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FRACTIONS PEPTIDIQUES FAVORISANT LA CROISSANCE ET LA SYNTHESE
DE PRODUIT(S) D'INTERET EN CULTURE DE CELLULES ET/OU DE TISSUS
La présente invention concerne le domaine de la supplémentation de milieux
de culture de cellules ou de tissus. Plus particulièrement, la présente
invention a pour
objet un milieu de culture cellulaire sans sérum et/ou protein free
comprenant des
fractions peptidiques isolées à partir de graines de colza, notamment de
tourteaux de
colza. L'invention concerne également un procédé de culture cellulaire
comprenant ces
fractions peptidiques ainsi que leur utilisation.
Depuis la connaissance de l'existence des cellules vivantes, les types et
techniques de culture cellulaire n'ont cessé d'augmenter et de se diversifier.
Initialement, les cultures de cellules utilisaient des milieux non définis
comme
du plasma, du sérum ou encore des extraits embryonnaires. Il a fallu attendre
le milieu
des années 1950 pour voir apparaître le premier milieu de culture défini qui
comprenait,
en plus de sels et de glucose, divers acides aminés ainsi que les vitamines
que les
cellules ne pouvaient synthétiser.
Plus récemment, il a été montré que parmi tous les acides aminés apportés, la
L-glutamine joue un rôle essentiel à la fois comme source d'énergie et comme
source de
carbone et d'azote, principalement pour permettre la synthèse de purine et de
pyrimidine. Cependant, un premier inconvénient réside dans le fait que la
glutamine
n'est pas stable sous la forme d'acide aminé libre et va avoir tendance à se
décomposer
en ions ammonium et en acide pyroglutamique. Une solution, basée sur
l'utilisation
d'hydrolysats de céréales, a été apportée à ce problème par la demande de
brevet
WO 96/26266 déposée au nom de QUEST INTERNATIONAL.
De manière générale, les cellules et tissus, et plus particulièrement les
cellules
animales, sont cultivés in vitro dans un milieu nutritionnel, appelé milieu de
base ou
basal, supplémenté avec de 5 à 20 % de sérum, généralement du sérum de veau
foetal ou
FCS (d'après la nomenclature anglo-saxonne Foetal Calf Serum ).
Cependant l'utilisation de tels Sera présente d'autres inconvénients comme i)
l'introduction de protéines animales nécessitant par la suite leur
élimination, ii)
l'introduction potentielle de contaminants comme des champignons, des
bactéries, des
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virus, des prions et iii) une qualité variable et des coûts élevés.
De plus, afin de limiter plus particulièrement les risques d'encéphalopathie
spongiforme bovine (ESB) dans les produits pharmaceutiques, les législations
tant
nationales qu'internationales prévoient l'interdiction d'utiliser des produits
d'origine
animale dans un futur proche.
Parmi ces inconvénients, le risque d'introduction de contaminants reste le
plus
problématique et a poussé à l'utilisation de milieu sans sérum ou SFM (d'après
la
nomenclature anglaise Serum Free Medium ). Néanmoins, certains SFM utilisés
aujourd'hui comprennent encore des peptones et des hydrolysats issus d'animaux
et
donc n'apportent pas entière satisfaction quant aux risques de contaminations
défmis
plus haut.
Quant aux SFM dépourvus de matériel d'origine animale, ils sont généralement
issus de matières premières riches en protéines telles que, par exemple, les
matières
premières céréalières comme le riz (WO 98/15614 ; WO 99/57246) ou le blé. A
titre
d'exemple d'autres matières premières utilisées, on peut également citer le
soja (WO
01/23527 ; WO 00/03000), ou encore le concombre (WO 99/47648). Cependant, de
tels
milieux de culture sont relativement onéreux à obtenir et sont généralement
issus de
matières premières à fort potentiel protéique pouvant être utilisées pour
d'autres
applications comme, par exemple, des applications alimentaires. Il existe donc
un réel
besoin de développer des milieux de culture complètement dépourvus de produits
issus
d'animaux et de faibles coûts ou, à tout le moins, issus d'une matière
première
faiblement valorisée et/ou valorisable.
La présente invention se propose de pallier ce manque de l'art antérieur en
proposant un milieu de culture dépourvu de sérum et obtenu à partir d'une
matière
première végétale à faible teneur protéique initiale.
Plus particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation d'un
extrait
peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture
in vitro
de cellules ou de tissus, sans sérum, ledit extrait étant obtenu par
fractionnements
successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite
matière
première végétale consiste en la graine de colza.
Par milieu sans sérum, il faut comprendre un milieu dépourvu de sérum
d'origine animale tel que le FCS, le FBS (d'après la nomenclature anglo-
saxonne
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Foetal Bovine Serum ) ou tout sérum analogue.
Aujourd'hui, la plupart des produits issus de la culture cellulaire sont les
anticorps monoclonaux, les virus et les protéines recombinantes. D'un point de
vue
industriel, les cellules les plus cultivées aujourd'hui, outre des cellules de
tissus ou de
remplacement des modèles animaux en toxicologie sont les hybridomes, les
cellules
VERO (African green monkey kidney cells), BHK (d'après la nomenclature anglo-
saxonne Baby Hamster Kidney ), CHO (d'après la nomenclature anglo-saxonne
Chinese Hamster Ovary ), NSO, ou encore Spodopterafrugiperda (Sf9) infectées
par
un baculovirus. Les hybridomes sont des cellules productrices d'anticorps
monoclonaux
alors que les cellules VERO et CHO sont généralement utilisées pour la
production de
virus ou bien de protéines recombinantes. Bien entendu cette énumération n'est
aucunement limitative et tout type de cellules peut être concerné par la
présente
invention.
On peut également citer, à titre d'exemples non limitatifs, les tissus
suivants
cartilage, cellules musculaires, peau, cellules osseuses, tendons, cellules
embryonnaires,
organes artificiels.
Une première caractéristique de l'invention repose sur l'utilisation même
d'oléagineux et, tout particulièrement, de la graine de colza. En effet,
contrairement aux
céréales ou autres matières premières utilisées à ce jour, cette graine est
particulièrement riche en lipides et pauvre en protéines. Pour ces raisons,
l'homme de
l'art n'a pas, jusqu'à ce jour, cherché à utiliser la graine de colza pour la
préparation de
milieux de culture car il était admis que, dans ce but, il fallait utiliser
préférentiellement
des matières premières riches en protéines.
De manière tout à fait surprenante, et contrairement aux préjugés de l'art
antérieur, il a été mis en évidence qu'il était possible d'utiliser la graine
de colza pour la
réalisation de milieux de culture sans sérum et/ou protein free . De
manière encore
plus surprenante, il a également été mis en évidence que de tels milieux
comprenant des
extraits peptidiques issus de colza permettaient non seulement d'obtenir une
augmentation significative de la concentration fmale des cellules ou tissus
mis en
culture mais également une augmentation de la vitesse spécifique de production
d'une
ou plusieurs molécules d'intérêt par des cellules en culture.
En outre, il a été également mis en évidence le fait qu'une telle augmentation
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de la concentration finale des cellules ou tissus n'est pas liée uniquement à
un effet
nutritionnel.
Selon un aspect préféré, la présente invention concerne l'utilisation d'un
extrait
tel que décrit plus haut, caractérisée en ce que ledit extrait peptidique
assure une
fonction au niveau de l'augmentation de la concentration cellulaire ou
tissulaire et/ou au
niveau de l'augmentation de la durée de vie des cellules et/ou au niveau de la
vitesse
spécifique de production d'une ou plusieurs molécules d'intérêt, ladite
fonction étant
liée non pas uniquement par la composition élémentaire en acides-aminés mais
par la
composition sous forme peptidique desdits acides-aminés.
Cet effet particulièrement positif a été établi en comparaison de l'effet
provoqué par un milieu de composition élémentaire, c'est-à-dire constitué
d'acides
aminés libres, en tout point identique à la composition de l'extrait
peptidique objet de
l'invention mis à part le fait que, dans l'extrait selon l'invention, les
acides aminés sont
sous forme peptidique. Ce point sera plus clairement établi à la lumière des
exemples ci-
après.
De manière générale, il ressort de l'art antérieur que les milieux de culture
utilisés à ce jour ont été réalisés dans le but d'apporter aux cellules ou
tissus les
nutriments, et surtout les acides aminés, nécessaires comme source d'énergie
et comme
source de carbone et d'azote à la cellule. Ces acides aminés sont généralement
présents
dans les milieux de culture sous forme principalement d'acides aminés libres.
Certains
acides aminés sont présents sous forme de di- ou tri-peptides afin de leur
assurer une
stabilité suffisante dans un milieu liquide (WO 96/26266).
La présente invention montre, de manière tout à fait surprenante, que
l'extrait
peptidique objet de l'invention et obtenu par fractionnements successifs d'une
matière
première issue de graines de colza assure une fonction favorable à la
croissance et au
maintien en vie des cellules ou tissus en culture. En effet, comme il
ressortira plus
clairement des exemples décrits ci-après, il a été montré que, pour des mêmes
quantités
en chaque acide aminé, il est nécessaire que ceux-ci soient sous forme de
peptides pour
qu'une augmentation de la concentration, et plus particulièrement une
augmentation de
la durée de vie des cellules ou tissus et de la vitesse spécifique de
production d'une ou
plusieurs molécules d'intérêt, soit observée. Il semble que l'invention repose
non pas
uniquement sur des quantités en acides aminés libres mais bien sur une
composition en
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peptides, préférentiellement di- tri- tetra- ou penta-peptides, donnée.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, il semble probable que
l'extrait objet de la présente invention joue non pas uniquement un rôle
positif sur la
croissance mais tient également un rôle au niveau de la réduction de
l'induction de
5 l'apoptose.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'un
extrait
peptidique pour la préparation et/ou la supplémentation d'un milieu de culture
in vitro
de cellules ou de tissus, protein free , ledit extrait étant obtenu par
fractionnements
successifs d'une matière première végétale, caractérisée en ce que ladite
matière
première végétale consiste en la graine de colza.
De manière similaire au milieu sans sérum décrit plus haut, l'utilisation de
l'extrait peptidique tel que décrit ci-dessus est caractérisée en ce que ledit
extrait
peptidique assure une fonction au niveau de l'augmentation de la concentration
cellulaire ou tissulaire et/ou au niveau de l'augmentation de la durée de vie
des cellules
et/ou au niveau de la vitesse spécifique de production d'une ou plusieurs
molécules
d'intérêt, ladite fonction étant liée non pas uniquement par la composition
élémentaire
en acides-aminés mais par la composition sous forme peptidique desdits acides-
aminés.
Par l'expression protein free , il faut non pas comprendre un milieu
totalement dépourvu de protéines mais un milieu totalement dépourvu de
protéine
d'origine animale. Cette expression englobe, entre autre, les dénominations
ADCF
(d'après la nomenclature anglo-saxonne Animal Derived Component Free ) ou
encore animal protein free .
En effet, la présence de protéines est généralement nécessaire à la croissance
de cellules ou de tissus. Le point important, comme mentionné plus haut,
réside en
l'absence de protéine d'origine animale. Un tel milieu de culture permet
d'éliminer
encore plus radicalement que les milieux sans sérum tout risque de
contamination par
une molécule, ou partie d'une telle molécule, qui serait d'origine animale.
Selon une forme d'exécution préférée, l'invention vise l'utilisation telle que
décrite plus haut, ladite utilisation étant caractérisée en ce que la matière
première
végétale consiste en du tourteau de colza.
Par tourteau, il faut comprendre le résidu solide obtenu lors du traitement
des
grains et des fruits oléagineux en vue de l'extraction d'huile (Définition du
Petit
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Larousse Illustré, 1989, page 975). Un avantage de la présente invention
réside donc
dans le faible coût de la matière première utilisée. En effet, les tourteaux
constituent,
dans toutes les cultures oléagineuses, les co-produits obtenus et faiblement
valorisés à
ce jour, de l'industrie huilière. La présente invention apporte donc une voie
de
récupération et de valorisation des déchets de l'industrie huilière.
Les extraits peptidiques, objet de la présente invention, sont, de manière
préférée, obtenus par hydrolyse de tourteaux de colza. Un procédé de
fractionnement
permettant d'obtenir de tels extraits a été développé. La figure 1 représente
un
diagramme de type flow sheet d'un procédé préféré. Bien entendu, toute
modification évidente pour l'homme de l'art de ce procédé fait partie de la
présente
invention.
Plus particulièrement, ce procédé comprend six étapes successives
correspondant respectivement à :
Etape 1: Extraction des protéines
Cette étape a pour objectif la production d'un concentrat de protéines de
colza,
afm d'avoir une matière première enrichie en protéines de colza (70-80 % de
matière
protéique par rapport à la matière sèche, contre 30-45 % dans le tourteau de
colza).
Etape 2 : Hydrolyse
Le but de cette étape est d'hydrolyser les protéines afm d'obtenir une
solution
constituée de peptides.
Ici également, le procédé utilisé est classique. L'utilisation de 1'Alcalase
qui
est une préparation enzymatique d'origine microbienne, est par conséquent sans
risque
de transmission d'éléments biologiques d'origine animale (virus pathogènes à
l'encontre de cellules animales, prions, ...). Durée d'hydrolyse : 5 heures, T
= 60 C, pH
= 9, rapport concentration enzyme/concentration substrat = 1/10. Contenu de
l'hydrolysat en acides aminés libres : 4 % massiques.
Etape 3 : Précipitation acide pH 4
Cette étape vise l'élimination des grosses molécules, essentiellement
protéines et peptides de grande taille, présentes dans l'hydrolysat, ce qui
permet de
diminuer le colmatage lors des étapes de filtration ultérieures.
Etape 4: Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 3 kDa
L'objectif de cette étape est la récupération des petits peptides par
l'élimination
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des molécules d'une taille supérieure à 3000 Da (composés phénoliques de type
tannins
et polypeptides). Le procédé utilisé est un procédé membranaire classique pour
enrichir
en peptides de petite taille contenus dans un hydrolysat.
Etape 5: Nanofiltration avec une membrane de seuil de coupure 500 Da
Le but est de diminuer le taux d'acides aminés libres dans la solution de
petits
peptides obtenue après l'étape 4 et dessaler cette même solution afin de
diminuer
l'osmolarité du mélange. Il est utilisé un procédé de dessalage classique. Une
baisse de
80 % de la concentration en sels permet un meilleur fractionnement des
peptides selon
leur charge dans l'étape 5.
Etape 6: Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 1 kDa
Il s'agit ici de fractionner les petits peptides selon leur taille et leur
charge.
Cette étape présente un intérêt particulier en ce sens qu'elle est basée sur
l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration dans le but de fractionner,
selon leur taille
et leur charge, les peptides contenus dans un hydrolysat végétal. Par rapport
au perméat,
le rétentat final, correspondant à l'extrait peptidique selon l'invention, a
une teneur plus
élevée en peptides contenant des acides aminés acides, et plus faible en
peptides
contenant des acides aminés basiques.
Il faut noter que le procédé décrit ci-dessus n'est donné qu'à titre
d'illustration
d'une forme de réalisation mais n'est aucunement limitatif. Toute modification
ou
amélioration de ce dernier doit être considérée comme faisant partie de la
présente
invention.
Afin de mieux caractériser les extraits peptidiques, objet de la présente
invention, plusieurs études et dosages ont été réalisés dont les protocoles et
résultats
détaillés sont présentés plus loin dans les exemples. Néanmoins, il ressort
que l'extrait
peptidique utilisé dans le cadre de l'invention se caractérise en ce qu'il est
constitué
d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %, en masse de matière azotée.
Par l'expression matière azotée , on entend désigner dans la présente
description toute matière constituée d'acides aminés, ces derniers pouvant
être sous
forme libres ou bien associés en peptides ou protéines.
Une telle concentration en matière azotée, à partir d'un oléagineux à faible
teneur protéique, et plus particulièrement du colza, est obtenue grâce au
procédé décrit
plus haut. Cette caractéristique est de grand intérêt en ce sens que la
plupart des extraits
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végétaux de supplémentation pour milieu de culture ont des teneurs en matière
azotée
beaucoup plus faibles. A titre d'exemple, les extraits issus de céréales
décrits dans la
demande de brevet au nom de QUEST INTERNATIONAL (WO 96/26266) présentent
des teneurs en matière azotée, respectivement de 54 % pour les extraits de
soja, 75 %
pour les extraits de blé et 69 % pour les extraits de riz.
La présente invention se distingue donc de l'art antérieur de par la teneur
élevée en matière azotée de l'extrait peptidique utilisé.
En outre, il a également été mis en évidence par les inventeurs que ladite
matière azotée comprend peu d'acides aminés libres mais est principalement
constituée
de très petits peptides. Pour les protocoles et résultats, se reporter aux
exemples plus
loin.
Plus particulièrement, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce
que
ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides
présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
Il est généralement admis que des peptides de moins de 500 Daltons sont sous
forme principalement de di-, tri- tetra- ou penta-peptides. En effet, la masse
molaire
moyenne des acides aminés est d'environ 150 g/mol, avec la plus faible
correspondant à
75,1 g/mol pour la glycine et la plus élevée à 204,2 g/mol pour le
tryptophane.
Selon encore un aspect de l'invention, l'utilisation est caractérisée en ce
que
ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides
présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
Toujours dans un souci de caractérisation de l'extrait peptidique objet de la
présente invention, il a été mis en évidence que celui-ci présente une teneur
élevée en
acides aminés acides.
Plus particulièrement, la présente invention concerne donc l'utilisation telle
que décrite plus haut, caractérisée en ce que ledit extrait comprend entre 20
et 40 %
molaire d'acide aspartique et d'acide glutamique et/ou de leurs amides
respectifs.
Enfm, l'invention se caractérise en ce que ledit extrait peptidique comprend
moins de 1 % en masse de composés phénoliques.
Plus particulièrement, ledit extrait peptidique présente la composition
suivante
en acides aminés totaux :
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acides aminés % molaire
Alanine 2-6
Arginine 5-9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2-6
Leucine 5-9
Lysine 2-6
Méthionine 0-3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3-7
Sérine 5-9
Thréonine 5-9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5-9
Les pourcentages indiqués dans le tableau ci-dessus consistent en des
moyennes dont les modes de mesure sont clairement détaillés dans les exemples.
Diverses concentrations préférées seront également illustrées dans les mêmes
exemples.
Selon une forme d'exécution préférée, l'utilisation selon l'invention est
caractérisée en ce que lesdites cellules consistent en des cellules
eucaryotes,
préférentiellement des cellules animales.
A titre d'exemple non limitatif de cellules eucaryotes préférées, on peut
citer
les cellules utilisées dans l'industrie comme, par exemple, les cellules CHO,
BHK, NSO,
PER C6, VERO, HEK293, etc.
Selon un autre aspect, la présente invention ne se limite pas à l'utilisation
d'un
extrait peptidique tel que décrit plus haut comme élément de supplémentation,
mais elle
concerne également un milieu de culture sans sérum.
Plus particulièrement, la présente invention vise un milieu de culture de
cellules ou de tissus, sans sérum, obtenu par utilisation d'un, ou comprenant
un extrait
peptidique tel que décrit plus haut.
Comme mentionné plus haut, les milieux de culture sont préférentiellement
constitués d'un milieu dit basal sélectionné selon le type de culture
souhaitée auquel
sont additionnés des Sera ou bien des suppléments de type hydrolysats. Le
milieu de
culture objet de la présente invention se différencie de par la nature même de
l'extrait
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ajouté, à savoir un extrait issu d'oléagineux, plus particulièrement de
graines de colza,
tel que décrit plus haut.
Les milieux dits de base utilisés dépendent donc de la nature de la
culture
souhaitée. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer les milieux
suivants : RPMI
5 (Roswell Park Memorial Institute), MEM (Minimum Essential Medium), Iscove's,
IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's medium), Ham's, NCTC, TC 100, Grace, ...
Dans la pratique, les extraits selon l'invention sont utilisés sous forme de
solutions dans lesquelles les concentrations en ces mêmes extraits peptidiques
peuvent
varier selon le type de culture souhaitée. A titre d'exemple non limitatif,
dans le cas de
10 culture de cellules de type CHO (d'après la nomenclature anglo-saxonne
Chinese
Hamster Ovary ) les concentrations préférées sont de l'ordre de 2 à 6 g/l,
préférentiellement 4 g/l. Comme il ressortira des exemples ci-après, une
concentration
plus faible n'est pas suffisante et une concentration plus élevée entraîne une
inhibition
de la croissance cellulaire ou potentiellement l'apoptose des cellules.
Pour les exemples ci-après, le milieu de référence utilisé est le milieu RPMI
1640 (SIGMA - ALDRICH).
Selon un mode d'exécution, le milieu de culture selon l'invention est
caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, des vitamines, des sels
inorganiques, des
acides aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres.
La présente invention couvre également l'utilisation d'un milieu de culture
selon la présente invention pour la culture en masse de cellules ou de tissus.
Selon un autre aspect de la présente invention, il est également couvert un
milieu de culture non seulement sans sérum mais également protein free ,
c'est-à-
dire, comme explicité plus haut, dépourvu de protéines animales.
La présente invention a également pour objet un milieu de culture de cellules
ou de tissus, protein free , obtenu par utilisation d'un, ou comprenant un
extrait
peptidique tel que décrit ci-avant.
De manière similaire à ce qui a été décrit plus haut pour les milieux sans
sérum, selon un mode de réalisation le milieu de culture protein free selon
l'invention, peut comprendre en outre des vitamines, des sels inorganiques,
des acides
aminés libres, des acides organiques et/ou des sucres.
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L'invention couvre également l'utilisation d'un milieu de culture protein
free selon la présente invention pour la culture en masse de cellules ou de
tissus.
Selon une autre forme d'exécution, la présente invention concerne un procédé
de culture in vitro de cellules ou de tissus. Pour ce qui est des étapes mêmes
du procédé,
on peut citer, comme exemple non limitatif, i) culture en mode statique et à
très petite
échelle (plaques 96 puits), ii) culture en mode statique à des échelles un peu
plus
importantes (flacons de culture de 25 cm2, 75 cm2 et 175 cm) puis, iii)
culture en mode
agité, à des échelles croissantes (fioles d'Erlenmeyer, spinners et
cytoculteurs
contrôlés). Plus particulièrement, l'ensemencement peut être réalisé par toute
technique
classique connue de l'homme de l'art.
Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de culture in
vitro
de cellules ou de tissus dans un milieu dépourvu de sérum, caractérisé en ce
qu'il
consiste à ensemencer lesdit(e)s cellules ou tissus dans un milieu comprenant
un extrait
peptidique obtenu par fractionnements successifs d'une matière première
végétale,
ladite matière première végétale consistant en la graine de colza.
Une forme de réalisation consiste à mettre en oeuvre le procédé de
fractionnement décrit plus haut de manière à obtenir un extrait présentant les
propriétés
énumérées.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ladite matière première consiste en du tourteau de colza.
Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en
ce
que ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins
90 %, en
masse de matière azotée.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de peptides
présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en
ce
que ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de
peptides
présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ledit
extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et d'acide
glutamique
et/ou de leurs amides respectifs.
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Enfin, de manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est
caractérisé en ce que ledit extrait présente la composition suivante en acides
aminés
totaux :
acides aminés % molaire
Alanine 2-6
Arginine 5-9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
Histidine 1 - 5
Isoleucine 2-6
Leucine 5-9
Lysine 2-6
Méthionine 0-3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3-7
Sérine 5-9
Thréonine 5-9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5-9
De manière similaire aux milieux de culture tels que décrits plus haut, un
autre
aspect de la présente invention concerne un procédé de culture in vitro de
cellules ou
tissus, ledit procédé étant caractérisé par le fait qu'il est en milieu
protein free .
Plus particulièrement, le procédé de culture in vitro de cellules ou de tissus
dans un milieu protein free , caractérisé en ce qu'il consiste à ensemencer
lesdit(e)s
cellules ou tissus dans un milieu comprenant un extrait peptidique obtenu par
fractionnements successifs d'une matière première végétale, ladite matière
première
végétale consistant en la graine de colza.
De manière similaire au procédé de culture en milieu sans sérum, le présent
procédé de culture en milieu protein free se caractérise en ce que ladite
matière
première consiste en du tourteau de colza.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ledit extrait est constitué d'au moins 80 %, préférentiellement au moins 90 %,
en masse
de matière azotée.
Encore plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en
ce
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que ladite matière azotée est constituée d'environ 50 % à environ 60 % de
peptides
présentant une taille moléculaire inférieure à 500 Daltons.
De manière préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ladite matière azotée est constituée d'environ 20 % à environ 30 % de peptides
présentant une taille moléculaire comprise entre 500 et 1000 Daltons.
De manière encore plus préférée, le procédé selon l'invention est caractérisé
en
ce que ledit extrait comprend entre 20 et 40 % molaire d'acide aspartique et
d'acide
glutamique et/ou de leurs amides respectifs.
Plus particulièrement, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que
ledit extrait présente la composition suivante en acides aminés totaux :
acides aminés % molaire
Alanine 2-6
Arginine 5-9
Acide aspartique + Asparagine 10 - 14
Cystéine 0
Acide Glutamique + Glutamine 15 - 19
Glycine 7 - 11
I3istidine 1 - 5
Isoleucine 2-6
Leucine 5-9
Lysine 2-6
Méthionine 0-3
Phénylalanine 1 - 5
Proline 3-7
Sérine 5-9
Thréonine 5-9
Tryptophane Non déterminé
Tyrosine 1 - 5
Valine 5-9
Enfm, selon un dernier aspect de la présente invention, des propriétés
particulièrement intéressantes ont été mises en évidence quant à l'adaptation
d'un
milieu avec sérum à un milieu selon l'invention. En effet, il peut être
avantageux, pour
différentes raisons connues de l'homme de l'art, comme (i) l'obtention de
nouvelles
lignées cellulaires par modifiation génétique (transfection), (ii) une
viabilité cellulaire
plus élevée lors de la décongélation suite à une congélation dans un milieu
contenant du
sérum, (iii) une croissance plus importante et (iv) une résistance plus élevée
des cellules
aux forces de cisaillement, de débuter une culture dans un milieu avec sérum
et, plus ou
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moins rapidement, de faire passer cette culture en milieu dépourvu de sérum
et/ou
protein free . Il est connu que de tels transferts sont difficiles à mettre
en oeuvre car
les cellules ont du mal à supporter un tel changement qui constitue un stress
pour elles
qui, dans la plupart des cas, leur est fatal. Pour éviter un tel stress, il
est procédé à un
transfert en douceur des cellules dans des milieux comprenant des
concentrations
décroissantes en sérum de manière à adapter les cellules au nouveau milieu
sans sérum
en douceur. Une telle période, dite d'adaptation, est relativement longue et
fastidieuse.
De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont montré que ce stress
pouvait être évité en transférant les cultures dans un milieu sans sérum
contenant la
fraction peptidique objet de l'invention, et ce même de manière brutale. Cette
propriété
de l'invention ressortira clairement des exemples et figures ci-après.
La présente invention concerne donc un procédé de transfert direct d'une
culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu sans sérum,
caractérisé en
ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du milieu avec sérum
et à les (1')
ensemencer directement dans un milieu sans sérum tel que décrit dans la
présente
demande de brevet.
Selon encore un autre aspect avantageux, la présente invention concerne un
procédé d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture
en milieu
sans sérum, caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le
tissu du
milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans des milieux
présentant
respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
La présente invention couvre un procédé d'adaptation tel que décrit ci-dessus,
caractérisé en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes
suivantes
- Etape 1: 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
- Etape 2: 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
- Etape 3 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
- Etape 4: 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de transfert direct
d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en milieu protein
free ,
caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules et/ou le tissu du
milieu avec
sérum et à les (1') ensemencer directement dans un milieu protein free tel
que décrit
dans la présente invention.
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Selon encore une forme d'exécution, la présente invention couvre un procédé
d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en
milieu
protein free , caractérisé en ce qu'il consiste à récupérer les cellules
et/ou le tissu du
milieu avec sérum et à les (1') ensemencer par étape dans des milieux
présentant
5 respectivement des concentrations en sérum décroissantes.
Plus particulièrement, le procédé d'adaptation selon l'invention est
caractérisé
en ce que ledit procédé d'adaptation comprend les quatre étapes suivantes :
- Etape 1: 75 % milieu avec sérum / 25 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
- Etape 2: 50 % milieu avec sérum / 50 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
10 - Etape 3 25 % milieu avec sérum / 75 % milieu sans sérum + extrait
peptidique,
- Etape 4: 100 % milieu sans sérum + extrait peptidique.
Enfm, selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet un procédé
d'adaptation d'une culture in vitro en milieu avec sérum à une culture en
milieu
protein free , caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes
suivantes :
15 - Etape 1: mettre en oeuvre le procédé objet de l'invention,
- Etape 2 récupérer les cellules et/ou les tissus du milieu sans sérum,
- Etape 3 ensemencer lesdit(e)s cellules et/ou tissus directement en milieu
protein
free .
Les avantages de la présente invention seront mis en évidence à la lumière des
exemples et des figures ci-après dans lesquelles :
- la figure 1 représente un diagramme en flux, autrement appelé flow sheet
d'une forme d'exécution d'un procédé permettant d'obtenir l'extrait peptidique
conforme à l'invention ;
- la figure 2 représente l'effet d'une filtration stérilisante sur l'extrait
selon
l'invention ;
- la figure 3 représente, sous la forme d'un histogramme, l'effet de la
concentration de l'extrait selon l'invention sur la densité cellulaire
maximale ;
- la figure 4 illustre l'adaptation des cellules VERO d'un milieu avec sérum à
un milieu sans sérum et à un milieu protein free comprenant l'extrait selon
l'invention ;
- la figure 5 illustre l'adaptation des cellules type hybridomes d'un milieu
avec
sérum à un milieu sans sérum comprenant l'extrait selon l'invention ;
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- la figure 6 illustre l'adaptation des cellules CHO Kl dhfr- d'un milieu avec
sérum à un milieu sans sérum et à un milieu protein free comprenant
l'extrait selon
l'invention ;
- les figures 7A et 7B illustrent l'adaptation des cellules CHO C5 d'un milieu
sans sérum à un milieu sans sérum et à un milieu protein free comprenant
l'extrait
selon l'invention ;
- la figure 8 représente l'évolution de la concentration de cellules viables
au
cours de cultures prolongées de cellules CHO C5 ;
- les figures 9, 10 et 11 illustrent l'effet de l'extrait selon l'invention
sur la
vitesse spécifique de production d'interféron par les cellules CHO C5
cultivées ; et
- la figure 12 met en évidence que la fonction de l'extrait selon l'invention
n'est pas liée uniquement à la composition élémentaire en acide aminé mais à
la
composition sous forme peptidique desdits acides aminés.
EXEMPLE 1: Protocoles du procédé de génération de l'extrait peptidique objet
de l'invention
Le protocole décrit ci-après est illustré par la Figure 1. Plus
particulièrement, le
présent exemple reprend l'ensemble des étapes en les détaillant selon une des
formes
d'exécution préférée. Il est bien entendu que des variantes, évidentes pour
l'homme de
l'art, pourront être apportées à ce procédé.
Etape 1 : Protocole d'extraction des protéines de colza
Le protocole suivi pour cette étape est représenté dans le schéma ci-dessous.
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30 kg de tourteau déshuilé de colza + 300 L de soude 0,2 M
turbo mélangeur (3 mn, T ambiante)
mélange tourteau / extrait alcalin
décanteur centrifug horizontal (3500 g)
récupération de l'extrait et ajustement à pH 4 avec HC1(35 % v/v)
séparateur à assiettes en ode clarification (3000 g)
récupération du précipité
lavages finaux d précipité à l'eau
Concentrat de protéines de tourteau de colza
Les protéines végétales utilisées sont une farine industrielle déshuilée,
résidu
de l'industrie huilière (Novance, Compiègne, France), contenant 35 % en poids
de
matière azotée. A partir de ce substrat, un concentrat protéique est préparé
(75 % de
matière azotée) par extraction à la soude et précipitation acide au pH
isoélectrique des
protéines (pH 4).
Le rendement total en protéines du procédé d'obtention du concentrat à partir
du tourteau de colza est d'environ 28 %.
La composition du concentrat obtenu est la suivante (voir Tableau 1) :
Tableau 1 : Composition du concentrat obtenu
Protéines Fibres Lipides Cendres Autres
Teneur (%) 75 14 5 3 3
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Etape 2 : Protocole d'hydrolyse du concentrat de protéines de tourteau de
colza
Utilisation de l'Alcalase 2.4 L qui est une préparation enzymatique d'origine
microbienne à un rapport concentration enzyme/concentration substrat = 1/10.
Le concentrat est hydrolysé enzymatiquement dans un réacteur agité
thermostaté (60 C) par l'action de l'Alcalase 2.4 L (NovoNordisk, Bagsvaerd,
Danemark), avec régulation de pH (pH 9 maintenu par addition de soude). Après
5
heures d'hydrolyse, correspondant à un degré d'hydrolyse de 28 % (technique du
pH-
stat), la réaction est arrêtée par inactivation de l'enzyme (90 C pendant 10
mn).
Etape 3 : Précipitation acide pH 4
Le pH de l'hydrolysat obtenu à la fm de l'étape 2 est ensuite abaissé à 4 afin
de
précipiter les molécules de grande taille et concentrer les peptides dans le
surnageant.
Cette nouvelle étape permet d'éliminer les grosses molécules responsables du
colmatage
lors des étapes de filtration ultérieures et de concentrer les peptides de
tailles
relativement petites.
Etape 4: Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 3 kDa
L'objectif de cette étape est la purification des petits peptides par
l'élimination
des molécules d'une taille supérieure à 3000 Da (composés phénoliques +
polypeptides).
Le procédé utilise une membrane en cellulose régénérée classique pour
concentrer les peptides de masse molaire théorique inférieure à 3000 g/mol.
Etape 5: Nanofiltration avec une membrane de seuil de coupure 500 Da
L'objectif de cette étape est de diminuer le taux d'acides aminés libres dans
la
solution de petits peptides obtenue après l'étape 4 et dessaler cette même
solution afin
de diminuer l'osmolarité du mélange.
Cette étape de séparation qui met en jeu une membrane constituée d'un film
composite polyamide/polysulfone, conduit à une baisse de 80 % de la
concentration en
sels, ce qui permet un meilleur fractionnement des peptides selon leur charge
dans
l'étape suivante 6.
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Etape 6: Ultrafiltration avec une membrane de seuil de coupure 1 kDa
L'objectif est de fractionner les petits peptides selon leur taille et leur
charge.
Il est utilisé une membrane en cellulose régénérée classique dans le but de
fractionner selon leur taille mais aussi selon leur charge, en fonction des
conditions de
mise en oeuvre de la membrane, les peptides récupérés après l'étape 5 dont les
masses
molaires doivent théoriquement être comprises entre 500 et 3000 g/mol.
L'exécution de cette étape conduit à deux fractions :
- un perméat contenant essentiellement des peptides de masse molaire
théoriquement
inférieure à 1000 g/mol,
- un rétentat qui, par rapport au perméat, présente, d'une part, une teneur
plus élevée en
peptides contenant des acides aminés acides, et, d'autre part, une teneur plus
faible en
peptides contenant des acides aminés basiques.
L'extrait peptidique objet de la présente invention consiste en le rétentat
obtenu
par mise en oeuvre du procédé tel que décrit ci-dessus.
De manière évidente, des modifications peuvent être apportées. A titre
d'exemple non limitatif, il peut être envisagé d'ajuster le pH à 4 lors des
étapes 5 et 6,
au lieu de 9 ou encore de supprimer l'étape 5.
EXEMPLE 2: Protocoles mis en aeuvre pour la caractérisation de l'extrait objet
de l'invention
2.1. Dosa2e d'azote par la méthode de Kieldahl
= Réactifs
- Catalyseur de minéralisation (Na2SO4 17 % ; CuSO4.5 H20 1,5 %; sels 1,5 %)
Prolabo, 22550-293
- 1-12SO4 1 N : Labosi A4715891
- H202 35 % : Labosi, A4823251
- NaOH 40 % : Merck, 191537
- 1-13B03 : Labosi, A4703851
= Matériel
- Appareil de Kjeldahl automatique Vapodest 4 titramatic : Gerhardt GmbH & Co.
KG,
Bonn, Allemagne
- Système de titrage automatique 645 Multi-dosimat : Metrohm, Herisau, Suisse
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- Banc de minéralisation Kjeldatherm KT 12 S: Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn,
Allemagne
= Protocole du dosage
La teneur protéique a été déterminée par la méthode de Kjeldahl. Cette
5 méthode de dosage est basée sur la transformation de l'azote organique en
azote minéral
sous forme de sulfate d'ammonium (NH4)2SO4. Le dosage est réalisé de façon
automatique avec le Vapodest 4S. Pour chaque échantillon, l'analyse est
effectuée deux
fois de manière à pouvoir calculer une valeur moyenne. Il est également
nécessaire de
faire un dosage à blanc pour obtenir, après soustraction, une valeur de
l'azote total
10 réellement contenu dans l'échantillon.
Les résultats sont exprimés en concentration massique d'azote, selon la
formule : taux d'azote (g/1) = (V-VO) x N x 14 / E
avec V volume d'H2S04 nécessaire à la titration de l'échantillon en mL,
Vo : volume d'H2S04 nécessaire à la titration du blanc en mL,
15 N titre de la solution d'H2S04 (mol/1),
E prise d'échantillon en mg ou en ml.
Le pourcentage de protéines est obtenu à l'aide du coefficient de
transformation pour les protéines de colza (6,25), lui-même calculé à partir
de la teneur
en azote de ces protéines (16 %) : taux de protéines = 6,25 x taux d'azote. Il
ressort de
20 ce calcul que le % protéique de l'extrait objet de l'invention est
d'environ 90 % (voir
tableau 2 plus loin).
2.2. Hydrolyse acide des peptides et dosa2e des acides aminés
= Réactifs
- Acide trichloroacétique à 50 % (p/v) dans l'eau : Prolabo, 20734.295
- 9-Fluorénylméthyl chloroformate (FMOC-Cl) : OSI, A4 700.792,
- 2,5 mg/ml dans l'acétonitrile : Fluka, 23184
- o-phthalaldéhyde (OPA) : Fluka, 79760
- Acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) : Sigma, M-6750
- 10 mg de chacun des composés (OPA et 3-MPA) dans 1 ml de tampon borate 0,4 N
et
pH 10,5 : Hewlett-Packard, 5061-3339
- Solution étalon de mélange des acides aminés : Sigma, AA-S-18
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- Solution de NaOH 2 N : Fluka, 72071
- HC16 N : Labosi, A4715801
Solutions d'élution :
Solvant A : 20 mM d'acétate de sodium, 3 H20 (OSI, 27652.298), à 0,024 %
(v/v) de triéthylamine (OSI, 28 745.296) et 0,5 % (v/v) de tétrahydrofurane
(OSI, 28
556.293). Le mélange est ajusté à pH 7,2 avec de l'acide acétique (OSI, 20
104. 298).
Solvant B : 20 % (v/v) d'un tampon d'acétate de sodium à 100 mM (OSI, 27
652.298) ajusté à pH 7,2 avec de l'acide acétique, 40 % (v/v) d'acétonitrile
et 40 %
(v/v) de méthanol (Prolabo, 20 865.322).
= Matériel
- Filtres à usage unique 0,22 m : Schleicher & Schuell, Dassel, Allemagne
- Etuve modèle 700 : Memmert, Schwabach, Allemagne
- Colonne Hypersil C18 : Interchim, H5 C18-20R, Montluçon, France
- Système de chromatographie HP 1090 : Hewlett Packard, Palo Alto, Etats-Unis
= Méthode
Une hydrolyse acide des fractions peptidiques est préalablement effectuée pour
obtenir un mélange homogène d'acides aminés libres. Un échantillon de 1 g ou
de 1 ml
est placé dans un tube à essais avec bouchon. Puis 4 ml d'acide chlorhydrique
(6 N)
sont ajoutés puis le tube à essais est mis sous atmosphère d'azote avant
d'être fermé
hermétiquement. L'hydrolyse se fait ensuite dans une étuve à 110 C pendant 24
h.
Après refroidissement, les hydrolysats sont neutralisés jusqu'à un pH
d'environ 6 par
ajout de soude 4 N. Les échantillons sont finalement filtrés sur filtre
seringue à 0,22 m.
L'inconvénient de l'hydrolyse acide est la destruction du tryptophane et la
transformation de la glutamine et de l'asparagine, respectivement en acide
glutamique et
en acide aspartique. L'analyse du tryptophane peut être effectuée après une
hydrolyse
basique par chromatographie d'échange d'ions (Hugli T.E. et al., 1972,
Determination
of the tryptophane content of proteins by ion exchange chromatography of
alcaline
hydrolysates, Ibid., 247, 2828-2834). Etant donné que la quantité en
tryptophane est très
limitée dans le colza (Godon B., 1996, Les méthodes courantes de laboratoire
pour la
séparation et l'analyse des protéines végétales. In : Eds Lavoisier. Protéines
végétales,
65-80), cet acide aminé n'est pas analysé. Quant à la glutamine et
l'asparagine, leur
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quantification sera intégrée avec les acides aminés acides correspondant, sous
les
formes Glx et Asx (Glx = Gln + Glu, Asx = Asn + Asp).
= Protocole
Les acides aminés ainsi que les dipeptides alanyl-glutamine et glycyl-
glutamine sont dosés par Chromatographie Liquide en Phase Inverse après
dérivation en
présence d'o-phtahaldéhyde (OPA) et de 9-fluorényl-méthyl chloroformate
(FMOC). Le
principe de la dérivation est le suivant : les acides aminés primaires sont
placés en
présence d'OPA et d'acide 3-mercapto-propionique (3-MPA), pour donner des
isoindoles hautement fluorescents et absorbants dans le domaine UV (338 nm)
(Godel
et al., 1992, Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-Cl
precolumn derivatization, LC-GC INTL., 5, 44-49).
Selon le même principe, les acides aminés secondaires sont dérivés en présence
de FMOC, pour donner des dérivés hautement fluorescents et absorbants dans le
domaine UV (262 nm). Le seuil de détection est de l'ordre de 100 pmoles.
Les échantillons sont dérivés automatiquement à l'aide d'un système HP 1090
Liquid Chromatograph Hewlett Packard. 3 l d'échantillon sont tout d'abord
neutralisés
avec 1,5 l de NaOH 2 N pour obtenir une dérivation totale. Puis, le tout est
mélangé à
6,0 L de tampon borate 0,4 N, 2,5 l de la solution d'OPA + 3-MPA et 2,5 l
de la
solution de FMOC. Le mélange dure 15 mn afm de permettre la dérivation ; enfm,
le
tout est injecté au niveau de la colonne de séparation Hypersil C18. Le
solvant d'élution
est composé de 100 % de solution A, pendant 17 mn, puis de 40 % de solution A
et
60 % de solution B pendant 1 mn et enfin de 100 % de solution B, pendant 7 mn.
Les
acides aminés sont séparés selon leur polarité ; les plus polaires sortent en
début
d'analyse et les moins polaires en fm d'analyse. En sortie de colonne, les
acides aminés
primaires et les dipeptides sont détectés par un détecteur UV, à 338 nm, et
les acides
aminés secondaires sont détectés par un détecteur UV, à 262 nm. La durée
totale de
l'analyse est de 25 mn.
La détermination du taux d'acides aminés libres est effectuée selon le même
protocole, exceptée l'absence d'étape d'hydrolyse acide.
Avant analyse des échantillons, trois solutions, contenant 17 acides aminés
aux
concentrations de 0,25, 0,5 et 2,5 mM respectivement, sont dérivées et
injectées sans
neutralisation préalable avec du NaOH 2 N. Les profils obtenus servent à
établir une
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gamme étalon pour chaque acide aminé, ce qui permet ensuite de déterminer la
concentration de chaque acide aminé contenu dans un échantillon après
intégration des
pics (système Hewlett Packard).
2.3. Dosa2e de la matière sèche
La détermination de l'humidité a été faite en portant les échantillons (1 à 5
g) à
105 C dans une étuve jusqu'à l'obtention d'une masse constante.
2.4. Détermination de la taille des peptides par chromato2raphie d'exclusion
de
taille
= Matériel
- Colonne Superdex Peptide HR 10/ 30 (7000-200 Da) : Amersham Biosciences,
Uppsala, Suède
- Filtres 0,22 m Minisart RC 25 : Sartorius, Goettingen, Allemagne
- Dispositif de filtration sous vide, fritté en verre SM 16309 : Sartorius,
Goettingen,
Allemagne
- Système de chromatographie BioCAD 700E : Applied Biosystems, Foster City,
Etats-Unis
- Collecteur de fraction Modèle 203B : Gilson, Middleton, Etats-Unis
= Méthode
Les conditions opératoires sont les suivantes
- Eluant : ACN/H20/TFA (40/60/0,1 - v/v/v), filtré sur 0,45 m
- Solvant dégazé à l'hélium : 5 ml/mn
- Débit de l'éluant : 0,6 ml/mn
- Température de la colonne : ambiante (25 C)
- Détection : U.V. à 214 nm
- Volume injecté : 50 L
- Durée d'analyse : 45 mn
La colonne a été préalablement étalonnée avec des peptides de masses molaires
connues. Deux droites ont été obtenues en traçant le logarithme de la masse
molaire en
fonction du temps de rétention. La détermination de la relation liant la masse
molaire
(MM) des molécules à leur temps de rétention sur la colonne a permis de
définir la
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distribution selon la taille des peptides contenus dans les différentes
fractions.
2.5. Dosa2e des composés phénoligues
La quantité de composés phénoliques dans les fractions a été estimée en
équivalent acide sinapique. L'acide sinapique (Sigma, D 7927), avec une masse
molaire
de 224 g/mol, a été utilisé comme référence parce qu'il est l'acide phénolique
majoritairement présent dans le tourteau de colza (entre 70 et 90 %) selon
Naczk M. et
al., 1992, Recovery of rapeseed tannins by various solvent systems, Food
Chem., 45,
51-54.
L'étalonnage et les mesures ont été effectués en utilisant les mêmes
conditions
chromatographiques que celles qui sont employées en C.L.H.P.-E.T., exceptée la
longueur d'onde de détection fixée dans ce cas à 310 nm, ce qui correspond à
la
longueur d'onde d'absorption maximale de cet acide (Sakakibara H. et al.,
2003,
Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits and teas,
J. Agric.
Food Chem., 51, 571-581). La quantité de composés phénoliques dans chaque
fraction a
été exprimée en mg d'équivalents d'acide sinapique / 100 g de matière sèche.
La teneur
en composés phénoliques libres a été estimée en calculant la proportion d'aire
du pic
ayant un temps de rétention (compris entre 34 et 37 mn) identique à celui du
standard
utilisé pour établir la courbe d'étalonnage.
Les résultats de l'exemple 2 sont regroupés dans les tableaux ci-dessous :
Composition de la matière azotée et uhénoligue de l'extrait ueutidigue :
(Voir Tableau 2)
Tableau 2:
Contenu % quantité de polyphénols
peptidique acides aminés libres / MP (mg / 100 g MS)
31 % tannins
extrait 90 % 3% 65 % ac. phénoliques liés
4 % ac. phénoliques libres
MP : Matière Peptidique ; MS : Matière Sèche.
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Répartition de la taille des peptides (par rapport à la matière ueutidigue
totale) :
(Voir Tableau 3)
Tableau 3
5
Taille (Da) > 5000 5000-1000 1000-500 < 500
extrait 0% 20 % 23 % 57 %
Composition en acides aminés de l'extrait ueutidigue (3 analyses) :
(Voir Tableau 4)
10 Tableau 4
aa % % %
Asx 13 12 12
Glx 17 17 20
Ser 7 7 5
His 3 3 2
Gly 9 9 9
Thr 7 7 5
Ala 4 4 5
Arg 7 7 7
Tyr 2 3 3
Cys 0 0 0
Val 7 7 8
Met 1 1 0
Phe 3 3 3
I1e 4 4 4
Leu 7 7 7
Lys 4 4 4
Pro 5 5 6
100 100 100
Asx : acide aspartique + asparagine
Glx : acide glutamique + glutamine
Dans l'ensemble des exemples 4 à 9 ci-après, et sauf information
contraire indiquée dans le texte, les cultures ont été réalisées avec les
cellules
CHO-C5 dans les milieux de culture suivants :
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Milieu de référence (o) = RPMI 1640 (Sigma)+ BITS + ET + Glutamine
Milieu d'intérêt (0) = Milieu de Référence + 4 g/L d'extrait peptidique
selon l'invention.
EXEMPLE 3: Effet d'une filtration stérilisante
Le système de culture utilisé consiste en une fiole d'Erlenmeyer de 125 ml, Vu
=25m1.
La culture des cellules CHO C5 a été faite en milieu de référence (o) ou en
milieu d'intérêt (0) stérilisé 1 fois (symboles vides) ou 3 fois (symboles
pleins) par
filtration stérilisante 0,22 m.
Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 2.
Il ressort de ces derniers qu'il n'y a pas de diminution de l'effet de
l'extrait
peptidique selon l'invention lors de la filtration sur 0,22 m.
EXEMPLE 4: Effet "cryoprotecteur" de l'extrait peptidique selon l'invention
(Voir Tableau 5)
Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques
Tableau 5
Durée de la période de stockage à-196 C
1 semaine 1 mois 5 mois
Temps après
décongélation et 0 24 48 96 0 24 48 96 0 24 48 96 120
remise en culture (h)
M.
61 44 60 81 46 33 36 65 44 34 36 53 72
% Référence
Viabilité M. 64 52 56 85 58 46 55 74 39 38 45 68 92
Intérêt
Une meilleure récupération des cellules congelées en présence de l'extrait
selon l'invention est observée. Cette propriété est particulièrement
intéressante en ce
sens que, dans la pratique, les cellules sont souvent congelées puis
décongelées afm
d'être, par exemple, conservées ou bien transportées.
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EXEMPLE 5: Effet de la concentration de l'extrait selon l'invention sur la
densité
cellulaire maximale
Le système de culture utilisé consiste en des plaques 96 puits, Vu = 200 L.
Le
suivi de la croissance a été réalisé avec l'appareil Cellscreen (Innovatis).
Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 3.
Ces résultats montrent que la concentration de 4 g/L est celle qui présente
les
résultats les meilleurs. Des concentrations trop élevées compromettent la
croissance.
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs avancent
l'hypothèse
que la concentration d'inhibiteurs ou de toxiques pourrait annihiler l'effet
positif des
activateurs.
EXEMPLE 6: Essais d'adaptation de diverses cellules
6.1. Passa2e d'un milieu avec 10 % de sérum à un milieu sans sérum contenant
l'extrait selon l'invention
Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques.
6.1.1. Cellules VERO (cellules adhérentes)
Le milieu de base utilisé est le aMEM. L'adaptation réalisée est une
adaptation
brutale. Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 4.
Les passages successifs de cellules VERO, illustrés par la courbe (0),
représentent l'adaptation en présence d'extrait selon l'invention. La courbe
(o)
représente l'adaptation des cellules en absence d'extrait. De JO à J17, le FCS
est
diminué de 10 à 1 %. A J17, le FCS est brutalement supprimé et remplacé par le
mélange (extrait peptidique selon l'invention, BITS, ET, Q). A J36, les BITS
sont
supprimés.
Il ressort des résultats obtenus qu'en absence d'extrait peptidique conforme à
l'invention, l'adaptation est impossible (mort des cellules en 2 passages). En
présence
dudit extrait et de BITS, l'adaptation des cellules est rapide (récupération
de la
croissance au 3è' passage). En présence de ce même extrait et en absence de
protéines
animales (milieu protein free ), l'adaptation est un peu plus difficile mais
reste
possible.
En présence de BITS et d'extrait peptidique et en l'absence de sérum, les
cellules VERO restent adhérentes. Lorsque les BITS sont enlevés, elles le
restent
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également mais dans une moindre mesure (le temps nécessaire à la trypsination
est
largement diminué).
6.1.2. Hybridomes (cellules en suspension)
Le milieu de base utilisé est le RPMI.
ADAPTATION BRUTALE
Dans le cas d'une adaptation brutale, il est rapidement observé la mort des
cellules lors de la substitution brutale du FCS par le mélange (extrait
peptidique + BITS
+ ET + Q).
ADAPTATION DOUCE
Des passages successifs de cellules d'hybridomes ont été réalisés. Les
résultats
obtenus sont illustrés par la figure 5 dont la courbe (0) représente
l'adaptation en
présence d'extrait selon l'invention et la courbe (o) représente l'adaptation
des cellules
en absence d'extrait selon l'invention. De JO à J17, le FCS est diminué de 10
à 1 %. De
J17 à J35, le FCS est progressivement supprimé et remplacé par le mélange
(extrait
peptidique, BITS, ET, Q). A J47, les BITS sont supprimés.
Les résultats obtenus montrent qu'en absence d'extrait peptidique,
l'adaptation
est impossible (mort des cellules en 2 passages dans le mélange 25 % / 75 %).
En
présence d'extrait et de BITS et en absence de sérum, les hybridomes
s'adaptent
correctement (récupération au 4ème passage). La suppression des protéines
animales
(BITS) entraîne la mort instantanée des cellules.
6.1.3. CHO Kl dhfr- (CHO DUXB11)(cellules en suspension)
Le milieu de base utilisé est le aMEM + ribo- et désoxyribonucléosides.
ADAPTATION BRUTALE
Les mêmes observations qu'avec les cellules d'hybridomes sont rapportées
(données non montrées).
ADAPTATION DOUCE
Plusieurs passages successifs de cellules CHO Kl dhfr- ont été effectués. Les
résultats obtenus sont représentés dans la figure 6 dont la courbe (0)
représente
l'adaptation en présence d'extrait peptidique alors que la courbe (o)
représente
l'adaptation des cellules en absence d'extrait peptidique. De JO à J12, le FCS
est
diminué de 10 à 2 %. De J12 à J 40, le FCS est progressivement supprimé et
remplacé
par le mélange (extrait peptidique, BITS, ET, Q). A J40, les BITS sont
supprimés.
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Il ressort de ces résultats qu'en absence d'extrait peptidique, l'adaptation
est
impossible (mort des cellules en 3 passages dans le mélange 25 % / 75 %). En
présence
d'extrait peptidique et de BITS et en absence de sérum, les CHO Kl s'adaptent
correctement (récupération au 1er passage). La suppression des protéines
animales
(BITS) entraîne un ralentissement de croissance et une adaptation plus longue
(environ
6 passages), mais celle-ci reste possible.
6.2. Passne d'un milieu sans sérum (de référence) à un milieu sans sérum et
avec
extrait ueutidigue (d'intérêt ou d'intérêt sans protéine d'ori2ine animale)
6.2.1. Passages successifs de CHO C5 (cellules en suspension)
Le système de culture utilisé consiste en des flacons de cultures statiques.
Plusieurs passages successifs de cellules CHO C5 ont été effectués en milieu
de
référence (o), en milieu d'intérêt (0) et en milieu d'intérêt sans protéines
animales (x).
Les résultats obtenus pour le milieu de référence sont regroupés dans la
figure 7A. Les
résultats obtenus pour les milieux d'intérêt sont représentés, quant à eux, en
figure 7B.
Il ressort de ces figures que l'adaptation des cellules au milieu d'intérêt
ainsi
que l'effet positif de l'extrait peptidique est conservé pendant au moins 7
passages. De
même, la propagation des cellules dans le milieu sans protéines animales
permet
d'obtenir des concentrations cellulaires proches de celles observées en milieu
de
référence pendant au moins 7 passages.
Il peut être conclu que le milieu protein-free selon l'invention peut être
utilisé en milieu de routine pour entretenir les cellules, d'autant plus que
les cellules
peuvent n'être transférées que tous les 3 jours (au lieu de tous les 2 jours
pour le milieu
de référence).
6.2.2. Cinétiques de cultures prolongées (cellules en suspension)
Les systèmes de culture utilisés sont des spinners de 500 ml, Vu = 160 ml.
L'évolution de la concentration de cellules viables au cours des cultures de
cellules CHO C5 réalisées, sans adaptation préalable, est représentée à la
figure 8. Plus
particulièrement, cette figure illustre les cultures en milieu de référence
(o), en milieu de
référence sans BITS (-), en milieu d'intérêt (0) et en milieu d'intérêt sans
BITS (x).
Il ressort clairement des résultats obtenus que le milieu de référence ne
permet
plus la croissance des cellules lorsqu'on supprime les protéines animales. Le
milieu
d'intérêt permet pratiquement de doubler la concentration maximale. De plus,
la durée
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de la culture (avant disparition quasi-complète des cellules viables) est
multipliée par 3.
Le milieu d'intérêt permet la croissance lorsque l'on supprime les protéines
animales. En absence de protéines animales, et en présence d'extrait
peptidique, la
concentration maximale de cellules n'est pas améliorée mais la longévité de la
culture
5 est augmentée d'un facteur 2 par rapport au milieu de référence.
EXEMPLE 7: Effet de l'extrait peptidique sur la vitesse spécifique de
production
de l'interféron
Le système de culture utilisé consiste en un cytoculteur de 2 litres, Volume
10 utile Vu = 1,21.
La figure 9 représente la cinétique de croissance des cellules CHO C5 en
milieu de référence (o) et en milieu d'intérêt (0).
La figure 10 représente, quant à elle, la cinétique de production d'IFN
(interféron gamma) par les mêmes cellules CHO C5 en milieu de référence (o) et
en
15 milieu d'intérêt (0).
Enfin, la figure 11 illustre la vitesse spécifique de production d'interféron
par
les cellules CHO C5 en milieu de référence (pointillés) et en milieu d'intérêt
(plein).
+ L'effet positif de l'extrait peptidique sur les cellules viables est
confirmé à
l'échelle du réacteur (*3,3).
20 + On note une forte augmentation de la production finale d'IFN (*5,3).
+ Cette augmentation peut être le résultat conjugué de l'augmentation de
cellules viables, mais également de l'augmentation de la vitesse spécifique de
production (valeur maximale quasiment doublée).
25 EXEMPLE 8: Mise en évidence de la fonction liée non pas uniquement par la
composition élémentaire en acides-aminés mais par la composition sous forme
peptidique desdits acides-aminés
Le système de culture utilisé consiste en des spinners de 500 ml, Vu = 160 ml.
La figure 12 représente les cinétiques de cellules viables CHO C5 cultivées en
30 spinners, dans le milieu de référence (o), le milieu de référence
additionné d'acides
aminés libres (x) et le milieu d'intérêt (0). Les acides aminés libres
correspondent aux
acides aminés totaux présents dans l'extrait peptidique (peptides et libres).
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L'ajout d'acides aminés en même proportion que ceux présents dans l'extrait
peptidique, sous forme de peptides, ne permet pas d'augmenter la concentration
de
cellules viables. On note, par contre, un effet positif sur la longévité de la
culture. La
composition en acides aminés individualisés, équivalente à celle du mélange
peptidique
de l'extrait peptidique utilisée, favorise le maintien en vie des cellules (*
3 par rapport
au milieu de référence).
L'extrait peptidique améliore la quantité, par un doublement de la population
de cellules viables, mais aussi la viabilité des cellules (50 % de temps
supplémentaire
par rapport au milieu référence + acides aminés libres, en se repérant au
maximum de
concentration cellulaire obtenue dans ce cas). Ces résultats ne semblent pas
uniquement
induits par un effet lié à la seule composition globale en acides aminés. Ils
peuvent être
également provoqués par un effet facteur de croissance issu de la présence
de
certains peptides, à la composition particulière, dans l'extrait peptidique
selon
l'invention.
