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MATERIAUX MONOLITHIQUES FONCTIONNALISABLES
La présente invention se rapporte au domaine des matériaux organiques
monolithiques poreux. L'invention concerne également les différents procédés
de
préparation de ces matériaux.
Ces matériaux monolithiques possèdent certains avantages par rapport aux
matériaux macroporeux plus traditionnels, liés notamment à l'absence d'espaces
interstitiels à l'état tassé.
Une méthode générale pour I'élaboration de matériaux organiques
monolithiques et poreux dans les éléments que l'on souhaite à l'intérieur
d'une
cavité simple (colonne, capillaire), ou d'un microsystème (canaux, réservoirs,
chambres, points de dérivation) est basée sur la polymérisation in situ par
voie
thermique, photochimique ou radiochimique de monomères dissous dans un
mélange de solvants porogènes.
Différents matériaux monolithiques pour microsystèmes analytiques et leurs
procédés de préparation ont été décrits dans la littérature. Parmi ces
méthodes,
celles qui utilisent la voie thermique se caractérisent par des temps de
polymérisation relativement longs (16 à 26h) et des températures de
polymérisation élevées (60 à 90 C). Par ailleurs, les phases pôreuses obtenues
sont le plus souvent optimisées pour un seul type d'application. Surtout, les
matériaux monolithiques connus ne possèdent pas d'aptitude à la
fonctionnalisation ou bien leur teneur en groupes fonctionnalisables est
faible. De
plus, la réactivité des groupes fonctionnalisables utilisées à ce jour (époxy,
azlactone) est faible et nécessite des traitements longs et/ou dans des
conditions
sévères.
La présente invention a pour but de proposer, d'une part, de nouveaux
matériaux monolithiques fonctionnalisables sur mesure, après ajustement des
caractéristiques de porosité-perméabilité et, d'autre part, des procédés de
préparation de ces matériaux monolithiques, caractérisés par une mise en
oruvre
simplifiée.
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Selon un premier aspect, l'invention a pour objet des matériaux
monolithiques polymères comprenant des fonctions anhydride maléique aptes à
étre fonctionnalisées.
Selon un deuxième aspect, l'invention a trait à un procédé de préparation
de matériaux monolithiques foncionnalisables, ledit procédé comprenant une
étape préalable de traitement de la surface des parois qui servent de support
auxdits matériaux monolithiques, caractérisé en ce qu'il consiste en une
réaction
de polymérisation radicalaire thermique, photochimique ou radiochimique d'une
composition comprenant une composition de base comportant:
- de l'anhydride maléique comme monomère de base, connu pour son
caractère accepteur d'électrons favorable à la formation de
complexes à transfert de charge avec des monomères à caractère
donneur d'électrons, associé à des comonomères éthyléniques à
caractère donneur d'électrons et/ou à d'autres monomères
éthyléniques à caractère donneur ou accepteur d'électrons;
- un mélange de solvants porogènes,
ladite composition de base étant éventuellement additionnée d'un photoamorceur
ou d'un amorceur thermique.
Selon un troisième aspect, l'invention se rapporte aux compositions à base
d'anhydride maléique, de comonomères et/ou autres monomères et de solvants
porogènes mises en oeuvre pour l'élaboration de matériaux monolithiques selon
l'invention.
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des matériaux
monolithiques dans lesquels les fonctions anhydride maléique sont
fonctionnalisées par réaction avec des composés nucléophiles. Les propriétés
qui
résultent de cette fonctionnalisation sont extrêmement variées : balance
hydrophile/hydrophobe ajustable, présence de charges électriques positives ou
négatives, de groupements organiques fonctionnels variés, éventuellement
optiquement actifs, de substrats spécifiques, de sites catalytiques
artificiels ou
enzymatiques, etc.
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Cette diversité de propriétés accessibles permet d'ajuster les propriétés
fonctionnelles des matériaux poreux comme phase pour la chromatographie par
interaction hydrophobe, d'affinité, ionique, électrochromatographie,
électrophorèse
capillaire, comme réacteur, comme support pour l'absorption et I'analyse de
composés chimiques, comme capteur au sein d'un dispositif de détection. Selon
un
cinquième aspect, l'invention se rapporte donc aux diverses utilisations des
matériaux monolithiques fonctionnalisés pour microsystèmes analytiques.
L'invention va maintenant être décrite en détail.
Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un matériau monolithique
polymère à groupes fonctionnalisables caractérisé en ce que ceux-ci sont des
unités anhydride maléique.
Le choix du demandeur s'est porté sur des monolithes à forte teneur en
anhydride maléique car celui-ci présente notamment deux particularités :
- une tendance à former des copolymères alternés par réaction radicalaire
avec des monomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons (éthers de
vinyle, dérivés N-vinyliques),
- une aptitude à amorcer sa copolymérisation photochimique avec des
monomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons (éthers de vinyle,
dérivés N-vinyliques) sans avoir recours à un photoamorceur radicalaire
spécifique.
Les différentes applications nécessitent le plus souvent l'élaboration de
phases monolithiques poreuses de caractéristiques fonctionnelles et fluidiques
optimales. L'expérience montre que la microstructure et la porosité des
monolithes
sont très dépendantes de la composition du mélange réactionnel précurseur
(nature et quantité des monomères, nature et composition du mélange porogène)
ainsi que des conditions de l'élaboration (température, nature et cinétique
des
réactions d'amorçage, durée du traitement thermique, photochimique ou
radiochimique).
Ces deux caractéristiques sont interdépendantes, chaque changement de
propriété chimique par une modification de la composition du mélange
réactionnel
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précurseur nécessitant un ajustement des conditions de traitement en vue d'un
optimum des propriétés fonctionnelles et fluidiques.
Afin de s'affranchir de cette difficulté inhérente à la méthode d'élaboration
classique, le demandeur a développé une approche basée sur I'élaboration de
monolithes à forte teneur en sites réactifs, pouvant être modifiés
chimiquement
après leur élaboration, par réaction avec des composés apportant certaines des
propriétés fonctionnelles désirées.
A cet effet et selon un deuxième aspect, l'invention a trait à un procédé de
préparation de matériaux monolithiques fonctionnalisables, ledit procédé
comprenant une étape préalable de traitement de la surface des parois qui
servent
de support auxdits matériaux monolithiques, caractérisé en ce qu'il consiste
en
une réaction de polymérisation radicalaire thermique, photochimique ou
radiochimique d'une composition comprenant une composition de base
comportant:
- de l'anhydride maléique comme monomère de base, associé à des
comonomères éthyléniques à caractère donneur d'électrons et/ou à
d'autres monomères éthyléniques à caractère donneur ou accepteur
d'électrons;
- un mélange de solvants porogènes,
ladite composition de base étant éventuellement additionnée d'un photoamorceur
ou d'un amorceur thermique.
Les matériaux monolithiques ont été élaborés dans des corps ou objets
creux de dimensions et de formes variées, comportant une cavité délimitée par
des surfaces constituées de matériaux divers, ci-après désignés par
l'expression
objets contenants . Exemples de tels objets contenants sont :
- des tubes et capillaires de verre ou de silice fondue (diamètre de 50 pm à
10 mm) se prêtant à l'élaboration des monolithes par polymérisation thermique,
photochimique ou radiochimique ;
- des systèmes et dispositifs de géométries diverses, constitués de verre, de
silice, de silicium, de métaux, de matériaux polymères (thermoplastiques,
réseaux,
résines lithographiables) ou encore de la combinaison de ces divers types de
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matériaux, comportant des canaux ou des chambres dont le diamètre est compris
entre 100 nm et 5 cm.
Ces objets contenants sont plus particulièrement adaptés à I'élaboration des
matériaux monolithiques par photopolymérisation lorsque la cavité est
délimitée
5 sur une de ses surfaces par un matériau transparent au rayonnement UV-
visible.
Dans les autres cas, l'élaboration des matériaux monolithiques est réalisable
par
polymérisation thermique ou radiochimique.
Dans une variante de réalisation, le procédé de préparation de matériaux
monolithiques comprend une réaction de polymérisation thermique d'une
composition A comprenant, en plus de la composition de base, un amorceur
thermique, ladite réaction étant réalisée à une température de 40 à 90 C
pendant
une durée comprise entre 1 à 6h.
Dans une autre variante de réalisation, le procédé de préparation de
matériaux monolithiques comprend une réaction de polymérisation photochimique
d'une composition B comprenant, en plus de la composition de base, un
photoamorceur.
Le choix de la nature et de la quantité de l'amorceur introduit dans la
formulation, du domaine spectral utilisé et de la puissance de la source
lumineuse
revêt une grande importance pour l'obtention des caractéristiques
morphologiques
et fluidiques souhaitées. La formulation des monomères et des solvants avec un
photoamorceur est dégazée pendant 5 min sous azote. Les objets contenants sont
ensuite remplis avec la solution et placés sous une source de rayonnement
ultraviolet d'intensité variable (0,01 à 100 mW/cm2) pendant un temps optimisé
(selon le support et l'application). En général ce temps varie de 1 min
jusqu'à 60
min environ. Le monolithe est ensuite lavé avec un solvant organique inerte
pendant un temps correspondant à environ 100 volumes de colonnes. Des
solvants organiques inertes appropriés au lavage des monolithes sont par
exemple
un alcane ou un mélange d'alcanes en C5 à C8, le toluène, le tétrahydrofurane,
l'acétate d'éthyle.
Par ailleurs il est possible de réaliser un photoamorçage de la
polymérisation sans emploi de photoamorceur ajouté à la composition de base :
il
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s'agit d'une caractéristique spécifique des mélanges d'anhydride maléique et
de
monomères à caractère électro-donneur comme les éthers de vinyle ; la
formation
d'un complexe à transfert de charge absorbant dans le proche UV serait à
I'origine
de ce comportement. Ces formulations peuvent être polymérisées sous UV selon
la
même procédure que celle décrite plus haut mais sans ajout de photoamorceur.
Le temps de polymérisation varie entre 20 min et 2h30 environ. Le monolithe
est
ensuite lavé avec un solvant organique inerte pendant un temps correspondant à
environ 100 volumes de colonne.
Dans une autre variante de réalisation, le procédé de préparation de
matériaux monolithiques comprend une réaction de polymérisation sous
rayonnement ionisant, notamment sous faisceau d'électrons (amorçage
radiochimique), de la composition de base. Les objets contenants remplis de
précurseurs sont irradiés sans amorceur, avec des doses comprises entre 10 et
1000 kGy à des débits de dose variés : de 0,01 à 100 kGy/s. Le monolithe est
ensuite lavé avec un solvant organique inerte pendant un temps correspondant à
environ 100 volumes de colonnes.
Le traitement de surface préalable des parois de l'emplacement où l'on
souhaite réaliser le monolithe est un élément essentiel pour obtenir un
ancrage
satisfaisant des monolithes et il est réalisé par greffage de ces surfaces
avec des
composés nucléophiles. Par ailleurs, la présence dans les monolithes de
fonctions
anhydride maléique rend particulièrement efficace le greffage des surfaces
avec
des nucléophiles, telle les fonctions amine du gamma-
aminopropyltriméthoxysilane
(gamma-APS) fixé sur la surface de substrats en verre ou en silice, ou les
fonctions amine introduites à la surface de substrats en matériaux polymères,
notamment ceux utilisés dans les microsystèmes analytiques, par exemple la
résine lithographiable SU-8 après traitement avec l'ammoniac ou un composé
organique aminé.
Une étude des pàramètres influençant la polymérisation des monolithes à
base d'anhydride maléique a été réalisée, dont les résultats sont présentés ci-
après.
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Effet de la durée de la polymérisation et de la dose
L'effet d'une augmentation de la durée de la polymérisation sur la
perméabilité
des monolithes est présenté sur la Figure 1 annexée. Le graphe représente
l'influence de temps de polymérisation sur la perte de charge induite par la
présence de monolithe à base d'anhydride maléique polymérisé sous rayonnement
UV dans un capillaire avant (points A) et après la modification des unités
anhydride maléique avec de la n-hexylamine (points B). De même, on a effectué
la polymérisation de mélanges précurseurs de monolithes contenant de
l'anhydride
maléique sous faisceau d'électrons avec des doses de 10 kGy à 500 kGy et avec
des débits de dose variés : de 0,01 kGy/s à 100 kGy/s et observé la formation
de
monolithes avec une augmentation de la perte charge induite en fonction de la
dose appliquée.
Effet du pourcentage des monomères sur la polymérisation
On a effectué des polymérisations dans des colonnes de diamètres variables de
50
m à 1 mm avec des phases contenant de 10% jusqu'à 40% de monomères.
Effet de la diminution de diamètre de colonne sur la polymérisation
On a effectué des polymérisations dans des colonnes de diamètres variant de 50
m à 1 mm. Les études de morphologie ne démontrent pas un effet spectaculaire
de la diminution de diamètre sur la morphologie de nos monolithes. La Figure 2
annexée présente des clichés de microscopie électronique à balayage montrant
la
morphologie de monolithes à base d'anhydride maléique dans des capillaires de
difFérents diamètres (diamètre interne haut lmm, diamètre interne bas 75 pm,
polymérisés sous rayonnement UV) avant modification (Figure 2a, diamètre 1 mm)
et après modification (Figure 2b, diamètre 75 pm).
Selon un troisième aspect, I'invention se rapporte aux compositions à base
d'anhydride maléique, de comonomères et/ou autres monomères et de solvants
porogènes mises en oeuvre pour l'élaboration de matériaux monolithiques selon
l'invention.
D'une manière générale, le procédé d'élaboration de matériaûx
monolithiques met en ceuvre une composition de base comprenant :
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- de l'anhydride maléique comme monomère de base, associé à des
comonomères éthyléniques à caractère donneurs d'électrons et/ou à d'autres
monomères éthyléniques à caractère donneur ou accepteur d'électrons;
- un mélange de solvants porogènes,
ladite composition de base étant ou non additionnée d'un amorceur thermique ou
d'un photoamorceur.
Dans certains modes de réalisation de l'invention, le procédé d'élaboration
de matériaux monolithiques met en oeuvre une composition A comprenant, en
plus de la composition de base, un amorceur thermique. Dans ce cas, la teneur
molaire en anhydride maléique, évaluée relativement au nombre de moles de
fonctions polymérisables dans le mélange de monomères est comprise entre 0,1
et
0,5, préférablement comprise entre 0,2 et 0,5, alors que le ratio monomères :
solvants porogènes est compris entre 10-900/o et 40-60% en poids ; l'amorceur
thermique est présent à un taux compris entre 0,05 et 5% en poids.
Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, le procédé d'élaboration
de matériaux monolithiques met en oeuvre une composition B comprenant, en
plus de la composition de base, un photoamorceur. Dans ce cas, la teneur
molaire
en anhydride maléique, évaluée relativement au nombre de moles de fonctions
polymérisables dans le mélange de monomères est comprise entre 0,1 et 0,5,
préférablement comprise entre 0,2 et 0,5, alors que le rapport monomères :
solvants porogènes est compris entre 10-90% et 40-60% en poids et le
photoamorceur est présent à une concentration comprise entre 0,2 et 5% en
poids.
De préférence, les comonomères entrant dans ces compositions sont
sélectionnés dans le groupe: styrène et dérivés styréniques mono ou
multifonctionnels, éthers de vinyle mono- ou multifonctionnels (cyclohexyl
vinyléther, divinyl éther du 1,4-bis(hydroxyméthyl)cyclohexane), dérivés N-
vinyliques (N-vinyl pyrrolidone, N-vinyl carbazole), esters acryliques et
méthacryliques mono- ou multifonctionnels (acrylate de butyle, méthacrylate de
méthyle, diacrylate d'hexanediol, diacrylate de tripropylèneglycol), amides
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acryliques et méthacryliques mono- ou multifonctionnels, N-alkyl ou N-aryl
maléimides mono- et multifonctionnels.
Le mélange de solvants porogènes entrant dans les compositions de
l'invention comprend au moins deux solvants sélectionnés de préférence dans le
groupe : pentane, hexane, cyclohexane, éther de pétrole, toluène, dioxane,
tétrahydrofurane, dichlorométhane, acétate d'éthyle, alcools.
De préférence, l'amorceur thermique est sélectionné dans le groupe : azo-
bis-isobutyronitrile, chlorhydrate de 2,2-azobis(2-amidinopropane), 2,2-
azobis(isobutyramide)di hydrate, peroxyde de benzoyle,
dipropylperoxodicarbonate.
La solubilité limitée de l'anhydride maléique dans certains solvants et la
réactivité de sa fonction anhydride dans certains solvants ou en présence
d'autres
monomères nécessitent de déterminer les compositions qui conviennent à la
bonne mise en oeuvre du procédé. Par un choix judicieux des réactifs on peut,
dans des conditions variées d'amorçage (thermique, photochimique ou
radiochimique (faisceau d'électrons)), obtenir des monolithes présentant la
perméabilité désirée. Parmi les diverses compositions qui ont été évaluées de
manière systématique, il a été possible de retenir plusieurs formulations
précurseurs de monolithes présentant des caractéristiques de porosité (i.e.
perte
de charge à débit donné) dans la gamme de valeurs souhaitée.
L'une des formulations de base pour former un gel d'anhydride maléique
avec un éther de vinyle contient de l'anhydride maléique (AM) associé au
divinyl
éther du triéthylèneglycol (DVE3) ou au divinyléther du bis(hydroxyméthyl)-1,4-
cyclohexane (CHVE) avec un rapport en moles des insaturations maléiques et
vinyliques de 1 :1 dans un mélange des solvants : acétate d'éthyle cyclohexane
(50-50% en poids).
L'utilisation de deux molécules d'anhydride maléique pour une de ce type
de diéther assure un nombre de fonctions anhydride plus important que dans
d'autres matériaux monolithiques fonctionnalisables connus. La
copolymérisation
est alternée et espace les groupements fonctionnalisables.
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Le comportement fluidique de ces monolithes a été étudié dans des
capillaires ou des canaux de microsystèmes de diamètre interne 75 pm avec un
débit de tétrahydrofurane (THF) variant de 1pi/min à 4pI/min. Les mesures de
pression présentées sur la Figure 3 annexée montrent que l'augmentation de la
5 perte de charge avec le débit se produit de manière linéaire dans une
colonne
constituée d'un monolithe à base d'anhydride maléique et de divinyléther du
triéthylèneglycol polymérisé dans un capillaire de diamètre interne 75 pm, par
exposition à un rayonnement UV pendant 2 min (Figure 3a) et pendant 3 min
(Figure 3b). Ces phases sont facilement polymérisables sous rayonnement UV
10 avec et sans emploi d'un photoamorceur.
Pour chaque ratio monomères : solvants (pourcentages en poids): 40%-
60%; 25-75% ; 20%-80%; 10%-90%, diverses formulations de solvants
porogènes ont été évaluées. La perméabilité des monolithes à base d'anhydride
maléique peut être ajustée par des variations de la composition des
formulations,
en termes de proportion de monomères dans le mélange précurseur, et de
composition du mélange de solvants porogènes. La Figure 4 annexée représente
l'influence de la composition en termes de teneur pondérale en monomères
(anhydride maléique et diéther de vinyle équimolaires en fonctions insaturées)
et
d'acétate d'éthyle dans le mélange précurseur du monolithe sur la perte de
charge
par unité de longueur pour un débit de 1 pL/min après polymérisation sous
rayonnement UV (3 min, diamètre interne du capillaire 75 pm).
D'autres formulations évaluées comprennent comme monomères de
l'anhydride maléique et du diacrylate d'hexanediol, le rapport molaire entre
les
molécules de monomères étant de 2 :1 alors que le rapport en poids est de
1 :1,15. Ces formulations permettent d'obtenir un autre type de phase avec une
forte teneur en l'anhydride maléique, une perméabilité adaptée et une
morphologie homogène.
Les formulations suivantes ont été mises au point pour obtenir des phases
avec des perméabilités plus importantes que dans les exemples précédents en
introduisant un mono-acrylate de type acrylate de butyle ou un diacrylate
associé
à un éther de vinyle :
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- AM:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de 2 :1
alors que le rapport en poids est de 1: 1,53 ;
- AM:BMA:DVE3, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
1 : 1 :1 alors que le rapport en poids est de 1 :1,45: 1,7 ;
- AM:BMA:CHVE, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
1 : 1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1,7;
- AM:DVE3:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
4 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 2: 1: 1,13 ;
- AM:DVE3:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
4:1 :1 alors que le rapport en poids est de 2: 1: 1,5 ;
- AM:CHVE:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
4 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 2,3: 1: 1,3;
- AM:BMA:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
1 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 2,3 ;
- AM:BMA:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères étant de
1 : 1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 3;
- AM:BMA:DVE3:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères
étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1: 1,15 ;
- AM:BMA:DVE3:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères
étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1: 1,45: 1: 1,5 ;
- AM:BMA:CHVE:HDDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères
étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1,17: 1,7: 1: 1,3;
- AM:BMA:CHVE:TPGDA, le rapport molaire entre les molécules de monomères
étant de 2 :2 :1 :1 alors que le rapport en poids est de 1,17:1,7:1:1,8.
Les abréviations utilisées sont : AM pour anhydride maléique, BMA pour
méthacrylate de butyle, CHVE pour divinyl éther de bishydroxymethyl-1,4-
cyclohexane, DVE3 pour divinylether de triethyleneglycol, HDDA pour diacrylate
de
1,6-hexanediol, TPGDA pour diacrylate de tripropylène glycol.
La combinaison judicieuse de la composition des mélanges précurseurs et
des conditions de polymérisation permet l'obtention de matériaux monolithiques
possédant une perméabilité bien définie. Ainsi, des colonnes à but
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chromatographique élaborées dans ces conditions et parcourues par du THF à un
débit de 1 pL/min conduisent à une perte de charge comprise entre 3 bars et
150
bars, pour une longueur de 20 cm et un diamètre interne de 75 pm.
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des matériaux
monolithiques dans lesquels les fonctions anhydride maléique sont
fonctionnalisées par réaction avec des composés nucléophiles.
La fonctionnalisation est réalisée par addition de nucléophiles par perfusion
ou sous forme de solution aqueuse, organique, hydro-organique d'émulsion, de
mini ou microémulsion. La nature chimique de ces composés peut être très
variée : composés organiques simples porteurs d'au moins une fonction
nucléophile (comme des amines aliphatiques ou aromatiques, des alcools,
phénols, phosphines, et composés à hydrogène activé), des composés à squelette
hydrocarboné plus complexe et/ou porteurs de fonctions chimiques multiples,
neutres ou ioniques, des oligomères et des polymères synthétiques, des
protéines,
des enzymes, des anticorps, des acides nucléiques etc.
Les propriétés qui résultent de cette fonctionnalisation sont en conséquence
extrémement variées : balance hydrophile/hydrophobe ajustable, présence : de
charges électriques positives ou négatives, de groupements organiques
fonctionnels, éventuellement optiquement actifs, de substrats spécifiques, de
sites
de reconnaissance, de sites catalytiques artificiels ou enzymatiques.
Les monolithes contenant les fonctions anhydride maléique présentent en
outre l'avantage de posséder des fonctions ioniques de type carboxylate, qui
sont
générées soit par le couplage avec le nucléophile fonctionnel, soit par
hydrolyse
de la totalité ou du reliquat de fonctions anhydride maléique. Ces fonctions
ionisées peuvent s'avérer très utiles pour réaliser de
l'électrochromatographie
capillaire, ou pour générer un flux électro-osmotique pour le transport de
solvants
ou de solutions dans les microsystèmes.
Les conditions de la modification chimique des différents monolithes
contenant des fonctions anhydride maléique ont été étudiées : effet de la
concentration, de la nature du solvant (aqueux ou non), du pH. Il est
notamment
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possible de réaliser avec une grande efficacité le couplage de nucléophiles en
solution aqueuse, en certaines conditions de pH.
L'homme du métier peut imaginer le couplage simultané de différents
nucléophiles : par exemple un composé biologique actif et du polyéthylène
glycol
qui porte une fonction amine (peg-NH2) pour ajuster le caractère hydrophile du
matériau poreux fonctionnalisé. L'hydrolyse ultérieure permet de désactiver
les
fonctions anhydride maléique qui n'auraient pas réagi.
Fonctionnalisation avec des amines aliphatiques possédant de 4 à 18 atomes de
carbone
La fonctionnalisation est effectuée en dynamique, dans des conditions douces,
en
perfusant au travers de la colonne une solution de concentration variable
entre
0,5% jusqu'à 50% (en poids) de l'amine dans le THF, le toluène ou
l'acétonitrile
(selon la nature de l'amine) pendant une durée comprise entre 1 h et 4 h. Une
fois
la modification terminée, la colonne est lavée avec du THF, puis les fonctions
résiduelles d'anhydride maléique sont neutralisées pendant 1 h environ par
perfusion d'une solution tampon de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) à
pH 8.
Fonctionnalisation avec des enzymes : la trypsine
La modification avec la trypsine est effectuée en dynamique pendant un temps
qui
varie de 1 h à 4 h selon la température choisie, le plus souvent entre 4 C et
25 C.
La gamme des concentrations choisie pour immobilisation de la trypsine a été
définie entre 0,02 mg/ml jusqu'à 1 mg/ml de trypsine dans du tampon phosphate
selon le volume de réacteur. Le réacteur est ensuite lavé avec une solution de
tampon phosphate (PBS) et ensuite avec du tampon TRIS pour conditionner la
colonne.
Fonctiônnalisation avec un peptide : la streptavidine
Le protocole d'immobilisation est analogue à celui présenté dans l'exemple
d'immobilisation de la trypsine ; la concentration de la streptavidine est de
0,01
mg/ml avec une durée d'immobilisation de 1 à 8 h à température ambiante.
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Fonctionnalisation avec des polymères synthétiques : à fonction amine primaire
terminale
La modification est réalisée par perfusion du monolithe avec une solution dans
le
THF d'un polymère possédant une extrémité amine primaire (poly(N-
isopropylacrylamide) ou polyéthylène glycol) et d'une amine tertiaire telle
que la
triethylènediamine, pendant 1 h à 4 h, selon la concentration de la solution
du
polymère fonctionnel à greffer, selon le degré de polymérisation de ce
dernier, et
selon la concentration en amine tertiaire.
Les matériaux monolithiques à base d'anhydride maléique fonctionnalisés
selon l'invention ont été caractérisés par plusieurs méthodes, comme
exemplifié
ci-après.
Caractérisation par spectroscopie infrarouge
Des monolithes fonctionnalisés avec des amines aliphatiques et avec des
polymères ont été caractérisés par la spectroscopie infrarouge (IR) après
lavage et
1,5 séchage. Les analyses ont été effectuées en mode transmission après
réalisation
d'une pastille de poudre de monolithe avant et après modification avec du KBr.
Dans le spectre du monolithe modifié, on observe l'apparition des bandes
amides
à 1654 cm"1 et 1556 cm 1, ainsi que la disparition des bandes caractéristiques
de la
fonction anhydride à 1855 cm-1 et 1780 cm 1. Un exemple est présenté sur la
Figure 5 annexée, qui illustre les modifications du spectre IR de poudres
préparées à partir de monolithes à base d'anhydride maléique, avant et après
modification avec de la n-dodécylamine.
Caractérisation par fluorescence
Des monolithes modifiés avec des récepteurs d'interactions spécifiques ont été
caractérisés par la fluorescence à 532 nm du marqueur porté par de la
streptavidine-Cy3 excitée à 580 nm. On observe une nette fluorescence des
échantillons modifiés avec de la streptavidine et aucune sur des monolithes
témoïns.
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Caractérisation par l'analyse élémentaire d'azote
Des monolithes modifiés avec des diverses molécules (comme la trypsine) ont
été
caractérisés par l'analyse élémentaire de l'azote.
Mesure de la perte de charge
5 Les modifications structurales induites par la fonctionnalisation chimique
s'accompagnent de modifications limitées de la perméabilité des monolithes. Le
colmatage de la structure poreuse est évité. Des mesures de pression à
différents
débits de solvants imposés ont révélé des augmentations limitées de la perte
de
charge. Les résultats présentés dans la Figure 1 illustrent les changements
10 modifiés obtenus après traitement avec la n-hexylamine.
Hydrolyse de BAEE sur des réacteurs trXpsiques
L'activité enzymatique des phases monolithiques fonctionnalisées avec de la
trypsine a été mesurée en étudiant la cinétique d'hydrolyse de l'ester
éthylique de
la N-benzoyl arginine (BAEE). Des réacteurs trypsiques préparés selon
différents
15 protocoles ont été alimentés par une solution de substrat au moyen d'un
pousse-
seringue et reliés en aval à une cellule à circulation placée dans
spectromètre UV.
L'efficacité de l'hydrolyse a été suivie en continu par la mesure de
l'absorbance à
253 nm.
Les propriétés fluidiques des matériaux monolithiques à base d'anhydride
maléique selon l'invention ont été caractérisées selon différentes méthodes
présentées ci-après.
Caractérisation fluidique à basse pression
Des monolithes possédant une perméabilité élevée, préparés à partir de
certaines
formulations à base d'anhydride maléique par polymérisation thermique,
photochimique ou radiochimique, ont fait l'objet de mesures de débit sous
faible
pression de (THF, toluène à pression constante inférieure à 0,05 bar). La
Figure 6
annexée présente les propriétés d'écoulement du toluène à travers une phase
composée des monomères AM/BMA/CHVE, polymérisée sous rayonnement UV
pendant 1 h dans une colonne de 1 mm et non modifiée (faible perte de charge,
de 3 bars sur une colonne de 20 cm longueur et de 75 pm diamètre interne).
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Caractérisation fluidique à haute pression
Des monolithes à base d'anhydride maléique de plus faible perméabilité,
préparés
à partir de certaines formulations à base d'anhydride maléique par
polymérisation
thermique, photochimique ou radiochimique dans des capillaires de diamètre
interne compris entre 75 pm et 1 mm, ont fait l'objet de mesures de perte de
charge. L'écoulement d'un solvant est imposé par une pompe HPLC (Waters) à un
débit variant de ipl/min jusqu'à quelques dizaines de pl/min ou par un pousse-
seringue haute pression (Harvard Instrumentation). Des pressions pouvant
atteindre 150 bars ont ainsi été mesurées pour du THF s'écoulant avec un débit
de
lpL/min dans un capillaire de longueur 20 cm et de diamètre interne 75 pm.
Caractérisation fluidique des microsystèmes
La caractérisation fluidique des microsystèmes comportant des monolithes à
base
d'anhydride maléique élaborés à l'intérieurs de canaux de résine
photolithographiée SU-8, recouverts d'un capot en pyrex a été effectuée à des
débits de THF compris entre 1 pl/min et 10 pl/min. Les courbes notées C et D
reportées sur le graphe de la Figure 1 annexée présentent l'effet du temps de
polymérisation sur les propriétés fluidiques d'un microsystème possédant un
canal
de largeur 100pm et de hauteur 150pm, contenant un monolithe à base
d'anhydride maléique sur une longueur de 4 cm, avant (points C) et après
fonctionnalisation (points D) avec la n-hexylamine.
Caractérisation morphologique des monolithes
Les matériaux monolithiques à base d'anhydride maléique préparés selon
l'invention ont été caractérisés par microscopie électronique à balayage. La
Figure
7 annexée présente quatre phases monolithiques à forte teneur en anhydride
maléique: Figure 7a : Mélange de monomères AM/CHVE/BMA, dont 28% des
fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride maléique, le porogène
contenant de l'acétate d'éthyle ; Figure 7b : Mélange de monomères
AM/CHVE/BMA, dont 28% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride
maléique, le porogène contenant du toluène ; Figure 7c : Mélange de monomères
AM/CHVE, dont 50% des fonctions polymérisables proviennent de l'anhydride
maléique, le porogène contenant de l'acétate d'éthyle ; Figure 7d : Mélange de
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monomères AM/DVE3, dont 50% des fonctions polymérisables proviennent de
l'anhydride maléique, le porogène contenant de l'acétate d'éthyle. L'analyse
de la
macroporosité et de la taille de grains a été effectuée avec un logiciel
d'analyse
d'image SCION Image.
Selon un cinquième aspect, l'invention se rapporte aux diverses utilisations
des matériaux monolithiques fonctionnalisés pour microsystèmes analytiques. De
préférence, les matériaux monolithiques fonctionnalisés selon l'invention sont
utilisés :
- comme phase pour la séparation des molécules par une méthode
chromatographique sélectionnée dans le groupe : d'affinité, par interaction
hydrophobe, ionique, électrochromatographie, électrophorèse capillaire ;
- comme réacteur support de réactïf ou de catalyseur de réaction chimique
ou enzymatique ;
- comme support pour l'absorption, l'analyse et la détection de composés
chimiques.
L'invention sera mieux comprise à la lecture des exemples de réalisation
suivants non limitatifs de l'invention.
Exemple 1. Réacteur de séparation obtenu par fonctionnalisation avec la n-
hexylamine
Des analyses de type nanochromatographie liquide (nano-LC) ont été réalisées
pour évaluer les performances chromatographiques des colonnes obtenues de
monolithes à base d'anhydride maléique élaborés dans des capillaires et
fonctionnalisés par réaction avec des alkylamines. Les essais de séparation
des
peptides contenus dans des digestats de cytochrome C et de P-galactosidase ont
été réalisés en injectant de 0,1 p{ à 1pl de solution de digestat de
concentration
comprise entre 80 fmol/pl et 800 fmol/pl sur des colonnes de diamètre interne
75
pm et de longueur comprise entre 5 et 20 cm, avec élution par gradient
linéaire
eau-acétonitrile.
Un capillaire en verre de longueur 20 cm, revétu de polyimide et de 75 pm
diamètre interne, dont la surface interne a été modifiée avec un silane comme
le
gamma-aminopropyltriméthoxysilane (gamma-APS), a été remplie avec une
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solution contenant 20% (en poids) de monomères et le porogène composé de
toluène et cyclohexane. Cette colonne a été ensuite polymérisée sous faisceau
d'électrons avec une dose de 100 kGy et à un débit de 0,68 kGy/s par des
passages de 25 kGy. Après la polymérisation la colonne a été lavée au THF
pendant 1h à ipi/min, ensuite modifiée par une amine C6 dans THF (10% en
poids) pendant 2 h, lavée par perfusion de THF pendant 1 h et de tampon TRIS
pendant 1 h. Avant la séparation, la colonne a été stabilisée par perfusion
d'un
mélange eau : acétonitrile (50-50% en poids). La pression en cours d'analyse
n'a
pas excédé 49 bars pour une longueur de colonne de 20 cm.
La faisabilité de la séparation des principaux peptides a été démontrée sur
des colonnes de 5 cm longueur contenant un monolithe fonctionnalisé par la n-
hexylamine. La trace obtenue par spectrométrie de masse couplée à la
nanochromatographie liquide lors de la séparation de digestat de cytochrome C
(80 fmol/ l) sur une colonne de longueur de 8 cm et un diamètre interne de 75
m est présentée dans la Figure 8 annexée. Les peptides les plus hydrophobes de
cytochrome C ont été séparés et présentent un temps de rétention de plus de 15
min.
Exemple 2. Réacteur de digestion trXpsique
La digestion trypsique a été réalisée sur une colonne de 8 cm de long et 75 pm
de
diamètre interne. Le monolithe a été polymérisé sous rayonnement UV pendant 10
min, ensuite lavé pendant 1 h et modifié avec de la trypsine dans le tampon
phosphate PBS à 0,01 mg/mi pendant 1h à 4 C. La colonne a été ensuite lavée au
tampon PBS puis au tampon TRIS. La digestion de 20 pmol de Cytochrome C a été
effectuée en continu avec un débit de 3,5 pl/min sur un capillaire de longueur
8
cm de diamètre de 75 pm contenant un monolithe à base d'anhydride maléique
fonctionnalisé par de la trypsine. Le spectre de masse MALDI TOF obtenu à
partir
de 50 pI de solution de digestat est présenté sur la Figure 9 annexée.
L'exploitation des données permet l'identification de la protéine avec un
recouvrement de 65 % de la séquence.
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Exemple 3. Réacteur de digestion
L'hydrolyse de l'ester éthylique de la N-benzoyl arginine (BAEE) a été
réalisée sur
une colonne de 10 cm de long et 1 mm de diamètre interne. Le monolithe a été
polymérisé UV pendant 1 h, ensuite lavé avec du THF et modifié avec de la
trypsine dans le tampon PBS à 0,01 mg/ml, par perfusion pendant 4 h à 4 C. La
colonne est ensuite a été lavée au tampon PBS puis au tampon TRIS. L'hydrolyse
de BAEE (0,25 mM) a été effectuée par perfusion en dynamique avec détection
par spectrométrie UV à 253 nm. L'hydrolyse du BAEE approche 91% de
rendement, lorsque le temps de résidence dans la colonne est correctement
choisi, comme le montre le graphe présenté sur la Figure 10 annexée
(capillaire
de longueur 10 cm de diamètre de imm contenant un monolithe à base
d'anhydride maléique fonctionnalisé par de la trypsine).
Exemple 4. Réacteur d'affinité
La streptavidine a été immobilisée sur des phases monolithes à base
d'anhydride
maléique préparés par polymérisation sous rayonnement UV. Une interaction
spécifique a été réalisée avec un fluorophore portant de la biotine.
L'efficacité du
couplage a été démontrée par imagerie de la fluorescence du marqueur biotinylé-
CyS.
Exemple 5. Valve thermique
Des phases poreuses ont été préparées dans des microsystèmes fluidiques
comportant des canaux passant au travers de chambres de méme section et de
longueur 100 pm remplies de monolithe fonctionnalisé par du poly(NIPAM) à
fonction amine terminale. La température des chambres peut être modifiée au
moyen de résistances chauffantes insérées dans la structure du microsystème.
L'efficacité de la fonctionnalisation et de la réponse stimulée par une
élévation
contrôlée de la température a été démontrée par des essais d'écoulement de
i'eau
dans le canal à température variable, en imposant une pression de 1 bar le
débit
mesuré est 6pl/min à 20 C et passe à une valeur comprise entre 20 et 40
pl/min
à 40 C selon les conditions de la modification effectuée.
