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Procédé et Méthodes de détection de la maladie d'Alzheimer
La présente demande concerne des méthodes et compositions utilisables pour la
détectior
de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, en particulier les humains.
Elle décri
notamment des marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer et leurs
utilisations dans de:
méthodes de diagnostic. Elle concerne également des outils et/ou kits
utilisables pour k
mise en ceuvre de ces méthodes (réactifs, sondes, amorces, anticorps, puces,
cellules, etc.)
leur préparation et leurs utilisations. L'invention est utilisable pour
détecter la présence oi
l'évolution de la maladie d'Alzheimer chez les mammifères, y compris en phase
précoce.
La maladie d'Alzheimer représente la principale cause de démence et la mala&
neurodégénérative la plus fréquente. Cette maladie, d'évolution progressive,
est caractérisé,
par la perte de mémoire et par une dégradation des aptitudes au langage, à
l'orientation e
au jugement. La nature des symptômes, souvent confondus avec les désagrément
physiologiques liés à la vieillesse, leur sévérité ainsi que l'âge de leurs
apparitions, varien
selon les individus. Ceci contribue à la difficulté d'établir un diagnostic
aux stades précoce
de la maladie.
L'examen de cerveaux de patients atteints de cette maladie révèle une perte de
neurones d,
l'hippocampe, centre important de la mémoire, et du cortex cérébral, impliqué
dans 1,
raisonnement, le langage et la mémoire. Les neurones cholinergiques sont
particulièremen
affectés par cette déplétion.
Une autre anomalie majeure observée dans les cerveaux des malades atteints de
la maladi,
d'Alzheimer est l'accumulation d'agrégats intracellulaires et extracellulaires
de protéines
Des agrégats neurofibrillaires intracellulaires de la protéine tau semblent
bien corrélés avo
la gravité de la démence. Des plaques séniles formées par agrégation intra et
extracellulair,
de peptide beta-amyloïde caractérisent des régions d'altérations de neurones
et de cellule
gliales.
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Il est cependant remarquable de noter que ces zones d'agrégation ne
correspondent pas aux
sites de la déplétion en synapses caractéristique du déclin des fonctions
cognitives.
Les études génétiques menées sur les formes familiales ont montré que 4 gènes
sont
associés au développement de la maladie. L'APP (Amyloid Precursor Protein ;
précurseur
du peptide beta amyloide), les présénilines 1 et 2(PS1 et PS2) et
l'apolipoprotéine E
(ApoE). Bien que des mutations ou polymorphismes dans chacun de ces gènes
aboutissent à
une production accrue de peptide beta amyloïde, les mécanismes qui président
aux pertes
synaptiques et neuronales restent mal connus. A cet égard, plusieurs
hypothèses et
mécanismes semblent ainsi coexister, qui impliquent différents phénomènes:
1 Des phénomènes purement cérébraux impliquant les neurones et les cellules
gliales:
- le stress oxydatif, qui peut être induit notamment par le peptide beta
amyloïde et modulé par le métabolisme du cholestérol;
- des modifications de flux calciques et l'excitotoxicité.
2 Des phénomènes inflammatoires et immunitaires réactionnels ;
3 Une altération des hormones sexuelles ;
4 L'hypothyroïdisme et des défauts dans la régulation des signaux
insuliniques.
Par conséquent, la maladie d'Alzheimer serait caractérisée par une altération
de différents
systèmes d'intégration régulant l'homéostasie, l'atteinte de certains neurones
entraînant à la
fois une réaction inflammatoire impliquant le système immunitaire et des
modifications des
régulations endocriniennes. Ces dernières ont en retour un impact sur
l'activité et la
viabilité d'autres neurones et sur les fonctions immunitaires, ces réactions
en cascade
soulignant le rôle non seulement de la neurodégénérescence mais aussi des
régulations
hormonales et de la réponse immunitaire dans la progression de la maladie
d'Alzheimer.
Il n'existe actuellement aucune signature robuste et spécifique de la maladie
d'Alzheimer,
susceptible de permettre d'établir un diagnostic de cette pathologie,
notamment des
différents stades de l'évolution de la maladie. La mise à disposition d'un
test de diagnostic
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efficace, notamment précoce, permettrait aux patients d'être pris en charge
dès le début de
la maladie, et de bénéficier ainsi d'un traitement plus efficace et plus
adapté, notamment
par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase tels que la tacrine, le donepezil
et la rivastigmine,
dans des conditions optimales.
La présente invention apporte une réponse à ce besoin. L'invention décrit
notamment
l'identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer, permettant
la mise au
point de diagnostics efficaces et prédictifs de la présence, du stade ou du
risque de
développer cette maladie. L'invention décrit ainsi l'identification de
signatures moléculaires
spécifiquement ou préférentiellement exprimées dans le sang de patients
atteints de la
maladie d'Alzheimer, résultant notamment d'épissages alternatifs. De manière
particulièrement inattendue, la présente demande démontre l'existence, au
niveau des
cellules sanguines de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, d'une
dérégulation de
l'horloge inteme et de voies de signalisation moléculaire impliquées dans la
phagocytose
et/ou le stress oxydatif. L'invention peut donc proposer, pour la première
fois, des outils et
méthodes de diagnostic, de prédiction et/ou de suivi de l'évolution de la
maladie
d'Alzheimer, basés sur une mesure, dans le sang de sujets, de l'expression
d'un ou plusieurs
gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les gènes
impliqués dans
la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif. La présence d'une
dérégulation dans
l'expression de tels gènes permet d'établir le risque ou la prédisposition à
la maladie
d'Alzheimer, ou de confirmer la présence de cette pathologie chez un sujet.
Un objet de l'invention réside ainsi dans une méthode pour détecter (in vitro
ou ex vivo) la
présence ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère,
comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du
mammifère,
de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans un
ou plusieurs
gènes ou ARN choisis parmi les gènes régulés selon un rythme circadien et les
gènes
impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif, la
présence d'une telle
altération étant indicative de la présence ou du risque de développer la
maladie d'Alzheimer
chez ce mammifère.
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Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour évaluer ou suivre
l'efficacité d'un
traitement de la maladie d'Alzheimer, comprenant une étape de mesure de
l'expression d'un
ou, de préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un
rythme
circadien et les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du
stress oxydatif,
au cours du traitement, et une comparaison de l'expression ainsi mesurée à
celle mesurée à
un stade antérieur du traitement.
Un autre objet de l'invention concerne une amélioration aux méthodes de
traitement de la
maladie d'Alzheimer, l'amélioration consistant à mesurer l'expression d'un ou,
de
préférence, de plusieurs gènes choisis parmi les gènes régulés selon un rythme
circadien et
les gènes impliqués dans la régulation de la phagocytose ou du stress
oxydatif, chez un
sujet, avant et/ou pendant le traitement. La mesure de l'expression permet
d'adapter le
traitement en fonction de l'évolution de la pathologie. Le traitement est
typiquement un
traitement par des inhibiteurs d'acétylcholinestérase, tels que la tacrine, le
donepezil et la
rivastigmine.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un inhibiteur
d'acétylcholinestérase, tel
que la tacrine, le donepezil et la rivastigmine, pour la préparation d'un
médicament pour
traiter la maladie d'Alzheimer chez un patient présentant une dérégulation de
l'expression
d'un gène (au moins) tel que défini précédemment.
L'altération dans un gène ou ARN désigne au sens de l'invention (i) toute
altération de
l'expression, à savoir en particulier une dérégulation dans les niveaux
d'expression (e.g., de
transcription ou de traduction), une dérégulation de l'épissage, conduisant
par exemple à
l'apparition de formes épissées particulières ou à une modification de la
quantité (relative)
ou du rapport entre les différentes formes d'épissage, de même que (ii) toute
altération dans
la structure de la protéine produite (apparition ou disparition de formes
tronquées,
allongées, mutées, etc.).
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Comme il sera décrit dans la suite du texte, la présente demande décrit
l'identification de
dérégulations de l'épissage des acteurs des cascades de signalisation
impliquées dans le
rythme circadien et dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif
dans le sang
de patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Toute molécule ou technique
permettant de
5 mesurer l'expression de ces gènes dans le sang peut être mise en ceuvre dans
le cadre de la
présente invention, telles que des amorces nucléotidiques, des sondes
nucléotidiques ou des
anticorps spécifiques, qui peuvent être en suspension ou sous forme
immobilisée, comme il
sera décrit en détails dans la suite du texte.
Ainsi, un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un
support
sur lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence
complémentaire et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN
tels que
définis précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques
distincts
comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20,
30, 40, 50,
60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un
support sur
lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou
un ARN tel
que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20,
30, 40, 50, 60
ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides
mentionnés ci-
dessus.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un
compartiment ou
conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques
comprenant
une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs
tels que
définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou
plusieurs
polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend
au moins
5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents
choisis parmi les
acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par
ailleurs des
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réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas
échéant, des
contrôles et/ou instructions.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel
que défini ci-
dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifere, de
préférence
un sujet humain.
Marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer
La présente invention repose sur la mise en évidence et la caractérisation
d'événements
biologiques sériques caractéristiques de la maladie d'Alzheimer chez un
patient humain.
Ces événements constituent des biomarqueurs, dont la détection chez un patient
permet, de
préférence en combinaison, de déterminer, même à un stade précoce, le risque
de
développer une telle maladie, la présence d'une telle maladie, ou le stade
d'évolution de
cette maladie. En outre, les marqueurs selon l'invention sont également
utilisables pour
mesurer l'efficacité d'un traitement, et/ou pour sélectionner des médicaments
candidats. Les
combinaisons de marqueurs de l'invention peuvent permettre de distinguer la
maladie
d'Alzheimer des autres pathologies neurodégénératives.
Les événements biologiques identifiés correspondent typiquement à des
modifications dans
la régulation de l'expression de gènes. Il peut s'agir d'une inhibition
partielle ou totale de
l'expression de gènes ou d'ARN, ou de certaines formes de gènes ou d'ARN,
d'une
augmentation de l'expression de gènes ou de certaines formes de gènes ou
d'ARN, de
l'apparition ou de la disparition de formes d'épissages de gènes, etc.
Au sens de l'invention, on entend par le terme gène régulé selon un rythme
circadien
tout gène dont l'expression est régulée par l'horloge biologique interne. Il
s'agit en
particulier de tout ARN ou toute protéine dont l'expression ou l'activité est
régulée selon un
rythme chronologique, par exemple une périodicité de 24h. Chez l'homme, le
rythme
circadien est contrôlé par une "horloge biologique" (le noyau suprachiasmique)
située dans
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l'hypothalamus. Elle tient sous sa dépendance d'autres horloges biologiques,
contrôlant
entre autres le rythme thermique du corps ou la synthèse d'hormones. A titre
d'exemples
illustratifs de gènes régulés selon un rythme circadien pour la mise en ceuvre
de l'invention,
on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau 1.
Ainsi, un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour
détecter (in
vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie
d'Alzheimer chez un
mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon
biologique du
mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une
altération dans un ou
plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 1, ou dans les ARN correspondants, en
particulier
d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle
altération étant
indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer
chez ce
mammifère.
Dans un mode de mise en ceuvre particulier, la méthode de l'invention comprend
au moins
la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère,
de
préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène
BMAL1 ou
CLOCK, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une altération de
l'épissage d'un
tel gène ou ARN.
Au sens de l'invention, on entend par le terme gène impliqué dans la
régulation de la
phagocytose ou du stress oxydatif tout gène dont le produit d'expression
participe au
mécanisme de la phagocytose ou du stress oxydatif dans les cellules sanguines.
La
phagocytose est le mécanisme par lequel certaines cellules vivantes englobent
et digèrent
certaines particules étrangères. A titre d'exemples illustratifs de tels gènes
au sens de
l'invention, on peut citer notamment tous les gènes mentionnés dans le tableau
2.
Ainsi, un autre objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode
pour détecter
(in vitro ou ex vivo) la présence ou le risque de développer, la maladie
d'Alzheimer chez un
mammifère, comprenant la détermination de la présence, dans un échantillon
biologique du
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mammifère, de préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une
altération dans un ou
plusieurs gènes indiqués dans le Tableau 2, ou dans les ARN correspondants, en
particulier
d'une altération de l'épissage d'un tel gène ou ARN, la présence d'une telle
altération étant
indicative de la présence ou du risque de développer la maladie d'Alzheimer
chez ce
mammifère.
Dans un mode de mise en ceuvre particulier, la méthode de l'invention comprend
au moins
la détermination de la présence, dans un échantillon biologique du mammifère,
de
préférence dans un échantillon (dérivé) de sang, d'une altération dans le gène
de la L-
Plastin ou de la Calnexin, ou dans un ARN correspondant, en particulier d'une
altération de
l'épissage d'un tel gène ou ARN.
De manière préférée, l'invention repose sur la détection combinée d'une
altération dans
plusieurs gènes choisis parmi les gènes mentionnés ci-dessus. Le terme
détection
combinée indique que l'altération de plusieurs gènes est déterminée pour
aboutir à un
évaluation, cette détermination pouvant être réalisée de manière simultanée ou
non. Ainsi,
un mode de mise en ceuvre particulier de l'invention implique la détection
combinée d'une
altération dans au moins un gène régulé par le rythme circadien et dans au
moins un gène
impliqué dans la régulation de la phagocytose ou du stress oxydatif.
L'invention repose donc sur la détection, dans un échantillon, d'une ou
plusieurs molécules
cibles choisies avantageusement parmi :
a) les gènes indiqués dans les Tableaux 1 et 2, ou les ARN correspondants, ou
un
fragment distinctif de ceux-ci ayant au moins 15, de préférence au moins 16,
17,
18, 19, 20, 25 ou 30 bases consécutives,
b) les acides nucléiques ayant une séquence complémentaire d'une séquence
selon
a),
c) les analogues fonctionnels d'acides nucléiques selon a) ou b), ou
d) les polypeptides codés par les acides nucléiques selon a) à c).
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La molécule cible peut être la séquence complète du gène ou de l'ARN ou de la
protéine
correspondante, ou un fragment distinctif de celle-ci, c'est-à-dire un
fragment dont la
séquence est spécifique dudit gène ou ARN, ou de la dite protéine, et/ou
comporte un
domaine de variabilité (épissage, délétion, polymorphisme, etc.) représentatif
de
l'événement biologique à détecter.
Le terme analogue fonctionnel désigne un analogue provenant d'une autre
espèce de
mammifère. En effet, les gènes indiqués dans les tableaux 1 et 2 sont des
gènes humains, et
ces séquences constituent des marqueurs efficaces et adaptés à la détection de
la maladie
d'Alzheimer chez les patients humains. Néanmoins, pour une application des
méthodes de
l'invention à d'autres espèces de mammifères, il est généralement préférable
d'utiliser des
analogues fonctionnels de ces séquences, caractérisés dans l'espèce
considérée. Ces
analogues peuvent être identifiés par toute technique connue de l'homme du
métier,
notamment en considération des séquences fournies dans la demande et des noms
des gènes
correspondants.
Dans un mode de réalisation particulier, la méthode comprend la détermination
de la
présence d'au moins un acide nucléique selon a) à c).
Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode est utilisée pour
détecter la maladie
d'Alzheimer chez un sujet humain et comprend la détermination de la présence
d'au moins
un acide nucléique selon a) ou b).
Méthodes de détection d'une altération dans un gène
Comme indiqué précédemment, une altération dans un gène ou ARN désigne au sens
de
l'invention (i) toute altération de l'expression, à savoir en particulier une
dérégulation dans
les niveaux d'expression (e.g., de transcription ou de traduction), une
dérégulation de
l'épissage, conduisant par exemple à l'apparition de formes épissées
particulières ou à une
modification de la quantité (relative) de ou du rapport entre différentes
formes d'épissage,
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de même que (ii) toute altération dans la structure de la protéine produite
(apparition ou
disparition de formes tronquées, allongées, mutées, etc.).
Différentes techniques permettant la détection d'une espèce d'acide nucléique
dans un
5 échantillon sont utilisables dans la présente invention, comme par exemple
le Northern
Blot, l'hybridation sélective, l'utilisation de supports revêtus
d'oligonucléotides sondes,
l'amplification d'acide nucléique comme par exemple par RT-PCR, PCR
quantitative ou
ligation-PCR, etc. Ces méthodes peuvent comprendre l'utilisation d'une sonde
nucléique
(par exemple un oligonucléotide) capable de détecter sélectivement ou
spécifiquement
10 l'acide nucléique cible dans l'échantillon. L'amplification peut être
réalisée selon différentes
méthodes connues en soi de l'homme du métier, telles que la PCR, la LCR,
l'amplification
médiée par transcription (TMA), l'amplification par déplacement de brin (SDA),
NASBA,
l'emploi d'oligonucléotides spécifiques d'allèles (ASO), l'amplification
spécifique d'allèle,
le Southem blot, l'analyse conformationnelle SSCA, l'hybridation in situ
(e.g., FISH), la
migration sur gel, l'analyse d'hétéroduplexes, etc. Si nécessaire, la quantité
d'acide
nucléique détectée peut être comparée à une valeur de référence, par exemple
une valeur
médiane ou moyenne observée chez des patients qui ne sont pas atteints de la
maladie
d'Alzheimer, ou à une valeur mesurée en parallèle dans un échantillon témoin.
Ainsi, il est
possible de mettre en évidence une variation de niveaux d'expression.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre, la méthode comprend la détection de
la présence
ou de l'absence ou de la quantité (relative) d'un acide nucléique selon a) à
c) par hybridation
sélective ou amplification sélective.
L'hybridation sélective est typiquement réalisée en utilisant des sondes
nucléiques, de
préférence immobilisées sur un support, tel qu'un support solide ou semi-
solide présentant
au moins une surface, plane ou non, permettant l'immobilisation de sondes
nucléiques. De
tels supports sont par exemple une lame, bille, membrane, filtre, colonne,
plaque, etc. Ils
peuvent être réalisés en tout matériau compatible, comme notamment du verre,
silice,
plastique, fibre, métal, polymère, etc. Les sondes nucléiques peuvent être
tout acide
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nucléique (ADN, ARN, PNA, etc.), de préférence simple-brin, comprenant une
séquence
spécifique d'une molécule cible telle que définie en a) à c) ci-dessus. Les
sondes
comprennent typiquement de 5 à 400 bases, de préférence de 8 à 200, plus
préférentiellement moins de 100, et encore plus préférentiellement moins de
75, 60, 50, 40
ou même 30 bases. Les sondes peuvent être des oligonucléotides synthétiques,
produits sur
la base des séquences de molécules cibles de l'invention selon des techniques
de synthèse
classique. De tels oligonucléotides comportent typiquement de 10 à 50 bases,
de préférence
de 20 à 40, par exemple 25 bases environ. Dans un mode particulièrement
avantageux, on
utilise plusieurs oligonucléotides (ou sondes) différents pour détecter la
même molécule
cible. Il peut s'agir d'oligonucléotides spécifiques de régions différentes de
la même
molécule cible, ou centrés différemment sur un même région. On peut également
utiliser
des couples de sondes, dont un membre est parfaitement apparié à la molécule
cible, et un
autre présente un mésappariement, permettant ainsi d'estimer le bruit de fond.
Les sondes
peuvent être conçues pour s'hybrider à une région d'un exon ou d'un intron, ou
à une
région de jonction de type exon-exon, exon-intron ou intron-intron. Ainsi, les
sondes
permettent de mettre en évidence et de distinguer différentes formes
d'épissage d'un gène.
Les sondes peuvent être synthétisées préalablement puis déposées sur le
support, ou
synthétisées directement in situ, sur le support, selon des méthodes connues
en soi de
l'homme du métier. Les sondes peuvent également être fabriquées par des
techniques
génétiques, par exemple par amplification, recombinaison, ligation, etc.
Les sondes ainsi définies constituent un autre objet de la présente demande,
ainsi que leurs
utilisations (essentiellement in vitro) pour la détection de la maladie
d'Alzheimer chez un
sujet.
L'hybridation peut être réalisée dans des conditions classiques, connues de
l'homme du
métier et ajustables par celui-ci (Sambrook, Fritsch, Maniatis (1989)
Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory Press). En particulier, l'hybridation peut être
réalisée dans
des conditions de stringence élevée, moyenne ou faible, selon le niveau de
sensibilité
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recherché, la quantité de matériel disponible, etc. Par exemple, des
conditions appropriées
d'hybridation incluent une température comprise entre 55 et 63 C pendant 2 à
18 heures.
D'autres conditions d'hybridation, adaptées à des supports de haute densité,
sont par
exemple une température d'hybridation entre 45 et 55 C. Après l'hybridation,
différents
lavages peuvent être réalisés pour éliminer les molécules non-hybridées,
typiquement dans
des tampons SSC comprenant du SDS, tels que un tampon comprenant 0,1 à 10 X
SSC et
0,5-0,01% SDS. D'autres tampons de lavage contenant du SSPE, du MES, du NaCI
ou du
EDTA peuvent également être utilisés.
Dans un mode de mise en oeuvre typique, les acides nucléiques (ou les puces ou
supports)
sont pré-hybridés dans un tampon d'hybridation (Rapid Hybrid Buffer, Amersham)
contenant typiquement 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon à 65 C pendant 30
min.
Les acides nucléiques de l'échantillon sont ensuite mis en contact avec les
sondes
(typiquement appliqués sur le support ou la puce) à 65 C pendant 2 à 18
heures. De
préférence, les acides nucléiques de l'échantillon sont marqués au préalable,
par tout
marquage connu (radioactif, enzymatique, fluorescent, luminescent, etc.). Les
supports sont
ensuite lavés dans un tampon 5X SSC, 0,1% SDS à 65 C pendant 30 min, puis dans
un
tampon 0.2X SSC, 0,1% SDS. Le profil d'hybridation est analysé selon des
techniques
classiques, comme par exemple en mesurant le marquage sur le support au moyen
d'un
instrument adapté (par exemple Instantlmager, Packard Instruments). Les
conditions de
l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par
exemple en
modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon
ainsi que
par ajout de substances auxiliaires comme le formamide ou de l'ADN simple
brin.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans une méthode pour
détecter la présence
ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez un mammifère, ou pour
évaluer
l'efficacité d'un traitement contre la maladie d'Alzheimer, comprenant la mise
en contact,
dans des conditions permettant une hybridation entre séquences
complémentaires, des
acides nucléiques issus d'un échantillon de sang du mammifère et d'un ensemble
de sondes
spécifique des molécules cibles identifiées précédemment pour obtenir un
profil
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d'hybridation, le profil d'hybridation étant caractéristique de la présence ou
du risque de
développer la maladie d'Alzheimer chez ce mammifère, ou de l'efficacité du
traitement.
L'amplification sélective est de préférence réalisée en utilisant une amorce
ou une paire
d'amorces permettant l'amplification de tout ou partie d'un des acides
nucléiques cibles
dans l'échantillon, lorsque celui-ci y est présent. L'amorce peut être
spécifique d'une
séquence cible telle que définie précédemment, ou d'une région flanquant la
séquence cible
dans un acide nucléique de l'échantillon. L'amorce comprend typiquement un
acide
nucléique simple-brin, d'une longueur comprise avantageusement entre 5 et 50
bases, de
préférence entre 5 et 30. Une telle amorce constitue un autre objet de la
présente demande,
ainsi que son utilisation (essentiellement in vitro) pour la détection de la
maladie
d'Alzheimer chez un sujet. Les amorces peuvent être conçues pour s'hybrider à
une région
d'un exon ou d'un intron, ou à une région de jonction de type exon-exon, exon-
intron ou
intron-intron. Ainsi, les amorces permettent de mettre en évidence et de
distinguer
différentes formes d'épissage d'un gène.
A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une
amorce
nucléotidique ou d'un ensemble d'amorces nucléotidiques permettant
l'amplification de tout
ou partie d'un ou, de préférence plusieurs gènes mentionnés dans les Tableaux
1 et 2, ou
des ARNs correspondants, pour détecter la présence ou le risque de développer
la maladie
d'Alzheimer chez un mammifère, ou pour évaluer l'efficacité d'un traitement
contre de la
maladie d'Alzheimer chez un mammifère, tout particulièrement chez un être
humain.
Détection d'une altération dans un polypeptide
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend la détermination de la
présence ou
de la quantité (relative) d'un polypeptide codé par un gène tel que défini
précédemment. La
mise en évidence ou le dosage d'un polypeptide dans un échantillon peut être
réalisée par
toute technique connue en soi, comme notamment au moyen d'un ligand
spécifique, par
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exemple un anticorps ou un fragment ou dérivé d'anticorps. De préférence, le
ligand est un
anticorps spécifique du polypeptide, ou un fragment d'un tel anticorps (par
exemple un Fab,
Fab', CDR, etc.), ou un dérivé d'un tel anticorps (par exemple un anticorps
simple-chaîne,
ScFv). Le ligand est typiquement immobilisé sur un support, tel qu'une lame,
bille, colonne,
plaque, etc. La présence ou la quantité du polypeptide cible dans
l'échantillon peut être
détectée par mise en évidence d'un complexe entre la cible et le ligand, par
exemple en
utilisant un ligand marqué, en utilisant un deuxième ligand de révélation
marqué, etc. Des
techniques immunologiques utilisables et bien connues sont les techniques
ELISA, RIA,
etc. Si nécessaire, la quantité de polypeptide détectée peut être comparée à
une valeur de
référence, par exemple une valeur médiane ou moyenne observée chez des
patients qui ne
sont pas atteints de la maladie d'Alzheimer, ou à une valeur mesurée en
parallèle dans un
échantillon témoin. Ainsi, il est possible de mettre en évidence une variation
de niveaux
d'expression.
Des anticorps spécifiques des polypeptides cibles peuvent être produits par
des techniques
conventionnelles, notamment par immunisation d'un animal non-humain avec un
immunogène comprenant le polypeptide (ou un fragment immunogène de celui-ci),
et
récupération des anticorps (polyclonaux) ou des cellules productrices (pour
produire des
monoclonaux). Des techniques de production d'anticorps poly- ou monoclonaux,
de
fragments ScFv, d'anticorps humains ou humanisés sont décrites par exemple
dans Harlow
et al., Antibodies: A laboratory Manual, CSH Press, 1988 ; Ward et al., Nature
341 (1989)
544 ; Bird et al., Science 242 (1988) 423 ; W094/02602 ; US5,223,409 ;
US5,877,293 ;
W093/01288. L'immunogène peut être fabriqué par synthèse, ou par expression,
dans un
hôte approprié, d'un acide nucléique cible tel que défini ci-avant. Un tel
anticorps,
monoclonal ou polyclonal, ainsi que ses dérivés ayant la même spécificité
antigénique,
constituent également un objet de la présente demande, de même que leur
utilisation pour
détecter un cancer.
Des modifications de l'expression et/ou de la structure des protéines peuvent
aussi être
détectées au moyen des techniques connues en soi de l'homme du métier et
impliquant la
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spectroscopie de masse, plus généralement regroupées sous le nom d'analyse
protéomique,
afin de détecter des signatures spécifiques du sang des patients atteints de
la maladie
d'Alzheimer.
5 Mise en ceuvre du procédé
La méthode de l'invention est applicable à tout échantillon biologique du
mammifère testé,
en particulier tout échantillon comportant des acides nucléiques ou des
polypeptides. On
peut citer avantageusement un échantillon de sang, plasma, plaquette, salive,
urine, selles,
10 etc., plus généralement tout tissu, organe ou, avantageusement, fluide
biologique
comportant des acides nucléiques ou des polypeptides.
Dans un mode de mise en ceuvre préféré et particulièrement avantageux,
l'échantillon est un
échantillon dérivé du sang, par exemple un échantillon de sang, de sérum ou de
plasma.
15 L'invention découle en effet de l'identification de marqueurs sanguins de
la maladie
d'Alzheimer, et permet donc une détection de cette pathologie sans biopsie
tissulaire, mais
uniquement à partir de prélèvements sanguins.
L'échantillon peut être obtenu par toute technique connue en soi, par exemple
par
prélèvement, par des techniques non invasives, à partir de collections ou
banques
d'échantillons, etc. L'échantillon peut par ailleurs être pré-traité pour
faciliter l'accessibilité
des molécules cibles, par exemple par lyse (mécanique, chimique, enzymatique,
etc.),
purification, centrifugation, séparation, etc. L'échantillon peut également
être marqué, pour
faciliter la détermination de la présence des molécules cibles (marquage
fluorescent,
radioactif, luminescent, chimique, enzymatique, etc.).
Dans un mode de mise en ceuvre préféré, l'échantillon biologique est un
échantillon de sang
total, c'est-à-dire n'ayant pas subi d'étape de séparation, qui peut être
éventuellement dilué.
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De préférence, la méthode comprend la détermination combinée de la présence,
absence ou
quantité de 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 molécules cibles telles que définies
ci-dessus.
Un autre objet particulier de la présente demande concerne une méthode pour
détecter la
présence, l'évolution ou le risque de développer la maladie d'Alzheimer chez
un sujet
humain, comprenant la mise en contact d'un échantillon biologique du sujet
contenant des
acides nucléiques avec un produit comprenant un support sur lequel sont
immobilisés des
acides nucléiques comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un
ou, de
préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que définis précédemment et la
détermination du
profil d'hybridation, le profil indiquant la présence, le stade ou le risque
de développer la
maladie d'Alzheimer chez ledit sujet humain. De préférence, le produit
comprend des
acides nucléiques distincts comprenant une séquence complémentaire et/ou
spécifique d'au
moins 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus gènes ou ARNs différents tels que
mentionnés ci-
dessus.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un
support sur
lequel sont immobilisés des acides nucléiques comprenant une séquence
complémentaire
et/ou spécifique d'un ou, de préférence, plusieurs gènes ou ARN tels que
définis
précédemment. De préférence, le produit comprend des acides nucléiques
distincts
comprenant une séquence complémentaire et/ou spécifique d'au moins 5, 10, 20,
30, 40, 50,
60 ou plus gènes ou ARN tels que définis précédemment.
Un autre objet de la présente demande concerne un produit comprenant un
support sur
lequel est immobilisé au moins un ligand d'un polypeptide codé par un gène ou
un ARN tel
que défini ci-dessus. De préférence, le produit comprend au moins 5, 10, 20,
30, 40, 50, 60
ou plus ligands de polypeptides différents choisis parmi les polypeptides
mentionnés ci-
dessus.
Le support peut être tout support solide ou semi-solide présentant au moins
une surface,
plane ou non (c'est-à-dire en 2 ou 3 dimensions), permettant l'immobilisation
d'acides
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nucléiques ou de polypeptides. De tels supports sont par exemple une lame,
bille,
membrane, filtre, colonne, plaque, etc. Ils peuvent être réalisés en tout
matériau compatible,
comme notamment du verre, silice, plastique, fibre, métal, polymère,
polystyrène, téflon,
etc. Les réactifs peuvent être immobilisés sur la surface du support par des
techniques
connues, ou, dans le cas des acides nucléiques, synthétisés directement in
situ sur le
support. Des techniques d'immobilisation incluent l'adsorption passive (Inouye
et al., J.
Clin. Microbiol. 28 (1990) 1469), la liaison covalente. Des techniques sont
décrites par
exemple dans W090/03382, W099/46403. Les réactifs immobilisés sur le support
peuvent
être ordonnés selon un schéma pré-établi, pour faciliter la détection et
l'identification des
complexes formés, et selon une densité variable et adaptable.
Dans un mode de mise en oeuvre, le produit de l'invention comprend un
pluralité
d'oligonucléotides synthétiques, d'une longueur comprise entre 5 et 100 bases,
spécifiques
d'un ou plusieurs gènes ou ARNs tels que définis précédemment.
Les produits de l'invention comprennent typiquement des molécules contrôle,
permettant
d'étalonner et/ou normaliser les résultats.
Un autre objet de la présente demande concerne un kit comprenant un
compartiment ou
conteneur comprenant au moins un, de préférence plusieurs, acides nucléiques
comprenant
une séquence complémentaire et/ou spécifique d'un ou plusieurs gènes ou ARNs
tels que
définis précédemment et/ou un, de préférence plusieurs ligands d'un ou
plusieurs
polypeptides tels que définis précédemment. De préférence, le produit comprend
au moins
5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ou plus acides nucléiques et/ou ligands différents
choisis parmi les
acides nucléiques et ligands mentionnés ci-dessus. Le kit peut comprendre par
ailleurs des
réactifs pour une réaction d'hybridation ou immunologique, ainsi que, le cas
échéant, des
contrôles et/ou instructions.
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Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un produit ou kit tel
que défini ci-
dessus pour la détection de la maladie d'Alzheimer chez un sujet mammifere, de
préférence
un sujet humain.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la
lecture des exemples
qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Exemple 1: Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer liés
au
rythme circadien
Une analyse génétique a été réalisée à partir d'ARN extraits de sang de
patients atteints de
la maladie d'Alzheimer et présentant différents degrés d'évolution de la
maladie, d'une part,
et d'ARN préparés à partir de sang d'individus sains contrôles, présentant une
moyenne
d'âge identique à celle des individus malades, d'autre part.
Les signatures ainsi obtenues ont été analysées par des techniques
bioinformatiques et ont
permis d'identifier les bases moléculaires de phénomènes dérégulés dans la
maladie
d'Alzheimer.
Ainsi il a été identifié une signature qui dérive de l'ARNm codant pour BMALI
et qui
correspond aux nucléotides 128 à 247 de la séquence Genbank AB000816. BMAL1
code ,
tout comme le gène CLOCK, un facteur de transcription de la famille basic
helix-loop-
helix (bHLH) -PAS domain containing transcription factors . Les produits de
BMAL1 et
de CLOCK forment un complexe transcriptionnel impliqué dans la régulation de
l'horloge
interne, de la régulation des rythmes circadiens. Par conséquent, la présente
invention
décrit, pour la première fois une dérégulation du rythme circadien des
cellules sanguines
chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Le système circadien
chez les
mammifères implique des oscillateurs centraux et périphériques. Il a été
montré une
dominance hiérarchique entre le système circadien du système nerveux central
et celui des
tissus périphériques. Ainsi, le système central assure le synchronisme
périphérique. La zone
du cerveau qui contrôle cette horloge interne centrale est altérée au cours de
la maladie
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d'Alzheimer et la présente invention documente pour la première fois une
répercussion au
niveau des cellules sanguines d'une dérégulation de l'horloge interne. Le
Tableau 1 ci-
dessous donne une liste de gènes régulés selon le rythme circadien, qui
constituent des
cibles au sens de la présente invention.
Tableau 1
...............................
BMAL1 ?>
----
CLOCK
00007 Arylalkylamine N
acetyltransferase 17q25
- -------- -
00009 Aryl hydrocarbon receptor nuclear
translocator-like 11p15 NM 001178
..............................
...............................................................................
.;................................ ...........................
00011 Casein kinase 1, gamma 2 19p13.3 P_ 'VI
f 1}
--------
Eukaryotic translation initiation
00012 factor 1A, X-linked Xp22.12 f"v v? 001 4 12
00014 DnaJ (Hsp4O) homolog, subfamily
A, member 1 9p13-p12 0:~3195
..............................
...............................................................................
.>................................ ...........................
00017 Casein kinase 1, alpha 1 5q32 ü01892
-
00018 Casein kinase 1, epsilon 22q13.1 P<',` s:M
..............................>................................................
.............................. ............................... . ..........
................. .
00021 Karyopherin (importin) beta 1 17q21.32 N M 002265;
..,
00022 Microtubule-associated protein 4 3p2l s
................................
......................................................................;........
..........................:................................
Myosin, heavy polypeptide 3,
00024 skeletal muscle, embryonic 17p13.1 NM 002470
00025 Neuronal PAS domain protein 2 2q11.2 ~"~ -~!_L~1 ~
00026 Ornithine decarboxylase 1 2p25
.. .. .. ..
........;......................................................................
..........
.7.p.1. 3:.1 _
. ......
1
00027 Period homolog 1 (Drosophila)
17p12 Cs~~-~1
..............................>................................................
................................................................ .
............................
00028 Phosphomannomutase 1 22q13.2 L il.' O0 26 7:6
---------------------------
00029 Proteasome (prosome,
macropain) subunit, alpha type, 4 15q25.1 ï:`1
---------------------------- -
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .; . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
00031 Spectrin, alpha, erythrocytic 1
(elliptocytosis 2) 1q21 "v`; Oü3126
.......................................
..............................
Signal transducer and activator of
00032 transcription 5A 17q11.2 ` l~ _'> `F12 00034 SMT3 suppressor of m if two
3
homolog 1 (yeast) 2q33 NM 003352
............................... .. .. .
............................................................,..................
.................>..............................,
00038 Basic helix-loop-helix domain
containing, class B, 2 3p26 L ;:;k;;,:~' :3
.. .. .. . . ..
.......................................................;.......................
...........:...............................
00039 Timeless homolog (Drosophila) 12q12-q13 i920
00040 Cryptochrome 1 (photolyase-like) 12q23-q24.1 ~f Q I'J-1ts75
Succinate dehydrogenase
00043 complex, subunit A, flavoprotein
(Fp) 5p15 N M 004 68:
00044 Runt-related transcription factor 2 6p2l 1="v;v?
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00045 Casein kinase 1, gamma 3 5q23 NM 004384
..............................
...............................................................................
.;................................
00047 Clock homolog (mouse) 4q12 -- 00 5 8
---- -
00051 V-ets erythroblastosis virus E26
oncogene homolog 2 (avian) 21q22.3
---------
00053 Protein phosphatase 1, regulatory
(inhibitor) subunit 3C 10q23 q24 0~"5
.. ..
...............................................................................
.........;..................................:...............................:
00054 Nuclear receptor coactivator 4 10q11.2 Ci-:-'.> 137
00057 Melatonin receptor 1A 4q35.1 i)û~>95:3
..............................: .. ..
...............................................................................
.....................................................
Tumor necrosis factor, alpha-
00060
induced protein 2 14q32
00062 UDP-glucose pyrophosphorylase
2 2p14-p13 M'
,` tsûs
...............................;...............
............................................................
.............................. ............................
00063 Quaking homolog, KH domain
RNA binding (mouse) 6q26-27 ~~,__î! `_~~~ i
00064 Splicing factor 3a, subunit 3,
6îVI
.............................:..................................O.kD
.a.................................:..........~. P34.3 .......... f_~
00066 RNA binding protein with multiple
splicing 8p12-p11 (~~,~ 006867
00067 RAR-related orphan receptor B 9q22 P<0 . 1 1
........ ......... ......... ......... ........
00068 SMT3 suppressor of mif two 3
homolog 3 (yeast) 21q22.3 ~â~,__Ç?:Mg3F
00070 Chromobox homolog 3 (HP1
gamma homolog, Drosophila) 7p15.2 N ;v; C~~~î'2-i6
................................ .. . . . .. ..
......................................................;........................
...................W ..................
Upstream binding transcription
00072
factor, RNA polymerase l 17q21.3 N,1.' î; 4 2"~3
.............................. .....................................
00079 WD repeat domain 50 17q21.33 ,'V;
- -
00080 Zinc finger RNA binding protein 5p13.3 C~" >~7
.. .. .. .
.........;.....................................................................
... ......:
00081 Period homolog 3 (Drosophila) 1 p36.23 N 1~.' ;:; ~:ae=:~1
----------------------------
00082 Plexin A3 Xq28 Iw;w" 014
................................ .. . .. . .. . . .. . . . . . .
..........................................;..................................:.
.............................,
5-hydroxytryptamine (serotonin)
00083 receptor 7 (adenylate cyclase-
coupled) 10q21-q24 0"9 8 59
...............................;...................
...............................................................................
.................: - --- ..
00084 Aryl hydrocarbon receptor nuclear 12p12.2-
translocator-like 2 p11.2 NM..~i~~'~~
00085 Cryptochrome 2(photolyase-like) 1 1 p 1 1 . 2 0 2~ 17
..............................;................................
...............................................................................
..................................
Nuclear receptor subfamily 1,
00086
group D, member 1 17q11.2 ~~'v` 021 7 2~~
- --
00087 Casein kinase 1, gamma 1 15q22.1
q22.31 8
..............................;................................................
...............................: ............................... .
............................ .
00088 Period homolog 2 (Drosophila) 2q37.3 I:`_ _)''_'' P
- - -
00090 Basic helix loop helix domain 12p11.23
containing, class B, 3 p12.1 f',= ~s ~r ~L .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .> . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .g . . . . . . .p . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . .
.
00092 Zinc fin er rotein 384 I:.~,' 4; :a
---------------- ---------
00094 Casein kinase 1, delta 17q25 1=w;v?
................................ ..........
....................................... ................
.............................. .........................
00102 SMT3 suppressor of mif two 3
homolog 2 (yeast) 17q25.1 N M 006937
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Exemple 2: Identification de marqueurs sériques de la maladie d'Alzheimer
impliqués
dans le phénomène de phagocytose
Une analyse DATAS entre des ARN extraits de patients atteints de la maladie
d'Alzheimer
d'une part et des patients contrôles d'autre part a également permis de
montrer une
altération de l'épissage de gènes impliqués dans le phénomène de phagocytose.
Ce
phénomène, régulé par les cascades de signalisation qui contrôlent de stress
oxydatif, est
représentatif des macrophages et de leur contribution au phénomène d'immunité
innée.
Une diminution des propriétés de phagocytose des macrophages a été rapportée
chez
certains patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Cependant, aucune base
moléculaire
n'a pu être identifiée pour expliquer ce phénomène.
L'analyse DATAS réalisée par les inventeurs a permis d'identifier des
séquences
correspondant aux ARN de la L-Plastin et de la Calnexin. Plus
particulièrement, la
séquence identifiée pour la L-Plastin correspond aux nucléotides 3249-3487 de
la séquence
Genbank NM_002298 et la séquence identifiée pour la Calnexin correspond aux
nucléotides 3764-4007 de la séquence Genbank NM_001746.
La Calnexin est connue par l'homme de métier pour interagir avec la
préséniline 1(PS1),
protéine impliquée dans la maladie d'Alzheimer et dans la production de la
plaque bêta
amyloïde. La Calnexin interagit également avec le récepteur CD14 et est
impliqué dans le
phénomène de phagocytose.
La L-Plastin, dans le phénomène de phagocytose est plus particulièrement
impliquée dans
l'activation du stress oxydatif consécutif à l'internalisation.
Par conséquent, la présente invention fournit pour la première fois des
informations sur
l'origine moléculaire des défauts de phacocytose que présentent les
macrophages de
patients atteints de la maladie d'Alzheimer.
Le Tableau 2 ci-dessous donne une liste de gènes impliqués dans les mécanismes
de la
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phagocytose et du stress oxydatif, qui constituent des cibles au sens de la
présente
invention.
Tableau 2
L-Plastin - Genbank NM 002298
Calnexin - Genbank NM 001746
Homo sapiens CD 14 molecule (CD 14), transcript variant 1, mRNA.
ACCESSION NM000591
Homo sapiens CD14 molecule (CD 14), transcript variant 2, mRNA.
ACCESSION NM001040021
Homo sapiens toll-like receptor 4 (TLR4), mRNA.
ACCESSION NM138554
Homo sapiens toll-like receptor 2 (TLR2), mRNA.
ACCESSION NM_003264
Homo sapiens toll-like receptor 7 (TLR7), mRNA.
ACCESSION NM016562
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript
variant 2, mRNA.
ACCESSION NM003467
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) receptor 4 (CXCR4), transcript
variant 1, mRNA.
ACCESSION NM001008540
Homo sapiens interferon, gamma (IFNG), mRNA.
ACCESSION NM_000619
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Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA.
ACCESSION NM_002090
Homo sapiens interferon, beta 1, fibroblast (IFNB1), mRNA.
ACCESSION NM002176
Homo sapiens interferon regulatory factor 3 (IRF3), mRNA.
ACCESSION NM001571
Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho
family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), transcript variant
Rac 1 c, mRNA.
ACCESSION NM198829
Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho
family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), transcript variant
Rac 1, mRNA.
ACCESSION NM006908
Homo sapiens ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (rho
family, small GTP binding protein Racl) (RAC1), transcript variant
Raclb, mRNA.
ACCESSION NM018890
Homo sapiens lipopolysaccharide binding protein (LBP), mRNA.
ACCESSION NM004139
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1(IL1RL1), transcript
variant 2, mRNA.
ACCESSION NM003856
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 1(IL1RL1), transcript
variant 1, mRNA.
ACCESSION NM016232
Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant B,
mRNA.
ACCESSION NM138688
Homo sapiens toll-like receptor 9 (TLR9), transcript variant A,
mRNA.
ACCESSION NM_017442
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Homo sapiens NADPH oxidase 4 (NOX4), mRNA.
ACCESSION NM016931
Homo sapiens interleukin 6 (interferon, beta 2) (IL6), mRNA.
ACCESSION NM_000600
Homo sapiens macrophage migration inhibitory factor
(glycosylation-inhibiting factor) (MIF), mRNA.
ACCESSION NM002415
Homo sapiens ras homolog gene family, member A (RHOA), mRNA.
ACCESSION NM001664
Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gene
enhancer in B-cells 1(p105) (NFKB1), mRNA.
ACCESSION NM_003998
Homo sapiens interleukin 1, beta (IL1B), mRNA.
ACCESSION NM000576
Homo sapiens interferon, alpha 1(IFNA1), mRNA.
ACCESSION NM024013
Homo sapiens nuclear factor of kappa light polypeptide gene
enhancer in B-cells inhibitor, alpha (NFKBIA), mRNA.
ACCESSION NM020529
Homo sapiens interleukin 4(IL4), transcript variant 2, mRNA.
ACCESSION NM172348
Homo sapiens interleukin 4(IL4), transcript variant 1, mRNA.
ACCESSION NM000589
Homo sapiens PRotein Associated with Tlr4 (MGC40499), mRNA.
ACCESSION NM152755
Homo sapiens toll-like receptor 3 (TLR3), mRNA.
ACCESSION NM003265
Homo sapiens toll-like receptor 5 (TLR5), mRNA.
ACCESSION NM003268
CA 02652258 2008-11-14
WO 2007/132120 PCT/FR2007/051263
Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 1
(ILIR.APL1), mRNA.
ACCESSION NM014271
5
Homo sapiens toll-like receptor 1(TLRl), mRNA.
ACCESSION NM_003263
Homo sapiens interleukin 1 receptor-like 2(IL1RL2), mRNA.
10 ACCESSION NM_003854
Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL10), mRNA.
ACCESSION NM001565
15 Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAKl),
transcript variant 3, mRNA.
ACCESSION NM001025243
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAKl),
20 transcript variant 2, mRNA.
ACCESSION NM001025242
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 1(IRAKl),
transcript variant 1, mRNA.
25 ACCESSION NM001569
Homo sapiens toll-like receptor adaptor molecule 2 (TICAM2), mRNA.
ACCESSION NM021649
Homo sapiens toll interacting protein (TOLLIP), mRNA.
ACCESSION NM019009
Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 2,
mRNA.
ACCESSION NM138636
Homo sapiens toll-like receptor 8 (TLR8), transcript variant 1,
mRNA.
ACCESSION NM016610
Homo sapiens interleukin 1 receptor accessory protein-like 2
CA 02652258 2008-11-14
WO 2007/132120 PCT/FR2007/051263
26
(ILIR.APL2), mRNA.
ACCESSION NM017416
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 4 (IRAK4),
mRNA.
ACCESSION NM016123
Homo sapiens toll-like receptor 6 (TLR6), mRNA.
ACCESSION NM_006068
Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLR10), transcript variant 2,
mRNA.
ACCESSION NM001017388
Homo sapiens toll-like receptor 10 (TLR10), transcript variant 1,
mRNA.
ACCESSION NM030956
Homo sapiens interleukin-1 receptor-associated kinase 2 (IRAK2),
mRNA.
ACCESSION NM001570
Homo sapiens myeloid differentiation primary response gene (88)
(MYD88), mRNA.
ACCESSION NM002468
Homo sapiens CD55 molecule, decay accelerating factor for
complement (Cromer blood group) (CD55), mRNA.
ACCESSION NM000574
