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Dérivé de Resveratrol à longue chaîne hydroxylée utiles comme neurotrophiques
La présente invention a pour objet un composé neurotrophique, neuroprotecteur
et/ou anti-inflammatoire, en particulier un dérivé de resvératrol portant une
longue
chaîne w-alcanol de formule générale (I) suivante :
OR2
R6 n OH
R~ ~ \ \
1 OR3
R,O R5
R4
dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un
atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6 , un groupe (alkyle en C1-C6)
carbonyle , R4,
R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alcoxy en C1-C6,
un
groupe alkyle en C1-C6, un groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle oxyet n est un
nombre
entier compris entre 8 et 20, de préférence entre 10 et 16.
Le système nerveux central (SNC) est constitué de deux populations cellulaires
que l'on peut qualifier de cellules neurales : les neurones, et tous les
autres types
cellulaires, regroupés sous le nom de cellules gliales. Les astrocytes et les
oligodendrocytes représentent les types majeurs des cellules gliales chez
l'adulte. Ces
cellules sont générées tout au long de la vie foetale et leur production se
poursuit après
la naissance et jusque chez l'adulte dans certaines régions du cerveau.
Neurones, astrocytes et oligodendrocytes dérivent d'un précurseur commun, une
cellule multipotente aux capacités de prolifération théoriquement illimitées,
qui est
localisée dans le tube neural. Ces précurseurs peuvent être considérés comme
des
cellules souches neurales car ils répondent aux critères qui définissent les
cellules
souches : auto-renouvellement, capacité de prolifération quasi infinie et
capacité de
générer les types cellulaires constituant le tissu dont elles sont issues.
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Le neurone, cellule hyper spécialisée, se développe au sein d'un tissu de
soutien et
d'environnement, la glie. La glie centrale est composée des cellules gliales
du système
nerveux central et, la glie périphérique, des cellules gliales du système
nerveux
périphérique. Plus précisément, la glie centrale comprend les astrocytes
(astroglie), les
oligodendrocytes (oligodendroglie) et les microgliocytes (microglie). La glie
périphérique comprend quant à elle les cellules de Schwann, équivalant des
oligodendrocytes de la glie centrale.
Les astrocytes sont des constituants de la barrière hématoencéphalique (BHE).
Ils
interviennent dans la régulation du métabolisme cérébral et servent
d'interface entre les
capillaires et les neurones (rôle nutritif) par l'intermédiaire de
prolongements
(pseudopodes) qui s'enroulent autour des capillaires. Ils participent à la
recapture des
neurotransmetteurs et interviennent également dans la cicatrisation en
produisant des
filaments gliaux (constituants du cytosquelette).
Les microgliocytes sont des cellules gliales originaires de la lignée myéloide
envahissant le système nerveux central pendant la période embryonnaire. La
microglie
est spécialisée dans l'élimination des macromolécules, la phagocytose des
cellules en
apoptose ou en nécrose, la reconnaissance et l'élimination d'éléments
pathogènes, ainsi
que dans la régulation de la réponse immunitaire.
Les oligodendrocytes assurent la myélinisation des axones dans le système
nerveux central. Il existe une diversité de progéniteurs à l'origine des
oligodendrocytes.
Ces cellules sont générées dans des foyers ventriculaires très restreints tout
au long du
tube neural. Chez l'adulte les oligodendrocytes sont dispersés dans tout le
parenchyme
cérébral, avec une prédominance dans les faisceaux de substance blanche.
La gaine de myéline, synthétisée par les oligodendrocytes, est un complexe
protéique membranaire qui s'enroule autour des axones. Elle possède une double
fonction : elle joue un rôle d'isolant électrique et surtout elle permet
d'augmenter la
vitesse de propagation de l'influx nerveux. Une atteinte de cette gaine
conduira à un
ralentissement, voire un arrêt du potentiel d'action, perturbant la
transmission nerveuse
de l'information et provoquant des troubles neurologiques. La perte ou la
dégénérescence de la myéline entraîne l'apparition de maladies dites
démyélinisantes ou
dysmyélinisantes.
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Les problèmes de santé publique que posent les maladies neurodégénératives et
démyélinisantes telles que la maladie d'Alzheimer et la sclérose en plaques
sont
incontestables, de même que leurs enjeux économiques. Ces maladies,
aujourd'hui
incurables, provoquent la mort lente et très progressive des cellules
nerveuses et
demeurent, pour la plupart, dépourvues de tout traitement efficace.
La prévalence de la maladie d'Alzheimer dans le monde est de 12 millions et
sera
multipliée par 3 en 50 ans au vu de l'augmentation de l'espérance de vie dans
les pays
développés.
Les traitements actuels ne sont que symptomatiques et il existe une forte
demande
pour de nouveaux médicaments à forte efficacité et d'un mode d'administration
périphérique. Les médicaments symptomatiques pour la maladie d'Alzheimer sont
en
majorité des anti-cholinestérasiques (Aricept , Exelon , Reminyl ). Le dernier
venu sur
ce marché est le Namendâ qui est un inhibiteur du récepteur du N-methyl-D-
Aspartate(NMDA).
En outre, une des plus répandues et des plus dévastatrices des maladies
démyélinisantes est la sclérose en plaques (SEP) qui est une maladie
inflammatoire
évolutive du système nerveux caractérisée par une dégénérescence de la gaine
de
myéline, des oligodendrocytes et des neurones.
La sclérose en plaques touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde,
parmi lesquelles un grand nombre de jeunes adultes (entre 20 et 40 ans).
Les traitements pour la sclérose en plaques sont répartis entre quatre
médicaments
immonomodulateurs (Rebit , Avonex , Betaserori et le Copaxone ). Les
traitements
actuels prennent relativement bien en compte la composante inflammatoire.
Cependant
ils s'avèrent inactifs sur la composante démyélinisation, cause du handicap
permanent et
cumulati Contrairement à ce que l'on pensait autrefois, il s'avère que, même
au début
de la maladie, les oligodendrocytes gardent la potentialité de fabriquer de la
nouvelle
myéline (remyélinistation). Par contre, au stade chronique, cette capacité de
remyélinisation semble bien perdue. On sait ainsi que chez la plupart des
malades, la
SEP évolue d'abord sous la forme de "poussées et rémissions", ensuite sous la
forme
"progressive". Il semble bien que les oligodendrocytes et leurs précurseurs
peuvent
survivre aux phénomènes inflammatoires de la première phase, mais que par
contre leur
nombre et leur efficacité sont considérablement réduits pendant la phase
chronique.
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Deux possibilités thérapeutiques étaient jusque là envisagées : la
transplantation de
précurseurs d'oligodendrocytes (greffe) ou une stimulation de la myélinisation
par des
substances chimiques à partir des oligodendrocytes survivants et des
précurseurs
d'oligodendrocytes endogènes (remyélinisation endogène).
En ce qui concerne la transplantation, l'utilisation des précurseurs des
oligodendrocytes (cellules jeunes peu différenciées) considérés comme ayant de
plus
grandes possibilités de synthèse de myéline et de migration que les
oligodendrocytes
adultes, est envisagée dans l'art antérieur pour permettre la réparation d'un
volume
maximum de zones démyélinisées. La source idéale d'oligodendrocytes serait du
tissu
nerveux humain très jeune (embryonnaire) ce qui soulève des problèmes éthiques
et
pratiques. On ignore d'autre part quelles seront leurs propriétés migratoires.
Or, le
problème est que, chez la plupart des patients, les lésions sont multiples et
qu'il est
illusoire de les "greffer" chacune individuellement. On ne sait en outre
toujours pas si
ces oligodendrocytes sont capables de migrer par eux-mêmes ou si
l'intervention de
facteurs chimiques spécifiques est indispensable, de même que l'on ignore la
longévité
de ces cellules.
On a par ailleurs décrit, dans l'art antérieur, différents facteurs
neurotrophiques (L.
Shen, A. Figurov & B. Luu, Journal of Molecular Medicine, 1997, vol. 75,637-
644) qui
régulent la survie, la croissance et la différenciation des neurones et sont
donc des
facteurs de croissance spécifiques du cerveau. Ils protègent les cellules
nerveuses contre
diverses agressions, en particulier contre les substances libérées par les
cellules
microgliales activées et responsables de l'inflammation au sein du cerveau
ainsi que vis-
à-vis de diverses maladies dues au mauvais fonctionnement du système nerveux.
Cependant, ces macromolécules, neuroprotectrices, traversent difficilement la
barrière hémato-encéphalique, d'où la nécessité de bénéficier des molécules
lipophiles
neurotrophiques avec une administration par voie systémique pour le traitement
des
maladies du système nerveux central et pour cela de synthétiser des molécules
trophiques capables d'induire la différenciation des cellules souches neurales
et d'autres
précurseurs cellulaires.
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Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs se sont penchés sur les
actions possibles de nouveaux composés sur les cellules dites souches
(M.Brehm, T.
Zeus & B. E. Strauer, Herz, 2002, vol. 27, 611-620).
Les mécanismes par lesquels une cellule souche neurale donne naissance aux
trois
5 types cellulaires majeurs du SNC, sont encore mal connus. On sait cependant
que ce
développement procède par étapes successives au cours desquelles les
potentialités
développementales de la cellule souche neurale sont progressivement
restreintes. Il y a
ainsi production de précurseurs intermédiaires aux potentialités de plus en
plus limitées
qui aboutiront à des cellules hautement différenciées. Initialement, les
cellules souches
sont d'origine embryonnaire. Elles sont ainsi essentiellement présentes chez
les foetus et
les enfants en bas âge. Elles sont capables de se multiplier quasiment à
l'infini. Sous
l'action de ces facteurs neurotrophiques, elles se transforment en cellules
matures et
fonctionnelles de différents types (M. Y. Chang, H. Son, Y. S. Lee & S. H.
Lee,
Molecular and CellularNeuroscience 2003, vol. 23N 3, 414-426). Très récemment,
il a
été démontré que les cellules souches sont aussi présentes dans des organes de
stades
plus développés, en particulier dans le cerveau (Ph. Taupin & F.H. Gage,
Journal of
Neuroscience Research, 2002, vol. 69,745-749) et la moelle épinière des
adultes. Ainsi,
sous l'action de différents facteurs de croissance, les cellules souches
neurales, c'est-à-
dire les cellules souches présentes dans le cerveau, peuvent se transformer en
neurones,
en astrocytes ou en oligodendrocytes, c'est-à-dire les principaux types de
cellules
nerveuses.
Cependant à cause de leur taille moléculaire et de leurs propriétés
physicochimiques, ces facteurs de croissance naturels protéiques ne peuvent
traverser
diverses barrières biologiques, en particulier la barrière hématoencéphalique.
Ils ne
peuvent donc pas pénétrer dans le cerveau en quantités suffisantes pour
exercer leurs
actions bénéfiques. En outre, ils présentent une très mauvaise
biodisponibilité, limitant
ainsi leur efficacité et leur utilisation.
De plus, lorsque des cellules souches sont utilisées pour le traitement des
neuropathies dégénératives, ces derniéres sont introduites dans le cerveau à
l'aide d'une
opération chirurgicale qui est une étape invasive risquée (C. N. Svendsen & M.
A.
Caldwell, Progress in Brain Research, 2000, vol. 127,13-34) tout comme peuvent
l'être
les précurseurs des oligodendrocytes.
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L'invention propose à présent une alternative avantageuse à la
transplantation. En
effet, les inventeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue que
si l'on
greffe une chaîne alcanol sur un noyau resvératrol, on obtient des molécules
capables de
franchir la barrière hématoencéphalique et de favoriser une remyélinisation
endogène en
modulant la spécification cellulaire des cellules souches neurales, i. e.,
d'influencer le
choix pour une cellule souche neurale de s'orienter vers la voie neuronale ou
gliale
(modulation du ratio neurone/cellules gliales). D'autre part, ces composés
sont capables
de mimer l'action de certains facteurs neurotrophiques. Ces mimes sont en
mesure de
transformer des cellules souches neurales en cellules nerveuses différenciées
et en
particulier d'induire préférentiellement la formation de neurones et ceci, in
situ, dans le
cerveau. Cette formation préférentielle de neurone est particulièrement
intéressante pour
le traitement de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, les composés selon la présente
invention
sont particulièrement adaptés pour être utilisés dans le traitement de la
maladie
d'Alzeimer.
Plus particulièrement, les composés selon l'invention favorisent la survie
neuronale et la croissance des neurites. Les composés selon l'invention sont
aussi
capables de diminuer la composante inflammatoire lors de maladies affectant le
système
nerveux. Ils peuvent ainsi, en particulier, diminuer l'activation de la
microglie et/ou des
astrocytes.
Ces composés sont par ailleurs capables de diminuer la gliose réactionnelle,
i. e.,
la cicatrisation gliale, plus particulièrement en modulant l'expression de
certains
composés du cytosquelette des astrocytes. La répression de l'activation des
cellules
microgliales et la transformation des cellules souches neurales en cellules
oligodendrocytaires matures sont des caractéristiques essentielles pour le
traitement des
maladies neurodégénératives ou de type démyélinisante/dysmyélinisante telles
que
notamment la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, la maladie de
Parkinson, la
maladie de Creutzfeldt-Jakob, mais également les démences vasculaires, la
sclérose
latérale amyotrophiques, les amyotrophies spinales infantiles et les
neuropathies liées
aux accidents vasculaires cérébraux.
Le pouvoir anti-oxydant du resvératrol est dû à la présence des groupements
hydroxyles et plus particulièrement à celui en position 4' :
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7
OH
13
2 4
6'
5~ ~ ~. 6 5 O H
4
HO ~ 2
3'
Structure du resvératrol
Les radicaux hydroxyles sont des espèces électrophiles très réactives, ils
vont donc
aisément réagir par substitution avec des composés aromatiques.
Le radical hydroxyle va préférentiellement s'additionner sur la position
activée 3'
du cycle aromatique, de par l'effet électro-donneur du groupement OH en
position para
4' .
Le resvératrol est un polyphénol présent dans le vin, le thé et divers fruits.
Depuis
ces dix derniéres années un intérêt grandissant pour ce composé peut être
observé. Il est
en partie relié à une étude entreprise dans le sud de la France révélant une
relation de
corrélation inverse entre la consommation de vin et les maladies
cardiovasculaires; ce
phénomène est appelé le French Paradox[1]. Par ailleurs, le resvératrol est
retrouvé
dans l'extrait de plante Polygonum cuspidatum utilisé depuis très longtemps
par la
médecine traditionnelle chinoise pour ses propriétés anti-inflammatoires et le
traitement
de certaines allergies cutanées.
Ainsi, la présente invention a pour objet les alcools hydrocarbonés à longue
chaîne,
substitués par un noyau de type Resvératrol, nommés Resveratrol Fatty Alcohols
(RFA)
ainsi que leurs analogues, et en particulier les composés de formule générale
(I)
suivante :
OR2
R6 n OH
R~ ~ \ \
1 OR3
R,O R5
R4
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dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un
atome
d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, un groupe (alkyle en C1-C6)
carbonyl, R4,
Rs, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alcoxy en C1-C6,
un
groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle oxy et n est un nombre entier compris entre
8 et 20,
de préférence entre 10 et 16 ou ses sels d'addition pharmaceutiquement
acceptables,
isomères, énantiomères, diastéréoisomères, ainsi que leurs mélanges.
Par le terme acide pharmaceutiquement acceptable on entend au sens de la
présente invention tout acide non toxique, y compris les acides organiques et
inorganiques. De tels acides incluent l'acide acétique, benzènesulfonique,
benzoïque,
citrique, éthanesulfonique, fumarique, gluconique, glutamique, bromhydrique,
chlorhydrique, lactique, maléique, malique, mandélique, méthanesulfonique,
mucique,
nitrique, pamoique, pantothénique, phosphorique, succinique, sulfurique,
tartarique et
paratoluènesulfonique.
Par le terme groupe alkyle en C1-C6 , on entend au sens de la présente
invention tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou
ramifiés, en
particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle,
iso-butyle,
sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s'agit d'un
groupe
méthyle.
Par le terme groupe alkoxy en C1-C6 , on entend au sens de la présente
invention tout groupe alkoxy de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou
ramifiés, en
particulier, le groupe méthoxy.
Par le terme groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle , on entend au sens de la
R-C -
I I
présente invention tout groupe dans lequel R représente un radical alkyle en
C1-C6 tel que défini ci-dessus. Les exemples de radicaux (alkyle en C1-C6)
carbonyle
comprennent, mais ne sont pas limités aux groupes acétyle, propionyle, n-
butyryle, sec-
butyryle, t-butyryle, iso-propionyle, et similaires. En particulier on entend
le groupe
acétyle.
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Par le terme groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle oxy, on entend au sens de la
présente
R-C -O-
I I
invention tout groupe O dans lequel R représente un radical alkyle en C1-C6
tel que défini ci-dessus. En particulier on entend le groupe acétate.
Selon un aspect particulier de l'invention, les composés de formule générale
(I)
correspondent à ceux pour lesquels Ri, R2 et R3 représentent un groupe méthyle
(Me) ou
un atome d'hydrogène.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, les composés de formule (T)
correspondent à ceux pour lesquels Ri, R2 et R3 représentent un groupe méthyle
et R4,
R5, R6 et R7 un atome d'hydrogène ou un groupe méthoxy (OMe). De manière
avantageuse, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène.
La chaîne latérale du composé de formule (I) correspond à un W-alcanol dans
lequel n est compris entre 10 et 18.
Les composés de formule (I) dans lesquels n est un nombre entier égal à 10,
12, 14,
16 ou 18 sont des composés particulièrement efficaces dans le cadre de la
présente
invention.
Les composés comprenant une chaîne latérale de 10 ou 12 atomes de carbones
sont particulièrement avantageux.
Les composés encore plus particulièrement avantageux sont :
Le RFA- 12, de formule suivante :
OH
OH
~ \ \ OH
H
le MRFA-12, de formule suivante :
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OMe
OH
\ \ \
OMe
MeO
le DMRFA- 12, de formule suivante :
5
OMe
OH
\ \ \
OMe
Me0
OMe
le MRFA- 10 de formule suivante :
OMe
OH
\ \ \
OMe
MeO
et le DMRFA- 10 de formule suivante :
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OMe
OH
\ \ \
OMe
Me0
OMe
De manière avantageuse selon la présente invention, le composé est le RFA-12.
Un objet de l'invention concerne ainsi une composition pharmaceutique
comprenant à titre de substance active au moins un composé alcools
hydrocarbonés à
longue chaîne, substitués par un noyau de type Resvératrol, en particulier un
composé
de formule générale (I) selon l'invention telle que définie précédemment, en
association
avec un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Quelle que soit la voie d'administration choisie, des compositions
avantageuses
selon l'invention se présentent sous une forme favorable à la protection et à
l'assimilation optimale du principe actif
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de
différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être
administrés de
manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, comme par
exemple
par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-
artérielle,
etc., les voies intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, orale et par
inhalation étant
avantageuses.
Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de
suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de
perfusions,
par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des
solutions
salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un
usage
pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent
contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants,
solubilisants,
stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des
formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose,
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l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le
mannitol, la
gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc.
Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles,
comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, aérosols, etc.,
éventuellement au
moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée
et/ou
retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel
que la
cellulose, des carbonates ou des amidons.
Les composés selon l'invention peuvent en particulier moduler l'activation des
cellules microgliales et astrocytaires aux concentrations de 10-5 à 10-9, de
préférence
10-6 à 10-8M, encore plus préférentiellement 10-6M. Ces composés permettent,
dans les
mêmes conditions avantageuses de concentrations, d'induire la différenciation
des
cellules souches neurales en neurones ainsi que la survie des neurones dans
ces
conditions.
Les inventeurs ayant démontré une activité des composés selon l'invention aux
concentrations indiquées ci-dessus, il est entendu que le débit et/ou la dose
injectée
peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la
pathologie
concernée, du mode de réalisation, etc. En outre, des injections répétées
peuvent être
réalisée, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des
systèmes
retard ou prolongés peuvent être avantageux.
L'invention concerne par ailleurs les composés et compositions pharmaceutiques
selon la présente invention pour leur utilisation comme médicament.
Les composés et compositions selon l'invention sont utilisés en tant que
médicament ayant un effet neurotrophique et/ou neuroprotecteur et/ou anti-
inflammatoire, et/ou destiné à la prévention ou au traitement des maladies ou
désordres
du système nerveux altérant les oligodendrocytes ou les autres cellules du
système
nerveux et/ou des maladies ou désordres de l'inflammation du système nerveux,
et/ou
des neuropathies dégénératives, et/ou des maladies démyélinisantes ou
dysmyélinisantes
et/ou des accidents vasculaires cérébraux ou toutes autres atteintes
lésionnelles du
système nerveux.
En particulier, les composés ou la composition pharmaceutique selon la
présente
invention prévient ou traite la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer,
la maladie
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de Parkinson, la maladie de Creutzfeldt-Jakob. D'autres maladies susceptibles
d'être
traitées sont les démences vasculaires, la sclérose latérale amyotrophique,
les
amyotrophies spinales infantiles. De même les lésions dérivées d'accidents
vasculaires
cérébraux et toutes autres atteintes lésionnelles du système nerveux sont
susceptibles
d'être traitées par les composés et compositions de l'invention.
Au sens de l'invention, le terme traitement désigne aussi bien un traitement
préventif que curatif, qui peut être utilisé seul ou en combinaison avec
d'autres agents
ou traitements. En outre, il peut s'agir d'un traitement de troubles
chroniques ou aiguës.
Un autre objet de l'invention concerne les composés selon la présente
invention
pour son utilisation en tant que médicament destiné à moduler la spécification
cellulaire
des cellules souches neurales, favoriser la différenciation puis la survie des
neurones et
cellules gliales en différenciation, favoriser la différenciation de cellules
précurseurs
d'oligodendrocytes en oligodendrocytes matures, et/ou diminuer l'activation de
la
microglie et/ou l'activation des astrocytes et/ou la gliose réactionnelle.
L'invention concerne ainsi l'utilisation in vitro d'au moins un composé selon
la
présente invention pour l'obtention de neurones et/ou cellules gliales
différenciées à
partir de cellules souches.
Les composés de l'invention peuvent être préparés à partir de produits du
commerce, en mettant en oeuvre une combinaison de réactions chimiques connues
de
l'homme du métier, éventuellement à la lueur du procédé de préparation des
composés
de formule générale (I) telle que définie ci-dessous [2].
Les composés de formule générale (I) dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent
un
atome d'hydrogène peuvent être notamment obtenus par un procédé de préparation
comprenant l'étape (a) de réaction du composé de formule générale (I) dans
laquelle Ri,
R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6 avec le tribromure de bore
dans du
dichlorométhane à-78 C [3]. D'autres solvants et d'autres températures peuvent
être
utilisées.
Les composés de formule générale (I) dans laquelle Ri, R2 et R3 représentent
un
groupe alkyle en C1-C6 peuvent être notamment obtenus par un procédé de
préparation
comprenant l'étape (b) de couplage de Wadsworth-Emmons entre le composé de
formule générale (II) suivante :
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14
O
P\ OEt
OEt
R6 R5
D 1
R7 R4
OR, (II)
dans laquelle Ri représente un groupe alkyle en C1-C6 et R4, R5, R6 et R7 sont
tels que
définis ci-dessus
et le composé de formule générale (111) suivante [4]
OR2
nOTBDMS
H OR3
0
(III)
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6, TBDMS
représente le
tert-butyl-diméthylsilyle et n est tel que défini ci-dessus, avantageusement
en présence
de méthylate de sodium dans du diméthylformamide à reflux.
Le TBDMS présente un intérêt particulier comme groupement protecteur car il
peut être
clivé in-situ en présence de HC1 à 2M
Toutefois, il est également possible d'utiliser un autre groupement protecteur
du
groupe OH.
En particulier, le composé de formule générale (111) peut être obtenu par le
procédé de préparation comprenant les étapes (c), (d) et (e) suivantes :
-(e) hydrogénation catalytique, avantageusement avec du palladium sur charbon
à
5%, du composé de formule générale (IV) suivante [5] :
OR2
/ n2OTBDMS
\
MeO I ~ OR3
O (IV)
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6 et n est tel que
défini ci-
dessus
pour obtenir la composé de formule générale (V) suivante :
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OR2
n OTBDMS
Me0 I OR3
O (V)
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6 et n est tel que
défini ci-
dessus;
-(d) réduction de l'ester de formule (V) en alcool de formule générale (VI)
5 suivante
OR2
n OTBDMS
HO OR3
(VI)
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6 et n est tel que
défini ci-
dessus,
avantageusement à l'aide d'hydrure mixte d'aluminium et de lithium ;
10 -(c) oxydation de l'alcool de formule (VI) en aldéhyde de formule (III),
avantageusement en utilisant le tétra-n-propylammonium perruthénate et de la N-
méthylmorpho line.
En particulier, le composé de formule générale (IV) peut être obtenu par le
procédé de préparation comprenant l'étape (f) de réaction de couplage de
Sonogashira
15 entre le composé de formule générale (VII) suivante :
OR2
~ I
MeO I OR3
O (VII)
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en C1-C6
et le composé de formule générale (VIII) suivante [6]
/ n_2 OTBDMS (VIII)
dans laquelle n est tel que défini ci-dessus,
avantageusement à l'aide de PdClz(PPh3)z, en présence de Cul dans la
triéthylamine à
reflux.
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16
Avantageusement dans le cadre du procédé selon la présente invention, Ri, R2
et
R3 représentent un groupe méthyle et R4, R5, R6 et R7 représentent un atome
d'hydrogène ou un groupe méthoxy.
Ainsi, la synthèse des RFA repose principalement sur deux étapes clé. La
première
étape est une réaction de Sonogashira permettant le couplage entre un iodure
aromatique
et les différentes longueurs de chaîne (n = 10, 12, 14, 16, 18) sous forme
d'alcynes vrais.
La seconde étapeus met en oeuvre une réaction de Wadsworth-Emmons entre un
aldéhyde
et le phosphonate formé in-situ à partir du bromure de benzyle obtenu par
bromation de
l'alcool benzylique correspondant (Schéma 1).
OR2 R6 H
Rs ~jnOH R7 CBr O ~ OMe
R7 ~ \ \ OR ~ +
3 MeO R5 OTBDMS
R~O I R5 R4 OMe n 2
R4
OH
O
R6 Re MeO ~ OMe ~ OTBDMS
~ I / + i n-3
R7 Ra I
OMe OMe
Schéma 1 : Schéma rétrosynthétique
Synthèse de la chaîne latérale
Afin de synthétiser les différentes longueurs de chaînes nécessaires au
couplage de
Sonogashira, les inventeurs ont suivi le chemin réactionnel suivant (Schéma 2)
:
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O
O O
~,`~ ou LiAIH4 HBr 48 %
n_
HO"M 90-97% HO~OH H
12 OH THF, 0 C-~ t.a. n-2 75 - 85%
la lb ? 3
TBDMSCI = Li, H2NCH2CH2NH2 , DMSO
Br- ' OTBDMS ~-~.PTBDMS
Imidazole, CH2CI2, t.a. n-2 0 C-~ t.a., 80 - 90% /// n_
85-95%
4 5
Schéma 2 : Synthèse des différentes chaînes latérales.
Après réduction du diacide la ou de la lactone lb à l'aide de l'hydrure mixte
d'aluminium et de lithium, on obtient les diols correspondants 2. Pour les
autres
longueurs de chaîne, les diols sont commerciaux. La réaction de monobromation
est
réalisée dans un mélange hétérogène d'acide bromhydrique et de cyclohexane
afin
d'obtenir les bromoalcools 3 avec de bon rendements.
Les Inventeurs ont choisi le tert-butyl-diméthylsilyle comme groupement
protecteur de la fonction alcool car celui-ci est facilement déprotégé à
l'aide de TBAF.
Finalement, les dérivés acétylénés 5 sont obtenus par action de 1'acétylure de
lithium
dans le DMSO sur les bromoalcools silylés 4 correspondants.
Synthèse de l'iodure aromatique
Le 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle 7 est obtenu en deux étapes avec un
rendement tout à fait acceptable de 87%. Dans un premier temps, les inventeurs
on traité
l'acide 3,5-dihydroxybenzoïque avec une solution méthanolique de N-
iodosuccinimide
(NIS) afin de former le dérivé iodé 6 puis les inventeurs ont méthylés les
fonctions
hydroxyles pour former le composé 7 souhaité nécessaire au couplage de
Sonogashira.
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18
O OH O OH O OMe
NIS, MeOH Me2SO4, K2C03
0 C-'- t.a., 3h acétone, 4, 5h
HO OH 92% HO OH 95% MeO OMe
1
6 7
Schéma 3 : Synthèse de l'iodure aromatique.
Couplage de Sonogashira
Cette réaction va donc permettre de greffer les différentes chaînes W-
hydroxylées
5 sur le cycle aromatique 7 (schéma 4).
De manière générale les dérivés iodés ont une réactivité plus élevée, de ce
fait les
inventeurs ont décidé d'effectuer la réaction de Sonogashira avec un iode sur
l'ester
benzylique 7 (schéma 3) bien que ce dernier ne soit pas commercial.
La réaction de couplage se fait donc selon le chemin réactionnel suivant :
MeO O
MeO O
PdC12(PPh3)2, Cul
+ '-OTBDMS Me0 OMe
Me0 OMe z Et3N, 4, 24h, 69 - 75%
ç-zOTBDMS
7 5 8
Schéma 4 : Réaction de Sonogashira.
Maintenant que la chaîne w-alcanol est greffée, l'étape suivante est la
synthèse de
l'aldéhyde nécessaire au couplage de Wadsworth-Emmons pour former la double
liaison C-C trans entre les deux cycles aromatiques (Schéma 5).
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MeO O OH HO
H2, Pd/C 10% LiAIH4, THF ~ TPAP, NMO
--> --~ i
EtOH, t.a., 20h 0 C t.a. CH2CI2, t.a.
90% Me0" ( OMe 16h, 98% MeO OMe 1 h 89% MeO' OMe
n OTBDMS n OTBDMS InOTBDMS
$ 9 10 il
Schéma 5: Synthèse de l'aldéhyde 11 nécessaire au couplage de Wadsworth-
Emmons.
Le composé avec la chaîne saturée 9 est obtenu par hydrogénation catalytique
au
palladium sur charbon 5%. Afin de former l'aldéhyde 11 pour la réaction de
Wadsworth-Emmons, les inventeurs ont réduit l'ester 9 en alcool 10 à l'aide de
1'hydrure mixte d'aluminium et de lithium. Les inventeurs ont ensuite oxydé
l'alcool en
aldéhyde 11 en utilisant le tétra-n-propylammonium perruthénate TPAP [(n-Pr4N)
Ru04]
et de la N-méthylmorpholine.
Couplage de Wadsworth-Emmons
Le but étant, dans un premier temps, de synthétiser des dérivés du trans-
resvératrol, les inventeurs ont opté pour une des variantes de la réaction de
Wittig qui
permet de former exclusivement la double liaison carbone-carbone avec la
configuration
trans à savoir le couplage de Wadsworth-Emmons ( Schéma 6).
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O
OH Br OEt
OEt
PBr3, CH2CI2 P(OEt)3, 4
I/ 0 C-- .at I/ 6h I i
4h, 95%
OMe OMe OMe
12 13 14
0
~,OEt H O OMe
~OEt 1) NaOMe, DMF, 0 C taJJOH
~ OMe
Me0 OMe 3) 100 C 1h /
OMe 4) t.a., 16h Me0
n OTBDMS 5) HCI 2N, 3h
14 11
Schéma 6 Synthèse des hybrides resvératrol/c~alcanols : couplage de
Wadsworth-Emmons.
5
De manière générale, cette réaction est basée sur le couplage entre un
aldéhyde et
un phosphonate. L'alcool benzylique 12 est bromé à l'aide de tribromure de
phosphore
(PBr3) pour former le bromure de benzyle correspondant 13 qui en présence de
triéthylphosphite (POEt3) à reflux permet de former le phosphonate souhaité
14. Ainsi,
10 les inventeurs ont pu faire réagir le phosphonate et l'aldéhyde
précédemment formé en
présence de méthylate de sodium dans du diméthylformamide à reflux. Au cours
de
cette réaction il y a formation d'un intermédiaire, une bétaïne, qui par
élimination de
l'oxyde de triéthylphosphite conduit à la formation du produit de couplage
désiré 15.
Les inventeurs ont ainsi formés les différents méthoxylés des RFA qui seront
15 également testés.
Les RFA 16 sont finalement obtenus par action de tribromure de bore dans le
dichlorométhane à - 78 C (Schéma 7).
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OMe OH
R6 nOH BBr3, CH2CI2 R6 nOH
R7 R~
OMe -78 C - t.a., 2h OH
Me0 R5 750
o HO R5
R4 R4
15 16
Schéma 7: Déméthylation des dérivés méthoxylés, MRFA.
Les exemples suivants sont donnés à titre indicatif et ne doivent pas être
considérés comme limitant la présente invention.
EXEMPLES
Exemple 1. Préparation du 12-bromododécan-1-ol (3)
HBr à 48% dans l'eau (77 mL; 0,46 mol; 15 éq.) est ajouté à une solution de
1,12-dodécan-ol (6,15 g; 30,4 mmol; 1 éq.) dans du cyclohexane (140 mL). Le
mélange hétérogène est chauffé à reflux. Après 6h, la phase aqueuse est
extraite avec de
l'éther (3x100 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une
solution
saturée de NazCO3, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées. Le brut
réactionnel est
purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : hexane-AcOEt : 6-4)
pour donner
7,06 g d'un solide blanc.
Rendement : 85%
Formule brute : C12H25BrO
PM : 265,23
CCM : (hexane-AcOEt : 6-4) Rf = 0,4
Les composés où n = 8, 10, 14 et 16 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
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RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 1,26 (s large, 16H, H-3 à H-10) ; 1,56 (m, 2H, H-
2) ; 1,85 (q, 2H, J = 7,0 Hz, H-11) ; 3,40 (t, 2H, J = 6,8 Hz, H-12) ; 3,63
(t, 2H, J = 6,4
Hz, H-1).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 25,5 (C-3) ; 28,2 (C-11) ; 28,7 (C-9) ; 29,4 (C-4 à
C-8) ; 32,8 (C-2) ; 33,8 (C-12) ; 63, (C-1).
Br
HO
12
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H à 1,26 ppm et +/- 2C à 29,4 ppm.
Exemple 2. Préparation du (12-bromododécyloxy)(tert-
butyl)diméthylsilane (4)
Le chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (5,61 g; 37,3 mmol ; 1,5 éq.) et
l'imidazole (2,54 g; 37,3 mmol ; 1,5 éq.) sont ajoutés à une solution de 12-
bromododécan-1-ol (6,6 g; 24,9 mmol ; 1 éq.) dans du dichlorométhane (60 mL) à
température ambiante. Après 4h, le mélange réactionnel est versé dans une
solution
saturée de NH4C1(100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase
organique
est lavée avec une solution saturée de NaC1, séchée sur MgSO4, filtrée puis
évaporée.
Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant
hexane-
AcOEt : 95-5) pour donner 9,17 g d'une huile incolore.
Rendement : 99%
Formule brute : CigH39BrOSi
PM : 379,49
CCM : (hexane-CHzC1z : 8-2) Rf = 0,5
Les composés où n = 8, 10, 14 et 16 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
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RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s
large, 16H, H-3 à H-10) ; 1,39 à 1,53 (m, 2H, H-2) ; 1,85 (q, 2H, J= 6,9 Hz, H-
11) ;
3,40 (t, 2H, J = 6,9 Hz, H-12) ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-1).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 26,0 (CH3C) ; 28,2-
29,6 (C-2 à C-10) ; 32,9 (C-11) ; 34,0 (C-12) ; 63,4 (C-1).
1/ 1
Si Br
12
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H à 1,27 ppm et +/- 2C à 28,2-29,6 ppm.
Exemple 3. Préparation du tert-butyl(tétradéc-13-ynyloxy)diméthylsilane
(5)
Une solution de (12-bromododécyloxy)(tert-butyl)diméthylsilane (9,2 g; 24,2
mmol ; 1 éq.) dans le DMSO (5 mL) est ajoutée goutte à goutte à une solution
refroidie
à 0 C d'acétylure de lithium (3,35 g; 36,4 mmol ; 1,5 éq.) dans le DMSO (15
mL). Le
mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 16h. Le
mélange
réactionnel est versé dans une solution saturée de KC1 (100 mL) puis extrait à
l'hexane
(3x100 mL). La phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et
évaporée. Le
brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant
hexane-CHzC1z :
8-2) pour donner 6,38 g d'une huile incolore.
Rendement : 81%
Formule brute : C2oH4oOSi
PM : 324,62
CCM :(heptane-CHzC1z : 8-2) Rf = 0,4
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés par le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
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24
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,90 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s
large, 16H, H-3 à H-10) ; 1,38 à 1,59 (m, 4H, H-2 et H-11) ; 1,93 (t, 1H, J=
2,6 Hz, H-
14) ; 2,18 (td, 2H, J = 2,5 Hz et J = 6,9 Hz, H-12) ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz,
H-1).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi et C-12) ; 26,0 (CH3C) ;
25,8-29,9 (C-3 à C-11) ; 32,9 (C-2) ; 63,4 (C-1) ; 68,0 (C-14) ; 84,8 (C-13).
ô 1 14
Si
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,27 ppm et +/- 2C à 25,8-29,9
ppm.
Exemple 4. Préparation de l'acide 3,5-dihydroxy-4-iodobenzoïque (6)
Une solution de N-iodosuccinimide (5 g; 22,2 nunol ; 1,05 éq.) dans le
méthanol
(15 mL) est ajoutée goutte à goutte à une solution refroidie à 0 C d'acide 3,5-
dihydroxybenzoïque (3,26 g; 21,2 mmol ; 1 éq.) dans le méthanol (13 mL). Le
mélange
réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 3h. Le mélange
est versé
dans de l'eau froide (13 mL) puis dans une solution aqueuse de NazSO3 à 5% (20
mL).
La phase aqueuse est extraite avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique
est lavée
avec NaC1, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour donner 5,37 g d'un
solide blanc.
Rendement : 90%
Formule brute : C7H5104
PM : 280,02
CCM : (AcOEt) Rf = 0,1
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 2,67 (s, 1H, H,,,-,ae) ; 4,91 (s, 2H, OH) ; 6,98
(s,
2H, H-3 et H-5).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8: 80,3 (C-1) ; 106,2 (C-3 et C-5) ; 131,8 (C-4) ;
158,0 (C-2 et C-6) ; 168,1 (C-7).
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CO2H
4
)61 3
HO 2 OH
Exemple 5. Préparation du 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (7)
5 Du carbonate de potassium (12 g; 85,8 mmol ; 5,6 éq.) et du diméthylsulfate
(12,6
g; 99,6 mmol ; 6,5 éq.) sont ajoutés à une solution d'acide 3,5-dihydroxy-4-
iodobenzoïque (4,3 g; 15,3 mmol ; 1 éq.) dans l'acétone (48 mL). Le mélange
réactionnel est chauffé à reflux pendant 4h. Du méthanol (26 mL) est ajouté et
le reflux
est maintenu pendant lh supplémentaire. Le mélange est versé dans une solution
saturée
10 de NH4C1 (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase
organique est
séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée. Le brut réactionnel est purifié par
chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 6-4) pour donner
4,66 g d'un
solide blanc.
Rendement : 95%
15 Formule brute : C10H11I04
PM : 322,10
CCM : (heptane-AcOEt : 7-3) Rf = 0,4
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 3,93 (s, 3H, H-8) ; 3,94 (s, 6H, H-9 et H-10)
20 7,16 (s, 2H, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 52,4 (OMe) ; 56,8 (OMe) ; 84,3 (C-1) ; 104,7 (C-
3 et C-5) ; 131, 8 (C-4) ; 159,5 (C-2 et C-6) ; 166,6 (C-7).
CO2Me
4
5I 3
6
MeO 2 OMe
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26
Exemple 6. Préparation du 4-(14-(tert-
butyldiméthylsilyloxy)tétradéc-1-ynyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle
(8)
Le complexe de palladium PdC12(PPh3)2 (200 mg ; 0,28 mmol ; 0,07 éq.) et
l'iodure de cuivre (55 mg ; 0,28 mmol ; 0,07 éq.) sont respectivement ajoutés
à une
solution de 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (1,3 g; 4,04 mmol ; 1 éq.)
dans
la triéthylamine (11 mL). Le mélange réactionnel est laissé agiter à
température
ambiante pendant 10 minutes, puis du tert-butyl(dodécan-13-
ynyloxy)diméthylsilane
(1,97 g; 6,05 mmol ; 1,5 éq.) est ajouté. Après 48h de chauffage à reflux, le
mélange est
versé dans une solution saturée de NH4C1 (100 mL) puis extrait avec de
l'acétate
d'éthyle (3x100 mL). La phase organique est lavée avec une solution saturée de
NaC1,
séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est adsorbé sur
silice (200
m) puis purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt :
9-1)
pour donner 1,31 g d'une huile jaune.
Rendement : 63%
Formule brute : C3oH5oO5Si
PM : 518,80
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 8-2) Rf = 0,4
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s
large, 16H, H-5' à H-13') ; 1,47 à 1,68 (m, 2H, H-4') ; 2,55 (t, 2H, J= 7,0
Hz, H-3') ;
3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,92 (s, 9H, OMe) ; 7,21 (s, 2H, H-2 et H-
6).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,3 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 20,3 (C-3') ; 26,0
(CH3C) ; 28,8 à 29,5 (C-4' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 52,3 (OMe) ; 56,3 (OMe) ;
63,3 (C-
14') ; 72,2 (C-l') ; 102,5 (C-2') ; 104,6 (C-2 et C-6) ; 107,0 (C-4) ; 129,9
(C-1) ; 161,0
(C-3 et C-5) ; 166,7 (C-7).
CA 02644570 2008-08-29
WO 2007/099162 PCT/EP2007/051994
27
CO2Me
1
6 2
51 3
MeO 4 OMe
O.Si
14' ~
Les spectres RMN 'H et RMN '3C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,27 ppm et +/- 2C à 28,8-29,5
ppm.
Exemple 7. Préparation du 4-(14-(tert-
butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (9)
Du palladium sur charbon 10% (256 mg ; 0,24 mmol ; 0,01 éq.) est ajouté à une
solution de 4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradéc-l-ynyl)-3,5-
diméthoxybenzoate
de méthyle (1,28 g; 2,47 mmol ; 1 éq.) dans l'éthanol (5 mL). Le mélange
réactionnel
est laissé agiter sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante. Après
24h, le
mélange est filtré sur célite. Le brut réactionnel est purifié par
chromatographie sur gel
de silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3) pour donner 1,23 g d'une huile jaune.
Rendement : 95%
Formule brute : C30H54O5Si
PM : 522,83
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 7-3) Rf = 0,6
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,25 (s
large, 20H, H-3' à H-12') ; 1,43 à 1,53 (m, 4H, H-2' et H-13') ; 2,65 (t, 2H,
J 7,2 Hz,
H-l') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,85 (s, 6H, OMe) ; 3,91 (s, 3H,
OMe) ; 7,22 (s,
2H, H-2 et H-6).
CA 02644570 2008-08-29
WO 2007/099162 PCT/EP2007/051994
28
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 23,2 (C-l') ; 25,9
(CH3C) ; 28,9 à 29,8 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 52,1 (OMe) ; 55,8 (OMe) ;
63,4 (C-
14') ; 104,9 (C-2 et C-6) ; 125,4 (C-4) ; 128,4 (C-1) ; 158,0 (C-3 et C-5) ;
167,7 (C-7).
CO2Me
1
6 ~ 2
5I / 3
MeO 4 OMe
1O~Si
14' ~<
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,25 ppm et +/- 2C à 28,9-29,8
ppm.
Exemple 8. Préparation du (4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-
3,5-diméthoxyphényl)méthanol (10)
De l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium (87 mg ; 2,3 mmol ; 1 éq.) est
ajouté par petites portions à une solution de 4-(14-(tert-
butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (1,2 g; 2,3
mmol ;
1 éq.) dans le THF (9 mL) refroidie à 0 C. Le mélange réactionnel est laissé
agiter à
température ambiante. Après 2h30, le mélange est versé dans une solution
aqueuse de
tartrate de sodium à 10% (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La
phase
organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut
réactionnel est
purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3)
pour donner
1,05 g d'une huile incolore.
Rendement : 92%
Formule brute : C29H54O4Si
PM : 494,82
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 7-3) Rf = 0,3
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
CA 02644570 2008-08-29
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29
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,26 (s
large, 20H, H-3' à H-12') ; 1,29 à 1,52 (m, 4H, H-2' et H-13') ; 2,60 (t, 2H,
J = 7,2 Hz,
H-l') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,81 (s, 6H, OMe) ; 4,65 (s, 2H, H-
7) ; 5,30 (s,
OH) ; 6,55 (s, 2H, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 22,8 (C-l') ; 26,0
(CH3C) ; 25,8 à 29,8 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 55,7 (OMe) ; 63,4 (C-14')
; 65,9
(C-7) ; 102,4 (C-2 et C-6) ; 119,0 (C-4) ; 139,5 (C-1) ; 158,4 (C-3 et C-5).
HO
6 2
5I 3
MeO 4 OMe
1O~Si
~<
14'
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,26 ppm et +/- 2C à 25,8-29,8
ppm.
Exemple 9. Préparation du 4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-
3,5-diméthoxybenzaldéhyde (11)
De la N-méthylmorpholine (422 mg ; 3,12 mmol; 1,5 éq.) est ajoutée à une
solution de (4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-
diméthoxyphényl)méthanol (1,03 g; 2,08 mmol ; 1 éq.) dans le dichlorométhane
(5 mL)
en présence de tamis moléculaires 4Å (500 mg/mmol). Du tétra-n-propylammonium
perruthénate (37 mg ; 0,10 mmol ; 0,05 éq.) est ajouté par petites portions au
mélange
refroidi à 0 C. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température
ambiante pendant
2h puis filtré sur célite. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie
sur gel de
silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3) pour donner 855 mg d'une huile incolore.
Rendement : 85%
Formule brute : C29H5zO4Si
PM : 492,81
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 6-4) Rf = 0,6
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Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
5 RMN 1 H (300 MHz, CDC13) 8: 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,25
(s
large, 20H, H-3' à H-12') ; 1,29 à 1,52 (m, 4H, H-2' et H-13') ; 2,67 (t, 2H,
J = 7,2 Hz,
H-l') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,88 (s, 6H, OMe) ; 7,05 (s, 2H, H-2
et H-6) ;
9,90 (s, 1H, H-7).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) 8:-5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 23,5 (C-l') ; 26,0
10 (CH3C) ; 25,8 à 31,6 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 55,8 (OMe) ; 63,3 (C-
14') ; 104,9
(C-2 et C-6) ; 127,5 (C-4) ; 135,1 (C-1) ; 158,6 (C-3 et C-5) ; 191,9 (C-7).
O 7H
1
6 2
51 / 3
MeO 4 OMe
1O~Si~
14' ~<
15 Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,25 ppm et +/- 2C à 25,8-31,6
ppm.
Exemple 10. Préparation du bromure 4-méthoxybenzylique (13)
20 Du tribromure de phosphore (6,2 g; 25,0 mmol; 1,15 éq.) est ajouté à une
solution d'alcool 4-méthoxybenzylique (3 g; 21,7 mmol ; 1 éq.), refroidie à 0
C, dans
le dichlorométhane (35 mL). Après 5h à température ambiante, le mélange
réactionnel
est versé dans de l'eau glacée (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100
mL). La
phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour obtenir
4,1 g
25 d'une huile incolore.
Rendement : 94%
Formule brute : C8H9BrO
PM : 201,06
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CCM :(éluant heptane-AcOEt : 7-3) Rf = 0,6
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 3,81 (s, 3H, OMe) ; 4,51 (s, 2H, CH2Ph) ; 6,87 (d,
2H, J = 8,8 Hz, H-3 et H-5) ; 7,32 (d, 2H, J = 8,8 Hz, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 34,0 (CH2Ph); 55,3 (OMe) ; 114,2 (C-3 et C-5) ;
130,0 (C-1) ; 130,5 (C-2 et C-6) ; 159,7 (C-4).
Br
14
3 5
2I 6
OMe
Exemple 11. Préparation du (E)-14-(4-(4-méthoxystyryl)-2,6
diméthoxyphényl)tétradécan-1-ol (I')
De la triéthylphosphite (565 mg ; 3,44 mmol ; 2 éq.) et du bromure 4-
méthoxybenzylique (478 mg ; 2,38 mmol ; 1,4 éq.) sont chauffés à 130 C. Après
6h, le
mélange réactionnel est ramené à température ambiante puis une solution de
méthylate
de sodium à 5,4M (540 L ; 2,92 mmol ; 1,7 éq.), le diméthylformamide (2 mL)
et une
solution de 4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-
diméthoxybenzaldéhyde
(845 mg ; 1,72 mmol ; 1 éq.) dans le diméthylformamide (2 mL) sont
respectivement
ajoutés. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante
pendant lh,
puis chauffé à 100 C pendant lh supplémentaire. Le mélange est finalement
laissé
agiter à température ambiante une nuit. Au mélange réactionnel est ajoutée une
solution
de HC1 à 2M (6 mL). Après 3h, le mélange est versé dans une solution saturée
de KC1
(100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est
lavée, séchée
sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par
chromatographie sur
gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3) pour donner 568 mg d'un solide
blanc.
Rendement : 69%
Formule brute : C31H4604
PM : 482,69
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 7-3) Rf = 0,2
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Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 1,26 (s large, 20H, H-3" à H-12") ; 1,30 à 1,59
(m, 4H, H-2" et H-13") ; 2,61 (m, 2H, H-1 ") ; 3,64 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14")
; 3,83 (s,
3H, OMe) ; 3,86 (s, 6H, OMe) ; 6,67 (s, 2H, H-2 et H-6) ; 6,90 (d, 2H, J = 8,8
Hz, H-3'
et H-5') ; 6,98 (d, 1H, J= 16,1 Hz, H-8) ; 7,02 (d, 1H, J = 16,1 Hz, H-7) ;
7,45 (d, 2H, J
= 8,8 Hz, H-2' et H-6').
RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 23,0 (C-1 ") ; 25,7 à 29,8 (C-2" à C-11 ") ; 32,8
(C-13") ; 55,3 (OMe) ; 55,7 (OMe) ; 63,1 (C-14") ; 101,9 (C-2 et C-6) ; 114,1
(C-3' et
C-5') ; 119,4 (C-4) ; 127,2 (C-8) ; 127,4 (C-7) ; 127,6 (C-2' et C-6') ; 130,0
(C-l') ; 136
(C-1) ; 158,4 (C-3 et C-5) ; 159,2 (C-4').
OMe
3 4 1 OFi
2/
e1~11 1\ I 14õ
~7 6 5 OMe
Me0 3'
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,26 ppm et +/- 2C à 29,3-29,8
ppm.
Exemple 12. Préparation du (E)-5-(4-hydroxystyryl)-2-(14-
hydroxytétradécyl)benzène-1,3-diol (I)
Du tribromure de bore (230 L ; 2,42 mmol ; 15 éq.) est ajouté à une solution
de
(E)-14-(4-(4-méthoxystyryl)-2,6-diméthoxyphényl)tétradécan-1-ol (78 mg ; 0,16
mmo1;
1 éq.) dans le dichlorométhane (5 mL) à-78 C. Le mélange réactionnel est
laissé agiter
à température ambiante. Après 2h, de l'eau (15 mL) est ajoutée à-78 C puis à
nouveau
de l'eau est rajoutée au mélange (50 niL). La phase aqueuse est extraite avec
de
l'AcOEt (3x50 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une
solution
saturée de NaC1, séchées sur MgSO4, filtrées puis évaporées. Le brut
réactionnel est
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purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 45-55)
pour
donner 53 mg d'un solide blanc.
Rendement : 75%
Formule brute : C28H4004
PM : 440,61
CCM : (éluant heptane-AcOEt : 4-6) Rf = 0,3
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés par le même mode
opératoire que décrit ci-dessus.
RMN iH (300 MHz, CDC13) b: 1,28 (s large, 20H, H-3" à H-12") ; 1,40 à 1,52
(m, 4H, H-2" et H-13") ; 2,57 (m, 2H, H-1 ") ; 3,53 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14")
; 6,45 (s,
2H, H-2 et H-6) ; 6,74 (d, 1H, J = 15,9 Hz, H-8) ; 6,75 (d, 2H, J = 8,6 Hz, H-
3' et H-
5') ; 6,89 (d, 1H, J = 15,9 Hz, H-7) ; 7, 32 (d, 2H, J = 8,6 Hz, H-2' et H-
6').
RMN 13C (75 MHz, CDC13) b: 22,9 (C-1 ") ; 25,7 à 29,8 (C-2" à C-12") ; 29,7
(C-13") ; 64,3 (C-14") ; 104,6 (C-2 et C-6) ; 115,4 (C-4) ; 115,9 (C-3' et C-
5') ; 126,3
(C-8) ; 127,1 (C-7) ; 128,1 (C-2' et C-6') ; 128,6 (C-l') ; 135,7 (C-1) ;
156,7 (C-3 et C-
5) ; 156,8 (C-4').
OH
3
2 OH
14"
6' 8 1
5 I \ 1' 7 6 5 OH
3,
H0 4' /2
Les spectres RMN 'H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont
identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,28 ppm et +/- 2C à 25,7-29,8
ppm.
Exemple 13 : Partie physico-chimique
Le test au DPPH (2,2'-di(4-tert-octylphenyl)1-picrylhydrazyl a été utilisé
afin de
déterminer la capacité anti-oxydante de nos composés [9]. Le DPPH est un
radical
stabilisé qui absorbe à 517 nm (coloration violette). Si l'on met en présence
une
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molécule anti-oxydante, cette derniére va réagir avec le radical. Ainsi, une
diminution
de l'absorbance pourra être observée. La capacité anti-oxydante se traduira
donc par une
diminution de l'absorbance à 517 nm.
a) Mise en oeuvre du test DPPH
Sur une plaque Elisa à 96 puits, on introduit :
= 100 L des différentes solutions aux concentrations (10 mM, 5
mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,01 mM et 0,001 mM)
= 100 L d'une solution éthanolique de DPPH à 400 M
Après une incubation de respectivement 45 minutes, 2 heures et 3 heures, le
résultat est donné par une mesure de la densité optique à 550 nm à l'aide d'un
spectrophotomètre.
Le résultat est exprimé part l'ICso qui est la concentration à laquelle 50%
des
radicaux ont été réduits par la molécule antioxydante.
Les inventeurs ont testé le resvératrol, comme contrôle positif, ainsi que le
RFA10, RFA12 et RFA16.
Le resvératrol présente une ICso de 10 M. Nos molécules hybrides quant à
elles
ont une ICso de l'ordre de 2,5 M après un temps d'incubation de 3 heures. Il
peut être
remarqué que la capacité antioxydante est indépendante de la longueur de la
chaîne w-
hydroxylée. Cependant avec une IC5o de l'ordre de 2,5 mM, nos molécules
hybrides
conservent une bonne capacité antioxydante.
Les dérivés méthoxylés ont également été testés. Ces composés possèdent un
pouvoir antioxydant mais aux concentrations testées l'ICso n'est pas atteinte.
b) Principe du test à 1'ABTS
Au vu des résultats obtenus avec le test au DPPH l'uilisation du test à l'ABTS
([2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]) a été envisagé
[10], [11], [12].
Le test à l'ABTS est plus sensible dans la mesure où ce dernier fait
intervenir des
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radicaux hydroxyles moins encombrés. Par ailleurs, il est plus révélateur de
l'activité de
composés en tant qu'antioxydant dans la mesure où dans le cerveau le radical
prédominant est le radical hydroxyle.
La molécule d'ABTS va réagir avec les radicaux hydroxyles OH- générés dans le
5 milieu par la réaction de Fenton pour former un radical cation, ABTS*+
(coloration
verte), absorbant à 405 nm. Ainsi, si l'on met en présence une molécule anti-
oxydante,
capable de réduire les radicaux hydroxyles, une diminution de l'absorbance à
405 nm
pourra être observée.
10 Sur une plaque Elisa à 96 puits, on introduit :
= 180 L d'un mélange eau/éthanol : 50/50
= 30 L d'une solution aqueuse d'ABTS à 1 mM
= 30 L d'une solution aqueuse de FeS04 à 1 mM
= 30 gL de produit à tester aux différentes concentrations (10 mM,
15 5 mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,01 mM et 0,001 mM)
= 30 L d'une solution aqueuse de H202 à 100 mM
Après une incubation de respectivement 45 minutes, 1 heure et 2 heures, le
résultat est donné par une mesure de la densité optique à 405 nm à l'aide d'un
spectrophotomètre.
Etant donné que la longueur de la chaîne n'est pas déterminante pour la
capacité
antioxydante, il a été décidé de n'effectuer ce test qu'avec une seule
longueur de chaîne.
Afin de réduire au maximum les problèmes de solubilité le RFA10 a été testé.
Le
resvératrol est toujours utilisé comme contrôle positif
Les valeurs des ICso sont celles obtenues après une incubation de 2 heures. Le
resvératrol présente une ICso de 30 M et le RFA-10 une ICso de 45 M.
Malgré une capacité antioxydante un peu plus élevée pour le resvératrol, nos
composés présentent un potentiel antioxydant important.
Exemple 14 : Partie biologique
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Inhibition de l'activation de la microglie par les RFA et MRFA (Resveratrol
Fatty Alcohols et Methoxylated Resveratrol Fatty Alcohols). Production des
neurones par des cellules souches neurales.
Dans le cerveau, le système immunitaire est représenté par une population de
cellules de types monocytes-macrophages, les cellules microgliales. Ainsi, les
différents
tests mis en oeuvre permettront d'évaluer la capacité de nos composés à
moduler
l'activation de la microglie ainsi que leur activité anti-inflammatoire.
Lorsque la microglie est activée suite à différents stimuli
(Lipopolysaccharides,
Interféron-gamma...), un certain nombre de cytokines, comme le TNF-a, ou
encore
d'enzymes inductibles, NOS-II et COX-II, sont synthétisées.
Ainsi, le taux de monoxyde d'azote, NO et du Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a,
sont des indicateurs de l'activation microgliale.
Les expériences réalisées concernent ainsi la capacité des molécules RFA, MRFA
et DMRFA à inhiber, dans la microglie activée, la libération de nitrites et de
TNF-(X.
OH OMe OMe
nOH nOH nOH
I ~ \ \ OH I ~ \ \ OMe I ~ \ \ OMe
HO MeO Me0
OMe
RFA MRFA DMRFA
a) Mesures de la libération de nitrites
L'activité de la NO-synthase de type II (NOS II) représente un paramètre de
l'activité microgliale souvent analysée dans la littérature. Cette enzyme est
responsable
de la synthèse du radical monoxyde d'azote en condition d'activation
inflammatoire. La
microglie au repos n'exprime que des taux à la limite de la détection par
immunoempreinte. Une activation de 24 à 48 heures entraîne une forte
augmentation de
cette expression. Le produit de cette enzyme, le NO, se dégrade rapidement en
culture
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pour former des nitrites. Un dosage, par colorimétrie (méthode de Griess),
montre que
les niveaux de NOz- suivent la même tendance.
Dans les expériences réalisées, les concentrations en NOz- ont été mesurées,
après
24 heures et 48 heures d'activation dans des cultures de cellules microgliales
traitées
avec 0.01 g/ml de LPS, en présence des produits RFA-12, MRFA-10, MRFA-12,
MRFA-14, MRFA-16, MRFA-18, DMRFAIO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16,
DMRFA-18, MResvératrol, DMResvératrol et le Resvératrol à des concentrations
de
5.10-6, 10-6et 10-' M.
Les résultats obtenus pour les dérivés méthoxylés et diméthoxylés, provenant
de
trois expériences indépendantes, montrent que le MRFA-10, DMRFAIO et le
Resvératrol induisent une diminution dans les cellules de la production de
nitrites de
20% par rapport aux valeurs contrôles.
Dans la série des RFA, le RFA-12 induit une diminution du taux de nitrites
dans
les cellules de 50% à la concentration de 5.10-6 M.
Ces résultats montre l'importance de la longueur de la chaîne ainsi que de la
présence des groupements hydroxyles. En effet la meilleure activité est
observée pour le
RFA-12 qui est plus actif que le Resvératrol lui-même.
b) Mesure de la libération de TNF-a
L'expression du TNF-a représente un paramètre de l'activation microgliale
souvent analysée dans la littérature. La microglie au repos n'exprime pas
cette cytokine.
Une activation de 24 heures par le LPS entraîne une forte augmentation de
l'expression,
détectable par test Elisa.
Dans les expériences réalisées, les concentrations en TNF-a ont été mesurées
après 24 heures d'activation, dans des cultures de cellules microgliales
traitées avec
0.01 g/ml de LPS en présence de MRFA10, MRFA-12, MRFA-14, MRFA-16,
MRFA-18, DMRFAIO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16, DMRFA-18,
MResvératrol, DMResvératrol et le Resvératrol à des concentrations de 5.10-6,
10-6 et
10-' M.
Les résultats obtenus concernant la série des MRFA montrent que les MRFA-10,
MRFA-12 et MRFA-14 entraînent une diminution dans les cellules de la
production de
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TNF-a de 20 à 40% à la concentration de 5.10-6 M par rapport aux valeurs
contrôles.
L'activité de ces produits est concentration dépendante puisqu'elle décroît
avec la
concentration. L'homologue méthoxylé du resvératrol, le Mresvératrol, induit
une
baisse du taux de TNF-a de 20% seulement.
En ce qui concerne la série des dérivés diméthoxylés, les DMRFA, Le DMRFA-
et le DMRFA-12 induisent une baisse de TNF-a de 40% à 5.10-6 M par rapport au
contrôle. Une diminution de 50% est observée à la même concentration pour le
DMResvératrol.
Finalement, le RFA-12 induit une baisse du taux de TNF-a à la concentration de
10 5.10-6 M de 40% par rapport aux valeurs contrôles. Le resvératrol, quant à
lui, induit
une baisse de seulement 30% dans les mêmes conditions.
Ces résultats préliminaires sur la production de TNF-a montrent que de manière
générale, les composés hybrides, RFA, MRFA et DMRFA selon la présente
invention
présentent une meilleure activité que leurs homologues du resvératrol.
L'importance de
la présence de la chaîne w-hydroxylée a donc pu être mise en évidence, ainsi
que sa
longueur. En effet, les composés portant une chaîne latérale de 10 ou 12
atomes de
carbones se révèlent avoir la meilleure activité.
OMe OMe
~ \ \ I Me ~ \ \ I
I O OMe
MeO ~ MeO
OMe
MResvératrol DMResvératrol
Effet du RFA12 et de ces analogues sur la prolifération et la différenciation
des cellules souches neurales.
La plupart des maladies du système nerveux central (SNC) sont causées par une
dégénérescence ou une agression de différents types cellulaires comme les
neurones ou
les cellules gliales. Des études sur des modèles animaux suggèrent qu'il
serait possible
de remédier à ces dommages soit par transplantation de cellules souches
neurales ou en
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activant les cellules souches présentent au sein du système nerveux central.
Ces cellules
souches neurales permettent de générer des neurones, des oligodendrocytes et
des
astrocytes.
Une approche thérapeutique intéressante est le développement de petites
molécules comme les RFA permettant de contrôler ou d'induire la
différenciation
endogène de cellules souches neurales en différentes cellules nerveuses.
Protocole expérimental
Les neurosphères sont obtenues à partir de cellules provenant du telencéphale
d'embryons de souris cultivées en milieu défini contenant 20 ng/mL d'EGF.
Après
dissociation, les sphères prolifèrent pendant 3 jours en présence d'EGF (20
ng/mL)
durant la phase appelée phase de prolifération.
Ensuite elles sont collectées et déposées sur un support de poly-ornithine
dans un milieu
défini, en présence d'EGF 2 ng/mL. Dans ces conditions, les sphères adhèrent
au
support et se différencient. Les composés à tester, le RFA12 et ses analogues,
préalablement dissous dans l'éthanol, sont ajoutés immédiatement après le
dépôt des
neurosphères à différentes concentrations s'échelonnant de 10-5 à 10-9 M. Les
cultures
témoins sont traitées par un contrôle négatif (éthanol) et un contrôle positif
(Acide
rétinoïque).
Après 3 jours de culture (phase de différenciation) les cellules sont fixées
et les
différents types cellulaires sont révélés par immunocytochimie. Pour le
criblage de nos
composés nous avons effectués un double marquage à savoir celui des neurones
et des
astrocytes.
Les anticorps primaires utilisés sont :
= anticorps anti-MAP2ab (Microtubule Associated Protein), marqueur de neurones
précoces (mitotiques)
= anticorps TUJl (anti Béta (III) Tubuline), marqueur de neurones (post-
mitotiques)
= anticorps anti-GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), marqueur des
astrocytes
Les anticorps anti-MAP2ab et TUJl sont révélés par des anticorps secondaires
couplés
à un fluorochrome cyanine, le Cy-3 (rouge). Pour la détection des astrocytes,
un
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anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, dérivé de la rhodamine,
l'A1exa488
(vert) a été utilisé.
Afin de pouvoir quantifier les résultats, les noyaux sont marqués par un agent
5 intercalant, le TO-PRO (bleu). Les cultures sont ensuite observées au
microscope
confocal.
Résultats
1. Le RFA12 induit la différenciation de cellules souches neurales en
neurones.
10 L'effet du RFA12 sur la différenciation des cellules souches neurales en
neurone ou en
cellules gliales a été testé à des concentrations allant de 10-s à 10-9 M. A
la
concentration de 10 -s M il est à remarquer que le RFA12 ne permet pas
d'induire une
différenciation de par une toxicité à cette concentration. Parallèlement, à 10-
9 M le
RFA12 ne présente qu'une faible activité. Cependant, si les neurosphères sont
traitées
15 avec du RFA12 avec des concentrations allant de 10-6 M à 10-g M une
augmentation du
nombre de neurones par rapport au contrôle (cellules non traitées) est
observée. Aux
concentrations de 10-6, 10-' et 10-g M nous pouvons observer une augmentation
de la
population de neurones de 120%, 90% et 80% respectivement par rapport au
contrôle
fixé à 100%. Ces résultats montre que l'effet du RFA12 sur la différenciation
des
20 cellules souches neurales en neurones est dose-dépendante avec un effet
maximal à la
concentration de 10-6 M.
2. Afin de voir si les RFA et ces analogues permettaient également d'agir sur
la
prolifération des cellules souches neurales, ces derniéres sont dissociées
puis cultivées
25 en présence de RFA (10-6 et 10-8 M) pendant 5 jours, puis le nombre de
cellules vivantes
est comptabilisé ainsi que la taille et la morphologie des cellules.
Les résultats montrent que le RFA12 à la concentration de 10-6 M permet
d'inhiber la
prolifération des cellules souches neurales.
30 Conclusion
Le RFA12 permet d'induire la différenciation des cellules souches neurales en
neurones
tout en inhibant la prolifération de ces derniéres à la concentration de 10-6
M.
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