Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
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Procédé de quantification rapide des micro-organismes
coliformes vivants dans un échantillon d'eau
L'invention concerne un procédé de quantification rapide des
micro-organismes coliformes vivants dans un échantillon d'eau, ainsi que
son utilisation.
En particulier, mais de façon non limitative, la présente
invention porte sur le procédé de quantification rapide des micro-
organismes -Escherichia coli dans un échantillon d'eau de baignade,
notamment d'eau de mer.
Dans le cadre de la surveiliance de la qualité des eaux de
baignade, les analyses courantes portent essentiellement sur les
paramètres microbiologiques et principalement sur la recherche de
bactéries indicatrices (coliformes fécaux tels que Escherichia coli et
entérocoques) témoignant d'une pollution fécale, qu'elle soit d'origine
humaine où animale (animaux à sang chaud). La présence de ces germes
dans l'eau indique que celle-ci a été contaminée par des matières fécales
et sous-entend une présence potentielle de germes pathogènes. Ainsi, la
réglementation de la qualité des eaux de baignade fixe des valeurs guides
et impératives qui correspondent à deux plafonds de concentrations de
ces indicateurs dans les eaux analysées et qui permettent d'évaluer la
qualité microbiologique des eaux.
Aujourd'hui, les méthodes normalisées utilisées pour
l'énumération des coliformes fécaux et des entérocoques reposent pour la
plupart sur des méthodes Pasteuriennes. Certaines méthodes sont basées
sur la mise en culture des microorganismes sur des milieux de culture
sélectifs puis sur leur quantification après une période d'incubation allant
de 24 heures à 48 heures. D'autres méthodes sont basées sur des
méthodes enzymatiques et reposent sur la détection d'une enzyme ou
d'une combinaison d'enzymes dans des conditions de croissarice en
cnnditions sélectives. Les mesurp~~ sont effectijées en microphaties Qt les
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Un des enjeux dans le domaine du diagnostic en microbiologie,
et dans celui de l'analyse des eaux de baignade en particulier, est de
développer des méthodes alternatives aux méthodes de culture qui soient
plus rapides.
Le brevet EP 0 386 051 propose un procédé de quantification
des micro-organismes coliformes totaux utilisant la mesure d'une activité
enzymatique spécifique (activité (3-D-galactosidase) dans des conditions
standardisées de pH, de température et de concentration en substrat.
La vitesse de formation des produits de la réaction (hydrolyse
du 4-méthylumbélliféryl-~-D-galactoside (MuGala) en acide 5-D-
galactosique et en 4-méthylumbelliferone (MUF) (fluorescent) catalysée
par l'enzyme P-D-galactosidase) est proportionnelle dans des conditions
standardisées à la quantité d'enzyme présente naturellement dans le
milieu réactionnel. En partant du principe que la quantité d'enzyme est
constante au sein des bactéries des espèces formant les micro-organismes
coliformes totaux, la mesure de l'activité enzymatique (suivi de la
cinétique de formation du 4-méthylumbelliferone (fluorescent) par
spectrofluorimétrie) permet de déterminer le nombre des micro-
organismes coliformes totaux, dans un échantillon d'eau, et donc d'en
déduire sa concentration.
En particulier, EP 0 386 051 prévoit l'ajout de constituants
aptes à augmenter l'activité enzymatique, pour activer la fluorescence et
faciliter la mesure de la vitesse de variation de la fluorescence dans le cas
où la concentration en micro-organismes est faible, sans attendre la
multiplication des micro-organismes par reproduction sur plusieurs
générations.
Il est également connu ( Use of erazymatle methods far rapid
enumeratian of calïforms ln fresh waters , Journal of Applied
Microbiology 2000, 88, 4(}4-413, George et al) de réaliser une
qlaa_ritification rapide des micro-organisriies coliformes vivants constitués
des Eseherïchfa colï, cian s un ~chi nt iliç~r~
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Il existe aussi une méthode normalisée de dénombrement des
Escherfchia coli dans l'eau (ISO 9308-3) dite microplaque , qui sert de
référence dans la réglementation relative à la qualité microbiologique des
eaux de surface, en particulier des eaux de baignade, pour déterminer le
niveau de contamination.
Dans cette méthode normalisée NF EN ISO 9308-3, l'échantillon
dilué selon plusieurs dilutions est ensemencé dans une série de puits
d'une microplaque contenant le milieu de culture déshydraté et le substrat
de l'enzyme, le 4-méthylumbélliféryl-~-D-giucuronîde (MuGiu). Après une
période d'incubation de 36 à 72 heures à 44 C, les puits de la microplaque
sont examinés sous rayonnement ultraviolet de longueur d'onde 366 nm.
La présence d'Escherichia coli dans un puit donné est indiquée par une
fluorescence bleue résultant de l'hydrolyse du MuGlu. Pour chaque
dilution, le nombre de puits positifs est noté. Les résultats sont donnés en
nombre le plus probable (NPP) par 100ml (le NPP est une estimation
statistique de la densité des micro-organismes, supposée répondre à une
distribution de Poisson dans les volumes ensemencés).
Il faut relever que cette méthode normalisée est
particulièrement adaptée aux eaux riches en matières en suspension.
Cependant, cette méthode normalisée par microplaque
nécessite en moyenne 48 heures alors que les méthodes de détection
rapide des Escherichia coli décrites dans l'art antérieur, permettent
d'obtenir un résultat en 1 heure et peuvent être utilisées comme
indicateur rapide de la qualité microbiologique de l'eau et donc comme
outil de gestion du risque sanitaire immédiat.
Cependant les méthodes de détection rapides d'Escherichia coll
ne donnent pas toujours un résultat comparable à la méthode normalisée
par microplaque . Notamment, dans le cas des eaux chargées en matières
en suspension de type sable ou sédiments, les méthodes rapides donnent
un résultat supérieur à celLJi de la méthode normalisée.
La urésente invention a pour objectif de fournir r an procédé de
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Dans la suite du présent texte et au sens de la présente
invention, par rapide , on entend un procédé apte à être réalisé en
quelques heures au maximum, et notamment en 1 heure au plus.
A cet effet, selon la présente invention, le procédé est
caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
a) réaliser une étape préliminaire de traitement de l'échantillon permettant
de retirer au moins une partie des particules en suspension dans l'eau ;
b) filtrer l'échantillon sur un filtre ayant une taille de pores inférieure à
la
taille des micro-organismes coliformes, afin de concentrer les micro-
organismes coliformes sur le filtre ;
c) placer le filtre retenant les micro-organismes coliformes dans un
récipient contenant une solution tampon ;
d) porter le récipient à une température d'activité de l'enzyme mesurée ;
e) ajouter dans le récipient un substrat fluorogène apte à former, par
hydrolyse sous l'effet de l'enzyme, de la 4-méthylumbelliferone (MUF) ;
f) réaliser à intervalles régulier la mesure de la quantité de fluorescence
émise en :
f1) prélevant une quantité du milieu réactionnel contenu dans ledit
récipient,
f2) ajoutant un agent modificateur du pH pour augmenter la
fluorescence ;
f3) exposant le prélèvement à de la lumière d'une longueur d'onde
proche de la longueur d'onde d'excitation de la 4-méthylumbelliferone
(MUF) ;
f4) réalisant la mesure de fluorescence émise par la 4-
méthylumbelliferone (MUF) produite par le substrat fluorogène sous l'effet
de l'enzyme contenue dans les micro-organismes coliformes ;
g) calculer la vitesse de variation de la fluorescence émise ; et
h) déterminer la concentration des micro-organismes coliformes dans
l'échantillon d'origine à partir de la vitesse de variation calculée et d'un
schéma de corrélation de vitesse de variation en fonction de la
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détection rapide, un résultat comparable à celui obtenu par la méthode
normalisée par microplaque, quelle que soit la turbidité de l'eau à tester.
Cette solution présente aussi l'avantage supplémentaire, de
permettre, outre une simplicité de mise en uvre de cette étape
5 préliminaire, de ne pas nécessiter un temps de mise uvre important.
Globalement, grâce à la solution selon la présente invention, il
est possible de façon très simple, de mettre en oeuvre une méthode de
quantification rapide des micro-organismes vivants qui donne un résultat
comparable à la méthode normalisée.
Le procédé selon l'invention comporte l'une ou plusieurs de
autres dispositions préférentielles suivantes :
- l'étape préliminaire de traitement comporte une pré-filtration ;
- la pré-filtration est réalisée avec au moins un filtre présentant
une porosité supérieure ou égale à 8 pm ;
- la pré-filtration est réalisée avec un premier filtre et un
deuxième filtre présentant une porosité inférieure au premier filtre, placé
en amont du premier filtre ;
- la pré-filtration est réalisée avec un premier filtre présentant
une taille de pores supérieure ou égale à 15 pm (avantageusement
sensiblement égale à 20 pm ) et un deuxième filtre présentant une taille
de pores supérieure ou égale à 8 pm (avantageusement sensiblement
égale à 10 pm) ;
- le premier filtre et le deuxiéme filtre sont superposés ;
- le(s) filtre(s) est (sont) réalisé(s) dans un matériau
appartenant au groupe comportant le Nylon (marque déposée), le
polycarbonate, l'acétate de cellulose, le sulfone, le polyfluorure de
vinylidéne (PVDF), le polyéthersuifone (PES) et le polyacrylonitrile, ou plus
généralement dans tout type de polymère de synthèse.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention ressortiront
à la lecture de la description suïvande faite à titre d'exempïe et en
référence aux dessins annexés dans lesquels
- la eigure 1 schématiquement une particule en
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- la figure 3 est un diagramme représentant des résultats
obtenus selon la méthode normalisée, selon la méthode rapide de l'art
antérieur et selon l'invention.
Sur la figure 1, est représentée schématiquement une particule
10, par exemple un grain de sable, susceptible de se trouver en
suspension dans Ipeau de l'échantillon dont on souhaite mesurer la
concentration en bactéries Escherichia colï
Cette particule 10 porte sur sa surface dix bactéries Escherichia
coli 12.
Dans le cas de la mise uvre de la méthode de quantification
normalisée, les particules de matiéres en suspension auxquelles sont
fixées des cellules bactériennes du type Escherichia coli sont réparties
dans les puits des microplaques. Chaque particule 10 tombée dans un
puits entraîne le comptage de ce puits comme positif, c'est-â-dire,
statistiquement contenant une seule cellule de Escherichfa coli, alors
qu'en réalité il y a un nombre supérieur de Escherichia coli (dix dans le
cas de la particule 10 de la figure 1).
En revanche, pour la méthode rapide enzymatique, c'est une
activité globale que l'on mesure. Ainsi, toutes les cellules bactériennes
Escherichia coli attachées aux particules présentent une activité
enzymatique mesurable.
C'est pour cette raison que la méthode rapide enzymatique de
l'art antérieure donne un résultat supérieur à celui de la méthode de
quantification normalisée par microplaque du fait de la numération de
toutes les cellules de E coli, y compris chacune de celles attachées aux
matières en suspension.
La présente invention a donc pour principe de retirer tout ou
partie des particules en suspension dans l'eau afin de quantifier les micro-
organismes coliformes vivants, notamment les Escherichia coli,
individuelfement sans prericTr~- en consid~,r aJon celles qui sont regroupées
sur une particule.
A titre d'exempl~7 inventio-i, ont été
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Dans cet exemple, l'enzyme est la P-D-glucuronidase, le
substrat fluorogène est du 4-méthylumbélliféryl-R-D-glucuronide (MuGlu)
afin de quantifier les micro-organismes coliformes vivants Escherichia Coli
et l'agent modificateur du pH est de l'hydroxyde de sodium, pour obtenir
un pH supérieur à 10.
Egalement, dans cet exemple, l'étape préliminaire de traitement
de l'échantillon qui a été utilisée pour retirer au moins une partie des
particules en suspension dans l'eau est la pré-filtration.
A cet effet, l'échantillon d'eau à analyser est filtré au travers
de deux filtres superposés. Le premier situé sur le dessus est en
Nylon (marque déposée) et de porosité 20 pm. Le deuxième filtre, situé
sur le dessous est en polycarbonate et de porosité 10 pm.
C'est le filtrat issu de cette étape de pré-filtration qui est utilisé
pour réaliser la mesure d'activité enzymatique rapide.
Dans cet exemple, on cherche à mesurer la quantité de
bactéries de type Escherichia coli.
On réalise donc ensuite une étape de filtration pour concentrer
les Escherichia coli sur un filtre.
Cette étape de filtration consiste à passer les 100 mL
d'échantillon du filtrat sur un filtre en polycarbonate de 47 mm de
diamètre et 0.22 pm de porosité,
Avant la fin de la filtration, on effectue le rinçage des parois de
l'entonnoir à l'eau distillée (ou à l'eau apyrogène), Ensuite, on place le
filtre de polycarbonate dans un récipient contenant du tampon Phosphate
(pH 6.9) à 44 C (bain-marie thermostaté).
Ensuite, on effectue la mesure de l'activité enzymatique
proprement dite.
Pour cela, on ajoute de la solution de 4-méthylumbélliféryl-p-D-
glucuronide (MuGlu 1.1 mg/ml, iriton X100 0.040lo vol/vol) dans le
récipient contenant le mélange réactionnel.
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On utilise une lumière avec une longueur d'onde d'excitation de
362 nm et une longueur d'onde d'émission de 445 nm.
On réalise enfin le traitement des données, à savoir des
mesures de fluorescence.
Il s'agit du calcul de la pente de la droite représentant
l'évolution de la concentration en MUF (nmoiJL) en fonction du temps, et
qui est significative de l'activité enzymatique (pmol de MUF/minute).
La concentration en E. co/i(nombre de E. coli pour 100 mL) est
déterminée à l'aide de la droite de corrélation Activité
Enzymatique/Dénombrement par microplaque . Le nombre de E. coli dans
les 100 mL d'échantillon est calculé en même temps que l'activité
enzymatique.
Cette droite de corrélation est représentée sur la figure 2 dans
le cas de l'eau de mer : il s'agit de la régression linéaire logarithmique
entre l'activité GLUase et la concentration en Escherichia coli pour des
échantillons d'eau de mer d'un site de la Méditerranée (Pyrénées-
Orientales, France) , à savoir Log (GLUase act. pmoles/min.100 ml) _
0.6534 Log (Escherichia coli/100 ml) + 0.8856 (r~= 0.7229).
Sur la figure 3, on a reporté, les résultats obtenus avec les trois
méthodes: méthode normalisée, méthode enzymatique rapide sans pré-
filtration, et selon l'invention, à savoir la méthode enzymatique rapide
avec l'étape de pré-filtration sur des échantillons d'eau de mer de turbidité
allant de 34 à 223 FNU.
Les résultats montrent que plus la turbidité est importante, plus
la réalisation de l'étape de pré-filtration est cruciale pour obtenir des
résultats proches de ceux obtenus avec la méthode normalisée et fournir
un indicateur de la qualité microbiologique réglementaire.
Sur la base de ces résultats, on comprend que le procédé selon
l'invention peut être mis en uvre quelle que soit la turbidité de l'eau, et
qu'elle est très avantageuse pour l'analyse d'une eau présentant une
turbidité supérieure ou e-gaie- à 35 FNU , avantageusement supériEUre a
50 FNU.
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seul filtre, par exemple un filtre de porosité 8 pm notamment en
polycarbonate.
Il est à noter que le deuxième filtre en polycarbonate et de
porosité 10 pm peut être remplacé par un filtre ayant une porosité de
8 pm.
L'utilisation de deux filtres superposés dans une même unité de
pré-filtration est équivalente à la réalisation successive des deux pré-
filtrations.
Le choix du ou des filtre(s) de l'étape de pré-filtration repose
sur le matériau et sur la taille des pores (seuil de coupure), étant entendu
qu'il faut éviter un seuil de coupure trop faible entraînant un colmatage ou
encore retenant les bactéries formant les micro-organismes coliformes
vivants à quantifier.
La présente invention n'est pas non plus limitée à la mise en
oyuvre d'un traitement préliminaire consistant à effectuer une préfiltration.
En effet, on peut retirer au moins une partie des particules en
suspension dans l'eau par d'autres moyens.
En particulier, cette étape préliminaire de traitement peut
comporter ou consister en une centrifugation à basse vitesse.
De cette façon, on peut séparer les particules en suspension du
filtrat.
Cette étape préliminaire de traitement peut aussi comporter ou
consister en la mise en uvre d'une sédimentation ou d'une décantation,
c'est-à-dire de la chute naturelle des particules par la mise au repos de
l'échantillon, puis la récupération du surnageant pour effectuer la mesure .
Une telle étape préliminaire de sédimentation peut être
combinée à un phénomène physico-chimique d'agrégation (floculation ou
coagulation)
Il faut noter que la présente iGivention propose une étape de
trQitement pré.liminaire permettant d'adaptef- les résoltats obtenus par la
tnéthocle ~api~e de l'art antérieur aux résultats obtenus par la méthode
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particules avant de réaliser l'analyse par la méthode normalisée, et ceci
afin de dénombrer toutes les bactéries. Dans le cas du prétraitement par
décrochage, la fraction de l'échantillon mesurée par les deux méthodes est
celle des bactéries non fixées et celle des bactéries fixées aux particules
5 des matières en suspension.
Un tel décrochage peut être mis en oeuvre par différentes
méthodes physico-chimiques : traitement par ultrasons, utilisation de
détergents...
