marquages avec cyanine 5, dans le
voisinage de 488
mn pour les marquages des parties hybridées avec Sybr Green (Molecular
Probes,
Eugene, Oregon). La liste n'est pas limitative.
Un autre aspect de l'invention concerne des kits, notamment d'analyse
biologique,
comprenant l'utilisation d'un dispositif tel que défini précédemment.
L'invention est applicable dans de nombreux domaines, notamment pour l'analyse
histologique ou sérologique dans un contexte médical, vétérinaire,
environnemental,
agro-alimentaire, etc.
Description détaillée de l'invention
Comme indiqué précédemment, l'invention porte sur un dispositif adapté à
l'analyse de lames. Les principaux éléments constitutifs sont présentés sur la
figure 1. Le
dispositif comporte avantageusement une embase solide (1) portant une plaque
(2) ayant
pour but de maintenir le positionnement des différents éléments les uns par
rapport aux
autres.
Chaque diode électroluminescente (3) est enfermée dans un étui (4) contenant
le
dispositif d'homogénéisation, l'ensemble constituant un canal d'éclairage
emboîté dans
un support (5) sur lequel est fixé la chambre porte lame (6). Au delà de celle-
ci est vissé
le premier objectif (7) qui est lui-même emboîté dans un manchon solidaire de
l'étui du
carousel à filtres (8). Symétriquement, au delà du carousel, on trouve le
deuxième
objectif (9) vissé sur la caméra CCD (10). L'allumage des diodes par le
boîtier (11), le
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positionnement du porte-filtre et la mise en route de la caméra sont pilotés
par un micro-
ordinateur, qui par ailleurs contient le logiciel d'interpétation selon
l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, l'axe optique de l'optique de reprise est
horizontal.
Les diodes électroluminescentes possédent de préférence une puissance
électrique
comprise entre 500 et 5000 mW. Devant les diodes, on place un jeu de lentilles
convergentes afin de donne au faisceau lumineux un parallélisme approxiinatif.
Une
divergence de moins de 10 degrés est préferée. Puis on place un filtre propre
à restreindre
la fenêtre spectrale de la lumière excitatrice. Une valeur préférée de la
fenêtre est un
intervalle égal ou inférieur à 40 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, les longueurs d'onde excitatrices sont
écartées les unes des autres, l'une dans le proche UV, une seconde dans le
bleu, une
troisième dans le jaune, l'orangé ou le rouge. Une valeur préférée de l'écart
entre les
longueurs d'onde excitatrices est un intervalle égal ou supérieur à 100 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif d'homogénéisation est
constitué
par une surface diffusante à l'entrée d'un guide optique mélangeur constitué
d'un tube de
matière transparente à fort indice de réfraction d'une longueur comprise entre
20 et 40
mm de préférence, et d'un diamètre compris entre 6 et 10 mm de préférence.
Dans ce cas,
une lentille d'entrée concentre le faisceau avec un angle convenable. (figure
2)
Dans un autre autre mode de réalisation préféré, le dispositif
d'homogénéisation
est constitué par une surface diffusante, placée au foyer d'une lentille de
collimation dont
on forme l'image sur l'objet (montage dit de Kôhler) (figure 3).
Dans un mode de réalisation préféré, le diffuseur est de type holographique, à
très
grand rendement.
Dans un mode de réalisation particulier, la lame à mesurer est enchâssée dans
un
support amovible qui est lui-même glissé dans une fente. Le support est muni
d'une
ouverture au droit de la zone active de la lame. Un dispositif de blocage, tel
qu'une butée
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à bille immobilise le dit support dans la position où sa fenêtre est dans
l'axe de l'optique
de reprise.
Dans un mode de réalisation préferré, la lame à mesurer est directement
introduite
dans le dispositif au travers d'une fente et positionnée par des appuis sur
glissières, et
ressorts sur la face opposée. Dans un mode de réalisation préferré, la lame
est munie d'un
détrompeur, par exemple une échancrure sur un angle, qui prévient une
introduction
erronée.
Les étuis porte diode et le logement de la lame constituent avantageusement un
ensemble rigide qui peut être réalisé à partir de matériaux variés,
éventuellement
mélangés. Il peut en particulier être composé (ou à base de) de matériau
plastique, de
métal et/ou de tout matériau rigide à des températures de 37 C ou plus. Dans
un mode de
mise en aeuvre préféré, le bloc est composé de nylon (delrin, rilsan) noir ou
d'alliage
d'aluminium anodisé ou peint pour éviter les reflets.
Dans un mode de réalisation préferré, le logement de la lame, ou le porte lame
amovible sont réalisés en métal pour éviter toute déformation préjudiciable au
maintien
de la mise au point.
Dans un mode de réalisation préferré, les objectifs ont une distance focale
comprise entre 20 et 40 mm. Dans un autre mode de réalisation préferré,
l'objectif côté
caméra a une distance focale inférieure à celle de l'objectif côté objet.
Ainsi, une
réduction est opérée qui augmente la capacité de capter en une seule image un
nombre
plus élevés de dépôts. La matrice photoélectrique a de préférence un nombre de
pixels
supérieur à 10 000.
Le capteur CCD peut être celui d'un appareil de photographie numérique tels
que
CoolPix de Nicon, ou de maniére préférée sur une Caméra telle que Hamamatsu
5885, Q-Imaging Qicam, Sony SVS, ou de toute autre marque. Il n'est pas
nécessaire de
refroidir le capteur, l'orientation oblique de la lumière excitatrice assure
un excellent
rapport signal/bruit.
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Dans un mode de réalisation possible, l'axe optique est vertical. Dans un mode
de
réalisation préféré, il est horizontal.
5 Dans un mode de mise en oeuvre préféré du dispositif de l'invention, la lame
fait
saillie de la fente de mesure et permet la lecture d'un code à barre ou d'une
étiquette
électronique. Le dispositif selon l'invention comprend donc un lecteur de code
barre ou
une antenne de communication avec l'étiquette électronique. Ainsi, un objet
particulier
de la présente invention concerne des lames munies d'étiquettes électroniques
sur
10 lesquelles les caractéristiques de la lecture et les résultats de la
lecture peuvent être
enregistrées.
Ainsi, un objet particulier de la présente invention concerne l'algorithme de
lecture propre aux lames de sérologie. Trois images sont enregistrées, avec
trois
fluorescences différentes. La première image, qui concerne un marqueur de
fluorescence
systématiquement attaché au dépôt au moment de la fabrication des lames, est
analysée
en termes de clusters , c'est-à-dire d'éléments connexes, qui sont les
dépôts.
L'avantage de procéder ainsi est qu'il n'y a pas à positionner une grille sur
l'image des
dépôts, ce qui serait de toute manière imprécis du fait des distorsions
inévitables de
l'optique. On est également affranchi du jeu dans les glissières du logement
de la lame et
une analyse automatique devient possible. Les deux autres images,
correspondant à deux
autres marqueurs fluorescents, sont associées respectivement aux réponses
immunoglobuline G et immunoglobuline M du patient. Les micro dépôts étant
entachés
d'une grande incertitude quant à leur quantité, c'est un élément de
l'invention d'utiliser
l'un des marqueurs fluorescents comme témoin de la quantité de matière déposée
et
d'utiliser le signal correspondant pour corriger les signaux représentatifs de
la réaction
sérologique. C'est un autre élément de l'invention d'utiliser des images d'une
lame
portant un élément diffusant ou fluorescent pour mesurer les différences
locales
d'éclairement et ensuite utiliser ces résultats pour corriger la fluorescence
des dépôts pour
les irrégularités de l'éclairement. C'est un autre élément de l'invention que
de rapporter
la fluorescence associée aux anticorps d'un sujet s'étant fixé sur un dépôt
d'antigène, à
celle d'un dépôt de référence d'imunoglobulines pure, respectivement de type G
ou de
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type M, rendu fluorescent par le même révélateur fluorescent anti IgG et anti
IgM
respectivement. Cela se comprendra mieux dans l'exemple 3.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif de l'invention comporte en
outre
un moyen pour assurer un déplacement de la lame perpendiculairement à l'axe
optique
pour pouvoir ainsi réaliser des images de différentes zones de la lame et
aussi pouvoir
mesurer un nombre accru de dépôts. Selon ce mode, jusqu'à 40 000 dépôts
seraient
lisibles, ce nombre étant un ordre de grandeur, et pouvant être dépassé selon
les
techniques de dépôts et le nombre de pixels du capteur.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un dispositif d'alimentation
automatique en lames comportant un magasin à lames, un dispositif de lecture
de
l'identifiant et une mécanique de transfert à travers le dispositif de
lecture.
Les dispositifs selon l'invention sont adaptés à tout type de lame de
microscope.
Dans ce contexte, au sens de la présente demande, on entend par "lame" tout
élément
rigide porte-objet pouvant être utilisé pour immobiliser un dépôt biologique,
délimitant
ainsi une zone réactive. Il peut s'agir par exemple d'une lamelle solide,
d'une membrane,
d'un filtre rendu transparent, etc. La lame peut être réalisée en (ou à base
de) tout
matériau connu et conventionnel, comme du plastique, verre, nylon, des
polymères
biologiques, de la silice, etc. Des lames préférées sont des lames porte-objet
de
microscopie en verre. Leurs dimensions sont généralement standard, soit
environ 26rnm x
76mm. Dans un mode de réalisation préféré, les lames sont munies d'un
détrompeur, par
exemple sous la forme d'une encoche dans un coin.
D'une manière particulièrement avantageuse, dans le dispositif de l'invention,
la
lame (ou les microarrays) utilisée pour le diagnostic ne comprend pas plus de
400 dépôts,
par exemple, ce qui permet d'en former l'image de fluorescence en une seule
prise de
vue. Comme indiqué ci-dessus, la mise en place de la lame peut s'effectuer
soit par un
support, soit en glissant la lame dans une fente. Cette fente ménagée dans un
materiau
noir, est munie de lamages évitant de déteriorer les dépôts lors d'une
introduction, même
erronée.
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Différents mode de réalisation et d'utilisation de l'invention sont décrits
dans les
exeinples et dans les figures annexées, dans lesquelles:
La Figure 1 est un schéma général d'un dispositif conforme à l'invention.
La Figure 2 est un schéma d'un canal d'éclairage à diode de type à guide
mélangeur.
La figure 3 est un schéma d'un canal d'éclairage à diode avec un éclairage de
type
Kôhler.
La Figure 4 représente un écran de contrôle de la séquence d'acquisition.
La Figure 5 représente la feuille de résultats correspondant à la figure 4.
Les
fluorescences des témoins IgG et IgM sont arbitrairement normalisées à 10 000.
Comrne illustré sur les figures, l'invention peut être mise en oeuvre pour
l'analyse
de lames de sérologie. Dans le mode sérologique, la lame porte une série de
dépôts
biologiques ("spots"), par exemple d'agents infectieux, pathogènes,
d'autoantigènes ou
d'allergènes. Les dépôts sont soigneusement repérés, ce repérage constituant
un code
d'identification. L'échantillon liquide à tester est un sérum de patient,
généralement dilué
dans un tampon approprié. Le traitement de la lame peut être effectué par des
moyens
manuels, consistant en trempage dans des bains successifs, ou par des moyens
automatiques tels que décrits dans la demande de brevet FR0403365.
L'invention peut également être mise en ceuvre pour l'analyse de biologie
moléculaire, soit en mode fluorescence, comme précédemment décrit, soit en
mode
densité optique. Dans ce dernier cas, les lames portent un support de nylon
sur lequel sont
déposés les spots, l'éclairage est diffusé par le nylon et les spots absorbent
la lumière. Ils
sont détectés et quantifiés comme taches sombres sur fond clair.
D'autres aspects et avantages de le présente invention apparaîtront à la
lecture des
exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
Exemple 1 - Description d'un dispositif selon l'invention
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Ce mode de mise en aeuvre est décrit en relation avec la Figure n 1.
Les diodes électroluminescentes sont :
Nichia-NCCUO41 ou NCCU0033 pour l'excitation UV, associée au filtre
Semrock FF 409-Ex02 ;
Lumileds LXHL -MB 1 D pour l'excitation à 470 nm, associée au filtre
Semrock FF 506-Ex03 A ;
Lumileds LXHL -ML1D pour l'excitation à 594 nm, associée au filtre
Chroma Technologies HQ590/40.
Le dispositif d'homogénéisation est du type à guide de lumière.
Le porte lame est réalisé en Delrin noir.
L'optique de reprise comprend :
- un objectif Fujinon f--25 mm réglé à l'infini ;
- trois filtres : Semrock FF 409-Em02-B, Semrock FF 506-Em02-B et Chroma
HQ655/40 montés dans un porte filtre linéaire en aluminium anodisé noir ;
- un objectif Fujinon f--25mm réglé à l'infini.
L'image est projetée sur le capteur d'une caméra SVS Vistek SV084 S
comportant 658x494 pixels.
L'ensemble est piloté par un micro-ordinateur portant un logiciel de pilotage,
de
lecture et d'analyse selon l'invention.
Exemple 2 - Description d'une analyse selon l'invention
Une lame de sérologie porte 12 dépôts, arrangés en 3 lignes et 4 colonnes au
pas
de 0,5 mm. Les deux premiers dépôts de la première ligne sont des témoins
d'imunoglobulines IgG et IgM respectivement. Les autres dépôts sont des agents
infectieux.
Avant toute incubation, tous les dépôts fluorescent dans le bleu, sous
excitation
360-380 nm. La lame est d'abord incubée trente minutes avec le sérum du
patient.
Ensuite, après un rinçage, la lame est incubée dix minutes avec les réactifs
anticorps
secondaires qui sont un anticorps de chèvre anti immunoglobuline G humaine
marquée à
la fluorescéine, et un anticorps de chèvre anti immunoglobuline M humaine
marquée au
CA 02576779 2007-01-24
WO 2006/024772 PCT/FR2005/002009
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Texas red, en mélange. Les dépôts ayant fixé des IgG ont une fluorescence
verte excitable
à 470 nm et les dépôts contenant des IgM ont une fluorescence rouge excitable
à 594.
Seule l'image excitée à 365 nm est présentée (figure 4).
Exemple 3 -Traitement du signal selon l'invention
L'algorithme vise à corriger la fluorescence des spots : des aléas des dépôts,
des
irrégularités d'éclairement, et des réactifs.
Notation
Si : surface du spot i;
l'indice i varie de 1 à n, nombre des spots ;
la valeur i=g est associée au spot témoin IgG, la valeur i=m est associée au
spot
témoin IgM.
Fij : fluorescence du spot i à la longueur d'onde j, fond déjà soustrait,
j= 1 éclairage UV (référence)
j = 2 éclairage 470
j = 3 éclairage 594
Eij éclairement de la surface S; à la longueur d'onde j
z;2 et Zi3 sont appelés fluorescences relatives. Elles sont utilisées pour
quantifier
les teneurs de l'échantillon en anticorps IgG et IgM respectivment,
spécifiques de
l'antigène i.
R Ei1F E
z;2 = F2E Fg' gZ pour les taux d' IgG (j = 2)
il i2 g2Eg1
F.E=F E
zi3 = ~3EI~F 1m3 pourlestauxd'IgM(j=3)
i1 i3 m3Eml
Les fluorescences relatives, par exemple 42, ont bien les propriétés
attendues. En effet :
- Toutes choses égales par ailleurs, taille des spots, éclairement, réactifs
fluorescents , la fluorescence relative Zi2 est proportionnelle au signal
spécifique Fi2 qui
représente l'intensité de la réaction sérologique, ou de la réaction
d'hybridation.
CA 02576779 2007-01-24
WO 2006/024772 PCT/FR2005/002009
- Les surfaces ne figurent pas dans l'expression de Zi2, elle ne dépend donc
pas du
plus ou moins grand étalement du dépôt sur la lame.
- Elle ne dépend pas de la quantité du dépôt, qui fait varier dans le même
rapport
5 Fiz et Fil par exemple, au numérateur et au dénominateur.
- Elle ne dépend pas de l'intensité de l'éclairement dans la zone du dépôt,
qui fait
varier dans le même rapport F;2 et Ei2 car la fluorescence d'une surface est
proportionnelle
à son éclairement.
- Elle ne dépend pas de la qualité du réactif qui fait varier dans le même
rapport
F;a et Fg2.
On peut utiliser les formules simplifiées suivantes, dans la mesure où la
densité du
marquage UV est constante, ce sont les fluorescences normalisées Fn2(i),
Fn3(i) :
FnZ (i) = F12Eg2 pour les IgG
E;2Fg2
Fn3 (i) = Fi3Em3 pour les IgM
Ei3Fm3
qui jouissent des mêmes propriétés d'invariance.
La même analyse prévaut pour la fluorescence relative zi3. Les résultats
correspondant à l' exemple 3 sont présentés dans la figure 5.
