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UTILISATION D'UN EXTRAIT INSAPONIFIABLE DE PULPE VEGETALE
DANS LE TRAITEMENT DU VIEILLISSEMENT CUTANE.
Le domaine de la présente invention concerne l'utilisation d'un extrait
insaponifiable de pulpe végétale pour la préparation d'un produit cosmétique,
pharmaceutique ou nutraceutique destiné à traiter et/ou à prévenir les
désordres cutanés
associés au vieillissement.
Le vieillissement est un phénomène inévitable, lentement évolutif et
irréversible
entraînant des modifications anatomiques et histologiques responsables
d'anomalies
fonctionnelles des organes. Les premiers signes visibles se manifestent au
niveau du tissu
cutané par des altérations de la texture, de la couleur, de la transparence et
par
l'apparition de rides. Ces manifestations peuvent être potentialisées par des
facteurs
extrinsèques comme le soleil, le tabac...
L'importance des radicaux libres oxygénés (RLO) dans les processus impliqués
dans le
vieillissement est retenue comme une des théories majeures.
Au niveau cutané, les RLO sont décrits comme les médiateurs précoces de
pathologies
inflammatoires et du vieillissement (Kress M. et al. Pain 1995; 62:87-94).
Au cours du vieillissement, toutes les structures de la peau se modifient.
Mais les
altérations fondamentales prédominent dans le derme et ce sont les
fibroblastes et la
matrice extracellulaire qui en sont les principales cibles et les principaux
acteurs. Les
fibroblastes sont capables d'entrer en sénescence. En conséquence, leur nombre
diminue,
leur fonction est ralentie et leur phénotype est modifié. Ils participent
alors activement à
la dégradation de la matrice extracellulaire dermique. De plus, lors de la
sénescence, les
fibroblastes perdent leur réactivité et voient leur régulation modulée. En
effet, il est
admis que le vieillissement est associé à une réduction voire une perte de la
réponse au
stress environnemental et, de ce fait, à une apparition de maladies
infectieuses, auto-
immunes et de cancers (Gardner I.D. Rev. Infect. Dis. 1980; 2: 801-10).
L'apparition des rides est un des signes les plus précoces du vieillissement.
Elle
constitue, pour certaines personnes, un véritable problème dans leurs
relations avec
l'extérieur. Ainsi aujourd'hui, de nombreux produits cosmétiques visant le
traitement du
vieillissement cutané sont mis à la disposition du public. Principalement, ces
spécialités
sont à base d'extraits végétaux.
L'Arganier, connu dans la nomenclature botanique internationale sous
l'appellation
d'Argania spinosa (L.) Skells, a notamment été valorisé par l'industrie
cosmétique, et
plus particulièrement l'amande de la graine.
FEUILLE DE REMPLACEMENT (REGLE 26)
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L'Arganier est un arbre trapu de 6 à 10 mètres de haut, dont le port rappelle
celui de
l'Olivier.
Le port de la couronne foliaire est quelque peu variable, pouvant être dressé
ou pleureur.
Les rameaux, très épineux, portent de toutes petites feuilles lancéolées,
alternes, étroites,
courtes (environ 2 cm), souvent regroupées en fascicules.
Le feuillage de l'Arganier est généralement persistant, mais il arrive qu'en
période de
grande sécheresse, il devienne caduc.
Les fleurs, de coloration jaune-verdâtre, hermaphrodites (étamines et pistils
sur la même
fleur) et pentamères (5 pétales, 5 sépales...), sont regroupées en
inflorescences de type
glomérule. Elles s'épanouissent de mai à juin.
L'Arganier fructifie dès l'âge de 5 ans. Le fruit est une baie sessile jaune
et ovale de 4 à 5
cm de long. Elle est formée d'un péricarpe charnu (aussi appelé pulpe),
renfermant une
sorte de faux noyau très dur de couleur marron. Cet élément est constitué
en réalité de
2 à 3 graines aplaties soudées entre elles et renfernlant chacune une amande
oléagineuse.
Les applications les plus valorisées ont pour origine l'amande de la graine.
Celle-ci
fournit une huile puis dans un second temps un tourteau.
L'huile issue des graines a fait l'objet de plusieurs brevets d'invention :
obtention de
l'huile par solvant (FR 2 553 788), l'huile d'argan enrichie en insaponifiable
(FR 2 724
663).
Des substances autres que l'huile ont également été brevetées. C'est le cas de
peptides
issus des tourteaux des graines obtenus après extraction de l'huile :
association de l'huile
et de peptides de tourteaux pour le traitement des troubles liés au
vieillissement cutané
(FR 2 756 183). La feuille de l'Arganier, les protéines et les saponines de
tourteaux ont
également fait l'objet de brevets d'invention : EP 1 213 025 concerne des
extraits de
feuilles, EP 1 213 024 traite des protéines de tourteaux et EP 1 430 900 des
saponines de
Tourteaux.
Les pulpes de fruits de l'Arganier ont fait l'objet plus récemment de la
demande de
brevet W02005/039610.
Le fruit de l'Arganier est une fausse drupe. Il est donc constitué d'un
péricarpe charnu
appelé pulpe (55 à 75 % du fruit) et d'un noyau pourvu d'une coquille très
dure
contenant une à trois amandes. De ces dernières est extraite l'huile.
La pulpe du fruit a fait l'objet d'études chimiques. Elle est constituée de
glucides dont la
cellulose, du glucose, fructose et saccharose (Charrouf Z. Guillaume D.,
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Ethnoeconomical, ethnomedical, and phytochemical study of Argania spinosa (L.)
Skeels., Journal of Ethnopharmacology, 1999, 67, 1, 7-14 - Sandret F.G.,
Etudes
préliminaires des glucides et du latex de la pulpe du fruit d' Argan (Argania
spinosa) :
variation au cours de la maturation, Bulletin de la Société de Chimie
Biologique, 1957,
39, 5-6, 619-631). Les lipides y sont également présents. Leur teneur est de 6
%. Dans la
fraction insaponifiable de ces lipides ont été identifiés 5 alcools
triterpéniques =
érythrodiol, lupéol, a et (3-amyrine, bétulinaldéhyde et 2 stérols = a
spinostérol et
schotténol (Charrouf Z., Fkih-Tetouani S., Charrouf M., Mouchel B.,
Triterpènes et
stérols extraits de la pulpe d'Argania spinosa, Plantes Médicinales et
Phytothérapie,
1991, 25, 2-3, 112-117).
La demande de brevet W02005/039610 a trait, d'une manière générale, à
l'utilisation de
composition à base de pulpes de fruits d'arganier pour la préparation de
produits
cosmétiques. L'extrait des pulpes de fruits a été plus ou moins purifié. En
effet, les
inventeurs ont testé l'extrait à différentes étapes du procédé. Ainsi, c'est
préférentiellement l'utilisation d'un extrait de pulpes de fruits obtenu suite
à une
extraction à l'hexane qui est décrit (page 15). Puis suite à une classique
étape de
saponification connue de l'homme du métier, les auteurs ont testé la fraction
insaponifibale ainsi recueillie. Enfin, les auteurs ont également envisagé une
étape de
fractionnement de l'insaponifiable par chromatographie en prenant soin
d'écarter le
composé triterpénique érythrodiol.
Ce raisonnement a vraisemblablement été guidé par les résultats obtenus
notaminent par
le fait que l'érythrodiol seul est présenté comme toxique (exemple 1) à une
dose plus
faible que la fraction triterpénique telle que définie dans le document :
fraction A
dépourvue d'érythrodiol (page 38). De plus, l'érythrodiol seul ne présente
qu'un bénéfice
médiocre vis à vis des UVA et UVB (exemples 3 et 4), par rapport à ladite
fraction
triterpénique. L'enseignement général de ce document porte donc sur
l'utilisation de la
fraction triterpénique d'un extrait de pulpe de fruits d'arganier pour la
préparation de
produits cosmétiques et préférentiellement dans le traitement des peaux
agressées par les
UVA et UVB via la stimulation du métabolisme des fibroblastes.Plus
spécifiquement, ce
document enseigne que ladite fraction triterpénique telle que divulguée dans
W02005/039610 sera d'autant plus active que la quantité d'érythrodiol sera
faible.
De manière surprenante et inattendue, les auteurs de la présente invention ont
mis
en évidence un effet d'inhibition de la sénescence des fibroblastes de peaux
matures avec
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un extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier riche en érythrodiol
; ledit extrait
étant susceptible d'être obtenu par une extraction acétonique suivie d'une
étape classique
de saponification. Cependant, on peut raisonnablement envisager que les
bénéfices de la
présente invention puissent être étendus à tout extrait insaponifiable de
pulpe végétale
présentant une fraction triterpénique dont la composition en ses composés
majoritaires
est proche de celle issue des pulpes de fruits d'arganier.
La présente invention concerne l'utilisation d'un extrait insaponifiable de
pulpe
végétale comprenant une fraction triterpénique, caractérisé en ce que ladite
fraction
triterpénique comprend de l'érythrodiol, de l'a-amyrine, de la (3-amyrine et
du lupéol,
pour la préparation d'un produit cosmétique, pharmaceutique ou nutraceutique
destiné à
prévenir et/ou traiter des désordres cutanés associés au vieillissement
cutané. De façon
préférentielle, ledit extrait est obtenu par une extraction acétonique suivie
d'une étape
classique de saponification.
Cet extrait insaponifiable, encore appelé insaponifiable initial, peut être
solubilisé dans
un excipient pour faciliter sa formulation.
Préférentiellement ledit extrait est obtenu à partir d'un végétal choisi dans
la famille des
Sapotaceae ; et encore plus préférentiellement ledit extrait est obtenu à
partir de pulpes
de fruits d'arganier.
Un avantage de l'extraction acétonique réside dans le fait que l'on peut
s'affranchir du
latex, qui représente la très grande majorité de la fraction lipidique, et
ainsi être plus
concentré en substances insaponifiables dans la fraction lipidique.
La composition de l'insaponifiable selon la présente invention se différencie
à la fois
qualitativement et quantitativement de celle décrite préférentiellement dans
la demande
de brevet W02005/039610.
Les extraits selon la présente invention sont caractérisés par leur teneur en
substances triterpéniques. Ces derniëres peuvent être analysées par
chromatographie en
phase gazeuse selon une méthode appropriée classique qui permet d'identifier
la (3-
amyrine, l'érythrodiol. Par contre l'a-amyrine et le lupéol ne sont pas
séparés par cette
métllode, ces molécules peuvent alors être dosées communément.
Avantageusement, la fraction triterpénique dudit extrait est composée
d'érythrodiol dont
la fraction massique est comprise entre environ 7% et environ 40% de
l'insaponifiable
initial, de (3-anryrine dont la fraction massique est comprise entre environ
5% et environ
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30% de l'insaponifiable initial, de a-amyrine et de lupéol dont la somme de
ces deux
fractions massiques est comprise entre environ 10% et environ 50% de
l'insaponifiable
initial.
De façon avantageuse, ladite fraction massique d'érythrodiol est comprise
entre environ
10% et environ 20% de l'insaponifiable initial ; et de façon encore plus
avantageuse est
égale à environ 15% de l'insaponifiable initial.
De façon avantageuse, ladite fraction massique de J3-amyrine est comprise
entre environ
7% et environ 20% de l'insaponifiable initial ; et de façon encore plus
avantageuse est
égale à environ 10% de l'insaponifiable initial.
De façon avantageuse, la somme desdites fractions massiques de a-amyrine et de
lupéol
est comprise entre environ 15% et environ 30% de l'insaponifiable initial ; et
de façon
encore plus avantageuse est égale à environ 20% de l'insaponifiable initial.
Les teneurs en ces différentes molécules dépendent des conditions
d'extraction. Ces
valeurs seront moins importantes dans le produit cosmétique, pharmaceutique ou
nutraceutique en fonction du ou des excipients qui seront ajoutés à
l'insaponifiable
initial.
Un point remarquable de la présente invention est la contribution iinportante
de
l'érythrodiol dans les propriétés anti-vieillissement de l'extrait
insaponifiable selon la
présente invention. Les RLO jouant un rôle important dans le processus de
vieillissement
cutané, l'effet antiradicalaire (anti-RLO) de l'érythrodiol a été évalué en
comparaison
avec l'insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier selon la présente
invention.
Les dommages créés par les RLO au sein des cellules se traduisent par
l'altération des
composants lipidiques de la membrane plasmique (lipoperoxydation), des
protéines
(dénaturation et dégradation) et du matériel génétique ou ADN (mutations). Les
essais
réalisés in vitro ont porté sur la détermination:
- de l'efficacité de protection par l'érythrodiol et par l'extrait
insaponifiable contre
l'oxydation de lipides membranaires (exemple 3);
- et du pouvoir protecteur de l'érythrodiol et d'autres molécules
triterpéniques
(lupéol, a et J3-an-iyrine) vis à vis de l'altération de l'ADN génomique
(exemple 4).
Ces essais ont peinlis de mettre en évidence que l'érythrodiol est une
molécule qui
possède un potentiel anti-oxydant important.
Dans un mode particulier de réalisation de la présente invention, l'extraction
peut
être réalisée comme suit : les pulpes de frtiit d'Arganier séchées sont
broyées puis
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extraites avec de l'acétone. On peut également utiliser un mélange acétone-
eau.
L'extraction est menée sous agitation ou de façon statique, dans un ratio
plante/solvant
pouvant varier de 1/2 à 1/20, à des températures variant de la température
ambiante à la
température d'ébullition du solvant et sur une durée pouvant aller de 30
minutes à 24
heures.
Une fois extrait, le résidu solide de plante est séparé de la solution
extractive par
filtration ou centrifugation. La solution peut être plus ou moins concentrée
jusqu'à
l'obtention d'un extrait sec. Dans ce dernier cas, la matière sèche peut être
solubilisée
dans un alcool pour permettre la saponification.
A la solution, est ajouté un hydroxyde métallique, en particulier la soude ou
la potasse à
des concentrations variant de 0,1 à 10 N. La saponification est menée à des
températures
variant de la température ambiante à l'ébullition, sous agitation et sur une
durée variant
de 15 minutes à 48 heures selon la température.
La purification est menée par une extraction liquide/liquide. On rajoute alors
au milieu
d'hydrolyse un solvant non miscible qui peut être de l'eau saturée ou non en
sels [NaCI,
(NH4)2 S04] et ajustée à des pH variant de 3 à 9. Ce solvant peut être un
éther oxyde, un
ester, un alcane, un hydrocarbure halogéné, ou un mélange de ces solvants.
Une, deux ou
trois extractions liquides/liquides successives sont réalisées. Les phases
organiques sont
réunies puis lavées avec de l'eau saturée ou non en sels et à des pH variant
de 3 à 9. Cette
phase de lavage peut être répétée plusieurs fois.
Après purification, les phases organiques sont traitées de façon à éliminer le
solvant. Ce
traitement peut être effectué par évaporation en contrôlant la pression.
L'étape
d'évaporation peut mener à un produit de consistance lipidique plus ou moins
cireuse,
l'insaponifiable initial.
On peut rajouter un excipient qui peut être une cire animale (abeille par
exemple) ou
végétale (cire de Canlauba, de Candellila ou de Jojoba) une huile végétale
(maïs,
carthame, sésame, argan...) la glycérine, des produits d'origine synthétique
comme
l'huile de vaseline, les polyols (comme le propylène glycol, le butylène
glycol, le
glycérol...) des triglycérides estérifiés (comme le miglyol 812, le myritol
318, le neobee
MJ) les polymères oxypropylénés de formule H(OCH2-CHCH3)õ OH ou les polymères
oxyéthylénés de formule H(OCH2-CH2)õ OH, les diesters d'alcool gras de
longueur
variable, de C1 à C40. Les proportions de l'insaponifiable initial de pulpes
de fruits
d'Arganier et de l'excipient peuvent varier de 1/99 à 99/1.
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De façon avantageuse, la présente invention permet une valorisation des pulpes
de
fruits dans le traitement anti-vieillissement, à un coût de revient
raisonnable. L'extrait
insaponifiable est utilisé sans étape de purification supplémentaire, qui est
très coûteuse.
La composition selon la présente invention peut donc être obtenue à l'aide
d'un procédé
faisant intervenir des étapes classiques d'extraction et de saponification
connues de
l'homme du métier.
L'utilisation d'un extrait insaponifiable de pulpe végétale selon la présente
invention permet de prévenir et/ou traiter les désordres cutanés qui se
manifestent par des
altérations de texture, de couleur, de la transparence de la peau et par
l'apparition des
rides.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres cutanés
sont
consécutifs à une réduction ou une perte de réponse au stress environnemental,
notamment causé par le soleil ou le tabac.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les désordres
cutanés sont
consécutifs à une réduction ou une perte d'inductibilité des protéines HSP72.
Les
protéines HSP pour Heat Shock Protein sont exprimées constitutivement dans
de
nombreuses cellules et possèdent des fonctions indispensables dans le maintien
des
protéines, d'où leur nom de protéines chaperon . En effet, elles inhibent
l'agrégation
des protéines dénaturées, empêchent des associations non appropriées de
protéines et
elles sont impliquées dans le transport intracellulaire et dans le maintien
sous forme
inactive de certaines protéines (Morris S.D. Clin. Exp. Dermatol. 2002; 27:
220-224).
Les HSPs jouent également un rôle essentiel dans la réponse au stress et
notamment dans
les processus de protection cellulaires mettant en jeu la réponse adaptative
(Maytin E.V.
J. Invest. Derinatol. 1995; 104: 448-55).
De façon inattendue, l'utilisation d'un extrait selon la présente invention
permet de
restaurer l'induction des protéines HSP72 dans les fibroblastes sénescents.
Dans le cadre de la présente invention, le produit cosmétique, pharmaceutique
ou
nutraceutique, renfermant un extrait selon l'invention, est administré par
voie orale ou
par voie topique, et préférentiellement par voie topique.
Pour une administration par voie topique, la foime galénique est choisie dans
le groupe
conlprenant les crèmes, les gels, les pommades et les sprays.
Avantageusement, la forme orale est choisie parmi le groupe coinprenant des
coinprimés,
des gélules et des poudres pour suspensions buvables.
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De façon avantageuse, la quantité dudit extrait dans le produit cosmétique
final est
comprise entre environ 0,001% et environ 50%, préférentiellement entre environ
0,01%
et environ 10%; et encore plus préférentiellement entre environ 0,1% et
environ 2% en
poids du poids total de la préparation.
La préparation peut en outre contenir d'autres actifs bien connus de l'homme
du
métier pour le traitement et/ou la prévention des désordres cutanés associés
au
vieillissement cutané. Avantageusement, ladite préparation contient d'autres
substances
issues de l'arganier connues pour leur action anti-âge telles que l'huile
obtenue à
partir de l'amande de la graine et les peptides de tourteaux par exemple.
L'exemple ci-dessous d'une composition selon l'invention est donné à titre
indicatif et
non limitatif. Les pourcentages sont donnés en poids par rapport au poids
total de la
composition.
EXEMPLE 1 : soin anti-relâchement visage
- Extrait insaponifiable de pulpe de fruits d'arganier 0,1 à 2%
- Huile d'argan enrichie 1 à 5%
- Peptides d'argan 0,1 à 1%
- Dérivé de vitamine E 0,1 à 0,5%
- Ester glycérique de vitamine F 0,1 à 0,5%
- Palmitate vitamine A 0,1 à 1%
- Stéarate méthyl glucose 1 à 5%
- Triglycérides caprique caprylique 2 à 8%
- Paraffine liquide 5 à 12%
- Parfum qs
- Eau purifiée q.s.p. 100g
Les exemples suivants illustrent la présente invention sans toutefois en
limiter la portée.
EXEMPLE 2: procédé d'obtention d'un extrait insaponifiable de pulpes de fruits
d'arganier
1 tonne de pulpes de fruits d'Arganier séchées est broyée puis extraite dans
un réacteur
par 5 tonnes d'acétone. L'extraction est menée sous agitation pendant une
heure à reflux.
Une fois refroidie, la solution est récupérée par filtration puis concentrée
sous 'vide
jusqu'à l'obtention d'un extrait huileux désolvanté. Ce résidu est repris dans
500 1
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d'éthanol à 95 % v/v. On y ajoute 100 1 de lessive de soude 10 N et on porte à
reflux sous
agitation pendant une heure.
Après refroidissement, la solution hydrolysée est placée dans un décanteur, on
y ajoute
500 1 d'heptane et 300 1 d'eau. L'extraction liqu'ide/liquide est menée avec
précaution.
Après décantation, on récupère la phase organique. On répète 2 extractions
nouvelles
avec 500 1 d'heptane. Les 3 phases heptaniques sont regroupées et lavées 3
fois avec 500
1 d'eau chaque fois. Les phases organiques lavées sont désolvantées. On
récupère ainsi
une pâte cireuse. Cet extrait, qui correspond à l'insaponifiable initial, est
dosé pour sa
teneur en substances triterpéniques. Il contient 10 % de (3 amyrine, 15 % en
érythrodiol et
20 % du mélange lupéol-a amyrine.
EXEMPLE 3: analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de
la
peroxydation lipidique
1) Introduction
La membrane plasmique constitue la principale et la première cible des RLO et,
étant
riche en lipides, elle est le site d'une peroxydation accrue (Girotti A.W. J
Free Radic.
Biol. Med. 1985 ; 1: 87-95). Les peroxydes générés au cours de cette oxydation
lipidique
sont aussi très réactifs et capables de dégrader le matériel protéique et
génomique.
Pour évaluer l'altération membranaire, les auteurs de l'invention ont mesuré
la
peroxydation lipidique par un dosage in vitro des complexes entre les produits
d'oxydation lipidique et l'acide thiobarbiturique. Ces complexes sont appelés
TBARS
(pour Thiobarbituric Acid Reactive Substances) et donnent le nom au test :
Test des
TBARS.
Afin de mimer un stress oxydatif chimique, on a traité la lignée de
fibroblastes, L929, par
un complexe composé de peroxyde d'hydrogène (H202) et de fer (Fe2+/F,e3+)
reconstituant ainsi la réaction de Fenton, source de RLO et plus
particulièrement de
radical hydroxyle (OH ) (Vessey D.A. et al J. Invest. Derinatol. 1992 ; 99 :
859-63)
H202 + Fe2+ __> OH + OH- + Fe3+
2) Méthodologie
O Produits testés :
Les produits ont été évalués sur la lignée de fibroblastes murins L929. Les
cellules sont
prétraitées avec les différentes concentrations de produits (Tableau I)
pendant 16 heures
et sont ensuite stimulées avec le complexe II2O2-Fe2+/Fe3+ pendant 1 heure. Le
lot
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LK0304 d'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier a été préparé
selon
l'exemple 2.
Tableau I : Présentation des solutions testées
Référence Produit Solution mère Solutions testées
Insaponifiable de pulpes de fruits lOmg/ml 0.3 g/ml
d'arganier (DMEM/TWEEN20) 1 g/ml
Lot : LK0304 -20 C 3 g/ml
Erythrodiol / EXTRASYNTHESE 10 mg/ml DMSO 0.3 g/ml - 0,68 M
Lot: 05040605 200C 1 g/ml - 2,26 M
3 g/ml - 6,78 M
Vitamine E* SIGMA T-1539 400mg/ml 400 g/ml - 928.7 M
-20 C
(*Molécule de Référence Anti-radicalaire)
La peroxydation des lipides membranaires est analysée en mesurant les TBARS
(selon
Morlière P. et al BioclziTn. Biophys. Acta. 1991 ; 1084 : 261-268).
O Principe du test :
En milieu acide, à 95 C, se forment des complexes, notés TBARS pour Thio
Barbituric
Acid Reactive Substance, entre les produits d'oxydation lipidiques
(malondialdéhyde ou
MDA) et l'acide thiobarbiturique (TBA) qui peuvent être dosés en fluorescence
par
rapport à une gamme étalon avec le MDA. Le dosage des TBARS est alors exprimé
en
pmole/ g de protéines. Les protéines et TBARS sont dosés dans le milieu
intracellulaire.
O Calcul du pourcentage de protection des membranes cellulaires :
A partir du calcul des TBARS en pmole/ g protéines, l'efficacité protectrice
des
différents produits contre l'oxydation des lipides membranaires a été calculé
comme suit.
[TBARS contrôle] - [TBARS (+ produits)]
% de protection = X 100
[TBARS contrôle]
3) Résultats - Discussion
Après un traitement de 16h avec les divers produits à tester, le modèle de
stress
radicalaire utilisé dans cette expérience (réaction de Fenton) induit une
peroxydation
lipidique importante dans les fibroblastes L929. Cette décharge massive de
radical
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hydroxyle OH génère donc un stress oxydatif au niveau cellulaire et notamment
au
niveau des membranes. Cependant, dans ce type de réaction oxydative, les
produits issus
de la peroxydation lipidique sont intemalisés dans les cellules et les TBARS
sont alors
dosés dans le milieu intracellulaire.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau II ci-dessous.
Tableau II: Analyse de la peroxydation lipidique
Protection des lipides membranaires en %
Actifs testés N : nombre
Moyenne Ecart Type
d'expériences
Vit E 400,ug/uil - 928,7 M 56,62 8,74 3
Erythrodiol
0,3 g/m1 - 0,68gM 33,75 15,39 3
1 g/m1- 2,26 M 38,43 7,68 3
3 g/m1- 6,78 M 53,22 17,30 3
Insaponifiable de pulpes de fruits
d'arganier
0,3 g/ml 21,38 37,53 3
1 g/ml 30,53 17,80 3
3 g/ml 37,39 9,45 2
La vitamine E, constituant la molécule de référence anti-radicalaire, diminue
la
peroxydation lipidique induite par le complexe H2O2-Fe2+/Fe3+, et protège très
efficacement les membranes cellulaires (56% environ).
L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier préparé selon
l'exemple 2
présente une activité anti-radicalaire aux concentrations de 1 et 3 g/inl (30
et 37% de
protection des membranes lipidiques, respectivement).
L'érythrodiol, molécule contenue dans la fraction triterpénique de l'extrait
insaponifiable, présente une bonne activité anti-oxydante avec un effet
dépendant de la
dose. L'érythrodiol est actif dès 0,3 g/ml (33 % de protection). L'effet aiiti-
radicalire de
l'érythrodiol à 3 g/ml est très important et comparable à la Vitamine E.
4) Conclusion
Le modèle in vitro présenté dans cette étude reflète les conséquences dues à
un stress
oxydatif majeur sur la principale cible cellulaire qu'est la membrane
plasmique. Ainsi le
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dosage de la peroxydation lipidique constitue un bon marqueur du stress
oxydatif et
permet l'évaluation de l'action antioxydante, vis à vis du radical hydroxyle,
de principes
actifs au niveau de la membrane cellulaire.
La Vitamine E, molécule anti-oxydante, permet la validation de ce modèle.
Dans ces conditions expérimentales, il a été observé que l'extrait selon la
présente
invention contenant l'érythrodiol ainsi que l'érythrodiol lui-même possèdent
un potentiel
anti-oxydant important.
EXEMPLE 4: analyse de l'effet anti-radicalaire de l'érythrodiol - analyse de
l'atteinte génomique
1) Introduction
L'ADN est une cible des RLO qui induisent la modification de bases (oxydation,
nitration, déamination : Guetens G. et al Clin. Lab. ,Sci. 2002; 39 : 331-
457), la
formation de cassures de brins (sites abasiques ou (3-élimination) et de
pontage ADN-
protéines ou ADN-hydroperoxydes. L'altération du matériel génomique induit une
cascade de réactions cellulaires (blocage fourche de réplication, activation
de protéines
clés, arrêt dans le cycle cellulaire) qui aboutissent à l'induction des
mécanismes de
réparation. Les bases modifiées par un stress oxydatif sont ainsi prises en
charge
majoritairement par le système de réparation des bases ou BER pour Base
Excision
Repair (Friedberg E.C. et al DNA repair and mutagenesis, ASMPress ; Washington
DC
1995). Ce système agit vite et efficacement selon trois étapes clés :
1- reconnaissance de la base altérée;
2- incision et excision de la lésion;
3- resynthèse de la brèche.
Les RLO peuvent être produits en quantité telle que les systèmes de défense et
de
réparation cellulaires peuvent être saturés. Si les effecteurs de l'apoptose
sont activés, la
cellule endonimagée meurt. Mais, dans le cas où les lésions à l'ADN sont mal
réparées, il
peut y avoir génération de mutations délétères qui sont alors impliquées dans
l'étape
d'initiation de la carcinogenèse. C'est pourquoi, l'incidence biologique d'un
stress
oxydatif (mortalité ou mutagenèse) conditionne des évènements à plus long
terme
comme le vieillissement et le cancer.
De nombreuses études ont démontré la forte corrélation entre le vieillissement
et
l'accumulation progressive et irréversible de dommages oxydatifs au niveau des
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macromolécules cellulaires. Plusieurs groupes de recherche ont montré, chez le
rongeur,
que les taux de 8-OxoGuanine, mesuré dans différents tissus tels que la peau,
augmentent
avec l'âge (Tahara S. et al Mech. Ageing Dev. 2001 ; 122: 415-426). Les
travaux de
Mecocci P. et al (Free Radic. Biol. Med. 1999 ; 26: 303-8) sur le muscle
squelettique
chez l'homme, montrent que des lésions oxydantes sur l'ADN ou sur les lipides
s'accumulent avec l'âge. La même équipe a également montré que chez des sujets
atteints de maladie d'Alzheimer, les taux de bases oxydées dans l'ADN des
lymphocytes
et les taux d'antioxydants dans le plasma sont significativement plus hauts et
plus bas
respectivement, que chez les sujets sains (Mecocci P. et al Arch. Neurol. 2002
; 59 : 794-
8).
2) Objectif
Suite à l'exemple 3 et afin de contrôler l'activité antiradicalaire de
l'érythrodiol sur un
autre modèle, les auteurs de l'invention ont analysé son pouvoir protecteur
vis à vis de
l'altération de l'ADN génomique induite par un stress oxydatif, en comparaison
avec
l'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier et d'autres molécules
triterpéniques
contenues également dans ledit extrait.
Ils ont choisi de générer des lésions à l'ADN par un stress H202 et d'analyser
indirectement les dommages ainsi formés en analysant la réaction de
réparation. Pour
cela, un kit appelé test 3D pour DNA Damage Detection, a été utilisé. Cet
essai
biochimique mime in vitro la réaction de réparation par excision (Salles B. et
al Anal.
Biocheni. 1995 ; 232: 37-42 et Salles B. et al Biochirnie 1999 ; 81 : 53-58).
Le test 3D a
pour base la réparation des lésions de l'ADN au moyen d'extraits cellulaires
humains
purifiés. Au cours de l'étape de réparation, un marqueur est incorporé à l'ADN
et cette
incorporation, reflet quantitatif du nombre de lésions réparées, est ensuite
révélée par
chimiluminescence.
3) Méthodologie
O Produits testés :
Les produits ont été évalués sur la lignée de fibroblastes murins L929. Les
cellules sont
prétraitées avec les produits (Tableau III) pendant 16 heures et sont ensuite
stimulées
avec H2O2 (Peroxyde d'Hydrogène 3% - Réf. GIFRER - Laboratoire Gifrer
Barbezat) à
100 M pendant 30 minutes.
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Tableau III : Présentation des solutions testées
Référence Produit Solution mère Solutions testées
Insaponifiable de pulpe de fruits l Omg/ml
d'arganier (DMEM/TWEEN20) 3 g/m1
Lot : LK0304 -20 C
Erythrodiol / EXTRASYNTHESE 10 mg/ml DMSO
Lot: 05040605 20 O 3 g/m1- 6,78 M
50rnM DMSO
Lupéol (Triterpène) -20 c 3 g/m1- 7 M
50mM DMSO
a-Amyrine (Triterpène) -20 C 3 g/ml - 7 M
5OmM DMSO
(3-Amyrine (Triterpène) -20 C 3 g/ml - 7 M
O Test3D :
Le principe est le suivant: Après endommagement de l'ADN génomique (traitement
oxydatif), les cellules sont lysées. Le lysat est déposé sur une microplaque
coatée avec de
la polylysine :
1- Adsorption de l'ADN
2- Incubation de l'ADN avec un extrait protéique (enrichi en enzymes de
réparation)
et un pool de nucléotides dont un nucléotide est marqué à la biotine (dUTP-
Biotine) - Réparation des lésions et incorporation dans l'ADN des nucléotides
marqués dUTP-Biotine .
3- Incubation avec un complexe enzymatique Avidine-Peroxydase -
Reconnaissance par l'avidine des dUTP-Biotine incorporés.
4- Addition d'un substrat de la peroxydase luminescent et quantification du
signal
émis proportionnel au nombre de lésions réparées.
Le protocole de réalisation du test est suivi selon les instn.tctions du
fournisseur du kit
(Test 3D Solyscel - Réf : SFRIDN013 - AES Laboratoire). A la fin de la
réaction, la
plaque est lue dans un luminomètre (MITHRAS LB940 - BERTHOLD).
O Calcul du pourcentage de protection de l'ADN.=
Le rapport ci-dessous pennet de calculer, pour chaque concentration de produit
testé, le
% de protection contre l'induetion de lésions sur l'ADN par un stress oxydatif
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(l'Intensité de Luminescence - ou IL - exprime la quantité de lésions de
l'ADN).
IL (H202) - IL (produit)
% Protection de l'ADN = x 100
IL(H202) - IL(témoin)
4) Résultats et conclusion
Les résultats obtenus à l'exemple 3 ont montré que l'érythrodiol présente
l'activité anti-
radicalaire la plus forte à 3gg/inl (6,78 M). C'est pourquoi, les auteurs ont
choisi de
tester tous les tripterpènes (lupéol, a-amyrine, (3-amyrine et érythrodiol) et
l'extrait
insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier à 3 g/mi sur le test 3D DNA
Damage
Detection . Ledit extrait insaponifiable a été obtenu suivant le procédé de
l'exemple 2.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau IV ci-dessous. Les
valeurs indiquées
dans ce tableau sont les pourcentages d'inhibition (ou % de protection) des
lésions à
l'ADN suite à un stress oxydatif exogène, par rapport aux cellules témoin
basal
(100%) et aux cellules stressé H202 (0%).
Tableau IV: Protection de l'ADN par l'Erythrodiol
Intensité % Lésions à % protection de 1'ADN
luminescence l'ADN
Témoin 5460 0
HZ02 100 M-30 min 11576,7 100 0
Erythrodiol
5520 1 99
3gg/ml - 6,78 M
Insaponifiable de pulpes de
fruits d'arganier 6193,3 12 88
3gg/ml
Lupéol
9020 58,2 41,8
3 g/m1- 7 gM
a-Amyrine
8663,3 52,4 47,6
3 g/m1- 7 M
(3-Amyrine
13133,3 125,4 -25,4
3 g/ml - 7 M
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Le traitement par H202 induit une forte proportion d'oxydation au niveau de la
Guanine avec formation en particulier de 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine
(8-
OxoGuanine) (Dizdaroglu M. et al Arch. Biochena. Biophys. 1991 ; 285 : 388-
390). Le
test 3D montre une forte augmentation de luminescence après traitement à
l'H202,
reflétant une forte activité de réparation et par conséquent un taux important
de bases
endommagées sur l'ADN.
L'extrait insaponifiable de pulpes de fruits d'arganier protège efficacement
l'ADN vis à vis du stress oxydatif.
L'érythrodiol, molécule contenue dans ledit extrait insaponifiable, à 3 g/ml
présente une
très bonne activité anti-oxydante avec 99% de protection de l'ADN vis à vis de
la
formation de lésions oxydatives.
En coinparant les molécules triterpéniques à concentration molaire équivalente
(environ
7 M), c'est l'érythrodiol qui est le plus actif.
EXEMPLE 5: Modèle d'étude in vitro de l'effet de l'extrait insaponifiable
selon
l'invention sur l'induction des protéines HSP72
1) Bibliographie
Différents travaux ont montré la perte d'inductibilité des protéines HSP72
lors du
vieillissement. Chez des patients âgés, l'induction de la protéine HSP72 par
la chaleur est
réduite de façon importante au niveau cutané (Muramatsu T. et al. Br. J.
Der=fnatol. 1996;
134: 1035-1038). D'autre part, Gustmann-Conrad A. et al. (Exp. Cell. Res.
1998; 241:
404-413) ont montré que l'induction de la protéine HSP72 par un stress
thermique, est
significativement diminuée dans des fibroblastes issus de la peau de sujets
âgés par
rapport à ceux issus de sujets jeunes. Dans cette même étude, il a été montré
que le
niveau d'induction d'HSP72 est également réduit dans des fibroblastes (issus
de peau
jeune) ou dans des lignées de fibroblastes (IMR-90) devenus sénescents au
cours des
divisions cellulaires.
Un premier stress modéré suffit à induire in vitro les protéines HSPs afin
qu'elles
protègent la cellule vis à vis de nouveaux stress (Morris S.D. et al. J. Clin.
Iizvest. 1996;
97: 706-12). L'HSP72 est une protéine majoritaire de la famille des HSP70,
exprimée
dans les kératinocytes et les fibroblastes cutanés et inductible par de
nombreux agents
stressants (chaleur, UV..) (Trautinger F. et al. J. Invest. Derfiacatol. 1993;
101: 334-38
Charveron M. et al. Cell. Biol. Toxicol. 1995; 1 l: 161-65).
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2) Protocole expérimental
Les auteurs de la présente invention ont choisi d'analyser le niveau
d'induction, par un
stress thermique, des protéines HSP72 dans des fibroblastes IMR-90 (lignée
fibroblastique) lors de la sénescence, et ceci afin d'évaluer les propriétés
anti-âge
d'un extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2, soit
contenant 10 %
de P amyrine, 15 % d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - a amyrine.
Dans un premier temps, les auteurs ont mis en place et validé un modèle de
vieillissement cellulaire en induisant la sénescence des fibroblastes par un
stress oxydatif.
- Modèle de sénescence induite :
Les fibroblastes se divisent jusqu'à un stade critique qu'on appelle la
sénescence
réplicative et qui s'assimile à un vieillissement cellulaire. Mais la
sénescence peut
également être induite notamment par un stress oxydatif, il s'agit de la
Stress-Induced
Premature Senescence ou SIPS (Dumont et al Free Radic. Biol. Med. 2000 ; 28
: 361-
373).
Modèle utilisé : L'induction de la sénescence dans la lignée de fibroblastes
IMR-90
jeunes a été mise en évidence en traitant les cellules 2h avec de l'H202. 72h
après ce
stress, les cellules IMR-90 sont sénescentes.
Dans un second temps, ils ont montré la diminution du niveau d'induction des
HSP72 suite à un stress thermique, dans des fibroblastes sénescents comparés à
des
fibroblastes jeunes. Finalement, ils ont évalué les propriétés d'un extrait de
pulpes de
fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2, soit contenant 10 % de (3 amyrine,
15 %
d'érythrodiol et 20 % du mélange lupéol - (x amyrine sur ce modèle de
sénescence.
3)Résultats
L'invention sera mieux comprise et les buts, avantages et caractéristiques de
celle-ci
apparaîtront plus clairement de la description qui suit et qui est faite en
référence aux
dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 présente l'analyse du taux d'induction des HSP72 dans les
fibroblastes
IMR-90 au niveau transcriptionnel et traductionnel.
- la figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72
dans
les cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait de
pulpes
de fruit d'Arganier selon l'invention.
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- la figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des
protéines
HSP72 (nomzalisée par le niveau d'expression de la P-actine) dans les
Fibroblastes IMR-90 sénescents pré-traités avec différentes concentrations de
l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier selon l'invention.
- Analyse de l'induction des HSP72 par un stress thermique au cours de la
sénescence
des fibroblastes IMR-90 :
Les cellules cultivées à 37 C sont incubées 1h à 45 C et sont ensuite incubées
à 37 C
pendant 2h (analyse des ARNm) ou pendant 4h (analyse des protéines) :
* Expression de la protéine (Western Blot)
Les protéines intracellulaires, extraites des fibroblastes, ont été analysées
par la technique
du Western Blot, en utilisant un anticorps anti-HSP72 (Anticorps monoclonal,
CHEMICON) et un système de révélation indirecte en luminescence. La membrane
est
analysée et l'intensité des bandes est quantifiée par densitométrie (Logiciel
IinageMaster
TotalLab AMERSHAM). Le niveau d'expression de HSP72 est nonnalisé par celui
d'une protéine exprimée de façon constitutive, la (3-Actine.
La figure lA présente l'analyse semi-quantitative par Western Blot du taux
d'induction
des protéines HSP72 dans les IMR-90 jeunes (~~) et IMR-90 sénescents (0)
(sénescence
induite par H202). Ainsi, la figure lA montre clairement que le taux de
protéines HSP72
est induit par un stress thermique dans des fibroblastes IMR-90 jeunes. Cette
induction
d'HSP72 est diminuée dans des fibroblastes IMR-90 sénescents.
* Expression des ARNm (PCR en temps réel)
Les auteurs ont analysé l'expression HSP72 au niveau transcriptionnel en
quantifiant les
ARNm par la technique de PCR en temps réel.
Le niveau d'expression du gène d'intérêt HSP72 est calculé dans les
échantillons traités
par un stress thermique et les échantillons témoins. Le niveau d'expression du
gène
HSP72 est ensuite normalisé en utilisant trois gènes de référence [(3-actine,
GAPDH
(Human glyceraldehyde-3 -phosphate deshydrogenase) et YWHAZ (Tyrosine-3-
monooxygenase, tiyptophane-5-monooxygenase activation protein zeta
polypeptide)],
dont l'expression est constitutive.
Enfin, en fixant le niveau d'expression dans les échantillons témoins à 1, il
est alors
possible de déterminer le facteur d'induction du gène HSP72.
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La figure 1B présente l'analyse quantitative par PCR en temps réel du taux
d'induction
des ARNni HSP72 dans les IMR-90 jeunes (W) et IMR-90 sénescents ( )
(sénescence
induite par H202). La figure 1B montre clairement que l'induction des ARNm
HSP72 est
également très diminuée lors de la sénescence induite des fibroblastes IMR-90.
- Analyse de l'efficacité de l'extrait de pulpes de fruits d'Arganier :
Les auteurs de l'invention ont utilisé le modèle de sénescence induite ou SIPS
(Stress
Induced Premature Senescence) avec la lignée fibroblastique IMR-90 pour
évaluer
l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier préparé selon l'exemple 2.
Les cellules ont été incubées avec l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier aux
concentrations de 1 et 3 g/ml pendant 24h. Puis elles ont subi le stress
oxydatif
induisant la sénescence.
Tous les traitements ont été comparés à un lot de cellules IMR90 j eunes
et un lot de
cellules sénescentes (sénescence induite) non pré-traitées par l'extrait
de pulpes de
fruits d'Arganier.
Trois jours (72h) après le stress oxydatif, les HSP72 ont été induites par la
chaleur.
Finalement, les ARN et les protéines HSP72 ont été analysées par PCR en temps
réel et
Western Blot, respectivement.
La figure 2 présente l'analyse par Western Blot du taux de protéines HSP72
dans les
cellules IMR-90 traitées avec différentes concentrations de l'extrait
insaponifiable
préparé selon l'exemple 2. Les mentions T et ST signifient
respectivement
Témoin et Stress Tlzermique . Les analyses A, B, C, et D se rapportent
respectivement à des fibroblastes IMR-90 jeunes, des fibroblastes IMR-90
sénescents
(sénescence induite par H202), des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés avec
l'extrait
insaponifiable à l g/ml et enfin des fibroblastes IMR-90 sénescents incubés
avec
l'extrait insaponifiable à 3 g/ml.
La figure 3 présente l'analyse semi-quantitative du taux d'induction des
protéines HSP72
(normalisée par le niveau d'expression de la ~-actine) dans les fibroblastes
IMR-90
sénescents pré-traités avec l'extrait insaponifiable à 1 g/ml (C) et à 3 g/m1
(D). Sont
également représentés les taux d'induction des protéines HSP72 dans les
fibroblastes
IMR-90 jeunes (A) et dans les fibroblastes IMR-90 sénescents (B) (sénescence
induite
par H20z).
Ces Figures 2 et 3 niontrent qu'il n'y a plus d'induction des protéines HSP72
dans les
fibroblastes IMR-90 devenus sénescents, mais que 1'extrait de ptllpes de
fruits
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d'Arganier, aux concentrations de 1 et 3 g/ml, restaure l'induction des HSP72
par le
stress thermique.
Enfin, le tableau V ci-dessous donne le facteur d'induction (après
normalisation)
des ARNm HSP72 dans des fibroblastes sénescents pré-traités avec différentes
concentrations d'extrait de pulpes de fruits d'Arganier.
Tableau V : Facteur d'induction
Facteur d'induction
IMR-90 jeunes 109.1
IMR-90 sénescence induite par l'H202 79.0
IMR-90 sénescents + extrait de pulpes de fruits d'Arganier 1 gg/ml 84.3
IMR-90 sénescents + extrait de pulpes de fruits d'Arganier 3 g/ml 98.1
Ce tableau confirme les résultats obtenus au niveau transcriptionnel et montre
la
restauration quasi-totale de l'induction des ARNm HSP72 par l'extrait de
pulpes de fruit
d'Arganier. C'est à la concentration de 3 g/ml que cet extrait est le plus
actif.
4) Conclusion
Les protéines HSP72 sont des protéines inductibles par de nombreux stress
(chaleur..) et
sont fortement impliquées dans les processus de réponse adaptative. Il est
reconnu que
l'inductibilité des protéines HSP72, au niveau cutané et dans d'autres tissus,
diminue
avec l'âge et notamment lors de la sénescence cellulaire. De plus, il est
admis que le
vieillissement est associé à une réduction de la réponse au stress
environnemental
entrainant des pathologies liées à l'âge.
A partir d'un modèle de sénescence induite dans des fibroblastes en culture,
les auteurs
ont évalué la capacité de l'extrait de pulpes de fruit d'Arganier à moduler la
diminution
d'induction des HSP72 par la chaleur.
L'ensemble des résultats confirme d'une part qu'il y a une forte diminution de
l'induction des HSP72 (par un stress thermique) dans des fibroblastes
sénescents en
comparaison avec des fibroblastes jeunes. D'autre part, ces travaux montrent
que l'extrait
de pulpes de fi-uit d'Arganier restaure l'induction des protéines HSP72 dans
les
fibroblastes sénescents. Dàns ce modèle d'étude in vitro, l'extrait de pulpes
de fruit
d'Arganier limite les conséquences biologiques de la sénescence cellulaire et
donc
présente des propriétés anti-vieillissement.
