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Protection d'ingrédients alimentaires bioactifs par
encapsulation
La présente invention se rapporte à un produit alimentaire contenant un
ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient
alimentaire bioactif d'intérêt, dans lequel le ou lesdits microorganismes
vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont mis
en oruvre de manière à réduire la métabolisation du ou desdits
ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes.
Le marché des ingrédients alimentaires, en particulier des peptides,
bioactifs ou fonctionnels (i.e., ayant une activité bénéfique pour le
consommateur soit localement dans le tube digestif, soit à distance dans
l'organisme, après être passés dans le système circulatoire) est, depuis
quelques années, en plein essor.
Les peptides bioactifs sont des séquences définies d'acides aminés qui
sont inactives au sein de leur protéine d'origine, mais qui présentent des
propriétés particulières une fois libérées par action enzymatique. On les
appelle aussi peptides fonctionnels. Ces peptides bioactifs sont capables
d'exercer, entre autres, un effet sur le système digestif, les défenses de
l'organisme (par exemple, un effet antimicrobien ou immunomodulateur),
le système cardiovasculaire (notamment un effet antithrombotique ou
antihypertenseur), et/ou le système nerveux (tel qu'un effet sédatif et
analgésique de type opioide) (voir tableaux 1 et 2 ci-après).
Le tableau 1 ci-après liste les principaux peptides fonctionnels libérés par
l'hydrolyse des protéines du lait humain et du lait de vache.
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Tableau 1
Protéines Peptides Origine du
originelles fonctionnels* lait** Activités décrites
caséine a a casomorphine V activité opiacée
caséine
a exorphine V activité opiacée
casokinine V activité antih pertensive
caséine R R casomorphine H V activité opiacée
activité immunomodulatrice +
casokinine H V activité antihypertensive
CPP H V action sur les minéraux
caséine K CMP=GMP V modulation de la motricité
gastrointestinale et de la
libération d'hormones
digestives
casoxine H V antagoniste opiacé
casoplatellines activité antithrombotique
a lactalbumine fragments 50-53 H V activité opiacée
activité opiacée + activité
lactoglobuline lactorphines V antihypertensive
lactoferrine lactoferroxine V antagoniste opiacé
lactoransferrine H
(*) les séquences des acides aminés ne sont pas
exactement les mêmes
(**) H: lait humain / V: lait de vache
Le tableau 2 ci-après recense les principales activités physiologiques des
peptides fonctionnels issus du lait connus à ce jour.
Tableau 2
~r- -- -T ~__ __ _ - - -T- - ----
Activités Peptides In vitro In vivo anïmai In vivo homme Réf.
_ - a -_ -- -J o
- - - -' - _
Caséinomacropeptide production de CCK par
(CMP) cellule intestinale de rat Beucher 1994
- - - --------- --------- - --- ----- -------------------------------------- --
-------- ------- -------- - ----- -------- -------------- ---------------- ----
-----
Veau: après ingestion de CMP
(210 mg/kg), inhibition de la Homme: après ingestion de
sécrétion gastrique et diminution CMP (4g), diminution de la Yvon 1994
de la concentration plasmatique sécrétion acide
en CKK
Lapin après introduction dans
lumen: effet antisecrétoire sur Ben Mansour
(3 casomorphines l'iléon 1988 ~
------.-..-..---------- ------- --- ------ - ----- -- --- ----------- ---------
------- -- ---- -- ------ ------- ----- ---------- - - ------ ----------------
Chien: après administration N
intragastrique, modulation de Schusdziarra
Effet sur la l'insulinémie post-prandiale; 1983
digestion annulation de cet effet par la
naloxone
0
(3 casomorphines Plusieurs effets au niveau Tomé 1987,
naturelles et certains de de l'iléon de lapin 1988 - Mahé
leurs analogues 1989
Analogues de R Stimulation de l'absorption Ben Mansour
casomorphines non intestinale d'électrolytes 1988
métabolisés
Chien: administration 10g
caséine/300mL eau par sonde
intragastrique: inhibition de la
Caséine Defilippi 1995
motilité du gréle, annulée par la
naloxone.vs. 10g de protéine de
soja: pas d'effet
0
i apieau 2 (suite)
Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Ref.
Lactoferricine - ~C
Inhibition de la croissance Tomita 1994 - 0
Casocidine I(caséine a. des souches pathogènes Zucht 1995
SI) -165-203
Effet Fragment caséine a S1B Inhibition de la croissance Souris, Mouton:
efficace en
antimicrobien (1-23 N terminal) = injection IM contre Lahov 1996
des souches pathogènes
isracidine Staphylococcus aureus
Souris: effet protecteur en Migliore-
Fragment caséine (3 injection IV contre K. Samour 1989
humaine pneumoniae
Fragments de a Prolifération des
lactalbumine bovine et de lymphocytes humains (PBL) Kayser 1996
caséine K bovine activités par Con A
(3 casokinine 10 et (3 Prolifération ou suppression
casomorphine 7 de des PBL suivant Kayser 1996
synthèse concentration ~
Stimulation de la OD
phagocytose des globules
Caséine R humaine 54-59 rouges de mouton par les Parker 1984
Effet immuno a lactalbumine 51-53
macrophages péritonéaux ô
modulateur de souris CD
Stimulation des
macrophages périonéaux de ~
Caséine 0 bovine la souris Pas de protection in vivo Migliore- 1O
Samour 1988
Caséine 191-193
Caséine 63-68
Caséine x bovine Inhibition de la prolifération
des lymphocytes B des Otani 1992,
Caseino-macropeptides plaques de Peyer chez 1995
106 169 souris et lapin
0
Tableau 2 (suite)
Activités Pept O
ides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf.
Caséinoglycopeptide CGP isolé dans le plasma
bovin (bCGP) de nouveaux-nés après Chabance
Caséinoglycopeptide ingestion de lait infantile 1995
humain (hCGP) ou lait de mère
Peptide 106-116 de Inhibition de l'agrégation Jollès 1986
Effet caséine x bovine plaquettaire
antithrombotique Tétrapeptide de Inhibition de l'agrégation
lactotransferrine humaine plaquettaire Raha 1988
(39-42)
------------------ ------------------------ ---- --------- --------------------
----
Rat et cobaye avec thrombose
artérielle expérimentale: après Drouet 1990 c~
injection IV, activité >
antithrombotique
Hydrolysats enzymatiques CD
de P lactoglobuline et d'a Inhibition de l'ACE Mullaly 1997 N
lactalbumine
Rats recevant de l'angiotensine I: Kohmura
Fragments synthétiques Inhibition de l'ACE après injection IV, retour au
niveau 1989
de caséine humaine initial de pression artérielle
Rats hypertendus: ingestion de 10 ~
Peptides de lait fermenté mL lait fermenté / kg poids ~
par L. helveticus et S. corporel, on retrouve les peptides Masuda 1996
cerevisiae dans l'aorte avec inhibition de
Effet l'ACE
antihypertenseur Peptides issus de lair Rats hypertendus: après ingestion,
Yamamoto
fermenté par L. helveticus diminution de la pression artérielle 1994
Peptides issus de la
fermentation de lait par L. Rats hypertendus: après ingestion, Nakamura
helveticus + S. cerevisiae diminution de la pression artérielle 1995
Val-Pro-Pro (VPP) / II-Pro- Rats normaux: pas d'effet
Pro (IPP)
----------- ------------- -- ------ ---- -- ----- --------- --------------.-.-
..---------- ----- ----- -------- -- ---------- ---------- -------- - ------- -
-----
Homme hypertendu (36
sujets): après 8 semaines
d'ingestion de 95 mL/j, Hata 1996
diminution de la pression
artérielle
Tableau 2 (suite)
Activités Peptides In vitro In vivo animal In vivo homme Réf.
- __ -_ _ -- _ _ __-- -_._ _ - - - ~_ - -- -I
Rats: après injection intra-
accumulation de Ermisch 1983
casomorphines dans la zone sans
a casomorphines barrière hématoencéphalique
---- ---- -- - - -- ----- - ------- -- ---- -- - ------ -- -------------------
-
Veaux nouveaux-nés: après leur
premier repas de lait de vache, (3 Umbach 1985
casomorphines dans le san~
--------------------- -------- --------- -- ------- -
Mini-pores: après ingestion de
caséine bovine, 0 casomorphine Meisel 1986
isolée du chyme duodénal
- -- --- - - -------- --- - ------- - -------- ------
Chiots: après ingestion de lait de
mère, existence de (3 Singh 1989 >
Effets opiacés casomor hines dans le san
- -- --------------- ------- - p ----------- ----g N
Homme: après ingestion ô
de lait de vache, présence Svedberg 1985
de (3 casomorphines dans
.lpnintesflnaIgrêle o
mais pas dans le sang Teschemacher
d'adulte 1986
Effet opioïde sur iléon isolé
Peptides de caséine (3 de cobaye annulé par la Yoshikawa 1986
humaine de synthèse naloxone
Effets opiôides antagonistes
Casoxines (caséine x) sur muscle de l'iléon isolé de Chiba 1989
bovine et humaine cobaye
.W.
0
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Ces peptides sont le plus souvent obtenus par hydrolyse de protéines
végétales (par exemple des protéines de soja) ou animales (par
exemple, les caséines ou les protéines sériques du lait), hydrolyse
générée par des procédés enzymatiques et/ou fermentaires, le plus
souvent accompagnée d'une concentration de la fraction active, étape
généralement nécessaire pour apporter le bénéfice santé visé. La
fabrication et l'utilisation de ces peptides pour un bénéfice santé font
l'objet d'une littérature abondante (voir notamment la Danone World
Newsletter N 17 de septembre 1998).
Parmi les vecteurs alimentaires susceptibles d'accueillir de tels
ingrédients, les produits laitiers fermentés figurent en bonne position de
part leur bénéfice santé dû à la présence de ferments et de produits de
fermentation (c'est-à-dire les molécules issues de la transformation, par
les bactéries lactiques, des substrats présents dans le lait). Jusqu'à
présent, la communauté scientifique prenait surtout en compte les
propriétés des ferments. Les chercheurs commencent depuis peu à
s'intéresser aux produits de fermentation, parmi lesquels certains
peptides occupent une place particulière, car ce sont des messagers
biologiques nombreux et spécifiques. Les produits laitiers fermentés
paraissent donc particulièrement appropriés comme vecteurs
d'hydrolysats de peptides bioactifs obtenus, par exemple, à partir de
substrats laitiers comme les caséines ou les protéines sériques.
Un problème majeur se pose alors : les microorganismes et, en
particulier, les bactéries lactiques utilisées dans la fabrication des
produits laitiers frais (type yoghourts, spécialités laitières fermentées,
boissons fermentées à base de lait, etc...), sont généralement capables
de consommer les peptides pour satisfaire leurs besoins nutritionnels et,
plus particulièrement leurs besoins en azote. On parlera à cet effet dans
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ce qui suit de métabolisation des peptides . Les bactéries lactiques
sont en effet dotées de plusieurs systèmes de dégradation et/ou transport
leur permettant de métaboliser les peptides, les faisant alors disparaître
du milieu :
1/ un système protéolytique (protéases de paroi PRT) qui découpe
protéines et gros peptides pour faciliter leur assimilation ( système de
métabolisation extracellulaire ),
2/ des systèmes de transport vers l'intérieur de la cellule, dont l'un est
spécifique des oligo-peptides d'une taille proche de 10 acides aminés,
l'autre étant adapté au transport de di- et tri-peptides (les lactobacilles
possèdent un système supplémentaire de perméases à tri-peptides)
( système(s) de transport vers l'intérieur de la cellule ), et
3/ un système enzymatique intracellulaire capable de dégrader les
peptides en acides aminés (comprenant une quinzaine d'endo- et
exopeptidases) ( système de métabolisation intracellulaire ).
Etant donné que la quantité de peptides naturellement présents dans le
lait est généralement trop faible par rapport aux besoins des bactéries
lactiques, il est commun d'accélérer leur croissance en fournissant un
supplément de peptides. Ceux-ci sont alors totalement consommés
pendant la fermentation.
En définitive, du fait : (i) du besoin en azote des bactéries lactiques, dont
les peptides constituent la principale source dans le lait, (ii) de la
capacité
de ces bactéries à consommer efficacement les peptides, et (iii) de la
survie d'une population importante de bactéries lactiques dans les
produits fermentés à base de lait, jusqu'à la date limite de
consommation (DLC), la mise en ceuvre d'ingrédients à base de
peptides fonctionnels dans les produits laitiers fermentés est difficile,
voire impossible, car ces ingrédients sont le plus souvent
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consommés par les bactéries lactiques, pendant la fermentation, voire
pendant le stockage des produits jusqu'à DLC.
En outre, non seulement ce problème de dégradation par
métabolisation intempestive des peptides par les bactéries n'est
pas spécifique à un peptide donné, mais il n'est pas non plus
spécifique à un ferment (ou microorganisme, de préférence bactérie,
capable de fermenter) particulier.
Il s'agit là d'un problème général, qui se pose quels que soient le ou
les peptides et le ou les microorganismes considérés.
On citera, à titre d'exemple, le cas du peptide bioactif aS1 [91-100] (voir le
brevet européen EP 0 714 910 ; peptide aux propriétés relaxantes
contenu dans l'hydrolysat de protéines de lait commercialisé notamment
par la société Ingredia : 51-53, Avenue Fernand Lobbedez BP 946 62033
ARRAS Cedex, France, sous le nom Lactium ). La Demanderesse a
ainsi observé que la population de bactéries lactiques vivantes dans le
produit fini continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage
du produit fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais
dont la DLC est de 28 jours), entre 35 et 55% environ du peptide aS1
[91-100] ont disparu, ce qui est tout à fait inacceptable pour garantir un
effet santé chez le consommateur (données non montrées).
Puisque la consommation du peptide bioactif est le fait de l'activité
métabolique des ferments, on pourrait envisager de réduire ce
phénomène en détruisant tout ou partie des microorganismes, par
exemple à l'aide d'un traitement thermique approprié (thermisation ou
pasteurisation). En ce cas, il est possible de préserver le peptide aS1
[91-100] (par exemple après chauffage à 75 C pendant environ 1 min).
Toutefois, une telle solution présente de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage
de stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines,
amidons, carraghénanes, etc...), ce qui complique le procédé et
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augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande
un investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits
5 contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les
bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ; et
- l'impact organoleptique, généralement négatif, est significatif.
Il existe dès lors un besoin pour un produit alimentaire contenant à la fois
10 des microorganismes vivants, par exemple un yoghourt, et un ou plusieurs
ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt, dans lequel ces ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt seraient protégés contre la métabolisation
par lesdits microorganismes vivants, et ce, tout en préservant les qualités
organoleptiques du produit alimentaire.
Par la présente invention, la Demanderesse apporte une solution qui
permet de satisfaire le besoin existant.
La présente invention s'intéresse donc à un produit alimentaire contenant
un ou plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient
alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits
microorganismes vivants et le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs
d'intérêt sont mis en oeuvre de manière à réduire la métabolisation du ou
desdits ingrédients bioactifs par le ou lesdits microorganismes vivants.
Ainsi, la Demanderesse a pu montrer qu'un ou plusieurs ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt pouvaient être efficacement protégés contre
la métabolisation par des microorganismes vivants, dès lors que les
conditions de mise en ceuvre des uns avec les autres sont appropriées.
De telles conditions de mise en oeuvre appropriées peuvent faire appel à
divers moyens, parmi lesquels :
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a) l'utilisation de microorganismes vivants dont la capacité à
métaboliser les ingrédients bioactifs est réduite ; et/ou
b) l'utilisation d'ingrédients alimentaires leurres qui sont
délibérément livrés en pâture aux microorganismes vivants
et/ou
c) la mise en ceuvre d'une protection physique des ingrédients
bioactifs, notamment par encapsulation de ces derniers.
On notera à cet égard qu'un ou plusieurs de, voire tous, ces moyens
peuvent être avantageusement combinés au sein d'un même produit
alimentaire.
La Demanderesse propose donc un produit alimentaire contenant un ou
plusieurs microorganismes vivants et au moins un ingrédient alimentaire
bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le ou lesdits ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt sont protégés :
- physiquement, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt
étant de préférence encapsulés ; et/ou
- au moyen d'au moins un ingrédient alimentaire leurre contenu dans ledit
produit alimentaire,
de sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants
est réduite.
Plus précisément, un objet de la présente invention concerne un produit
alimentaire contenant un ou plusieurs microorganismes vivants et au
moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt, caractérisé en ce que le
ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont
protégés physiquement par encapsulation dans une matière grasse, de
sorte que leur métabolisation par le ou lesdits microorganismes vivants est
réduite.
Comme indiqué brièvement dans la description générale qui précède, par
métabolisé ou métabolisation , on entend désigner selon la
présente invention la transformation ou dégradation d'une substance par
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un ou plusieurs microorganismes vivants, visant à sa consommation à titre
de source de nutriments, et ayant pour conséquence finale sa disparition,
plus ou moins complète, du milieu.
Au sens de l'invention, la métabolisation d'un ingrédient est réduite si
elle est inférieure à la métabolisation du même ingrédient lorsque ce
dernier n'est pas protégé par au moins l'un des moyens prévus dans le
cadre de la présente invention.
Avantageusement, et idéalement, cette métabolisation réduite tend vers,
voire vaut, zéro, ce qui revient à peu, quasiment pas, voire pas, de
métabolisation dudit ingrédient.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, la
quantité résiduelle d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans
ledit produit alimentaire est, 3 semaines après sa préparation, comprise
entre 50 et 100 % environ par rapport à la quantité d'ingrédient(s)
alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présente dans le produit juste après sa
préparation.
Préférentiellement, ladite quantité résiduelle est comprise entre 80 et
100% environ.
Par quantité résiduelle en ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s)
d'intérêt
dans ledit produit alimentaire , on entend désigner selon la présente
invention le pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt
présent dans ledit produit alimentaire lorsque ce dernier est maintenu
dans des conditions de stockage adaptées (par exemple, de l'ordre de 4 à
10 C pour un produit frais) pendant 3 semaines, par rapport au
pourcentage d'ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt présent au
départ, c'est-à-dire juste après fabrication du produit.
Lors de la mise en ceuvre de la présente invention, on choisira le ou
lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt notamment parmi
- des protéines,
- des peptides,
- des vitamines,
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- des micronutriments,
- des analogues ou dérivés de ceux-ci, et
- leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt sera choisi
parmi:
- des protéines,
- des peptides,
- des analogues ou dérivés de ceux-ci, et
- leurs combinaisons.
Préférentiellement, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt est choisi
parmi : le peptide aS1 [91-100] (voir le brevet européen EP 0 714 910), le
peptide C6-as1194-199 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide
C7-R177-183 (voir le brevet américain US 6 514 941), le peptide C12-
as123-34 (voir le brevet US américain 6514941), les
caséinophosphopeptides, l'a-casomorphine, la caséine a exorphine, la
casokinine, la [3-casomorphine, les CaséinoMacroPeptides (CMP) aussi
appelés GlycoMacroPeptides (GMP) ou CaséinoGlycoMacroPeptides
(CGMP), la casoxine, les casoplatellines, les fragments 50-53, les [3-
lactorphines, la lactoferroxine, les peptides Val-Pro-Pro (voir le brevet
européen EP 0 583 074), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-GIn (voir la demande
EP 0 737 690), Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu (voir la demande EP 0 737 690),
Tyr-Pro (voir la demande EP 1 302 207 et le brevet EP 0 821 968), Ile-
Pro-Pro (voir Nakamura et al., 1995 ; et brevet japonais JP 6 197 786),
des fragments, analogues, dérivés de ceux-ci, des protéines et/ou
peptides les contenant, et leurs combinaisons (pour une revue, voir
notamment la Danone World Newsletter N 17 de septembre 1998).
De manière encore plus préférée, l'ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt
est choisi parmi : le peptide aS1 [91-100], des fragments, analogues,
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dérivés de celui-ci, des protéines et/ou peptides les contenant, et leurs
combinaisons.
On entend par analogue , n'importe quelle version modifiée d'un
composé initial, ici une protéine ou un peptide, ladite version modifiée
pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs
atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des
hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés
ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un
nouveau composé moléculaire.
Un dérivé au sens de l'invention est n'importe quel composé qui
présente une ressemblance ou un motif structurel en commun avec un
composé de référence (protéine ou peptide). Entrent également dans
cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres
composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires
dans la synthèse d'un composé de référence, moyennant une ou plusieurs
réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés
à partir dudit composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via
une ou plusieurs réactions chimiques.
Sont ainsi couverts par la définition de dérivés ci-dessus au moins les
hydrolysats, notamment trypsiques, de protéines et/ou peptides, les
fractions d'hydrolysats, ainsi que les mélanges d'hydrolysats et/ou de
fractions d'hydrolysats.
De plus, les termes analogue et dérivé d'un peptide ou d'une
protéine susmentionnés couvrent par exemple un peptide ou une
protéine glycosylé(e) ou phosphorylé(e) ou encore ayant subi n'importe
quel greffage de groupement chimique.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, l'ingrédient
alimentaire bioactif d'intérêt pourra notamment être un sucre ou un acide
gras.
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Dans le cadre de la présente invention, seul(s) le ou lesdits ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt est (sont) encapsulé(s) les
microorganismes vivants ne le sont pas.
Par encapsulé ou encapsulation , on entend désigner selon la
5 présente invention la mise en oeuvre d'un procédé de protection d'un
principe actif dans un véhicule de type microparticule afin de permettre un
relarguarge contrôlé de ce principe actif. En l'espèce, le principe actif est
constitué par un ou plusieurs ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
De manière fort avantageuse, l'encapsulation permet de remédier aux
10 inconvénients des solutions de l'état de la technique, en ce qu'elle
prévient la métabolisation des ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt
par les microorganismes vivants.
En outre, l'encapsulation permet aux ingrédients alimentaires bioactifs
d'intérêt de parvenir jusqu'au niveau de l'intestin, sans être dégradés, et
15 de traverser la barrière intestinale sans dommages afin d'y produire leurs
effets.
De plus, la Demanderesse fait observer que l'encapsulation de
substances est tout à fait originale s'agissant de produits alimentaires
fermentés, en particulier de produits laitiers fermentés.
Enfin, on soulignera que, de manière tout à fait intéressante,
l'encapsulation permet d'obtenir un produit final organoleptiquement plus
acceptable, par exemple en masquant l'amertume plus ou moins forte de
certains ingrédients bioactifs, en particulier de certains peptides.
C'est pourquoi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la
présente invention concerne un produit alimentaire comme décrit
précédemment, dont l'amertume est réduite.
Au sens de l'invention, l'amertume d'un aliment est réduite si un
aliment est considéré comme moins amer à l'issue d'un test par paire
(Directional Paired Comparison Method, Sensory Evaluation of Food,
Harry T. Lawless, Hildegarde Heymann (1990)). Ce test peut être réalisé
sur un panel (à partir de 10 personnes) réunissant différentes personnes
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ayant bien intégré ce qu'est la notion d'amertume (un apprentissage de
cette notion est réalisé par la dégustation de produits contenant une
molécule amère (e.g., caféine), ces produits étant rendus plus ou moins
amers suivant la concentration de ladite molécule). Le produit conforme à
la présente invention est alors soumis en aveugle (les membres du panel
ne savent pas quel produit leur est présenté en premier) aux personnes
constituant le panel, et celles-ci le comparent avec un produit non
conforme à l'invention. Bien entendu, les deux produits présentés au
panel ne diffèrent que en ce que l'un a été réalisé conformément à
l'invention, et pas l'autre. L'ordre de présentation des deux produits d'une
personne du panel à une autre obéit aux lois du hasard, le nombre de
personnes recevant en premier le produit réalisé suivant l'invention étant
égal au nombre de personnes recevant l'autre produit en premier. Chaque
personne doit indiquer, pour chaque répétition du test, quel est le produit
le plus amer parmi les deux produits goûtés.
Dans le cadre de l'invention, le ou lesdits ingrédients alimentaires bioactifs
d'intérêt sont encapsulés dans une matière grasse.
L'encapsulation dans une matière grasse peut notamment être réalisée
par dispersion des ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt dans
une phase grasse, où il(s) est (sont) finalement encapsuié(s), (i.e. ,
emprisonné(s), retenu(s)) dans de très fines gouttelettes lipidiques.
On notera que, par différence avec les procédés de dispersion connus et
utilisés notamment dans d'autres domaines techniques tels que la
cosmétologie, la mise en oeuvre d'une telle dispersion ne requiert aucune
étape de séchage ultérieure.
Conformément à l'acception usuelle, par matière grasse ou corps
gras , on entend désigner n'importe quelle substance contenant un ou
plusieurs lipides. Il peut s'agir, par exemple, d'une huile, d'une graisse,
d'un beurre, etc... Cette matière grasse peut être naturelle, existant alors
sous des formes diverses chez les animaux, les végétaux, et dans leurs
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produits (c'est-à-dire dans les produits issus de leur métabolisme), ou
synthétique.
Un critère de sélection de la matière grasse utilisable dans le cadre de la
présente invention est lié à sa température de fusion. En effet, afin de
réaliser une dispersion comme il est envisagé supra, il convient d'utiliser
une matière grasse concrète, c'est-à-dire solide à température ambiante.
Parmi les huiles appropriées, on peut notamment citer l'huile de palme et
ses fractions, l'huile de noix de coco et ses fractions, l'huile de palmiste
et
ses fractions, les huiles de beurre végétaux type cacao, les margarines,
les huiles végétales hydrogénées, ou partiellement hydrogénées, et
analogues.
Le choix de la matière grasse concrète se fera en tenant également
compte de ses qualités nutritionnelles. A cet égard, on préférera, par
exemple, les matières grasses fractionnées aux matières grasses
hydrogénées ou partiellement hydrogénées.
Si l'on souhaite disperser plus efficacement, voire solubiliser, l'ingrédient
alimentaire bioactif, on mettra de préférence en oeuvre l'encapsulation
au sein d'une émulsion multiple eau/huile/eau. Dans ce cas, l'utilisation
de matières grasses fluides à température ambiante (huiles) peut être
plus appropriée (colza, colza oléique, soja, tournesol, tournesol
oléique, huiles de poissons, huiles d'algues, etc...).
A cet égard, la Demanderesse souligne le fait que, par le choix d'une
matière grasse concrète, on met à profit sa recristallisation après fusion,
ce qui entraîne un emprisonnement et une protection physique de
l'ingrédient alimentaire bioactif.
On pourra notamment choisir une matière grasse appropriée parmi les
matières grasses animales, notamment laitières ou de poissons, et
végétales.
On précisera que les matières grasses extraites de poissons sont
particulièrement intéressantes pour leur teneur élevée en acides gras
polyinsaturés Oméga 3.
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Parmi les matières grasses végétales appropriées, on choisira en
particulier l'huile de palme, l'huile de colza et/ou une matière grasse
extraite d'une algue.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou
lesdits microorganismes vivants ont une capacité intacte ou réduite de
métabolisation du ou desdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt.
Selon la présente invention, une capacité réduite de métabolisation est
telle que la quantité d'ingrédients bioactifs d'intérêt métabolisée pendant la
fermentation (qui disparaît donc du milieu) est inférieure ou égale à 40%
de la quantité d'ingrédients initiale (avant fermentation).
Ceci se traduit mathématiquement par:
Qr0,6Qo(1)
Ou:
Qr : quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle (présente dans le milieu
après fermentation)
Qo : quantité d'ingrédients bioactifs initiale
La quantité d'ingrédients bioactifs résiduelle Qr peut être mesurée par une
méthode de chromatographie liquide CLHP couplée à un détecteur de
type MS/MS. Un exemple de procédure expérimentale est donné dans les
exemples ci-dessous.
Le ou lesdits microorganismes vivants seront de préférence des
bactéries, de préférence encore des bactéries lactiques, vivantes.
On choisira plus particulièrement les bactéries vivantes parmi
o Streptococcus spp, de préférence
Streptococcus thermophilus ;
o Lactobacillus spp ;
o Lactococcus spp ;
o Bifidobacterium spp.
De manière préférée, on choisira les bactéries vivantes parmi :
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- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM (Collection
Nationale de Cultures des Microorganismes (Institut Pasteur,
Paris, France)) le 24/01/02 sous le numéro 1-2774 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 24/10/95
sous le numéro 1-1630 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 10/05/04
sous le numéro 1-3211 ;
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04
sous le numéro 1-3301 ; et
- Streptococcus thermophilus, déposée à la CNCM le 16/09/04
sous le numéro 1-3302 .
De manière encore préférée, lesdites bactéries vivantes sont des
bactéries S. thermophilus déposées à la CNCM le 10/05/04 sous le
numéro 1-3211.
Avantageusement, le produit alimentaire contient au moins les bactéries
vivantes S. thermophilus et Lactobacillus spp.
Préférentiellement, lesdites bactéries vivantes Streptococcus thermophilus
sont choisies parmi S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/01/02 sous
le numéro 1-2774, S. thermophilus déposée à la CNCM le 24/10/95 sous le
numéro 1-1630, S. thermophilus déposée à la CNCM le 10/05/04 sous le
numéro 1-3211, S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous le
numéro 1-3301, et S. thermophilus déposée à la CNCM le 16/09/04 sous
le numéro 1-3302.
La teneur du produit alimentaire selon l'invention en microorganismes
vivants peut varier et sera choisie par l'homme du métier à la lumière de
ses connaissances générales dans le domaine. En pratique, on
recherchera de préférence une teneur globale standard, par exemple de
l'ordre de 10' à 109 bactéries par gramme de produit alimentaire.
Selon un mode particulier de réalisation, un produit alimentaire conforme à
l'invention contient en outre au moins un ingrédient alimentaire leurre.
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Par ingrédient alimentaire leurre , on entend désigner selon la présente
invention un ingrédient alimentaire (de préférence un peptide, une
protéine, un analogue ou un dérivé de ceux-ci, et leurs combinaisons)
capable de servir de source de nutriments (notamment de source d'azote)
5 pour des microorganismes vivants, et destiné à être préférentiellement
métabolisé par lesdits microorganismes, de manière à détourner ces
derniers des ingrédients bioactifs d'intérêt que l'on entend bien entendu
préserver en priorité. Ainsi, l'ingrédient leurre représente une source
nutritive pour les microorganismes, que l'on sacrifie délibérément afin de
10 sauvegarder le plus possible les ingrédients bioactifs d'intérêt.
L'ingrédient
alimentaire leurre agit à cet égard comme un inhibiteur compétitif du
transport des ingrédients bioactifs d'intérêt.
Par produit alimentaire , on entend ici un produit destiné à
l'alimentation animale et/ou humaine, de préférence humaine. Ce produit
15 peut se présenter sous n'importe quelle forme consommable. Ce peut être
une boisson telle que de l'eau, des jus végétaux (de fruits et/ou légumes
et/ou céréales...), du lait, des yoghourts à boire, des mélanges de ceux-ci.
Il peut également s'agir de produits solides ou de produits intermédiaires,
plus ou moins humides.
20 Selon un mode de réalisation particulier, le produit alimentaire conforme à
l'invention est une eau.
Préférentiellement, le produit alimentaire selon la présente invention est
un produit fermenté.
De manière encore préférée, le produit alimentaire fermenté est un produit
laitier ou végétal.
Par produit laitier , on entend désigner selon la présente invention, en
plus du lait, les produits dérivés du lait, tels la crème, la crème glacée, le
beurre, le fromage, le yoghourt ; les produits secondaires, comme le
lactosérum, la caséine ; ainsi que n'importe quel aliment préparé
contenant, comme ingrédient principal, du lait ou des constituants du lait.
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Par produit végétai , on entend désigner, entre autres, des produits
obtenus à partir d'une base végétale telle que, par exemple, les jus de
fruits et les jus végétaux parmi lesquels le jus de soja, le jus d'avoine ou
le
jus de riz.
En outre, les définitions ci-dessus de produit laitier et produit
végétal couvrent chacune n'importe quel produit à base d'un mélange
de produits laitiers et végétaux, tels qu'un mélange de lait et de jus de
fruits, par exemple.
La présente invention a également pour objet un procédé d'encapsulation
d'au moins un ingrédient alimentaire bioactif d'intérêt dans une matière
grasse.
A cet égard, dans la mesure où l'ajout d'un ingrédient alimentaire bioactif
dans une matière grasse concrète fondue entraîne une accélération de la
cinétique de cristallisation de celle-ci, il est important que la matière
grasse soit totalement fondue avant l'ajout de l'ingrédient. Ainsi, l'ajout
progressif et sous agitation d'un ingrédient dans une phase aqueuse
elle-même sous agitation permet à la fois une recristallisation induite et
lente autour de l'ingrédient, et la formation de gouttelettes d'huile de
tailles
adéquates, dont la distribution est homogène. Pour l'introduction de
l'ingrédient alimentaire bioactif dans une masse blanche, de préférence
fermentée, on préférera préparer un milieu aqueux intermédiaire du type
sirop. Ce sirop sera ensuite introduit dans la masse blanche. L'adjonction
de l'ingrédient alimentaire bioactif dans le milieu aqueux doit se faire sous
certaines conditions
(i) il convient d'éviter la recristallisation totale de la matière
grasse avant de mélanger l'ingrédient alimentaire bioactif
et le milieu aqueux, afin d'assurer une addition
progressive et homogène ;
(ii) la température du milieu aqueux doit être proche de la
température de fusion de la matière grasse
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d'encapsulation, de manière à éviter qu'elle recristallise
au contact du milieu aqueux ; et
(iii) afin d'assurer un mélange homogène de l'ingrédient
alimentaire bioactif et du sirop, une agitation forte (par
exemple, à l'aide d'un moteur d'agitation du type
ultraturax) est nécessaire : on obtient ainsi une
"émulsion" blanche ayant la texture d'une crème épaisse ;
de plus, la consistance légère de ce système est facile à
pomper lorsque la température reste de l'ordre de la
température de fusion de la matière grasse
d'encapsulation.
L'utilisation d'un additif alimentaire tel qu'un émulsifiant au cours de
l'encapsulation de l'ingrédient alimentaire bioactif permet d'obtenir une
"population" de globules gras plus homogène. Ainsi, en l'absence
d'émulsifiant, on a pu observer une majorité de gros globules gras (d'un
diamètre d'environ 25 m et plus), et une relativement faible dispersion du
peptide dans le produit. En revanche, en présence d'émulsifiant, la
dispersion est plus élevée et les globules plus petits (d'un diamètre
maximal d'environ 10 m).
Selon la présente invention, le procédé d'encapsulation comprend au
moins:
a) la préparation d'un mélange eau/matière grasse, à maintenir à une
température proche de la température de fusion de ladite matière grasse,
de préférence comprise dans un intervalle de 10 C autour de ladite
température de fusion ;
b) l'incorporation progressive et sous agitation, de préférence douce, de
l'ingrédient bioactif d'intérêt dans le mélange obtenu à l'étape a), en
maintenant l'ensemble à une température proche de la température de
fusion de ladite matière grasse, et de préférence comprise dans un
intervalle de 1 0 C autour de ladite température de fusion ; et
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c) facultativement, l'ajout d'un ou plusieurs additifs alimentaires tels que
des émulsifiants, des épaississants, etc..., et le mélange, de préférence
fort, de l'ensemble, tout en maintenant une température proche de la
température de fusion de ladite matière grasse, et de préférence comprise
dans un intervalle de 10 C autour de ladite température de fusion.
La température de mise en oeuvre des étapes a), b) et, facultativement, c)
ci-dessus pourra légèrement varier d'une étape à l'autre, tout en restant
de préférence comprise. dans l'intervalle de 10 C autour de la
température de fusion de la matière grasse. En pratique, la température
de mise en ceuvre de l'ensemble de ces étapes sera avantageusement
sensiblement la même.
L'homme du métier pourra, si nécessaire, adapter ce procédé en fonction
de la matière grasse qu'il utilisera, à l'aide de ses connaissances
générales et, le cas échéant, en mettant en oeuvre des expériences
simples de routine.
Ensuite, aux fins de la préparation d'un produit alimentaire conforme à
l'invention, tel qu'un produit laitier, le mélange ainsi obtenu, maintenu à
une température proche de la température de fusion de la matière grasse,
est incorporé, de manière tout à fait classique, dans une masse blanche,
notamment grâce à des systèmes de pompes et, de préférence, après les
étapes de traitement thermique et de fermentation de celle-ci.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation
d'un produit alimentaire tel que décrit supra, dans lequel un ou plusieurs
ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt sont encapsulés, par exemple
conformément au procédé décrit ci-dessus, avant d'être ajoutés au
mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
Selon, un mode particulier de réalisation de la présente invention, le ou
lesdits ingrédients alimentaires bioactifs d'intérêt encapsulés sont ajoutés
audit mélange sous agitation.
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Lorsque le produit alimentaire est fermenté, le ou lesdits ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt encapsulés peuvent être ajoutés au
mélange avant ou après fermentation.
On préférera cependant ajouter les ingrédients bioactifs encapsulés après
fermentation afin de préserver le plus possible l'intégrité des particules de
matière grasse vis-à-vis des étapes de traitement thermique éventuelles.
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation conforme à la
présente invention est tel que le ou lesdits microorganisme(s) vivants et le
ou lesdit(s) ingrédient(s) alimentaire(s) bioactif(s) d'intérêt encapsulés
sont
ajoutés les uns après les autres dans le mélange destiné à constituer ledit
produit alimentaire.
Alternativement, les microorganismes vivants et les ingrédients
alimentaires bioactifs d'intérêt encapsuiés sont ajoutés simultanément
dans le mélange destiné à constituer ledit produit alimentaire.
Les conditions de culture des microorganismes dépendent desdits
microorganismes et sont connues de l'homme du métier. A titre
d'exemple, on précisera que les températures optimales de croissance
pour S. thermophilus se situent généralement entre 36 et 42 C environ ;
elles se situent entre 42 et 46 C environ pour L. delbrueckii spp.
bulgaricus (que l'on trouve typiquement dans les yoghourts).
En règle générale, l'arrêt de la fermentation, qui dépend du pH que l'on
souhaite atteindre, est obtenu par refroidissement rapide, ce qui permet
de ralentir l'activité métabolique des microorganismes.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit
alimentaire tel que décrit supra comme aliment fonctionnel.
Par aliment fonctionnel , on entend désigner un produit alimentaire qui
affecte avantageusement une ou plusieurs fonctions cibles de l'organisme,
indépendamment de ses effets nutritionnels. Il peut ainsi en résulter une
amélioration de l'état de santé et/ou du bien-être et/ou une réduction des
risques d'apparition de maladies chez un consommateur qui ingère des
quantités normales dudit produit. A titre d'exemples d'activités d'un
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aliment fonctionnel , on citera notamment des activités anti-
cancéreuses, immunostimulatrices, promotrices de la santé osseuse, anti-
stress, opiacées, anti-hypertension, amélioratrices de la biodisponibilité du
calcium, ou encore anti-microbiennes (Functional Food Science in Europe,
5 1998).
De tels aliments fonctionnels peuvent être destinés à l'homme et/ou aux
animaux.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une matière
grasse pour encapsuler au moins un ingrédient alimentaire bioactif
10 d'intérêt destiné à être incorporé dans un produit alimentaire contenant un
ou plusieurs microorganismes vivants.
La présente invention est illustrée, sans être limitée, par les figures
suivantes :
15 Figure 1: Chromatogramme LC-MS illustrant la disparition du peptide
bioactif aSl [91-100] inclus dans l'ingrédient Lactium pendant la
fermentation lactique. Le détecteur MS/MS est réglé de façon à ne faire
apparaître que le signal des ions de m/z = 634.5 Da (masse du peptide
aS1 [91-100] doublement chargé) qui présentent, après fragmentation,
20 des ions fils de m/z = 991.5 Da ; 771.5 Da ; 658.3 Da (fragments
caractéristiques du peptide aSl [91-100]).
Figure 2 : Identification et quantification des principaux peptides de
l'ingrédient Lactium par LC-MS/MS avant et après fermentation du
mix laitier par un ferment consistant en un mélange des souches I-
25 2783 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le
24/01/02), I-2835 (déposée à la CNCM le 04/04/02) et le 1-1968 (déposée
à la CNCM le 14/01/98). Après fermentation, ces peptides ne sont plus
retrouvés qu'à l'état de traces et se confondent avec la ligne de base.
? signifie que l'identification de la séquence n'a pas été possible ou
n'est pas certaine ; seule la masse du peptide est alors rapportée.
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Figure 3: Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS)
d'un mix laitier contenant 1.5 g/L d'hydrolysat DMV C12 , avant (1) et
après fermentation (2) jusqu'à pH 4.7 par le ferment lactique Hansen
YC380. La quasi-totalité des peptides de l'hydrolysat, dont le peptide
bioactif C12 (fragment aSl [23-34]), a disparu suite à la métabolisation
par les souches du ferment.
Figure 4 : Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide
bioactif aS1 [91-100] dans un produit fini constitué de 95% de masse
fermentée par le ferment contenant les souches 1-2783, 1-2774, 1-2835 et
1-1968, et de 5% de sirop de sucre aromatisé contenant le peptide aS1
[91-100], pendant le stockage à 10 C. L'expérience a été réalisée à
raison de 4 essais indépendants El, E2, E3 et E4.
Figure 5 : Courbes illustrant l'évolution de la teneur résiduelle en peptide
bioactif aS1 [91-100], ajouté après fermentation dans un produit fermenté
puis thermisé à 75 C pendant 1 minute, et stocké à 10 C jusqu'à la date
limite de consommation (DLC).
Figure re 6 : Illustration de l'évolution de la teneur en ingrédient bioactif
encapsulé au cours du temps (conservation à 4 C).
Figure 7: Profils peptidiques comparés (chromatogrammes LC-MS/MS)
d'un mix laitier contenant 1.5 g/L de Lactium apporté sous forme
d'émulsion dans l'huile de palme conformément à la présente invention,
immédiatement après ajout dans la masse fermentée (1) et après 14 jours
de conservation à 10 C (2).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention
apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre purement
illustratif.
Exemples
Exemple 1: Mise en oruvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt sans
mettre en application l'invention revendiquée
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1.1) Exemple avec le peptide bioactif aS1 [91-100] contenu dans
l'hydrolysat Lactium
La mise en uvre d'ingrédients du type peptide ou protéine, souvent
apportés sous forme de poudres, est plus simple lorsque ceux-ci sont
ajoutés lors de l'étape de préparation du mix laitier (poudrage du lait),
avant le traitement thermique de sanitation (i.e., 95 C, 8 min) et, donc,
avant la fermentation. En ce cas, le risque de métabolisation du peptide
actif est très élevé. C'est, pour l'exemple, le cas lors de l'utilisation d'un
ingrédient fonctionnel comme le Lactium (Ingredia, France) contenant
un peptide bio-actif (fragment 91-100 de la caséine aS1).
Protocole : le milieu a été préparé par hydratation d'une poudre de lait
écrémé à 120 g/L, additionné de 1.5 g/L d'ingrédient Lactium
(correspondant à environ 30 mg/L de peptide bioactif aS1 [91-100]), puis
pasteurisé à 95 C pendant 8 minutes.
Le ferment lactique a été ajouté à un taux de 0.02%, et la fermentation a
été conduite à la température optimale du ferment sélectionné (entre 37 et
42 C), jusqu'à atteindre un pH de 4.70.
L'analyse des peptides résiduels, et notamment celle du peptide bioactif
aS1 [91-100], a été conduite avec une méthode de chromatographie
liquide CLHP couplée à un détecteur de type MS/MS comme décrit ci-
après :
- l'échantillon a été préparé par dilution du milieu fermenté dans un
mélange d'eau, de méthanol et d'acide trifluoroacétique (50/50/0.1%),
dans un rapport de 1 à 6 environ. Le surnageant après centrifugation
constituait l'échantillon représentatif du contenu peptidique du milieu
fermenté.
- Cet échantillon a été injecté dans un système chromatographique
CLHP de type Agilent 1100 (société Agilent Technologies France, 1
rue Galvani 91745 Massy cedex, France), équipé d'une colonne
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adaptée à l'analyse des peptides, de type Waters Symetry (5 m 2.1
x 150 mm, WAT056975, Waters France, 5, Rue Jacques Monod,
78280 Guyancourt) à la température de 40 C, débit de 0.25 ml/min.
Les peptides ont été élués de façon classique avec un gradient
croissant de solvant B (Acétonitrile + 0.100% d'acide formique) dans le
solvant A (Eau + 0.106% acide formique), sur une durée de 40 min à 2
heures en fonction de la résolution souhaitée.
- La détection a été effectuée à l'aide d'un détecteur spécifique de type
MS/MS, par exemple avec un appareil à trappe ionique comme
l'Esquire3000+ (Bruker Daltonique, rue de l'Industrie, 67166
Wissembourg Cedex), réglé soit pour l'analyse globale du contenu
peptidique (mode MS-MS), soit pour la quantification précise et
spécifique d'un peptide à partir de ses fragments caractéristiques. Par
exemple, le peptide aS1 [91-100]) a été isolé à partir de sa masse (ion
doublement chargé de masse 634.5 Da) et quantifié à partir de
l'intensité de ses ions fils caractéristiques après fragmentation (ions de
m/z de 991.5 Da, 771.5 Da et 658.3 Da). De façon encore plus précise,
un étalon interne constitué du méme peptide de synthèse deutéré deux
fois (fragment caractéristique de 993.5 Da) a permis de prendre en
compte et de s'affranchir d'éventuelles interférences liées à la matrice.
Les résultats sont illustrés par la figure 1.
Lors de sa mise en uvre à ce stade (avant fermentation par un ferment
consistant en un mélange des souches 1-2783 (déposée à la CNCM le
24/01/02), 1-2774 (déposée à la CNCM le 24/01/02), 1-2835 (déposée à la
CNCM le 04/04/02) et I-1968 (déposée à la CNCM le 14/01/98), ou un
ferment tel que YC380 (Chr. Hansen SA, Le Moulin d'Aulnay, BP64,
91292 ARPAJON Cedex France), on a mis en évidence que plus de 95%
du peptide bioactif aS1 [91-100] étaient consommés après fermentation.
Ces observations montrent que l'incorporation de peptides bioactifs
conformément à ce qui précède n'est pas applicable telle quelle à
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l'obtention de produits alimentaires, notamment laitiers, supplémentés
avec des quantités de peptides et/ou protéines bioactifs suffisamment
stables dans le temps pour observer l'effet recherché chez le
consommateur.
1. 2) Exemples avec d'autres peptides bioactifs d'intérêt
Les résultats sont illustrés par les figures 2 et 3.
L'ingrédient Lactium contient de nombreux autres peptides, dont
certains présentent potentiellement une activité biologique (comme le
fragment 23-34 de la caséine aS1, que l'on retrouve aussi commercialisé
dans l'ingrédient C12 de la société DMV International). Il est intéressant
de constater que la quasi-totalité des peptides apportés par l'ajout du
Lactium sont largement consommés pendant la fermentation.
Quelle que soit leur origine (provenant des différentes caséines aS1, aS2,
x, (3) et leur taille (de 2 à 3 résidus jusqu'à 12 résidus et plus), tous les
peptides sont globalement consommés pendant le processus de
fermentation.
1.3) Mise en oeuvre du peptide bioactif aS1 [91-100] (Lactium ) avec
d'autres ferments
Afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier aux deux
ferments utilisés dans le paragraphe 1.1) ci-dessus, les principaux
ferments industriels, ainsi que différentes souches pures rentrant dans la
composition de ces ferments, ont été testés sur la base du même test : du
lait reconstitué à partir de poudre de lait, auquel a été ajouté le Lactium
à une dose de 1,5 g/L, a été fermenté dans des conditions standard
(température optimale du ferment entre 37 et 42 C, arrêt de la
fermentation à pH 4.7, 2 répétitions). L'analyse du taux de peptide bioactif
aS1 [91-100] a ensuite été réalisée sur l'échantillon avant et après
fermentation.
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Les résultats obtenus sur les souches pures sont présentés dans le
Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3
Souches pures (S. thermophilus) % de peptide aS1 [91-100] restant
après fermentation
1-1630 (24/10/95) 0,3
1-1477 (22/09/94) 0,3
Souches pures Lactobacillus
1-1632 (24/10/95) 0,2
1-1519 (30/12/94) 0,1
1-1968 (14/01/98) 1,6
1-2809 (19/02/02) 0,4
5
Dans le tableau 3 ci-dessus, qui reflète la consommation du peptide
bioactif aS1 [91-100] par différents ferments et souches industrielles lors
de la fermentation d'un mix laitier contenant 1.5 g/L de Lactium , les
souches pures ont été identifiées par leurs numéro et date de dépôt
10 respectifs auprès de la CNCM (Institut Pasteur, Paris, France).
Le Tableau 3 montre que la totalité des ferments et souches testés
métabolisent de 94 à 100% du peptide bioactif aS1 [91-100] pendant la
fermentation d'un mix laitier standard. La mise en oeuvre de cet ingrédient
est donc impossible dans des conditions classiques pour produire des
15 produits alimentaires, notamment laitiers, contenant des peptides et/ou
protéines bioactifs en quantités suffisamment stables au cours du temps
pour produire un effet chez le consommateur.
En outre, afin de vérifier que ce phénomène n'était pas particulier à
l'ingrédient Lactium , plusieurs combinaisons de ferments et d'autres
20 ingrédients à base de peptides bioactifs ont été étudiées en mettant en
uvre le même test (lait reconstitué + ingrédient à tester à une dose de
1,5 g/L, fermenté dans des conditions standard, arrêt de la fermentation à
pH 4.7, 2 répétitions). Les diverses combinaisons testées sont rapportées
dans le Tableau 4 ci-dessous.
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Tableau 4
Ferments/souches Peptide aSl Autres peptides DMV DMV CPP
pures [91-100] dans Lactium C12
dans
LactiumOO
Mélange de 4 X X X X
souches :
I-2783 (24101102)
1-2774 (24/01/02)
I-2835 (04/04/02)
1-1968 (14/01/98)
I-1630 (24/10/95) X X X
YC380 Hansen X X X X
Les ingrédients C12 et CPP produits par la société DMV International sont
des hydrolysats de protéines de lait contenant des peptides bioactifs
ciblant respectivement le contrôle de l'hypertension et l'assimilation des
minéraux.
Sur l'ensemble des expérimentations, il est apparu que tous les ferments
testés ont une importante capacité de métabolisation des peptides,
quelles que soient leur nature et leur taille.
1.4) Ajout après fermentation
Une alternative logique à la procédure étudiée ci-dessus est d'introduire
l'ingrédient fonctionnel après la fermentation (procédé de type
différentiation retardée ), par exemple avec le sirop permettant
d'aromatiser la masse fermentée. La mise en uvre de la même quantité
d'ingrédient Lactium selon ce protocole conduit aux résultats illustrés
par la figure 4.
Comme le montre la figure 4, même ajouté à froid (4 C) après
fermentation, le peptide actif (apporté par l'équivalent de 1.5 g de
Lactium par kg de produit fini) est rapidement dégradé au cours du
stockage, pour ne laisser que 30 à 40% de la quantité initiale à la date
limite de consommation (DLC).
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Ainsi, la population de bactéries lactiques vivantes dans le produit fini
continue de métaboliser le peptide bioactif pendant le stockage du produit
fini, si bien qu'après seulement 10 jours (pour des produits frais dont la
DLC est de 28 jours), entre 35 et 50% du peptide aS1 [91-100] ont
disparu, ce qui reste inacceptable pour obtenir l'effet recherché chez le
consommateur.
1.5) Traitement thermique du produit laitier fermenté contenant
l'ingrédient bioactif d'intérêt
En ce cas, il est possible d'assurer la stabilité du peptide aSl [91-100]
(Figure 5), mais au détriment de la qualité globale du produit fini. Cette
solution présente en effet de nombreux inconvénients :
- la thermisation d'une masse laitière fermentée implique l'usage de
stabilisants ajoutés avant le traitement thermique (pectines,
amidons, carraghenanes, etc...), ce qui complique le procédé et
augmente sensiblement le coût de la formule ;
- la ligne de fabrication industrielle est plus complexe et demande un
investissement spécifique plus important ;
- le produit ne bénéficie plus d'appellations liées aux produits
contenant des ferments vivants (type yoghourt) et perd de fait les
bénéfices associés à la consommation de ferments lactiques ;
- l'impact organoleptique (généralement négatif) est significatif.
Exemple 2: Mise en aeuvre d'ingrédients bioactifs d'intérêt en
mettant en application l'invention revendiquée
2.1) Etape 1: encapsulation de l'ingrédient alimentaire bioactif
Huile d'encapsulation choisie : huile de palme (point de fusion = 37 C).
Les fournisseurs de ce type d'huile sont nombreux (e.g., Cargill).
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L'huile a été fondue à 50 C pour avoir une absence totale de cristaux, et
le Lactium contenant l'ingrédient alimentaire bioactif aS1 [91-100] a été
progressivement ajouté sous agitation magnétique (maintien à 50 c).
2.2) Etape 2 : fabrication du milieu aqueux du type sirop
Une sorte de sirop a été fabriquée à partir d'eau et du premix huile de
palme/ ingrédient alimentaire bioactif. L'ingrédient alimentaire bioactif a
été progressivement ajouté dans l'eau (30 C) sous agitation à l'ultraturax
(22000t/min), la teneur en palme dans la solution étant arbitrairement fixée
à 30%.
L'émulsion obtenue était facilement pompable à 30 C - 35 C, mais
devenait de plus en plus ferme dès que la température était inférieure à
25 C - 30 C (recristallisation progressive de l'huile de palme). L'utilisation
d'un émulsifiant alimentaire (e.g., Lactem fourni par Danisco) à hauteur
de 0.5% /MG a permis d'obtenir une population de globules gras moins
hétérogène.
2.3) Etape 3: ajout de l'émulsion dans la masse blanche fermentée.
Comme illustré par les figures 6 et 7, la teneur en ingrédient bioactif est
stable au cours du temps, indiquant qu'un ingrédient alimentaire bioactif
peut être efficacement protégé par encapsulation, conformément à la
présente invention.
Ainsi, outre le peptide aSl [91-100] dont la stabilité est montrée par la Fig.
6, d'autres peptides, comme le peptide bioactif aS1 [23-34] (présent dans
l'ingrédient C12 de la société DMV International), sont également bien
protégés (Figure 7). La disparition de peptides autres que ceux d'intérêt
(Fig.7, (1), symbolisés par les flèches) contribue à la diminution de la
charge peptidique globale et, donc, vraisemblablement à la perte
d'amertume du produit fini.
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