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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
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1_
Anticorps diriges contre le récepteur du LDL
La présénte invention concerne un anticorps monoclonal
dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density
Lipoprotein) , se liant au peptide correspondant aux
acides aminés 195-222 (SEQ ID NO : 1) de la séquence
peptidique du récepteur humain des LDL, son
utilisation comme médicament, une composition
pharmaceutique contenant cet anticorps,, ainsi que son
utilisation dans les analyses immunohistochimiques de
tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les
analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de
quantification in vivo.
Le cholesté-rol est un lipide fabriqué par le foie,
l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il
est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient
dans la fabrication des hormones sexuelles, -des
corticostéroïdes comme la cortisone naturelle et des
composants de la bile.
Insoluble dans le sang, le cholestérol y est
transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL
(Low Density Lipoprotein).
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la céllulé grâce
à une protéine cellulaire de surface capable de
reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R). Le
complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par
endocytose, et les LDL vont être digérées par les
lysosomes, libérant cholestérol que la cellule T-à
utiliser.
La cholestérolémie désigne le taux de cholestérol dans
le sang. Une hypocholestérolémie traduit une
insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une
hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol
dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut
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résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le
LDL-R, ou encore d'une défaut d'internalisation des
LDL, qui peuvent provenir d'une altération
structurelle familiale du LDL-R chez ces patients
(Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients
atteints de certains cancers présentent une
hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la
conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par
les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces
dernières induisent une augmentation du niveau
d'expression du récepteur des LDL'(LDL-R) au sein des
organes tumoraux (Henricksson et al., 1989).
Il existe ainsi une corrélation eritre- l'augmentation
du niveau d'expression du LDL-R par les cellules 'et
certains cancers. On peut citer notamment le cancer de
la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des
ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et 'les
leucémies.
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du
virus de l'hépatite C est médi.ée par les LDL-R. Ainsi,
le LDL-R pourrait servir de *récepteur'vir~.l.
Ainsi, il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de
nombreux mécanismes d'importance dans la vie
cellulaire, ainsi que dans denombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant pour
comprendre son profil d'expression tissulaire dans les
pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la
mise au point et l'étude de nouveaux outils
,thérapeutiqués pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a
cherché à mettre au point un nouvel outil présentant
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une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le
rendant particulièrement adapté à l'étude de
l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses
immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou
cirrhosés, en western blot, en ELISA, ou en tests de
quantification in vivo ou encore pour la fabrication
de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur
mise en cauvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention
Ainsi, l'.invention se rapporte à un anticorps
monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL
(Low Density Lipoprotein).
Un premier objet de l'invention se rapporte à un
anticorps monoclonal dirigé.contre le récepteur humain
des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide
correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des
LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine
transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend
trois régions : la région extra-cellulaire (1-768), la
région transmembranaire (768-790) ~ et la région
cytoplasmique (790-839). La région -extracellulaire est
divisée en deux sous-régions : celle de liaison des
LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de
liaison des LDL.:'(322-768) .
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière
à se lier de manière spécifique au peptide
correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est
situé dans la zone de liaison des LDL. Ce peptide a
été choisi car il présente une bonne accessibilité à
l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans
la zone de liaison des LDL, et à sa conformation
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4=
tridimensionnelle. De plus, il présente la
caractéristique d'être immunogène, de par sa
composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des
anticorps selon l'invention en vue de produire un
anticorps bon compétiteur des LDL et présentant donc
une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce peptide
présente 85-'. d'homologie avec le LDL-R murin ce qui
permet la production d'anticorps qui cross-réagissent
chez l'homme et la souris, d'où la possibilité de
mettre en uvre à la fois des tests (de toxicité
notamment) chez la souris et une utilisation chez
l'homme.
D'autres avantages concernant le .choix de ce peptide
particulier ressortiront à la lecture de la suite de
la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie
l'anticorps peut correspondre à un peptide compris
dans le peptide correspondant aux acides aminés 195-
222 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus particulièrement,
on entend par peptide toute molécule formée par
l'enchaînement d'au moins 2 acides aminés,
préfërentiellement de 5 à' 35 acides aminés, 'et
possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions anticorps
monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal
se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps
possédant une spécificité identique et uniqu~~~.
De plus, on entend par anticorps tout anticorps
entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou
protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment
d'immunoglobuline, ainsi que tout dérivé d'anticorps.
Une molécul'e d'immunoglobuline est composée de 4
polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy)'identiques
de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light)
identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère est
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5.
composée de 2domaines; un domaine variable V et un
domaine constant C, repliés indépendamment l'un de
l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La
chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH
et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine
comprend environ 110 acides aminés et est structuré de
manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées
par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est
liée à une chaîne légère par un pont disulfure
également
La région qui détermine la spécificité de l'anticorps
pour l'antigène est portée par les parties variables,
alors que les parties constantes peuvent interagir
avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des
molécules comme le complément pour médier différentes
propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par domaine d'immunoglobuline
l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2,
CH3, CH4. L'anticorps selon l'invention pouvant
avantageusement contenir un ou plusieurs de ces
domaines, toutes les combinaisons entre les domaines
précédemment cités font partie de l'invention.
On entend par fragment d'immunoglobuline un des
fragrricnts cixoisis parmi le fragment Fab, Fab',
F(ab' ) 2., Fc, un scFv ou - un CDR- --(Compiem-antarity
Determining Region).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la
papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle
fragment rab (Fragment Antigen Binding), et un
fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc
est le support des fonctions effectrices des
immunoglobulines.
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est
généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par
deux ponts disulfure, et le f-ragment Fc est scindé en
plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de
deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure
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6"
intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et
légères, on constate que la variabilité de séquence
n'est pas distribuée de .manière égale. En effet, les
régions variables sont constituées d'une part de
régions très peu variables nommées charpente ou
framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et
d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité
est extrême : il s'agit des régions
hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à
CDR3 ) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un
fragment constitué uniquement des domaines variables
VH' et VL d'un anticorps monoclonal; et dont la
structure est stabilisée par un court'bras peptidique
flexible placé entre les deux domaines (Billiald et
al., 1995). De tels fragments peuvent être produits
par des bactéries. Ces molécules conservent la
capacité à reconnaître de façon spécifique un
antigène. De petite taille (29 kDa), ils sont peu
immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps
entiers.
Ainsi, l'anticorps selon l'invention pouvant
avantâgeusement contenir ia"ri düplusiéurs" dë "cés
fragments, toutes les combinaisons-entre les fragments
précédemment cités font partie de l'invention.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps
selon l'invention contient au moins un 'domaine
d'immunoglobuline et au moins 'un fragment
d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une
ou plusieurs régions variables ou hypervariables.
Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout
anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou
plusieurs miitations, substitutions, délétions et/ou
additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés.
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L'anticorps selon l'invention, qui possède la
particularité de se lier au peptide correspondant aux
acides aminés 195-222 (SEQ ID NO : 1), ainsi que les
caractéristiques présentées ci-après, permet de
manière avantageuse le recrutement de cellules
effectrices. A cet égard, une cellule effectrice
est une cellule qui provoque la destruction des
cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
( cellules cibles ). Plus particulièrement, les
cellules effectrices expriment à léur surface un
récepteur du fragment Fc des anticorps. De. plus, on
entend par recrutement la faculté que possède
l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules
capables~de provoquer la destruction des céllules-
cibles. La destruction peut être une lysé, c'est-à-
dire une destruction des cellules-cibles avec
libération de leur contenu. Le peptide sur lequel se
lie l'anticorps selon l'invention ( peptide-cible ),
est situé dans la région de liaison des LDL (ligand
naturel du LDL-R), de manière à ce que l'anticorps
selon l'invention soit un bon compétiteur des LDL, et
présente donc une affinité pour le LDL-R comparable à
celle du ligand naturel des LDL-R.
Par cëtté liaison, l'anticorps selon l'invention
permet le recrutement de - cellules - capables de
provoquer la destruction de cellules sur lesquelles le
polypeptide selon l'invention est lié, c'est-à-dire de
cellules exprimant à leur surface le LDL-R
( ceUules-cibles ).
On entend par liaison la fixation du polypeptide
sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des
cellules capables de provoquer la destruction des
cellules-cibles.
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer). Elles peuvent aussi être des
macrophages, des neutrophiles, le lymphocyte T4, le
lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules possèdent
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à leur surface des récepteurs du fragment Fc des
polypeptides selon l'invention. Ces anticorps ou
polypeptides se lient à la cellule-cible par leur
fragment variable et se lient aux cellules effectrices
par leur fragment constant. Cett,e relation dépendante
des anticorps entre les cellules cibles et les
cellules effectrices provoque la lyse des cellules
cibles par un mécanisme de type ADCC (Antibody
Dependent Cellular Cytotoxicity).
De manière avantageuse,. les cellules cibles selon
l'invention sont des cellules tumorales.
De manière avantageuse,- l'anticorps selon l'invention
permet la destruction des cellules cancéreuses
( cellules cible ) En effet,'le recrutement dés
cellules effectrices erigendre une destruction des
cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention
est lié. Or, des études ont montré une corrélation
entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R
par les cellules et certains cancers. En effet, il
s'avère que des patients atteints de certains cancers
présentent une hypocholestérolémie. . Cette
hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-
utilisation du cholestérol par les cellules
cancéreuses. Pour leur survié, ces~â.ernièrés induisent
une augmentation du- niveau - d' expressi~on du~ récépteur
des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux
(Henricksson et al., 1989). On peut citer notamment le
cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas,
des ovaires, du colon, du poumon,"de l'estomac et les
leucémies.
Ainsi, les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R
seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon
l'invention.
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal
dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density
Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux
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acides aminés 195-222 (SEQ ID NO : 1) de la séquence
peptidique du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une régi.on CDR
(Complementarity Determining Region) de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les
séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3,-SEQ ID NO : 4,
SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, et au
moins une région CDR de chacune des chaînes lourdes de
l''anticorps selon l'invention possède une séquence
peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une
séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5,
SEQ ID NO : 6; SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 21, SEQ ID
NO : 22, SEQ ID NO : 23.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDR1
et/ou CDR2 et/ou CDR3.
Les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID
NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7
sont définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of
Proteins of Immunological Interest", NIH Publication,
91-3242 (1991)].
Les séquences SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO ,: 19, SEQ ID
.. _, _..... _ . . ._ - ---._. .__
NO : 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO 22 et SEQ ID NO :
23 sont définies selon l'analyse IMGT (international
ImMunoGeneTics database) [Lefranc, M.-P. et al., Dev.
Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. Cette définition,
ciifférente de celle de Kabat fondée sur la seule
analyse de variabilité des séquences, prend en compte
et combine la caractérisation des boucles
hypervariables [Chothia C. and Lesk A.M. J. Mol. Biol.
196 : 901-17 (1987)] et l'analyse structurale des
anticorps par cristallographie.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au
moins 70%, de manière préférée d'au moins 80-%, 900-.,
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95%, 99-. et de manière encore plus préférentielle de
100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé
en alignant les '2 séquences à comparer et en comptant
le nombre de positions possédant un acide aminé
identique, ce nombre étant divisé par le nombre
d'acides aminés total de la séquence. En tout état de
cause, ces différences de séquences n'affectent en
rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa
cible, ni sa capacité à recruter des cellules
immunitaires effectrices.
De manière particulièrement avantageuse, chaque
région CDR de chacune des chaînes légères de
l'anticorps selon l'invention possède une séquence
peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les
séquences SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :
3 ou SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 20
respectivement, et chaque région CDR de chacune des
chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention
possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5 ou SEQ ID
NO : 21, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO
7 ou SEQ ID NO : 23 respectivement. Ainsi, la région
CDR1 de chacune des chaînes légères de l'anticorps
selon -l'invention possède une séquence peptidi-que
ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 2 ou avec la séquence SEQ ID NO : 18, 1a région
CDR2 de chacune des chaînes légères de l'anticorps
selon l'invention possèder: une séquence peptidique
ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 3 ou avec la séquence SEQ ID NO : 19, la région
CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps,
selon l'invention possède une séquence peptidique
ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 4 ou avec la séquence , SEQ ID NO 20, et la
région CDR1 de chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps selon l'invention possède une séquence
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peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la
séquence SEQ ID NO : 5 ou avec la séquence SEQ ID NO
21, la région CDR2 de chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps selon l'invention possède une séquence
peptidique ayant au moins 70% d'identité avec 1a..
séquence SEQ ID NO : 6 ou avec la séquence SEQ ID NO
22, la région CDR3 de chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps selon l'invention possède une séquence
peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la
séquence SEQ ID NO : 7 ou avec la séquence SEQ ID NO
23.De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus-est d'au
moins 70%, de manière préférée d'au moins 80%, 90%,
95%, 99-. et de manière encore plus préféreritielle de
100% d'identité.
Avantageusement, la région variable de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est
codée par une séquence d'acide nucléique possédant au
moins 70'-.' d'identité avec la séquence d'acide
nucléique SEQ ID NO : 8, et en la région variable de
chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon
l'invention est codée par une séquence d'acide
nucléique possédant au moins 70o* -d'ïdern.tité avëc- la
séquence d'acide nucléique SEQ ID NO :-9.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au
moins 70%, et de manière préférée d'au moins 80-'à, et
de manière encore plus préférentielle de 95% ou 99-.
d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en
alignant 2 séquences à comparer et en comptant le
nombre de positions possédant un nucléotide identique,
ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides'
total de la séquence. La dégénérescence du code
génétique peut être à l'origine du fait qu'un même
acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de
nucléotides différents. En tout état de cause, ces
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différences de séquences n'affectent en rien
l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni
sa capacité à recruter des cellules immunitaires
effectrices.
Préférentiellement, la région variable de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est
codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8,
et la région variable de chacune de ses chaînes
lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique
SEQ ID NO : 9.
De manière avantageuse, la région variable de chacune
des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
~possèdé au moins 70% d'identité avec la séquence en
acides aminés SEQ ID NO : 10 et la. région variable de
chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70-'.
d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID
NO : 1l. De manière particulièrement avantageuse,
l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus
est d'au moins 70-0., et de manière préférée d'au moins
80%, et de manière encore plus préférentielle de 95-'.
ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est
calculé en alignant 2 séquences à comparer et en
comptânt le nômbté de-'positions possédaht un acide
aminé identiq-ae, ce nombre---é-tant , -divis-é- par le -nombre
d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des
chaînes légères de ,~'l'anticorps selon l'invention
possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la
région variable de chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps selon l'invention possède -la séquence
peptidique SEQ ID NO : il. La séquence peptidique SEQ
ID NO : 10 'est la séquence peptidique déduite de la
séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence
peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de
la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
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L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout
anticorps modifié répondant aux caractéristiques de
l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés
ont été ajoutés, substitué(s) ou délété(s). Un tel
ajout, substitution ou délétion peut être localisé à
n'importe quelle position dans la molécule. Dans le
cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés,
substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de
substitution ou de délétion peut être considérée. De
telles altérations de la séquence des régions
variables de l'anticorps 'selon, l'invention peuvent
être effectuées dans le but.d'augmenter le nombre de
résidus susceptibles d'entrer en contact avec le
peptide cible.
Avantageusement, un anticorps selon l'invention peut
être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2,
d'une fragment Fab', d'un fragment Fab, d'une région
CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de
ces ~fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un
anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps
-monoclonal murin est une IgGlkappa.- Un- -tel-- anticorps
peut être produit par immunisation d'un animal, en
particulier d'une souris, avec le peptide
correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO :
1), ou avec tout autre peptide du LDL-R humain ÇaLtue
dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de
production d'anticorps sont connues de l'homme du
métier. Selon un mode particulier de production des
anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
correspozidant aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO :
1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides
aminés 195-222 (SEQ ID NO: 1) de la séquence du LDL-R
peut être injecté par voie intra péritonéale à des
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~souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund.
Plusieurs rappels d'immunisation sont effectués en
présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de
la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des
prélèvements sanguins par ELISA contre peptide SEQ
ID NO: 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la
fusion des cellules spléniques des souris immunisées
avec des cellules de myélomes de souris en présence de
PEG (polyéthylèneglycol) Les cellules sont ensuite
cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse
contre le peptide SEQ ID NO: 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un
anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle, l'ânticorps selon
l'invention est chimérique.
On entend par anticorps chimérique un anticorps
dont les régions variables des chaînes légères et des
chaînes lourdes appartiénnent à une espèce différente
des régions constantes des chaînes légères et des
chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention
possède en outre des régions variables murines et des
régions constantes appartenant à une espèce non-
murine. A cet égard, toutes ré's fâmilles et espèces de
mammifères - non-murins -- sont - - susceptibles - - d' être
utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les
muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les
équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi
que les oiseaux._- De manière encore préférée, les
régions constantes de chacune des chaînes légères et
de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon
l'invention sont des régions constantes humaines. Ce
mode de réalisation préféré de l'invention permet de
diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme
et par là même d'améliorer son efficacité lors de son
administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la
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15.
région constante de chacune des chaînes légères de
l'anticorps selon l'invention est de type K. Totit
allotype convient à la réalisation de l'invention, par
exemple Km(1), Km(l, 2), Km(1, 2, 3) ou Km(3).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la
région constante de chacune des chaînes légères de
l'anticorps selon l'invention est de type A.
Dans un aspect particulier de l'invention, et
notamment lorsque les régions constantes de chacune
des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes
de 1'anticorps selon l'invention sont des régions
humaines, la région constante de. chacune des chaînes
lourdes de l'anticorps est de typey.:: Selon cette
variante, la région constante de. chac.une des chaînes
lourdes de l'anticorps peut être de type yl,'de type
y2, de type y3, ces trois types de régions constantes
présentant la particularité de fixer le complément
humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant
une région constante de chacune des chaînes lourdes de
type y appartiennent à la - classe des IgG. Les
immunoglobulines de type G (IgG), sont des
hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes.et de 2
chaînes légères, liées entre elles par des ponts
disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position
N-terminal-e, -d'une région ou--domaine va-r-iab].e-- -(-codée-
par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et
V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène
contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position
C-terminale, d'une région constante, constit;iu.ée d'un
seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines
(CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association
des domaines variables et des domaines CHl et CL des
chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui
sont connectées à la région Fc par une région
charnière très flexible permettant à chaque Fab de se
fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc,
médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps
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reste accessible aux molécules effectrices telles que
les récepteurs FcOR et le Clq. La région Fc,
constituée des 2 domaines globulaires CE12 et C03, est
glycosylée au niveau du domaine CE12 avec la présence,
sur chacune.des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné,
lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune
des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yl, car
un tel anticorps montre une capacité à engendrer une
activité ADCC (Antibody-Dependent Cellular
Cytotoxicity) chez le plus grand nombre d'individus
(humains). A cet égard, tout allotype convient à la
réalisation de l'invention, par exemple Glm(3), Gim
(1, 2, 17) ; Glm(l, 17) ou -Glm(1,3) .
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent
être construits en utilisant les techniques standard
de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du
métier, et plus particulièrement en utilisant les
techniques de construction des anticorps chimériques
décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 81, . 6851-55 (1984), où la
technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour
remplacer la région constante d'une chaîne lourde
et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un
anticorps provenant- d'un mammifère non-humain atiec -les
régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine.
De tels anticorps et leur mode de préparation ont
également été décrits dans la publication brevet EP
173 494, de,~IIs le document Neuberger, M.S. et al.,
Nature 312(5995):604-8 (1985), ainsi que dans le
document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour
générer des anticorps chimériques sont largement
disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les
chaînes lourdes et légères de l'anticorps peuvent être
exprimées séparément en utilisant un vecteur pour
chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul
vecteur.
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Un vecteur d'expression est une molécule d'acide
nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique
murine codant pour le domaine variable de chacune des
chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et la
séquence d'acide nucléique, de préférence humaine,
codant pour la région constante de chacune des chaînes
lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées,
afin de les introduire et de les maintenir dans une
cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments
d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car
il possède des séquences indispensables (promoteur,
séquence de polyadénylation; gène de sélection) à
cette expression. Le vecteur peut être par exemple un
plasmide, un adénovirus, un rétro-rirus ou' un
bactériophage, et la cellule hôte peut être toute
cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0,
IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées
CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-
Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero,
Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et
P3X63Ag8.653.
Pour la construction de vecteurs d'expression des
anticorps chimériques selon l'invention, des séquences
signal synthétiques et des *sitës dè restrictiôn
appropriés peuverrt être- --fusionnés aux régiôns,
variables au cours des réactions d'amplification par
PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec
les régions constantes d'un anticorps, de manière
préférentielle une IgGl humaine. Les-'gènes ainsi
construits sont clonés sôus le contrôle d'un promoteur
(par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site
de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés
(un pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également
munis de gènes de sélection connus, de l'homme du
métier, tels que par exemple le' gène dhfr ou le gène
de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent
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être produits par co-transfection dans une cellule
hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du
vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant
une méthode bien connue de l'homme du métier (par
exemple la co-précipitation au phosphate de calcium,
l'électroporation, la micro-injection, etc.). A
l'issue de la transfection, les cellules peuvent être
mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI
(Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5% de sérum
dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de
G418 (Invitrogen, réf. 10131-027) et 2.5 nM de
methotrexate (Sigma, réf. M8407)=. Les surnageants des
puits de transfection résistants sont criblés pour la
présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage
ELISA spécifique des séquences Ig humaines. Les
transfectants produisant le plus d'anticorps sont
amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin
d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3
meilleurs producteurs pour le clonage par dilution
limite (40 cellules / plaque).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un
anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un
anticorps d'origine non humaine, les autres parties dé
la - molécule d' anticorps étant--- dérivées d' un- -(ou - -de~
plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps
peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de
CDR ( CDR-grafting ) bien connues de l'homme du
métier ::{publications brevet US 5,225,539, US 6,180;370
; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5. (1986) ;
Verhoeyen et al., Bioessays 8(2): 74-8 (1988) ;
Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C.
et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(24) :10029-33
(1989) ; Lewis A.P. and Crowe J.S., -Gene 101(2):297-
302 (1991) ; Daugherty BL et= al., Nucleic Acids Res
19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad,
Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol
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150 (7): 2844-57 (1993) ; Presta et al., J. Immunol.,
151:2623 (1993)]. Le choix des domaines variables
humains à greffer pour la production d'anticorps
humanisés est important afin de réduire
l'immunogénicité de l'anticorps..-,sans altérer son
affinité pour sa cible. Dans une méthode de production
d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine
variable d'un anticorps murin est comparée à une
banque de séquences de régions variables humaines
connues et la séquence variâble humaine la plus proche
de la séquence murine est retenue comme région FR de
l'anticorps humanisé [Riechmann -et al.,,Nature 332:
323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA
86 (24) :10029-33 (1989) ; Sims et -al., J. Immunol.,
151 :2296 (1993 )]. Une autre méthode de sélection des
régions FR humaines est la comparaison de la séquence
de chaque sous-région de la séquence FR murine (FR1,
FR2, FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR
humaines connues, afin de choisir, pour chaque région
FR, la séquence FR humaine la plus proche de la
séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ;
Sato K. et al Mol Immunol 31(5) :371-81 (1994) ; Leung
S.O. et al., Mol Immunol; 32 (17-18) :1413-27 * (1995) J
Une autre -méthode- util-ise une -région--.FR --particulière-
dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps
humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde
ou légère [Sato K_ et al Mol Immunol 31(5):371-81
(1994) ]. La greffe de CDR est :-!complétée dans la
majorité des cas par la mutation de certains résidus
clés localisés dans les FR humains afin de conserver
une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa
cible [Holmes M.A. and Foote J., J Immunol
158 (5) :2192- 201 (1997) ] .
Les antz.corps humanisés selon l'invention sont
préférés pour leur utilisation dans des méthodes de
diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique
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et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou
humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par
l'organisme humain, et au moins aussi efficace que
l'..anticorps murin. De manière particulièrement
avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé
est 2 fois plus plus cytotoxique que l'anticorps murin
correspondant. De manière encore plus avantageuse,
l'anticorps ainsi chimérisé ou =humanisé est 10 fois,
ou encore 100 fois, ou de manière préférée plus de 100
fois plus cytotoxique que l'anticorps murin
correspondant.
Par anticorps humain, on entend désigner un anticorps
dont chaque région est dérivée d'ùn anticorps humain.
Ces anticorps peuvent être dérivés de souris
transgéniques portant des gènes d'anticorps humains,
ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin
Biotechnol. Oct;6(5):561-6 (1995) 1 ; Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of Immunology 13 :65-93
(1995) ; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97(2): 722-727 (2000)]
De mâriïère =avantàgeuse,=l'anticorps selon 'l'invention
est couplé à-une toxine: --La- toxine est; par exemple;
la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre
l'anticorps selon l'invention et la toxine est
suffisamment forte pour éviter la libération
syFrtémique de la toxine et aussi suffisamment labile,
afin que la toxine soit libérée dans les cellules
cibles.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est
couplé à un radio-isotope. La présence du radio-
isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux
isotopes sont essentiellement utilisés .'l'iode 131
(émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est
relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet
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tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule
tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention.
L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la
réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect
des mesures de radio-protection. L'yttrium 90
(émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5
jours), exerce des effets tumoricides sur une distance
de 5 mm.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention
permet le recrutement de cellules immunitaires
effectrices. En effet, l'anticorps selon l'invention
est un bon compétiteur des LDL : il présente une
affinité pour le LDL-R comp-arable à celle, du ligand
naturel des LDL-R.
Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa
bonne sensibilité, est un outil pouvant servir à
médier des réactions d'ADCC (Antibody Dependent
Cellular Cytotoxicity). En effet, l'anticorps selon
l'invention peut être modifié de manière à induire
l'ADCC, par exemple en étant chimérisé ou humanisé.
L'anticorps selon l'invention permet le recrutement de
cellules immunitaires effectrices. Aux fins de
l'invention,* on enten.d" 'dêllule inimunitaire
effectrice une cellule qui -provoque -l-a----destria:ction~
des cellules sur lesquelles l'anticorps selon
l'invention est lié ( cellules cibles ). Plus
particulièrement, les cellules effectrices expriment à
leur surface un récepteur .,de la région Fc des
anticorps. Par exemple, les cellules effectrices sont
des cellules NK (Natural Killer). Elles peuvent aussi
être des macrophages, des neutrophiles, l'e lymphocyte
T4, le lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules
possèdent à'leur surface des récepteurs de la région
Fc des anticorps selon l'invention.
De plus, on entend par recrutement la faculté que
possède le polypeptide selon l'invention de fixer des
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cellules capables de, provoquer la destruction des
cellules cibles. La destruction peut être une lyse,
c'est-â-dire une destruction des cellules-cibles avec
libération de leur contenu.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention
permet la destruction des cellules cancéreuses. En
effet, le recrutement des cellules effectrices par
l'anticorps selon l'invention engendre une destruction
des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
(cellule cible). Les cellules cancéreuses sur-
exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de
l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules
lysées sèront de manière quaài-spécifiques les
cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-
exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi
préservées.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est
produit dans la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL-
1581).
Un an.ticorps préféré selon l'invention est l'anticorps
12G4 produit par l'hybridome H12G4 (déposé sous le
numéro I-3487 à la CNCM). La région variable de
chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal
produit par l'hybridome H12G4 est codée par la
séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région
variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps
monoclonal produit par l'hybridome H12G4 est codée par
la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
Un objet particulier de l'invention concerne un
anticorps monoclonal se liant au LDL-R et permettant
le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps
est le 12G4, ou tout anticorps chimérique, humanisé ou
humain possédant les parties variables de l'anticorps
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12G4. -
Un autre objet de l'invention se rapporte à une lignée
cellulaire stable produisant un anticorps selon
l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable
selon l'invention est choisie parmi le groupe
consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule
YB2/3HL.P2.G1l.l6Ag.20, déposée à l'American Type
Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662),
SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain
Namalwa, PERC6, les lignées CHO; notamment CHO-K-1,
CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-,
Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK,
K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à
l'hybridome H12G4 déposé sous le numéro
d'enregistrement CNCM I-3487 à la Collection Nationale
de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut
Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex
15).
Un autre objet de l'invention se rapporte à un
fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour
la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps
selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé
pour la fabrication d'un polypeptide se liant au
peptide correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ
ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur
humain des LDL, ce polypeptide pouvant être un
anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un
fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour
la région variable de la chaîne légère d'un anticorps
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selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut
être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se
liant au peptide correspondant aux acides aminés 195-
222 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du
récepteur humain des LDL, ce polypeptide pouvant êt,xe
un anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur
d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN
choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9
ou SEQ ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide
correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur'humain des
LDL.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un
anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou
in vivo, les récepteurs FcyRIII de cellules
immunitaires effectrices. En effet, les anticorps de
l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à
activer par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci
représente un intérêt considérable, car ce récépteur
est exprimé à - la - surface- de cellu-les- appelées
cellules effectrices : la liaison de la région Fc
de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule
effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la
destruction des cellules cibles. Les cellule,,a
effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural
Killer), des macrophages, des neutrophiles, les
lymphocytes CD8, les lymphocytes TyS, les cellules NKT,
les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes.
Un autre objet particulier de l'invention est un
anticorps tel que décrit précédemment pour son
utilisation comme médicament.
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Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps
utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet
le recrutement de cellules effectrices.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se
lier .à tout ou partie de la région extracellulaire du
récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de
se lier à la région de liaison des LDL (correspondant
aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de
la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides
aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps
selon l'invention, se liant au peptide correspondant
aux acides aminés 195-222 (SEQ ID NO 1) de la
séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode
de réalisation particulier -de cet objet de-
1'invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est
l'utilisâtion d'un anticorps tel que décrit
précédemment pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se
lier à tout ou partie de la région extracellulaire du
récepteur humain des LDL, c'est-à-dire qu'il est
capable de se lier à la région de liaison des LDL
(correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la
région en dehors de la zone -de,--liaison -des LDL
(correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A
cet égard, l'anticorps selon l'invention, se liant au
peptide correspondant aux acides aminés 195-222 (SEQ
ID NO 1) de la ~séquence peptidique du récepteur
humain des LDL, est un mode de réalisation particulier
de cet objet de l'invention.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un
anticorps tél que décrit précédemment, c'est-à-dire
possédant la capacité de se lier à tout ou partie de
la régiôn extracellulaire du récepteur des LDL et
avantageusement au peptide correspondant aux acides
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aminés 195-222 (SEQ ID NO 1), pour la fabrication
d'un médicament destiné au traitement du cancer. En
effet, l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de
manière spécifique. A cet égard, l'anticorps selon
l'invention, en se liant à ce récepteur, va era.gendrer
une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses,
notamment par ADCC contre les cellules cibles
cancéreuses et permettre la lyse de ces dernières.
Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-
spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules
saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant
ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen
de l'anticorps selon l'invéntion sont les cancers pour
lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la
surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport
aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer
traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie,
du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du
poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une
augmehtâtion de la densité de récepteurs âia. LDL sur'la
surface m-embrariaire --des ~ ce1-lules---,cancéreuses Les
cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par
les cellules effectrices recrutées lors de la réaction
d'ADCC, les cellules saines étant préservées
puisqu'elles ne sur-expriment pas le LDL-R. =
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps
selon l'invention est utilisé pour la préparation d'un
médicament destiné au traitement des cancers incluant
la leucémie'myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires
aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémie
myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies
lymphoïdes, les leucémies lymphoïdes chroniques, les
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tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde
cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome
gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le
choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l'invention concerne une composition
pharmaceutique comprenant un anticorps selon
l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient
et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
Cette composition pharmaceutique a pour vocation de
cibler les cellules cancéreuses, notamment celles
surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses
exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au
LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés
par les cellules saines, le médicament ainsi préparé
sera préférentiellement lié par les cellules
cancéreuses.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une
solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée,
etc., ainsi que toute suspension, gel, poudre, etc.,
compatible avec un usage pharmaceutique et connu de
l'homme du métier. Les compositions selon l'invention
peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou
véhicules choisis parmi les dispersants,
solubilisants, stabili-sa:nts; sïirfactÉ:rits,
conservateurs, etc. D'autre part, les compositions
selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents
ou principes actifs.
Par ailleurs,' les compositions peuvent être
administrées de différentes manières et sous
différentes formes. L'administration peut être
réalisée par toute voie classique pour ce type
d'approche thérapeutique, comme notamment par voie
systémique, ' en particulier par injection
intraveineuse, intradermique,, intra-tumoràle, sous-
cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-
artérielle, etc. On peut citer par exemple l'injection
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2&
intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de
la tumeur ou irriguant la tumeur.
Les doses peuvent varier en fonction du nombre
d'administrations, de l'association à d'autres
principes actifs, du stade d'évolution de la
pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de
l'anticorps selon l'invention dans , les analyses
immunohistochimique's de tissus cancéreux, sains ou
cirrhosés, ou dans les analyses en Western. Blot, en
ELISA ou en test de quantification in vivo.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront
décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent
être considérés comme illustratifs et ne limitent pas
l'étendue de l'invention.
Légendes de figures
Figure 1: Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en
unités arbitraires de fluoréscence).
.Figure 2 : Liaison des LDL-Dil sur des cellules HepG2
(résultats exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes).
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer
du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés
en pourcentage de cellules fluoréscentes).
Figure 4A :'Liaison des anticorps anti-LDL-R 12G4 sur
des cellules A549 (résultats, exprimés en pourcentage
de cellules fluorescentes). Les anticorps anti-LDL-R
12G4 sont produits par l'hybridome H12G4 et sont
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dirigés contre le peptide correspondant aux acides
aminés 195-222 de la séquence du récepteur des LDL
(SEQ ID NO : 1).
Figure 4B : Liaison des anticorps anti-LDL-R 12G4 sur
des cellules A549 (résultats exprimés en moyenne de
fluorescence).
Figure 5A : Liaison des anticorps anti.-LDL-R 12G4 sur
des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 5B :.Liaison des anticorps anti-LDL-R 12G4 sur
.des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en moyenne
de fluorescence).
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
12G4 sur des cellules C2C12, CHO-K1 et ' YB2/0
(résultats exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes).
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
12G4 sur des cellules C2C12, CHO-K1 et YB2/0
(rÉsultats exprimés en moyenne de fluorescence).
Figure 7: Compétition des anticorps anti-LDL-R 12G4
avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats
exprimés en moyenne defluorescence).
Figure 8 Cinétique d'internalisation des anticorps
anti-LDL-R 12G4 avec les LDL, sur des cellules A549
(résultats exprimés en pourcentage d'internalisation).
Figure 9 : Caractérisation de l'anticorps 12G4 en
Western Blot
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Exemples
Exemple 1: Production, sélection et caractérisation
d'anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
correspondant à la séquence d'acides aminés 195-222 de
la.séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO: 1)
Choix de la séquence peptidique appropriée
Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ
ID NO: 1(correspondan.t aux acides aminés 195-222 de
la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la
région de liaison aux LDL a été synthétisé. La
séquence SEQ ID NO: 1 choisie a été modifiée
(remplacement des cystéines paz des..sérines) afin
d'éviter la formation de ponts d.isulfures en cas
d'oxydation du groupement thiol des cystéines, la
séquence correpondante est la séquence SEQ ID NO: 17.
Synthèse peptidigue
Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse
en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle
ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA),
en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA
0,5 mrnol.
Spectrométrie de masse
La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un
spectromètre de masse à électrospray d'ions. Le
spectre de l'électrospray a été obtenue,,en utilisant un
appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre
de masse par électrospray d'ions à quadripôle simple,
équipé avec un spray d'ions (électrospray assisté d'un
nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada).
Production d'anticorps monoclonaux
Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
,correspondant à la séquence SEQ ID NO . 1' sont
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produits en immunisant des souris mâles BALB/c par
injection intrapéritonéale du peptide correspondant à
la SEQ ID NO: 17, le peptide étant préalablement
émulsifié avec un volume égal d'adjuvant complet de
Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les
deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de
Freund. Quatre jours après la dernière injection, les
rates des animaux sont prélevées, puis les cellules
sont isolées et fusionnées avec des cellules de
myélome de souris Sp 2/0-Agl4 en présence d'agent de
fusion tel que le polyéthylène glycol. Les cellules
fusionnées sont ensuite incubées dans un milieu
sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissance de
cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des
hybridomes, des sous-clonages par dilution limite ont
été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages, un
hybridome dénommé H12G4 , producteur d'anticorps
dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO: 1 a été sélectionné. Cet hybridome appartient à la
classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l'hybridome H12G4 ont été
-testês par un test ELISA, poùr la sécrétion d'un
anticorps monoclonal dé spécificité recherchée, -'à
savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID NO:
1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c
mâles ,, ayant reçu au préalable une injection de
pristane et auxquelles 2.106 cellules d'hybridome H12G4
ont été injectées.
Les anticorps monoclonaux ont été isolés par
précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis
purifiés par chromatographie d'affinité sur gel de
protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham
Bioscience, Uppsala, Suède). Les protéines non
retenues ont été éliminées par lavage avec une
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WO 2007/014991 32 PCT/FR2006/001806
solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L,
pH 7,2, NaCl 150 mmol/L). L'élution des
Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de
l'anticorps dirigé contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO: 1 a été accomplie en utilisant
de la glycine à 0,2 M à pH2, 8. Les anticorps purifiés
ont été dialysés immédiatement contre 10 mmol/L de
PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par
aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à-20 C.
Ces anticorps seront dénommés ci-après Anti-LDL-R
12G4 .
Analyse en Western B1ot (Figure 9)
Les anticorps Anti-LDL-R 12G4 ont été testés en
Western Blot. Des extraits de protéines totales de
cellules MDA-MB-231 ont été soumis à une
électrophorèse dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis
transférés sur une membrane de nitrocellulose et mis à
réagir avec les anticorps Anti-LDL-R 12G4. Les
protéines immunoréactives ont été visualisées avec un
anticorps monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase
(Chemicon). Le développement de la réaction a été
effectué par chemiluminescence (Amersham,
-Biosciences). =
Isotypage
L'isotypage des hybridomes a été effectué par ELISA
avec le kit SBA Clonotyping System/HRP
(SouthernBiotech) et avec l'Isost:rip Mouse Monoclonal
Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027).
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses
Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été
criblées pour l'expression du LDL-R : HepG2, HeLa,
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MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la
liaison, de LDL marquées (Figures 1 et 2). Pour cela,
les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées
par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS,
pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions
dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-
dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanide
(Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur des cellules à
des concentrations finales de 0, 10 et 100 pg/ml
pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la
liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorting) c'est-à-dire que
la fluorescence de chaque cellule à.l'intérieur d'une
population donnée est individuellement mesurée :.par
cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton
Dickinson). Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) et la
fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm
après excitation avec un laser Argon à 488 nm. Les
résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes (Figure 1).
Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que
les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le
plus fortement le LDL-R.
De plus, plüsieurs lignées cellulaires' dè cancer du
sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-
MB-231. L'expression du LDL-R sur ces lignées
cellulaires cancéreuses humaines a été mise en
'évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur
cette lignée cellulas.re. Pour cela, les LDL (d=1.03-
1.053) ont été préparées par ultracentrifugation,
dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par
SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par
le fluorôchrome 1,11- dioctadecyl-3,3,3',3'-
tetramethyl-indocarbocyanide '(Dil). Les LDL-Dil ont
été incubées sur les cellules à des concentrations
finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 ug/ml pendant 3
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WO 2007/014991 34 PCT/FR2006/001806
heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaisôn a été
analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats
ont été exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau
d'expression du LDL-R (figure 2) : les MCF7-ras ainsi
que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R
équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-
231 représentent une population homogène qui exprime
le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 : Tests fonctionnels in vitro des anticorps
monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO: 1 sélec.tionnés.à l'Exemple 1
La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés
contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID
NO: 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des
anticorps au-LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549
et cellules MDA-MB-231), l'étude de la cross-
réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12
(souris), CHO-I{1 (hamster), YB2/0 (rat), l'étude de la
compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL-
R de cellules A459, -1' étude- de :--leur ciilétiquë
d' i.nr_e.r..na'lisation ainsi que .1_' étude du. caractère pro-
apoptotique des anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 12G4 au
LDL-R de cellules A549
La liaison des anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R a
été évaluée par quantification du marquage de cellules
A549 cultivées en présence de LPDS (Lipoprotein
Deficient Serum) pendant 24h, par cytométrie en flux
(FACS). Pour réali.ser 'ce test, les anticorps Anti-LDL-
R 12G4 ont été incubés à des çoncentrations finales de
(1, 3, 10, 30, 100 la.g/ml) pendant 3 heures à 4 C. Les
anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGi, ATCC-
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WO 2007/014991 35 PCT/FR2006/001806
LGC Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), préparés et incubés dans les mêmes
conditions que les Anti-LDL-R 12G4, ont servis
d'anticorps contrôles, négatif et positif
respectivement. La révélation de la liaison a été-
effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti-
IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage
de cellules fluorescentes (Figure 4A) et en moyenne de
fluorescence (Figure 4B).
Les anticorps Anti-LDL-R 12G4 et l'anticorps contrôle
C7 reconnaissent le LDL-R des cellules A549.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R =12G4 au
LDL-R de cellules MDA-MB-231
La liaison des anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R des
cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même
protocole décrit pour l'étude de la liaison des
anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R de cellules A549,
par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231
cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par
cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les
anticorps Anti-LDL-R 12G4 ont été incubé-s à des
concentrations finales de (1, 3, 10, 30, 100 la.g/ml)
pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps- commerciaux,--1C6
(anti-SRESP2, IgGl) ét,. L7
préparés et incubés dans les mêmes conditions que les
Anti-LDL-R 12G4, ont servis d'anticorps contrôles,
négatif et positif respectivement. La révélation de la
liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage de
cellules fluorescentes (Figure 5A) et en moyenne de
fluorescence (Figure 5B).
A des faibles concentrations d'anticorps (1-3 pg/ml),
l'anticorpscontrôle C7 se lie au LDL-R des cellules
MDA-MB-231 de façon plus importante que les anticorps
Anti-LDL-R 12G4. En revanche, pour des concentrations
plus élevées (10-100 }a.g/m1), l'anticorps Anti-LDL-R
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WO 2007/014991 36 PCT/FR2006/001806
12G4 reconnaît le LDL-R de façon plus importante que
l'anticorps C7.
Etude de la cross-réactivité des anticorps Anti-LDL-R
12G4 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0
La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R' a été
testée chez la souris (cellules C2C12), chez le rat
(cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-Kl).
Les anticorps Anti-LDL-R 12G4 ont été incubés à une
concentration finale de 30 pg/ml pendant 3 heures à
4 C sur des cellules C2C12, CHO-Ki et YB2/0
préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant
24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl)
et C7 (anti-LDL-R, IgG2b) ont. servis d'anticorps
contrôles négatif et positif - respectivement. La
révélation de la liaison a été effectuée en utilisant
un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et
en moyenne dé fluorescence (Figure 6B).
Seuls les anticorps Anti-LDL-R 12G4 cross-réagissent
avec la souris, le rat et le hamster. L'anticorps C7
ne cross-réagit pas avec la souris ni avec le hamster
mais présente néanmoins une très faible cross-
réactivité avec le rat.
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 12G4
avec les LDL sur des cellules A549
La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R
12G4 a été étudiée en t~-'stant la liaison des anticorps
Anti-LDL-R 12G4, à 30 ~a.g/ml, en compétition avec des
LDL non marquées à des concentrations croissantes (1,
4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée
en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à 4 C. La
révélation de là liaison a été effectuée en utilisant
un anti-IgG-PE. La liaison des anticorps au LDL-R a
été ~ensuite analysée par FACS et les résultats
exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7).
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WO 2007/014991 37 PCT/FR2006/001806
Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a
permis de mettre en évidence que la liaison de
l'anticorps C7 au LDL-R des cellules A549 n'est pas
diminuées par l'addition de LDL à des concentrations
physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les
anticorps C7 ne se lient pas. au même site que les LDL.
En revanche, l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 se lie moins
bien au LDL-R en présence de LDL (diminution de 60% de
la liaison, moyenne de fluorescence = 55 en absence de
LDL, moyenne de fluorescence = 20 en excès de 16 fois
de LDL). Ces résultats indiquent que le site de
liaison de l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 est le même que
celui des LDL.
-Cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R
12G4
La cinétique d'internalisation de l'anticorps Anti-
LDL-R 12G4 a été étudiée sur 24 heures lors de
l'incubation à 37 C de l'anticorps (30 pg/ml) marqué à
.la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur
des cellules A549. Les cinétiques d'internalisation de
l'anticorps contrôle C7 (30 ~zg/ml) marqué à la
rhodamine et des LDL-Dil (30 ~ig/ml) ont été étudiées
en parallèle. Après- 2h, 4h, 6h - et.-24h d' ircubation,
les anticorps/LDL-Dil liés mais nôri . internalis.és ont
été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés
par fluorimétrie. Les cellules A549 ont ensuite été
lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité
d'anticorps internalisés a été quantifiée pfLr
fluorimétrie. Le pourcentage d'internalisation a été
calculé selon la formule suivante : fluorescence des
anticorps internali.sés/(fluorescence des anticorps
intërnalisés + fluorescence des anticorps liés mais
non internalisés).
La cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-
R 12G4 est intermédiaire entre celle des LDL
(cinétique la plus rapide avec 60-'. d'internalisation à
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WO 2007/014991 38 PCT/FR2006/001806
4h) et celle du C7 qui s'internalise un peu plus
lentement (Figure 8). Comme pour les LDL, la cinétique
d'internalisation des anticorps est biphasique avec
une internalisation rapide au cours des 4 à 6
premières heures. Après 6h d'incubation, les 3
anticorps testés montrent le même taux
d'internalisati.on avec un plateau d'internalisation
d'environ 60% à 24h.
Etude du caractère pro-apoptotique des ànticorps Anti-
LDL-R 12G4
La croissance des cellules A549 en présence et en
l'absence d'anticorps Anti-LDL-R 12G4 a été étudiée
par un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à
la phosphatidylsérine des cellul.es apoptotiques en
phase précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne
marque que les cellules nécrotiques dont la membrane
plasmique est lésée) par cytométrie en flux (FACS).
Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 12G4
ont été incubés à une concentration finale de 30 pg/ml
pendant 16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 37 C. Les
anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7
(anti-LDL-R, IgG2b), préparés et incubés dans les
mêmes conditions que les Anti-LDL-R 12G4, -ont=servis
de _ réf éreizcre . Un . contrôle -négatif, , cellûlés . "saris.. .
anticorps, et uri contrôle positif, cellules incubées
avec de la camptothécine, ont été effectués
parallèlement.
Les anticorps Antj,:-LDL-R 12G4 ne présentent pas
d'effet fortement pro-apoptotique sur les cellules
A549 après 16h d'incubation.
Exemple 4: Etudes in vivo
Le modèle axïimal' choisi est un modèle de xénogreffe de
tissu tumoral humain sur , des souris nude. La
xénogreffe de cellules tumorales est implantée en
sous-cutanée.
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Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour
la xénogreffe
= Criblage des lignées cellulaires pour
l'expression du LDL-R
.Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont
disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et le
choix de la lignée à implanter dépend pour notre étude
du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R
sur ces lignées cellulaires cancéreuses'humaines a été
mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL
marquées sur cette lignée cellulaire. Pour 'cela, les
LDL (d=1.03-1.053 g/ml) ont été préparées par
ultracentrifugation, dialysées dans un tampon. PBS, pH
7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions
dénaturantes, puis marquées par le f luorochrome 1,1'-
dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indo-carbocyanide
(Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules à
-des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et
100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au
PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie
(FACS) et les résultats ont été exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, châqüè ligrnée ' a été-- ~ -test-ée~ ~pôia:r 'son ~niveau
- .. . ~._. _. .. . _,. . .
d'expression du LDL-R-(Figures 2 et 3) es MCF7-ras
ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du
LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les
MDA-MB-231 représentent une population homogène qui
exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu .,~de ces
résultats, notre choix sur la lignée à implanter s'est
porté sur les MDA-MB-231.
= Détermination du nombre de cellules à implanter
pour la xénogreffe
La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du
nombre de cellules implantées chez des souris nude a
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été étudiée. L'étude porte sur, l'implantation de
0, 5. 106, 106, 2.106 et 5.106 cellules.
= Liaison de l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R
des MDA-MB-231
La liaison de l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R a
été étudiée sur les cellules MDA-MB-231 selon le même
protocole que pour l'étude de la liaison de
l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 au LDL-R sür des celltiles
HepG2 (exemple 2), de façon indirecte puisque
l'anticorps n'a pas été directement marqué
l'anticorps a été incubé sur des cellules MDA-MB-231
pendant 3 heures à 4 C, puis révélé avec un anticorps
monoclonal anti-IgG conjugué à la FITC pour l'analyse
au FACS. Les résultats sont exprimés en pourcentage de
cellules fluorescentes.
= Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R
12G4 avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231
La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R
12G4 a été étudiée en testant la liaison des LDL
.marquées au Dil, à 12.5 pg/ml en compétition avec
l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 à des concentrations
croissaïntës (6,25, 12,5, 25', 50 et 80 pgJinl) sur dès
cellules MDA-MB-231 pendant 3 h à 4 C. La liaison des
anticorps au LDL-R a été ensuite analysée par FACS et
les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes :''
Protocole in vivo
Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti-
LDL-R 12G4, l'approche choisie consiste à injecter la
lignée cellulaire et l'anticbrps simultanément (Test
de Winn). Cette approche permet d'évaluer la capacité
de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
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41.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris
nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises
dans 2001a.1 d'un anticorps contrôle, de même isotype
que l'anticorps Anti-LDL-R 12G4 (IgGl) qui ne reconnaît
pas le LDL-R, sans traitement successif à
l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5 souris nude implantées
avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 200ul
d'anticorps Anti-LDL-R 12G4, sans traitement successif
à l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche modifiée du test de
Winn consistant à traiter* les souris nude après
implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 'et de
l'anticorps Anti-LDL-R 12G4'avec l'anticorps Anti-LDL-
R 12G4, deux fois par semaine au cours des 4 semaines
de l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le
troisième groupe comprend 5 souris nude implantées
avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 2001a.l
d'anticorps Anti-LDL-R 12G4, traitées en intra-
péritonéale par 500 gg d'anticorps Anti-LDL-R 12G4, 2
fois par semaine (le premier traitement par 500 }.zg
ayant eu lieu 3 à 4 h après l'implantation des
cellul.es).
Les souric.sont contrôlées tous les jours avec mesure
de la prise de poids et de la taille de la tumeur 3
fois par semaine. A la fin des 4 semaines de
protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le
coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés
à - 80 C pour chacune des 5 souris de chaque groupe.
Par ailleurs, les sérums des souris sont aussi
récupérés et congelés.
Ex.emple 5 Etude de faisabilité thérapeutique
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but
de mettre en évidence une sur-expression du LDL-R dans
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le tissu cancéreux par rapport au tissu sain, dans
différents types de cancers. Pour céla une analyse en
Western Blot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a
été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de
tissus issus de patients atteints de carcinome
hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose
provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le virus
de l'hépatite C (15 patients). Deux prélêvements de
tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un
échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais
cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu
tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70%
d'hépatocytes tumoraux).
De.s analyses de type Western Blot, en utilisant un
anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research
Diagnostics Inc), ont été réalisées sur ces tissus.
Une bande à 160 kDa, qui correspond à la forme mature
du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus
cirrhosés et sur les tissus cancéreux. En plus de
cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la
Lorme immature du LDL-R* - (nôri- glycosylée), est
présente.
La quantification de la bande correspondant au LDL-R
mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de
mettre en évidence
- Une.hur-expression du LDL-R-dans le tissu sain des
3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose
provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2
patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le
virus de Phépatite C.
- Une sur-expression du, LDL-R dans le tissu
cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients
atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour
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origine une infection par le virus de l'hépatite C
(niveau de sur-expression chez ces patients est
entre 2 et 14 fois).
- Six patients atteints de CHC survenu *sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le
virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de
différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6 : étude de la spécificité de l'anticorps
L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des
lames de tissue micro-array de tissus humains normaux,
comportant 108 spots correspondants à 54 tissus
humains normaux différents fixés en formol à 10%.
L'anticorps C7 a été dilué au' 1/10 (10pg/ml) et
l'anticorps .Anti-LDL-R 12G4 a été dilué au 1/50
(2pg/ml). La réactivation antigénique a été réalisée
au micro-ondes, 3 fois 5 minutes à 750 Watts dans un
tampon citrate 10mM, pH 6.
Il =a été observé une absence de marquage dans le
système hématopoïétique (amygdale, rate et ganglion
lymphoïde), le tissu musculaire (cceur et muscle strié
squelettique), le revêtement cutané et le tissu
tnammaire, quél que soit h'-anticorps =-utilisé-. Le
système nerveux centr'a1 --(corté.x -cérébral, cërvelét,
noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière),
les glandes surrénales'(cortex et médullaire), le foie
et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2
anticorps. L'anticorps .Anti-LDL-R 12C7~4 et l'anticorps
C7 ont marqué les testicules, le colon et,le pancréas,
avec un meilleur marquage avec l'anticorps Anti-LDL-R
12G4 pour ces deux derniers organes. Seul l'anticorps
Anti-LDL-R 12G4 marque la muqueuse gastrique,
l'épithélium malpighien des muqueuses buccale et
exocervicale et les différents tubes rénaux.
Ces résultats sont en accord avec la littérature sur
la distribution tissulaire du LDL-R puisque les
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surrénales, le foie, le système nerveux central, les
testicules et les reins ont été décrits comme des
tissus exprimant fortement le LDL-R. L'anticorps Anti-
LDL-R 12G4 et l'anticorps C7 donnent des marquages
d'intensité équivalente, avec une légère supériorité
de l'anticorps Anti-LDL-R 12G4. De par sa bonne
sensibilité et sa spécificité, l'anticorps Anti-LDL-R
12G4 a été sélectionné pour l'analyse
immunohistochimique d'adénocarcinomes mammaires.
Analyse immunohistochimique d'adénocarcinomes
mammaires
L'expression du LDL-R a été étudiée par
immunohistochimie sur 34 adénocarcinomes mammaires et
sur le tissu non tumoral adjacent avec l'anticorps
Anti-LDL-R 12G4.
Le marquage était d'une forte intensité et chaque fois
qu'un marquage a été observé (65% des échantillons),
seules les cellules tumorales étaient marquées,
mettant ainsi en évidence une sur-expression du LDL-R
dans les cellules cancéreuses.
Exemple 7*: Amplifà.cation et.séq~aençage des régions
variables des anticorps anti-LDL-R 12G4
1.Amplification des régions VH et VK
wX
L'AR1q total de 1'hybridome murin 12G4, produisant une
immunoglobuline de type IgGl,K, a été extrait (kit
Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Les
domaines variables des chaînes légère (VK) et lourde
(VH) de l'anticorps 12G4 ont été amplifiées par la
technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
(kit- 5'RACE, Invitrogen ref. 18374.041) en s'ancrant
dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la
chaîne légère Kappa, ou Gl murine, pour la chaîne
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lourde.
Brièvement, une première étape de transcription
inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une
amorce localisée dans la région 5' des régions
constantes CK ou Gl murines. Une séquence poly-dC- a
été ensuite ajoutée en 3' des ADNc synthétisés avant
de réaliser l'amplification des régions Vx et VH à
l'aide d'une amorce 5', reconnaissant la séquence poly-
dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions
constantes CK ou Gl murines en 5' de l'amorce de
transcription inverse. Afin d'améliorer la spécificité
de "1'amplification une deuxième PCR semi-nested a
été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une
amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première
PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont.
les suivantes :
1) amorces de transcription inverse
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin
5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO
12)
b. Amorce antisens spécifique Gl murin
-5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCEA''=3' (SEQ'ID NO : 13)*
2) âmorces de PCR 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin
5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14)
b. Amorces antisens spé,Q!if iques Gi murin
Amorce première PCR :
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO
15)
'AmorcePCR semi-nested
5'-CACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO
16) = ,
2. Détermination de la séquence des régions VH et VK
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Après amplification les séquences VK et VH de
l'anticorps 12G4 ont été clonées dans le plasmide
pCR4-TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing,
Invitrogen, ref. 45-0030). Les plasmides issus d'au
minimum 3 colonies recombinantes ont été purifiés et
leur insert séquencé à l'aide des amorces universelles
M13 uni et rev.
La séquence nucléotidique de la région VK de
l'anticorps murin 12G4 est indiquée sous la séquence
SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la
séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient a=u
sous-groupe VK8 (Almagro JC et al: Immunogenetics 1998,,
47 : 355-363). Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de
la région VK de l'anticorps murin 12G4, définies selon
Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of
Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242
(1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes :
SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 3 et SEQ ID NO : 4,
respectivement. Les séquences des CDR1-IMGT, CDR2-IMGT
et CDR3-IMGT de la région VK de l'anticorps murin
12G4, définies selon l'analyse IMGT (international
ImMunoGeneTics database) [Lefranc, M.-P. et ai., Dev.
Comp.- irnmunol., 27, '55-77 ('2003) ] sônt indiquées - sôus-~"
les séqizences suivantes SEQ ID NO :- 18, SEQ- ID -NO-
19 et SEQ ID NO : 20, respectivement. Cette
définition, différente de celle de Kabat fondée sur la
seule analyse de variabilité des séquences, prend en
icompte et combine la caractérisation des boucles
hypervariables [Chothia C. and Lesk A.M. J. Mol. Biol.
196 : 901-17 (1987)] et l'analyse structurale des
anticorps par cristallographie.
La séquence nucléotidique de la région VH de 12G4 est
la séquence-SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique
déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH
appartient.au sous-groupe VH9 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes . Honjo T. and Alt F.W.
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eds, academic Press, London, 1996, pp145-171) Les
séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VH de
l'anticorps murin 12G4, définies selon Kabat [Kabat et
al., "Sequences of Proteins of Immunological
Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont
indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO :
5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement. Les
séquences des CDR1-IMGT, CDR2-IMGT et CDR3-IMGT de la
région VH de l'anticorps murin 12G4, définies selon
l'analyse IMGT (international ImMunoGeneTics database)
[Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77
(2003)] sont indiquéés sousles séquences suivantes :
SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22 et SEQ ID NO : 23,
respectivement. Cette définition, différente de celle
de Kabat fondée sur la seule analyse de variabilité
des séquences, prend en compte et combine la
caractérisation 'des boucles hypervariables [Chothia
C. and Lesk A.M. J. Mol. Biol. 196 : 901-17 (1987)] et
l'analyse structurale des anticorps par
cristallographie.
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