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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
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brevets
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VOLUME
THIS IS VOLUME 1 OF 2
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
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WO 2007/014992 PCT/FR2006/001807
1
Anticorps dirigés contre le récepteur du LDL
La présente invention concerne un anticorps monoclonal
dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density
Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux
acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence
peptidique du récepteur humain des LDL, son
utilisation comme médicament., une composition
pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son*
utilisation dans les analyses immunohistochimiques 'de
tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les
analyses en Western Elot, en ELISA ou en test de
quantification in vivo.
Le cholestérol est'un lipide fabriqué par le foie,
l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il
est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient
dans la fabrication des hormones sexuelles, des
corticostéroïdes comme la cortisone nature-Ile et des
composants de.la bile. Insoluble dans le sang, le cholestérol y est
transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL
(Low Density Lipoprotein).
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la cellule grâce
à u:ne protéine cellulaire de surfa.cé capable de
reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R). Le
complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par
endocytose, et les LDL vont être digérées par les
1_,ysosomes, libérant le cholest-1:5.rol que la cellule va
utiliser.
La cholestérolémie désigne le'taux de cholestérol dans
le sang. Une hypocholestérolémie traduit une
insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une
hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol
dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut
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résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le
LDL-R, ou encore d'un défaut d'internalisation des
LDL, qui peuvent provenir d'une altération
structurelle familiale du LDL-R chez ces patients
(Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients
atteints de certains cancers présentent une
hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la
conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par
les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces
dernières induisent une augmentation du niveau
d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des
organes tumoraux (Henricksson et al., 1989).
Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation
du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et
certains cancers. On peut citer notamment le cancer de
la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des
ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les
leucémies.
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du
virus de l'hépatite C est médiée par les LDL-R. Ainsi,
le LDL-R pourrait servir de récepteur viral.
Ainsi,' il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de
nombreux mécanismes d'importance dans la vie
cellulaire, ainsi que dans de nombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant pour
comprendre son profil d'expression tissulaire dans les
pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la
mise au point et l'étude de nouveaux outils
thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a
cherché à mettre au point un nouvel outil présentant
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une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le
rendant particulièrement adapté à l'étude de
l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses
immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou
cirrhosés, en Western Blot, en ELISA, ou en tests de_
quantification in vivo ou encore pour la fabrication
de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur
mise en muvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention
L'invention se rapporte à un anticorps monoclonal
dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density
Lipoprotein).
Un premier objet de l'invention se rapporte à un
anticôrps monoclonal dirigé contre le récepteur humain
des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide
correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des
LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine
transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend
trois régions : la région extra-celli.ila:irë' - (1-76-8y, lâ
région transmembranaire (76~3-790) et la région
cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est
divisée en deux sous-régions : celle de liaison des
LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de
liaison des LDL (322-768).
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière
à se lier de manière spécifique au peptide
correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est
situé dans la zone de liaison des LDL. Ce peptide a
été choisi car il présente une bonne accessibilité à
l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans
la zone de liaison des LDL, et à sa conformation
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tridimensionnelle. De plus, il présente la
caractéristique d'être immunogène, de par sa
composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des
anticorps selon l'invention en vue de produire un
anticorps spécifique du LDL-R humain et présentant
donc une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce
peptide présente 85-'. d'homologie avec le LDL-R murin
ce qui permet la production d'anticorps qui cross-
réagissent chez l'homme et la souris, d'oû la
possibilité de mettre en uvre à la fois des,tests (de
toxicité notamment) chez la souris et une utilisation
chez l'homme.
D'autres avantages concernant le choix de ce peptide
particulier ressortiront à la lecture de la suite de
la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie
l'anticorps peut aussi correspondre à un peptide
compris dans le peptide correspondant aux acides
aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus
particulièrement, on entend par peptide toute
molécule formée par l'enchaînement d'au moins 2 acides
aminés; préférentiellement de 5 à 35 acides aminés',* et
possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions anticorps
monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal
se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps
possédant une spécificité identique et unique.
De plus, on entend par anticorps tout anticorps
entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou
protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment
d'immunoglobuline, ainsi"que tout dérivé d'anticorps.
Une molécul=e d'immunoglobuline est composée de 4
polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques
de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light)
identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère ést
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composée de 2 domaines, un domaine variable V et un
domaine constant C, repliés indépendamment l'un de
l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La
chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH
et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine
comprend environ 110 acides aminés et est structuré de
manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées
par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est
liée à une chaîne légère par un pont disulfure
également
La région qui détermine la spécificité de l'anticorps
pour l'antigène est portée par les parties variables,
alors que les parties constantes peuvent interagir
avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des
molécules comme le complément pour médier différentes
propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par domaine d'immunoglobuline
l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2,
CH3, CH4. L'-anticorps selon l'invention pouvant
avantageusement contenir un ou plusieurs de ces
domaines, toutes les combinaisons entre les domaines
précédemment cités font partie de l'invention.
On entend par fragment d'immunoglobuline un des
fragments choisis parmi le fragment Fâb,Fab',
F(ab' ) 2, Fc, - -un scFv ou yix~1 CDR (Compleméntarity
Determining Region).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la
papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle
fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et -'un
fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc
est - le support des fonctions effectrices des
immunoglobulines.
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est
généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par
deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en
plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de
deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure
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intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et
légères, on constate que la variabilité de séquence
n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les
régions variables_ sont constituées d'une part de
régions très peu variables nommées charpente ou
framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et
d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité
est extrême : il s'agit des régions
hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à
CDR3 ) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un
fragment constitué uniquement des domaines variables
VH et VL d'un anticorps monoclonal, et dont la
structure est stabilisée par un court bras peptidique
flexible placé entre les deux domaines (Billiald et
al., 1995). De tels fragments peuvent être produits
par, des bactéries. Ces molécules conservent la
capacité à reconnaître de façon spécifique un
antigène. De petite taille (29 kDa), ils sont peu
immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps
entiers.
Ainsi, l'anticorps selon l,'invention pouvant
avantageusenment. contenir un ou plusieurs de ces
fragments, toùtes les combinei-s-ons entre les--fragmen.ts -
précédemment cités font partie de l'invention.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps
selon l'invention contient au moins un domaine
d'immunoglobuline et au moins un fragment
d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une
ou plusieurs régions variables ou hypervariables.
Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout
anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou
plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou
additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés.
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Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps
selon L'invention, qui possède la particularité de se
lier au peptide correspondant aux acides aminés 280-
307 (SEQ ID NO : 1) du récepteur humain des LDL, ainsi
que les caractéristiques présentées ci-après, permet
de manière avantageuse le recrutement de cellules
effectrices. A cet égard, une cellule effectrice
est une cellule qui provoque la destruction des
cellules sur lesquelles - l'anticorps est lié
( cellules cibles ). Plus particulièrement, les
cellules effectrices expriment à leur surface un
récepteur du fragment Fc des anticorps. De plus, on
entend par recrutement la faculté que possède
l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules
capables de provoquer la destruction des cellules-
cibles. La destruction peut être une lyse, c'est-à-
dire une destruction des cellules-cibles avec
libération de leurcontenu. Le peptide sur lequel se
lie l'anticorps selon l'invention ( peptide-cible ),
est situé dans la région de liaison des LDL (ligand
naturel du LDL-R).
Par cette liaison, l'anticorps selon l'invention
permet le recrutement de cellules capables de
provoquer la destruction dë"'céllules"""sur lesquelles
l'anticorps selon l'-invention- est lié, c',est-à-dire de
cellules exprimant à leur surface le LDL-R
( cellules-cibles )-.
On entend par liaison la fixation de l'anticorps
sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des
cellules capables de provoquer la destruction des
cellules-cibles.
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer). Elles peuvent aussi être des
macrophages,= des neutrophiles, le lymphocyte T4, le
lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules possèdent
à leur surface des récepteurs du fragment Fc des
anticorps selon l'invention. Les anticorps selon
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l'invention se lient à la cellule-cible par leur
fragment variable et se lient aux cellules effectrices
par leur fragment constant. Cette relation dépendante
des anticorps entre les cellules cibles et les
cellules effectrices provoque la lyse des cellules
cibles par un mécanisme de type ADCC (Antibody
Dependent Cellular Cytotoxicity).
De manière avantageuse, les cellules cibles selon
l'invention sont des cellules tumorales.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention
permet la destruction des cellules cancéreuses
( cellules cible ). En effet, le recrutement des
cellules effectrices engendre une destruction des
cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention
est lié. Or, des études ont montré qu'il existe une
corrélation entre l'augmentation du niveau
d'expression du LDL-R par les cellules et certains
cancers. En effet, des patients atteints de certains
cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette
hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-
utilisation du cholestérol par les cellules
cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent
une augmentation du niveau d'expression du récepteur
des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux'
(Henricksson et al.*, 19-89-) .- On peut -Liter -notamment --le
cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas,
des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les
leucémies. Les cellules cancéreuses sur-exprimant le
LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps
selon l'invention qui, par recrutement de cellules
capables de détruire les cellules sur lesquelles
l'anticorps est lié, provoquera la destruction de ces
cellules cancéreusés.
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal
dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density
Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux
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acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence
peptidique du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une région CDR
(Complementarity Determining Region) de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les
séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4,
et au moins une région CDR de chacune des chaînes
lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une
séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec
une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDR1
et/ou CDR2 et/ou CDR3.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au
moins 70%, de manière préférée- d'au moins 80%, 900-.,
95%, 990-. et de manière encore plus préférentielle de
100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé
en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant
le nombre de positions possédant un acide 'aminé
identique, ce nombre étant-, divisé pa-r le -nombre
.- -
d-'-a:c~ides - aminés total de la -séquenc~-c . En - tout état-- -de --
cause, ces différences de séquences .n'.affectent.en
rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa
cible, ni sa capacité à recruter des cellules
immunitaires effectrices.
De manière particulièrement avantageuse, chaque région
CDR de chacune des chaînes légères de l'anticorps
selon l'invention possède une séquence peptidique
ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ
ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO 4
respectivement, et en ce que chaque région CDR de
chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon
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l'invention possède une séquence peptidique ayant au
moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5,
SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement. Ainsi, la
région CDR1 de chacune des chaînes légères de
l'anticorps selon l'invention possède une séquence
peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la
séquence SEQ ID NO : 2, la région CDR2 de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, la région
CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps
selon l'invention possède une séquence. peptidique
ayant au moins 7026 d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 4, et la région CDRl de chacune des chaînes
lourdes de. l'anticorps selon l'invention possède une
séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec
la séquence SEQ ID NO : 5, la région CDR2 de chacune
des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention
possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec lâ séquence SEQ ID NO : 6, la région
CDR3 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps
selon l'invention possède une séquence peptidique
ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO . 7.
De - maniè=re particulièrement avantageuse ~ 1' zdentité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au
moins 70'-., de manière préférée d'au moins 80-0., 90-'.,
95%, 99-. et de manière encore plus préférentielle de
100o d'identité.
Avantageusement, la région 'variable de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est
codée par une séquence d'acide nucléique possédant au
moins 70-'. ' d'identité avec la séquence d'acide
nucléique SEQ ID NO : 8, et, la région variable de
chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon
l'invention est codée par une séquence d'acide
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nucléique possédant au moins 70-'. d'identité avec la
séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
De manière particùlièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au
moins 70%, de manière préférée d_',au moins 80%, et de
manière encore plus préférentielle de 95-0. ou 99-0.
d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en
alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le
nombre de positions possédant un nucléotide identique,
ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides
total de la séquence. La dégénérescence. du code
génétique peut être à l'origine du fait qu'un même
acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de
nucléotides différents. En tout état de cause, ces
différences de séquences n'affectent en rien
l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni
sa capacité à recruter des cellules immunitaires
effectrices.
Préférentiellement, la région variable de chacune des
chaînes- légères de l'anticorps selon l'invention est
codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8,
et la région variable de chacune de ses chaînes
lourdes est codée par la 'séquence d'acidé nucléique
SEQID NO- : -~ -.
De manière avantageuse, la région variable de chacune
des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
possède au moins 70-'. d'identité avec la séquence en
acides aminés SEQ ID NO : 10 et la, région variable de
chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70-'.
d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID
NO : 11. De manière particulièrement avantageuse,
l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus
est d'au moins 70 -0., et de manière préférée d'au moins
80%, et de manière encore plus préférentielle de 95%
ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est
calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en
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comptant le nombre de positions possédant un acide
aminé identique, ce nombre étant divisé par le nombre -
d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des
chaînes légères de l'anticorps selon l'invention
possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la
région variable de chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps selon l'invention possède la séquence
peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ
ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la
séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence
peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de
la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout
anticorps modifié répondant aux caractéristiques de
l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés
ont_été ajouté(s), substitué(s) ou délété(s). Un tel
ajout, substitution ou délétion peut être localisé à
n'importe quelle position dans la molécule. Dans le
cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés,
substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de
substitutiôn ou de délétion peut être considérée. De
telles altérations de --la -- séquen.ce --cles régions
variables de l'anticorps selon l'invention peuvent
être effectuées dans le but d'augmenter le nombre de
résidus susceptibles d'entrer en contact avec le
pept.:-ide cible.
Avant'ageusement, un anticorps selon l'invention peut
être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2,
un fragment Fab', un fragment Fab, une région CDR ou
toute version modifiée de l'un quelconque de ces
fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un
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anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps
monoclonal murin est une IgGlkappa. Un tel anticorps
peut être produit par immunisation d'un animal, en
particulier d'une souris, avec le peptide
correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1), ou avec tout autre peptide du LDL-R humain situé
dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de
production d'anticorps sont connues de l'homme du
métier. Selon un mode particulier de production des
anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO
1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides
aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence du LDL-R
peut être injecté par voie intra péritonéale à des
souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund.
Plusieurs rappels d'immunisation sont effectués en
présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de
la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des
prélèvements _sanguins. par ELISA contre le peptide SEQ
ID NO : 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la
fusion des cellules spléniques des souris immunisées
avec des cellules de myélomes de souris en présence de
PEG (polyéthylèneglycol). Les cellules sont ensuite
cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse
..contrerle ~.eptide SEQ ID NO -: 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un
anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle,,ï l'anticorps selon
l'invention est chimérique.
On entend par anticorps chimérique un anticorps
dont les régions variables des chaînes légères et des
chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente
des régions= constantes ,des chaînes légères et des
chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention
possède en outre des régions variables murines et des
régions constantes appartenant à une espèce non-
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murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de
mammifères non-murins sont susceptibles d'être
utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les
muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les
équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi
que les oiseaux. De manière encore préférée, les
régions constantes de chacune des chaînes légères et
de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon
l'invention sont des régions constantes humaines. Ce
mode de réalisation préféré de l'invention permet de
diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme
et par là même d'améliorer son efficacité lors de son
administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la
région constante de chacune des chaînes légères de
-l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout
allotype convient à la réalisation de l'invention, par
exemple Km(1), Km(l, 2), Km(l, 2, 3) ou Km(3).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la
région constante de chacune des chaînes légères de
l'anticorps selon l'invention est de type A.
Dans un aspect particulier de l'invention, et
notamment lorsque les régions constantes de chacune
des chaînes- légères -et dè chacune des chaînes 'l:ôurdes '
de - l' anticorps selon -=l' invention - -scs-nt des régions-
humaines, la région constante de chacune des chaînes
lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette
variante, la région constante de chacune des chaînes
,.lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type
y2, de type y3, ces trois types de régions constantes
présentant la particularité de fixer le complément
humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant
une région constante de chacune des chaînes lourdes de
type y appartiennent à la classe des IgG. Les
immunoglobulines de type = G. (IgG), sont des
hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2
chaînes légères, liées entre elles par des ponts
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disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position
N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée
par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et
V-D-J pour'la chaîne lourde) spécifique de l'antigène
contre lequel l'anticorps, est dirigé, et en position
C-terminale, d'une région constante, constituée d'un
seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines
(CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association
des domaines variables et des domaines CH1 et CL des
chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui
sont connectées à la région Fc par une région
charnière très flexible permettant -à chaque Fab de se
fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc,
médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps
reste accessible aux molécules effectrices telles que
les récepteurs Fc[]R et le Clq. La région Fc,
constituée des 2 domaines globulaires CE12 et CE13, est
glycosylée au niveau du domaine C02 avec la présence,
sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné,
lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune
des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yi, car
un tel anticorps montre une capacité à engendrer une
activité ADCC (Antibody-Dependënt Cellulâr
Cytotoxicity) chez le plus- grand norribre- d'indivridus -
(humains). A cet égard, tout allotype convient à la
réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), Glm
(1, 2, 17), Glm(l, 17) ou Glm(1,3).
Les anticorps chimériques"selon l'invention peuvent
être construits en utilisant les techniques standard
de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du
métier, et plus particulièrement en utilisant les
techniques de construction des anticorps chimériques
-décrites par'exemple dans Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 81 : b851-55 (1984), où la
technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour
remplacer la région constante d'une chaîne lourde
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et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un
anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les
régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine.
De tels anticorps et leur mode de préparation ont
également été décrits dans la publication brevet EP
173 494, dans le document Neuberger, M.S. et al.,
Nature 1985 Mar 21-27;314(6008) :268=70. , ainsi que
dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes
pour générer des anticorps chimériques sont largement
disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les
chaînes lourdes. et légères de l'anticorps peuvent être
exprimées séparément en utilisant un vecteur pour
chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul
vecteur.
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide
nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique
murine codant pour le domaine variable de chacune des
chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la
séquence d'acide nucléique, de préférence humaine,
codant pour la région constante de chacune des chaînes
lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées,
afin de les introduire et de les maintenir dans une
cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments
d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car
il pôssède des "séqu:ericës ' ifidïspënsâ.bles (promôtëur,
séquence de polyadénylation, gène de sélection) à
cette expression. Le vecteur peut être par exemple un
plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un
bactériophage, et la cellule hôte peut être toute''
cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0,
IR983F, le myélôme humain Namalwa, PERC6, les lignées
CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-
L,ec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero,
. Molt-4, COS-'7, 293-HEK,.BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et
P3X63Ag8.653. '
Pour la construction de vecteurs d'expression des
anticorps chimériques selon l'invention, des séquences
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signal synthétiques et des sites de restriction
appropriés peuvent être fusionnés aux régions
variables au cours des réactions d'amplification par
PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec
les régions constantes d'un anticorps, de manière
préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi
construits sont clonés sous le contrôle d'un promoteur
(par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site
de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés
(un- pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également
munis de gènes de sélection connus de 1,'homme du
métier, tels que par exemple le gène dhfr ou le gène
de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent
être produits par co-transfection dans une cellule
hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du
vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant
une méthode bien connue de l'homme du métier (par
exemple,la co-précipitation au phosphate de calcium,
l'électroporation, la micro-injection, etc.). A
l'issue de la transfection, les cellules peuvent être
mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI
(Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5-. de sérum
dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de
-G418 (Invitrogen, réf : 10131-027) - et 25 - -nM- -de
methotrexate (Sigma, réf. M8407). Les surnageants des
puits de transfection résistants sont criblés, pour la
présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage
ELISA spécifique des., séquences Ig humaines. Les
transfectants produisant le plus d'anticorps sont
amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin
d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3
meilleurs producteurs pour le clonage par dilution
limite (40 cellules / plaque).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un
anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un
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anticorps d'origine non humâine, les autres parties de
la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de
plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps
peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de
CDR ( CDR-grafting ) bien connues de l'homme ,du
métier [publications brevet US 5,225,539, US
6,180,370 ; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5.
(1986) ; Verhoeyen et al., Bioessays 8(2) : 74-8 (1988)
; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen
C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(24):10029-33
(1989) ; Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2):297-
302 (1991) ;' Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res
19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad,
Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol
150 (7) : 2844-57 (1993) ;' Presta et al., J. Immunol. ,
151:2623 (1993')]. Le choix des domaines variables
humains à greffer pour la production d'anticorps
humanisés est important afin de réduire
l'immunogénicité de l'anticorps sans altérer son
af f inité pour sa cible. Dans une méthode de production
d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine
variable d'un anticorps murin est comparée à une
banque de séquences de régions variables humaines
connues et -la séquence variable Yï.urnàine la plus proche'
de -la- séquence murine est rettnué comme -région FR- de-
l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332:
323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA
86(24) :10029-33 (1989) ; Sims et al., J. Immunol.,
151 :2296 (1993 )]. Une autre méthode de sélection de5~
régions FR humaines est la comparaison de la séquence
de chaque sous-région de la séquence FR murine (FR1,
FR2, FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR
humaines connues, afin de choisir, pour chaque région
FR, la séquence FR humaine la plus proche de la
séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ;
Sato K_ et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ; Leung
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S.O. et al., Mol Immunol 32(17-18):1413-27 (1995) ].
Une autre méthode utilise une région FR particulière
dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps
humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde
ou légère [Sato K. et al Mol Immunol 31(5):371-81
(1994) ]. La greffe de CDR est complétée dans la
majorité des cas par la mutation de certains résidus
clés localisés dans les FR humains afin de conserver
une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa
cible [Holmes M.A. and Foote J., J Immunol
158 (5) :2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon l'invention sont
préférés pour leur utilisation dans des méthodes de
diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique
et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou
humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par
l'organisme humain, et au moins aussi efficace que
l'anticorps murin. De manière 'particulièrement
avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé
est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin
correspondant. De manière encore plus- avantageuse,
l'anticorps ainsi chimérisé y6u -.humanisé est 10 fois,
-. .ou en.core 10O fois.- ou - de -maniè--re ---préférée-- p-lus --dE- 100
fois plus cytotoxique que l'anticorps murin
correspondant.
Par anticorps humain,.~ on entend dé.signer un anticorps
dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain.
Ces anticorps peuvent être dérivés de souris
transgéniques portant des gènes d'anticorps humains,
ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin
Biotechnol. Oct;6(5):561-6 (1995) ; Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of~ Immunology 13 :65-93
(1995) ; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97 (2) : 722-727 (2000)].
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De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention
est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple,
la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre
l'anticorps selon l'invention et la toxine est
suffisamment forte pour éviter la libération
systémique de la toxine et aussi suffisamment labile,
afin que la toxine soit libérée dans les cellules
cibles.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est
couplé à un radio-isotope. La présence du radio-
isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux
isotopes sont essentiellement utilisés l'iode 131
(émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est
relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet
tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule
tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention.
L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la
réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect
des mesures de radio-protection. L'yttrium 90
(émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5
jours), exerce des effets tumoricides sur une distance
de 5 mm.
-.De- manière- avantagëuse;~-1-'-anticorps - selon-- 1' invention
permet le recrutement de cellules immunitaires
effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne
spécificité et sa bonne sensibilité, est un outil
pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Ar,~:ibody
Dependent Cellular Cytotoxicity). En effet,
l'anticorps selon l'invention peut être modifié de
manière à induire l'ADCC, par exemple en étant
chimérisé ou humanisé. L'anticorps selon l'invention
permet le = recrutement de çellules immunitaires
effectrices.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention
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permet la destruction des cellules cancéreuses. En
effet, le recrutement des cellules effectrices par
l'anticorps selon l'invention engendre une destruction
des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
(cellule cibl,e). Les cellules cancéreuses sur-
exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de
l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules
lysées seront de manière quasi-spécifiques les
cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-
exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi
préservées.
Un anticorps préféré selon l'invention ést l'anticorps
5E5, susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5
(déposé sous le numéro I-3488 à l.a CNCM, Collection
Nationale de Culture des Microorganismes, 25 rue du
Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). La région
variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps
monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée
par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la
région variable de,chacune des chaînes lourdes de
l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5
est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO :-9.
Un objet particulier de l'invention concerne un
anticorps monoclonal se liant* au LDL-R et permettant
le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps
est le 5E5, ou .,~out anticorps chimérique, humanisé ou
humain possédant les parties variables de l'anticorps
5E5.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est
produit dans= la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL-
1581).
Un autre objet de l'invention se rapporte à urie lignée
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cellulaire stable produisant un anticorps selon
l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable
selon l'invention est choisie parmi le groupe
consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule
YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type
Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662),
SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain
Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1,
CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-,
Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK,
K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à
l'hybridome H5E5 déposé sous le numéro
d'enregistrement CNCM I-3488 à la CNCM.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un
fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour
la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps
selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé
pour la fabrication d'un polypeptide se liant au
peptide correspondant aux acides aininés 280-307' (SEQ
ID NO : 1)--, ce polypeptidê pouvant être -un anticorps.,
Un autre objet de l'invention* se rapporte à un
fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour
la région variable de la Chaîne légère d'ury anticorps
selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut
être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se
liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-
307 (SEQ ID NO : 1), ce polypeptide pouvant être un
anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur
d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN
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choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9
ou SEQ ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide
correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des
LDL. =
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un
anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou
in vivo les récepteurs FcyRIII de , cellules
immunitaires effectrices. En effet, les anticorps de
l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à
activer par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci
représente un intérêt considérable, car ce récepteur
est exprimé à la surface de cellules appelées
cellules effectrices : la liaison de la région Fc
de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule
effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la
destruction des cellules cibles. Les cellules
effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural
Killer), des macrophages, des neutrophiles, les
lymphocytes CDB, les lymphocytes TyS, les cellules NKT,
les éosinophiles, lés basophiles bu les mastocytës ." --
Uri autre objet particulier de l'invention est un
anticorps tel que décrit précédemment pour son
utilisation comme médicament.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps
utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet
le recrutement de cellules effectrices.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se
lier à tout ou partie de la région extracellulaire du
récepteur des LDL, c'est-à-dire, qu'il est capable de
se lier à la région de liaison des LDL (correspondant
aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de
la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides
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aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps
selon ],'invention, se liant au peptide correspondant
aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO 1) de la
séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode
de réalisation.. particulier de cet objet de
l'invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est
l'utilisation d'un anticorps tel que décrit
précédemment pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se
lier à tout ou partie de la région extracellulaire du
récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de
se lier à la région de liaison des LDL (correspondant
aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de
la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides
aminés 322-768 du LDL-R). A cet égàrc3., l'anticorps
selon l'invention, se' liant au peptide correspondant
aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la
séquence peptidique du récepteur humain. des LDL, est
un mode de réalisation particulier de cet objet de
l'invention.'
Un autre objet de 1'invention -est l'u-tilisation d'un
a.r.ltiçorps. tel . qzze, décrit. précéci.emment, c'est-à-d.ire
possédant la capacité de se lier à tout ou partie de
la région extracellulaire du récepteur humain des LDL
et avantageusement au peptide correspondant aux acides
aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de ~la séquence du
récepteur humain des LDL, pour la fabrication d'un
médicament destiné au traitement du cancer. En effet,
l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de
manière spécifique.. A cet égard, l'anticorps selon
l'invention,, en se liant à ce récepteur, va engendrer
une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses,
notamment par ADCC contre les cellules cibles
cancéreuses et permettre la lyse, de ces dernières.
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Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-
spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules
saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant
ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen
de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour
lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la
surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport
aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer
traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie,
du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du
poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une
augmentation de la densité de récepteurs au LDL sur la
surface mémbranaire des cellulés cancéreuses. Les
cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par
les cellules.effectrices recrutées lors de la réaction
d'ADCC, les cellules saines étant préservées'
puisqu'elles.ne sur-expriment pas le LDL-R.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps
-selon l'invention est utilisé "poùr- la préparation.' d' iiri
-riédicâmént -destiné---au- traitement --des~ cancer-s-- incluant
la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires
aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémié
myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies
lympho3,des, les leucémies lymphoïdes chroniques, les
tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde
cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome
gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le
choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l'invention.concerne une composition
pharmaceutique comprenant un anticorps selon
l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient
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et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
Cette composition pharmaceutique a pour vocation de
cibler les cellules cancéreuses, notamment celles
surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses
exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au
LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés
par les cellules saines, le médicament ainsi préparé
sera préférentiellement lié par les cellules
cancéreuses.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une
solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée,
etc., ainsi que toute suspension; gel, poudre, etc.,
compatible avec un usage pharmaceutique et connu de
l'homme du métier. Les compositions selon l'invention
peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou
véhicules choisis parmi les dispersants,
solubilisants, stabilisants, surfactants,
conservateurs, etc. D'autre part, les compositions
selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents
ou principes actifs.-
Par ailleurs, les 'compositions peuvent être
administrées de différentes manières et sous
différentes formes. L'administration peut être
--rëalisée par toute voie "classique pour 'cé type*
-d' approche ----thérâpeut 'ique, -co-mme - notamment - par- - voie-
systémique, en, particulier par injection
intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-
cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-
artérielle, etc. On peut citer par., exemple l'injection
intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de
la tumeur ou irriguant la tumeur.
Les doses peuvent varier en fonction du nombre
d'administrations, de l'association à d'autres
principes actifs, du stade, d'évolution de la
pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de
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l'anticorps selon l'invention dans les analyses
immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou
cirrhosés, ou dans les analyses en Western Blot, en
ELISA ou en test de quantification in vivo.
L'anticorps 5E5 est particulièrement approprié pour
son utilisation en Western Blot, car il reconnaît de
manière spécifique une bande de 160 kDa et une bande
de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non
glycosylées respectivement du LDL-R humain.
L'anticorps 5E5 présente donc un avantage en tant
qu'outil de diagnostique des pathologies impliquant le
LDL-R, et plus particulièrement les cancers.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront
décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent
être considérés comme illustratifs et ne limitent pas
l'étendue de l'invention.
Légendes de figures
Figure 1: Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en
unités arbi-traires de flubrescènce) .
Figure 2 : Liaison des LDL-Dil sur des cellules HepG2
(résultats exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes).
p: .
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer
du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés
en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 4:-Liaison des anticorps anti-LDL~-R 5E5 sur
des cellules A549 (résultats, exprimés en pourcentage
de cellules fluorescentes) . Les anticorps anti-LDL-R
5E5 sont produits par l'hybridome H5E5 et sont dirigés
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contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-
307 de la séquence du récepteur des LDL (SEQ ID NO:
1).
Figure 5 Liaison des antiçorps anti-LDL-R SES sur
des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
SES sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats
exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats
exprimés en moyenne de fluorescence).
Figure 7 Compétition des anticorps anti-LDL-R 5ES
avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats
exprimés en moyenne de fluoresçence).
Figure 8 Cinétique d'internalisation des anticorps
anti-LDL-R SES avec les LDL, sur des cellules A549
(résultats exprimés en pourcentage d'internalisation).
-FigurA*__.. 9- : Caractérisaaibn de l'. anticorps - 5E5 en:,
Western Blot
Exemples
Exemple 1 Production, sélection et caractérisation
d'anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
correspondant à la séquence d'acides aminés 280-307 de
la séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO
1)
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Choix de la séquence peptidique a propriée
Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ
ID NO : 1 (correspondant aux acides aminés 280-307 de
la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la
région de liaison aux LDL a été synthétisé. La
séquence SEQ ID NO : 1 choisie a été modifiée
(remplacement des cystéines par des sérines) afin
d'éviter la formation de ponts disulfures en cas
d'oxydation du groupement thiol des cystéines (SEQ ID
NO : 17).
Synthèse peptidique
Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse
en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle
ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA),
en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA
0,5 mmol.
Spectrométrie de masse
La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un
spectromètre de masse à électrospray d'ions. Le
spectre de l'électrospray a été obtenu en utilisant un
appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre
de ma-sse par électrcispray- d' ions à qta.adripôlé simpl"e; "
. . .. .
équipé avec un spray-=d'.ions -(élec-t-r-osp-ray assisté d'urz-
nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada).
Production d'anticor s monoclonaux
Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide
correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 sont
produits en immunisant des souris mâles BALB/c par
injection intrapéritonéale du peptide correspondant à
la SEQ ID NO : 17, le peptide étant préalablement
émulsifié avec un volume égal d'adjuvant complet de
Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les
deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de
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Freund. Quatre jours après la dernière injection, les
rates des animaux sont prélevées, puis les cellules
sont isolées et fusionnées avec des cellules dé
myélome de souris Sp 2/0-Ag14 en présence d'agent de
fusion tel que le polyéthylène glycol. Les cellules
fusionnées sont ensuite incubées dans. un milieu
sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissànce de
cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des
hybridomes, des sous-clonages par dilution-limite ont
été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages, un
hybridome dénommé HSE5 , producteur d'anticorps
dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1 a été sélectionné.. Cet hybridome appartient à
la classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l'hybridome H5E5 ont été
testés par un test ELISA, pour la sécrétion d'un
anticorps monoclonal de spécificité recherchée, à
savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c
mâles ayant reçu au préalable une injection de
pristane et auxquelles 2.106 cellules d'hybridome H5E5
ont été injectées.
Les -anticorps monoclonaux -ont étê- isolés --par-
précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis
purifiés par chromatographie d'affinité sur gel de
protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham
Bioscience, Uppsala, Suède). Les protéines non
retenues ont été éliminées par lavage avec une
solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L,
pH 7,2, NaCl 150 mmol/L). L'élution des
Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de
l'anticorps =dirigé contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 a été accomplie en utilisant
de la glycine à 0,2 M à pH2,8. Les anticorps purifiés
ont été dialysés immédiatement contre 10 mmol/L de
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PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par
aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à-20 C.
Ces anticorps seront dénommés ci-après Anti-LDL-R
5E5 .
Analyse en Western Blot
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été testés en Western
Blot. Des extraits de protéines totales de cellules
MDA-MB-231 ont été soumis à une électrophorèse
dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis transférés sur
une membrane de nitrocellulose et mis à réagir avec
les anticorps Anti-LDL-R 5E5. Les protéines
immunoréactives ont été visualisées avec un anticorps
monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase
(Chemicon). Le développement de la réaction a été
effectué par chemiluminescence (Amersham,
Biosciences).
L'analyse en Western Blot montre que l'anticorps anti-
LDL-R 5E5 reconnaît une bande de 160 kDa et une bande
de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non
glycosylées respectivement du LDL-R humain (Figure 9).
Isotypage
L'isotypage des hybridomes a ét'é effëctüé par. - ELISA
avec- l-e kit SEA- ~lonotyping System/HRP,
(SouthernBiotech) et avec l'Isostrip Mouse Monoclonal
Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027).
L'anticorps 5E5 est une IgGl, kappa.
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses
Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été
criblées pour l'expression du LDL-R HepG2, HeLa,
MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la
liaison de LDL marquées (Figures 1 et 2). Pour cela,
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les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées
par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS,
pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions
dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-
dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-i.ndocarbocyanide
(Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur des cellules à
des concentrations finales de 0, 10 et 100 pg/ml
pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la
liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorting) c'est-à-dire que
la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une
population donnée est individuellement mesurée par
cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton
Dickinson). Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) et la
fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm
après excitation avec" un laser Argon à 488 nm. Les
résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes (Figure 1).
*Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que
les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le
plus fortement le LDL-R.
De plus, plusieurs lignées cellulaires de cancer du
sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-
MB-231. L"expréssion dia. LDL-R sïa.r cès - lignées
cellulaires cancéreuses humaines a été mise en
évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur
cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.03-
1.053) ont été prépa'rées par ultracentrifugation,
dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par
SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par
le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3,3,3',3'-
tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont
été incubées sur les cellules= à des concentrations
finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3
heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été
analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats
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ont été exprimés en pourcentage de cellules
fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau
d'expression du LDL-R (figure 3) : les MCF7-ras ainsi
que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R
équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-
231 représentent une population homogène qui exprime
le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 : Tests fonctionnels in vitro des-anticorps
monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 sélectionnés à l'Exemple 1
La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés
contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des
anticorps au,LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549
et cellules .MDA-MB-231), l'étude de la cross-
réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12
(souris) , CHO-K1 (hamster) , YB2/0 (rat) , l'étude de la
compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL-
R de cellules A459, l'étude de leur cinétique
d'internalisation ai.xs.si_ que a..' ét-.ude du caractère pro-
apoptotique aes anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au
LDL-R de cellules A549
La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R a été
évaluée par quantification du marquage de cellules
A549 cultivées en présence de LPDS (lipoprotein
Deficient Serum) pendant 24h, par cytométrie en flux
(FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps, Anti-LDL-
R 5ES ont été incubés à des concentrations finales de
(1, 3, 10, 30, 100 g/ml) pendant 3 heures à 4 C. Les
anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl, ATCC-LGC
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Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), préparés et incubés dans les mêmes
conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis
d'anticorps contrôles, négatif et positif
respectivement. La révélation de la liaison a été
effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti-
IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage
de cellules fluorescentes (Figure 4).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules A549 de manière dose-dépendante.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au
LDL-R de cellules MDA-MB-231
La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R des
cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même
protocole décrit pour l'étude de la liaison des
anticorps Anti-LDL-R 5ES au LDL-R de cellules A549,
par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231
cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par
cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les
anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à des
concentrations finales de 1, 3, 10, 30, 100 ~ig/ml
pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6
(anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R., IgG2b),
_ . : r,_..___,._.. _
préparés 'ét~ incubés' dans les -mêmes conditions que les--
Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles,
négatif et positif respectivement. La révélation de la
liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE.
Les résultats, ont,-été exprimés en pourcentage de
cellules fluorescentes (Figure 5).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules MDA-MB-231
Etude de la cross-réactivité des anticorps Anti-LDL-R
5E5 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-K1 et YB2/0
La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R a été
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testée chez la souris (cellules C2C12), chez le rat
(cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-K1).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à une
concentration finale de 30 }a.g/ml pendant 3, h:eures à
4 C sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0
préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant
24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl)
et C7 (anti-LDL-R,, IgG2b) ont servis d'anticorps
contrôles négatif et positif respectivement. La
révélation de la liaison a été effectuée en utilisant
un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et
en moyenne de fluorescence (Figure 6B).
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 5E5
avec les LDL sur des cellules A549
La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R
SE5 a été étudiée en testant la liaison des anticorps
Anti-LDL-R 5E5, à 30 pg/ml, en compétition avec des
LDL non marquées à des concentrations croissantes (1,
4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée
en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à 4 C. La
révélation de la liaison a été 'efféctué-e en ü.til=isant
un- anti-I-gG-PE "'.-Lâ -l*ia.is n dés- anticorps' --au LDL-R -a
été ensuite analysée par FACS et les résultats
exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7).
Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a
permis. de mettre en évidence que la liaisQn de
l'anticorps SES au LDL-R des cellules A549 n'est pas
diminuée par l'addition de LDL à des concentrations
physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les
anticorps 5E5 ne se lient pas au même site que les
LDL. Cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R
5ES
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La cinétique d'internalisation de l'anticorps Anti-
LDL-R 5E5 a été étudiée sur 24 heures lors de
l'incubation à 37 C de l'anticorps (30 pg/ml) marqué à
la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur
des cellules A549. Les cinétiques d'internalisation de
l'anticorps contrôle C7 (30 l.zg/ml) marqué à la
rhodamine et des LDL-Dil (30 }a.g/ml) ont été étudiées
en parallèle. Après 2h, 4h, 6h et 24h d'incubation,
les anticorps/LDL-Dil liés mais non internalisés ont
été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés
par fluorimétrie. Les cellules A549 ont ensuite été
lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité
d'ainticorps internalisés a été quantifiée par
fluorimétrie. Le pourcentage d'internalisation a été
calculé selon la formule suivante : fluorescence des
anticorps internalisés/(fluorescence des anticorps
internalisés + fluorescence des anticorps liés mais
non internalisés).
La cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-
R 5E5 est intermédiaire entre celle des LDL (cinétique
la plus rapide avec 60-'. d'internalisation à 4h) et
celle du C7 qui s'internalise un peu plus lentement
(Figure 8). Comme pour les LDL, la cinétique
d'inter-nalisation des- anticorps -est- biphâsique avec
. __ , .
une i,nterna,lisatïor? : ragide.-.au . cours--- des- 4- à.---5-
premières heures. Après 6h d'incubation, les 3
anticorps testés montrent le même taux
d'internalisation avec un plateau d'internalisation
d'environ 60-0. à 2.4h.
Etude du caractère pro-apoptotique des anticorps Anti-
LDL-R 5E5
La croissance des cellules A549 en présence et en
l'absence d'=anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée par
un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à la
phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase
précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne marque que
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les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique
est lésée) par c tométrie en flux (FACS). Pour
réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5ES ont été
incubés à une concentration finale de 30 ug/ml pendant
16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 37 C. Les
anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7
(anti-LDL-R, IgG2b), préparés et incubés dans les
mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis de
référence. Un contrôle négatif, cellules sans
anticorps, et un contrôle positif, cellules incubées-
avec de la camptothécine, ont été effectués
parallèlement.
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ne présentent pas d'effet
fortement pro-apoptotique sur lés cellules A549 après
16h d'incubation.
Exemple 4 : Etudes in vivo
Le modèle animal choisi est un modèle de xénogreffe de
tissu tumoral humain sur des souris nude. La
xénogreffe de cellules tumorales est implantée en
sous-cutanée.
Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour
la xénog,ré f f e
:,_ ... .
Cr blage- . -dés lignées cel-l-ul-aires - pour -
l'expression du LDL-R
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont
disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et,le
choix de la lignée à implanter dépend pour n.~itre étude
du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R
sur ces lignées cellulaires cancéreuses humaines a été
mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL
marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les
LDL (d=1.0à-1.053 g/ml) ont- été préparées par
ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH
7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions
dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-
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dioctadecyl-3,3,31,3'-tetramethyl-indocarbocyanide
(Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules à
des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et
100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au
PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie
(FACS) et les résultats ont été exprimés en
pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau
d'expression du LDL-R (Figures 2 et 3): les MCF7-ras
ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du
LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les
MDA-MB-231 représentent une population homogène qui
exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu de ces
résultats, notre choix -sur la lignée à implanter s'est
porté sur les MDA-MB-231.
= Détermination .du nombre de cellules à implanter
pour la xénogreffe
La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du
nombre de cellules implantées chez des souris nude a
été étudiée. L'étude porte sur l'"implantation de
0, 5. 106, 106, 2. 106 et 5. 106 cellules.
= Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R
5ES avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231
La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5
a été étudiée en testant la liaison des LDL marquées
au Dil, à 12.5 l.zg/ml en compétition avec l'anticorps
Anti-LDL-R 5E5 à des concentrations croissantes (6,25,
12,5, 25, 50., et 80 ~a.g/ml) sur des cellules MDA-MB-231
pendant 3 h à 4 C. La liaison des anticorps au LDL-R a
été ensuite analysée par FACS et les résultats sont
exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes..
Prôtocole in vivo
Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti-
LDL-R 5E5, l'approche choisie consiste à injecter la
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lignée cellulaire et l'anticorps simultanément (Test
de Winn=). Cette approche permet d'évaluer la capacité
de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris
nude implantées avec 106 cellules MDA-ME-231 reprises
dans 200~a.l d'un anticorps contrôle, de même isotype
que l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 (TgG3,) qui ne reconnaît
pas le LDL-R, sans traitement successif à
l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5- souris nude implantées
avec 106 cellules MDA-MB-231 r.eprises dans 200u1'
d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, sans traitement successif
à l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche modifiée du test de
Winn consistant à traiter les souris nude après
implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 et de
l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec 1'anticorps Anti-LDL-R
5E5, deux fois par semaine au cours des 4 semaines de
l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le
troisième groupe comprend 5 souris nude implantées
avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 2001-i1
d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, traitées en intra-
pérïtoriéâle par 500 ug d'ain.ticorps An'ti-LDL=R SES, 2
....
fois par semaine (le premier traitement par' 500 - g-
ayant eu lieu 3 à 4 h après l'implantation des
cellules).
Les souris sont contrôlées tous les jours avec mesure
de la prise de poids et de la taille de.:la tumeur 3
fois par semaine. A la fin des 4 semaines de
protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le
coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés
à - 80 C pour chacune des 5 souris de chaque groupe.
Par ailleurs, les sérums des, souris sont aussi
récupérés et congelés.
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Exemple 5 Etude de faisabilité thérapeutique.
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but
de mettre en évidence une sur-expression du LDL-R dans
le tissu, cancéreux par rapport au tissu sain, dans
différents types de cancers. Pour cela une analyse en
Western B1ot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a
été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de
tissus issus de patients atteints de carcinome
hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose
provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le virus
de l'hépatite C (15 patients). Deux prélèvements de
tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un
échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais
cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu
tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70%
d'hépatocytes tumoraux).
Des analyses de type Western Blot, en utilisant un
anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research
Diagnostics. Inc).,, ,_ont été r.éali.sées_..sur ces tissus.. _
Une bande à 160 kDa, qui correspond à la forme mature
du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus
cirrhosés et sur les tissus cancéreux. En plus de
cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la
forme immature du LDL-R (non glycosylée), est
présente."
La quantification de la bande correspondant au LDL-R
mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de
mettre en évidence :
- Une sur-expression du LDL-R dans le tissu sain des
3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose
provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2
patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le
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virus de l'hépatite C.
- Une sur-expression du LDL-R . dans le tissu
cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients
atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour
origine une infection par le virus, de l'hépatite C
(niveau de sur-expression chez ces patients est
entre 2 et 14 fois).
- Six patients atteints de CHC survenu sur une
cirrhose ayant pour origine une infection par le
virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de'
différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6: étude de la spécificité de l'anticorps
L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des
lames de tissue micro-array de tissus humains normaux,
comportant 108 spots correspondants à 54 tissus
humains normaux différents fixés en formol à 10%.
L'anticorps C7 et l'anticorps anti-LDL-R 5E5 ont ont
été dilués au 1/10 (10pg/ml). La réactivation
antigénique a été réalisée au micro-ondes, 3 fois 5
minutes à 750 Watts dans un tampon citrate lOmM, pH 6.
T1 a- -été observé une absence - de ' marquâ.ge '-dans le
systëme hématôpcïétique (amygdale-, -rate et gangl-ie;n
lymphoïde), le tissu musculaire (cceur et muscle strié
squelettique), le revêtement cutané et le tissu
mammaire, quel que soit l'anticorps utilisé. Le
système nerveux central (cortex cérébral, cervelet,
noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière),
les glandes surrénales (cortex et médullaire), le foie
et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2
anticorps.
Ces résultats sont en accord avec la littérature sur
la distribution tissulaire 'du LDL-R puisque les
surrénales, le foie, le système nerveux central, les
testicules et les reins ont été décrits comme dès
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tissus exprimant fortement le LDL-R.
LDL-R
Exemple 6 : Amplification et séquençage des régions
variables des anticorps anti-LDL-R 5E5
1.Amplification des régions VH et VK
L'ARN total de l'hybridome murin 5E5, produisant une
immunoglobuline de type IgGl,K, a été extrait (kit
Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Les
domaines variables des chaînes légère (Vx) et lourde
(VH) de 1-'anticorps 5E5 ont été amplifiées par la
technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
(kit 5'RACE, Invitrogen ref., 18374.041) en s'ancrant
dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la
chaîne légère Kappa, ou G1 murine, pour la chaîne
lourde.
Brièvement, une première étapé de transcription
inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une
amorce localisée dans la région 5' des régions
constantes CK ou G1 murines. Une séquence poly-dC a
été ensuite ajoutée en 3' dës ADNc synthétisés avarït
de. réaliser l' amplification- des régions~ -VK- et - VH à
l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly-
dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions
constantes CK ou G1 murines en 5' de l'amorce de
tran~c*ription inverse. Afin d'améliorer la spécificité
de l'amplification une deuxième PCR semi-nested a
été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une
amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première
PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont
les suivantes .
1) amorces de transcription inverse
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a. Amorce antisens spécifique Kappa murin
5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO
12)
b. Amorce antisens spécifique Gi murin
5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3' ,(SEQ ID NO : 13)
2) amorces de PCR 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin
5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14.)
b. Amorces antisens spécifiques G1 murin
Amorce première PCR
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO
15)
Amorce PCR semi-nested
5'-CACCATGGA.GTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO
16)
2. Déterminationde la séquence des régions VH et VK
Après amplification les séquences Vx et VH de
l'anticorps 5E5 ont été clonées dans le plasmide pCR4-
TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen,
ref . 45-0030) . Les plasmidè"s" issus -*d' âü"' mixi.imum. 3
colonie-s -recombinantes ont été purifiés et -1-eur- insert-
séquencé à l'aide des amorces universelles M13 uni et
rev.
La séquence nucléotidique de,,' la région VK de
l'anticorps murin 5E5 est indiquée sous la séquence
SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la
séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au
sous-groupe VK4 (VK4/5, Almagro JC et al
Immunogeneti~cs 1998, 47 : 355-363). Les séquences des
CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VK de -l'anticorps
murin 5ES, définies selon Kabat [Kabat et al.,
"Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH
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Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les
séquences suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et
SEQ ID NO : 4, respectivement
La séquence nucléotidique de la région VH de 5E5 est
la séquence SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique
déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH
appartient au sous-groupe V'.H1 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes . Honjo T. and Alt F.W.
eds, academic Press, London, 1996, pp145-171). Les
séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VH de
l'anticorps murin 5E5, définies selon Kabat [Kabat et
al., "Sequences of Proteins of Immunological
Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont
indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement.
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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
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CONTENANT LES PAGES 1 A 48
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brevets
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