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Modulateurs de SC4MOL dans le traitement de l'acné ou de l'hyperséborrhée
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs
de la C-4
méthyl stérol oxydase, pour le traitement de l'acné, ainsi que des désordres
cutanés
associés à une hyperséborrhée. Elle concerne aussi des méthodes de diagnostic
in
vitro ou pronostic in vitro de ces pathologies.
Une peau grasse hyperséborrhéique est caractérisée par une sécrétion et une
excrétion exagérées de sébum. Classiquement, un taux de sébum supérieur à
200 g/cmZ mesuré au niveau du front est considéré comme caractéristique d'une
peau grasse. Une peau grasse est souvent associée à un défaut de desquamation,
un teint luisant, un grain de peau épais. En plus de ces désordres
esthétiques,
l'excès de sébum peut servir de support au développement anarchique de la
flore
bactérienne saprophyte (P. acnes en particulier), et provoquer l'apparition de
comédons et/ou de lésions acnéiques.
Cette stimulation de la production de glandes sébacées est induite par les
androgènes. L'acné est, de fait, une maladie chronique du follicule pilosébacé
sous
dépendance hormonale. Une thérapie hormonale contre l'acné est une possibilité
de
traitement pour les femmes, le but étant de s'opposer aux effets des
androgènes sur
la glande sébacée. Dans ce cadre on utilise généralement des oestrogènes, des
anti-
androgènes, ou des agents diminuant la production d'androgènes par les ovaires
ou
la glande surrénale. Les anti-androgènes utilisés pour le traitement de l'acné
incluent
notamment la spironolactone, l'acétate de cyprotérone, et le flutamide.
Cependant
ces agents présentent des effets secondaires potentiellement sévères. Ainsi,
toute
grossesse doit être absolument empêchée, du fait notamment d'un risque de
féminisation pour le foetus mâle. Ces agents sont prohibés chez les patients
masculins.
Il existe donc un besoin d'identifier des médiateurs en aval de l'action des
hormones
stéroïdes, et de les moduler, pour obtenir un profil thérapeutique similaire,
mais avec
des effets secondaires réduits.
Les inventeurs ont maintenant trouvé que le gène codant pour la C-4 méthyl
stérol
oxydase était exprimé dans les glandes sébacées humaines, et que son
expression
était régulée par les androgènes, in vivo, dans un modèle de glande sébacée de
souris. Ils proposent dès lors de cibler ce gène ou son produit d'expression
l'enzyme
C-4 méthyl stérol oxydase, pour prévenir ou améliorer les phénomènes d'acné,
ainsi
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que tout désordre cutané associé à une hyperséborrhée, notamment l'aspect de
peau grasse.
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés
vulgaires, comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata,
ou
encore les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou
professionnelle.
SC4mol
La C-4 méthyl stérol oxydase (ou "SC4mol") catalyse la première des trois
étapes
enzymatiques d'élimination des deux groupes méthyles C-4 de la 4,4-
diméthylzymostérol conduisant à la formation de cholestérol chez l'animal. Des
changements dans l'activité de cette enzyme résultent dans des modifications
du
métabolisme lipidique, incluant l'accumulation des acides gras, des
triglycérides, des
méthyl stérols, et autres précurseurs de stérols (Li and Kaplan (1996) J.
Biol. Chem.
271:16927-16933).
Dans le contexte de l'invention, le terme gène SC4mol ou acide nucléique
SC4mol signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la C-
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méthyl stérol oxydase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou
son
produit d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules
exprimant
une C-4 méthyl stérol oxydase hétérologue, par intégration génomique ou
expression
transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme.
Une séquence d'ADNc humain de SC4mol est reproduite en annexe (SEQ ID No.1).
Il s'agit de la séquence NM006745 dont la partie codante se situe de l'acide
nucléique 131 à 1012.
Applications diagnostiques
Un objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou de
suivi de
l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une
hyperséborrhée chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression ou de
l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase (SC4mol), de l'expression
de son
gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, dans un échantillon
biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
L'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de cette
protéine
SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode,
notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la quantité d'ARNm
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correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de
l'activité
de SC4mol peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain .
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre
cutané lié a une hyperséborrhée, le sujet contrôle fait référence au même
sujet à
un temps différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To).
Cette
mesure de la différence de l'expression ou d'activité de la protéine SC4mol,
de
l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs,
permet
notamment de suivre l'efficacité d'un traitement, notamment un traitement par
un
modulateur de la SC4mol, tel qu'envisagé plus haut ou par un autre traitement
contre
l'acné ou un désordre cutané associé à une hyperséborrhée. Un tel suivi peut
conforter le patient quant au bien fondé, ou à la nécessité, de poursuivre ce
traitement.
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de
détermination d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions
acnéiques ou
un désordre cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la comparaison de
l'expression ou de l'activité de la protéine C-4 méthyl stérol oxydase
(SC4mol), de
l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs,
dans un
échantillon biologique d'un sujet par rapport à un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine peut être déterminée par un dosage de
la
protéine SC4mol par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre
méthode, notamment pour mesurer l'expression du gène, est de mesurer la
quantité
d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage
de
l'activité de SC4mol peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble
cutané lié
à une hyperséborrhée ou un acné. Le sujet contrôle , dans cette méthode,
signifie
un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette
susceptibilité
permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance
accrue des
signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une hyperséborrhée.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon
biologique testé
peut être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon
d'une
biopsie. De préférence l'échantillon peut être néanmoins une préparation de
cellules
de la peau, obtenues par exemple par desquamation ou biopsie. Il peut
également
s'agir de sébum.
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Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés
candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou de tout
désordre
cutané associé à une hyperséborrhée, comprenant la détermination de la
capacité
d'un composé à moduler l'expression ou l'activité de la C-4 méthyl stérol
oxydase ou
l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite
modulation indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou
curatif de
l'acné ou des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée. La méthode
permet donc de sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou
l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase, ou l'expression de son gène, ou
l'activité
d'au moins un de ses promoteurs.
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage
de
composés candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné et/ou
des
désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, comprenant les étapes
suivantes
a. préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges
réactionnels ;
b. mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels
avec un ou plusieurs des composés à tester ;
c. mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de
l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses
promoteurs, dans les échantillons biologiques ou mélanges
réactionnels ;
d. sélection des composés pour lesquels une modulation de
l'expression ou de l'activité de la protéine SC4mol, de l'expression
de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, est
mesurée dans l'échantillon ou le mélange traité en b), par rapport à
l'échantillon ou au mélange non traité.
Par modulation , on entend tout effet sur le niveau d'expression ou
d'activité de
l'enzyme, de l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses
promoteurs, à savoir éventuellement une stimulation, mais de préférence une
inhibition, partielle ou complète.
Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence
l'expression
ou l'activité de la protéine SC4mol, l'expression de son gène ou l'activité
d'au moins
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un de ses promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé
par
rapport à un contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à
partir de
25% ou plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement,
par
expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine ;
Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ;
Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à
déclencher
la transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc
indirectement la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine
naturelle ou
avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de
composés
chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non
caractérisés,
ou d'un mélange de composés.
Différents techniques peuvent être mises en oeuvre pour tester ces composés et
identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression
ou de
l'activité de la C-4 méthyl stérol oxydase.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules
transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie
du
promoteur du gène SC4mol, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer
l'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un
substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT
(chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta
glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP
(Green Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codé par le gène
rapporteur,
ou de son activité, est réalisé classiquement, par des techniques
colorimétriques,
fluorométriques, ou de chimioluminescence, entre autres.
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Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules exprimant le gène codant pour la C-4 méthyl stérol oxydase, et
l'étape c)
décrite ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule
exprimant le
gène SC4mol de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une
cellule ovarienne, ou encore mieux un sébocyte. On peut également utiliser des
organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande préputiale,
clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
Il peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique
hétérologue, codant pour une C-4 méthyl stérol oxydase, de préférence humaine,
ou
de mammifère.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que
par
exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293 L'acide nucléique peut être
transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de
l'homme du
métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus,
électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène de la C-4 méthyl stérol oxydase peut
être
déterminée en mesurant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de
traduction.
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm
correspondant
produite. Par taux de traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine
correspondante produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection
quantitative
ou semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur
l'hybridation de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les
plus
usuelles (Northern Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être
avantageux
d'utiliser des marqueurs de détection, tels que des agents fluorescents,
radioactifs,
enzymatiques or autres ligands (par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel
ou par
protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un
ARNm
connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une
hybridation
spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué
(radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un
ARNm
connu dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A)
du
tissu où la séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des
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conditions d'hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides
ARN:ARN
entre l'ARNm recherché et la sonde antisens. Le milieu hybridé est alors
incubé avec
un mélange de ribonucléases spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte
que
seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion. Le
produit
de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d'être analysé par
électrophorèse. Les ARN hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique
du
produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type
polyclonal
ou monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un
anticorps
polyclonal anti - C-4 méthyl stérol oxydase peut, entre autres, être obtenu
par
immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de l'enzyme
entière.
L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de
l'homme
du métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la
méthode
classique de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)).
D'autres
méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On
peut, par exemple, produire des anticorps monoclonaux par expression d'un
acide
nucléique clone à partir d'un hybridome. On peut également produire des
anticorps
par la technique d'expression sur phage ("phage display"), en introduisant des
ADNc
d'anticorps dans des vecteurs, qui sont typiquement des phages filamenteux qui
présentent des banques de gènes V à la surface du phage (par exemple fUSE5
pour
E.coli).
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase
homogène;
en un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à
titre d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré,
l'anticorps de
capture est immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre
d'exemples non
limitatifs de phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques
de
polystyrène, ou des particules ou des billes solides, des billes
paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de
détection
peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-
anticorps formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des
protéines isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro
et in
vivo) peut être réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette
identification
est rendue possible grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides
générée par l'hydrolyse enzymatique des protéines (trypsine en générale). De
façon
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générale, les protéines sont isolées selon les méthodes connues de l'homme du
métier, préalablement à la digestion enzymatique. L'analyse des peptides (sous
forme d'hydrolysat) est effectuée par séparation des peptides par HPLC (nano-
HPLC) basé sur leurs propriétés physico-chimique (phase inverse). La
détermination
de la masse des peptides ainsi séparés est réalisée par ionisation des
peptides et
soit par couplage direct au spectromètre de masse (mode electrospray ESI) soit
après dépôt et cristallisation en présence d'une matrice connue de l'homme de
l'art
(analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite identifiées grâce à
l'utilisation
d'un logiciel approprié (par exemple Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste
à
préparer des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme C-4 méthyl
stérol oxydase, un substrat de l'enzyme et un système réductase (par exemple
du
NADH avec un système générateur de NADH ou du NADPH avec un système
générateur de NADPH), et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer
l'activité
enzymatique.
L'enzyme SC4MOL peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant
les
cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à
l'aide
de microorganismes tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B.
subtilis), des
levures (par exemple Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles
que
Sf9 ou Sf21.
La mesure de l'activité enzymatique comprend de préférence la mesure de la
capacité de couplage de la méthyl stérol oxydase à une décarboxylase.
Des dosages de l'activité enzymatique de la SC4mol sont décrits dans la
littérature
(voir par exemple Miller et al, Biochemistry, 1967, 6 :2673-2678 ; Brady et
al, The
Journal of Biological Chemistry, 1980, 255(22) :10624-10629 ; Fukushima et al,
The
Journal of Biological Chemistry, 1981, 256(10) :4822-4826 ;).
Le mélange réactionnel peut par exemple comprendre la mise en réaction de
microsomes lavés qui apportent la SC4mol et la décarboxylase endogène, (1 à
2mg),
avec 0,5mM NAD+ ou 0,1mM NADH avec un générateur de NADH ou 0,1mM
NADPH avec un générateur de NADPH. Les systèmes de génération peuvent être
lOmM b-hydroxybutyrate et 0,31 unités/ml de b-hydroxybutyrate déshydrogénase
pour le NADH, et lOmM d'isocitrate avec 0,44 unités/ml d'isocitrate
déshydrogénase
pour le NADPH. Le substrat stérol est par exemple en concentration de 5OmM. II
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peut être marqué au14C , l'activité oxydase étant dosée en recueillant le14C02
libéré
suite au couplage de la réaction d'oxydation (C-4 méthyl stérol oxydase) avec
l'activité décarboxylase également présente dans les microsomes.
Les réactions catalysées par l'enzyme, et qui peuvent être suivies, sont
schématisées ci-après:
4a-formyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-carboxy-5a-cholesta-
8,24-dien-3(3-ol + NAD(P)(+) + H20 ,
4a-hydroxymethyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-formyl-5a-
cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + 2 H20,
4a-methyl zymosterol + NAD(P)H + 02 = 4a-hydroxymethyl-5a-cholesta-8,24-dien-
3R-ol + NAD(P)(+) + H20 ,
4a-formyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-carboxy-4R-
methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + H20,
4a-hydroxymethyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-
formyl-4R-methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + 2 H20 ,
4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,24-dien-3-R-ol + NAD(P)H + 02 = 4a-hydroxymethyl-4R-
methyl-5a-cholesta-8,24-dien-3R-ol + NAD(P)(+) + H20
Modulateurs de l'enzyme
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme
humaine
C-4 méthyl stérol oxydase susceptible d'être obtenu selon l'une des méthodes
décrites ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement
préventif et/ou curatif de l'acné et/ou des désordres cutanés associés à une
hyperséborrhée.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de
l'acné, ou
des désordres cutanés associés à une hyperséborrhée, méthode comprenant
l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de
l'enzyme humaine C-4 méthyl stérol oxydase, à un patient nécessitant un tel
traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme
humaine
C-4 méthyl stérol oxydase, pour le traitement esthétique des peaux grasses.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le
terme
inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou
réduit substantiellement l'activité enzymatique de la C-4 méthyl stérol
oxydase. Le
terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de
préférence
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d'au moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus
préférée
d'au moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui
interagit avec, et bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés
de
type inhibiteur compétitif.
Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations
en
inhibiteur de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence
encore
moins de 0,01 M.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti- C-4 méthyl
stérol
oxydase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière avantageuse, un tel
anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour obtenir
une
concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de
préférence d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide
antisens d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne
polypeptidique substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la
structure
spatiale mime celle de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
L'invention comprend l'utilisation de composés inhibiteurs de C-4 méthyl
stérol
oxydase, tels que ceux identifiés par la méthode de criblage décrite plus
haut, pour le
traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou tout désordre cutané associé
à une
hyperséborrhée.
Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples
d'inhibiteurs
de la C-4 méthyl stérol oxydase, les composés suivants :
- la 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-
hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-
2,9-dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione
- la (3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9-dimethyl-5-oxa-6-
pentylcyclotridecane-1,4-dione.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique,
en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces
compositions
peuvent être administrées par exemple par voie entérale, parentérale, ou
topique. De
préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par
voie
orale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de
comprimés,
de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres,
de
granules, d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de
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vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par
voie
parentérale, la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de
solutions ou suspensions pour perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement
destinée
au traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme
d'onguents, de crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés,
de
solutions, de gels, de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut
également se
présenter sous forme de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de
vésicules lipidiques ou polymériques ou de patchs polymériques ou d'hydrogels
permettant une libération contrôlée. Cette composition pour application
topique peut
se présenter sous forme anhydre, sous forme aqueuse ou sous la forme d'une
émulsion. Dans une variante préférée, la composition pharmaceutique se
présente
sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de la C4-méthyl stérol
oxydase allant de 0,001 à 10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par
rapport au poids total de la composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou
des
combinaisons de ces additifs, tels que :
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide
parahydroxybenzoïque;
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou
le
butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, I'Ubiquinol ou certains
chelatants
de métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la
portée.
Légende des figures :
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Les Figures 1A, 1 B et 1 C montrent l'expression de la SC4MOL dans la glande
sébacée de la peau de souris et dans la glande préputiale de souris par
hybridation
in situ. La Figure 1A est une photographie d'une coupe de peau de souris
soumise à
une hybridation in situ utilisant une sonde sens de SC4MOL (contrôle négatif;
animal
53, gonadectomisé). La Figure 1 B est une photographie d'une coupe de peau de
souris soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un
animal
intact (animal 44). La Figure 1 C est une photographie d'une coupe de peau de
souris
soumise à une hybridation in situ avec une sonde antisens, dans un animal
gonadectomisé (animal 53).
Les Figures 2A, 2B et 2C montrent l'expression de SC4MOL dans la glande
préputiale de souris par hybridation in situ. La Figure 2A est une
photographie d'une
coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde
sens de
SC4MOL (contrôle négatif; animal 45). La Figure 2B est une photographie d'une
coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde
antisens, dans un animal intact (animal 45). La Figure 2C est une photographie
d'une
coupe de prépuce de souris soumis à une hybridation in situ avec une sonde
antisens, dans un animal gonadectomisé (animal 52).
La Figure 3 est un graphe qui montre la mesure de l'expression du gène SC4MOL
chez des souris mâles gonadectomisées. Des souris mâles ont été
gonadectomisées
et ensuite étaient traitées avec le véhicule, le DHT, le DHEA ou la
combinaison de
DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une fois par jour (traitement
long
terme). A la fin de l'expérience les glandes préputiales ont été enlevées,
l'ARN a été
isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique Affymetrix.
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste
du
récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone
(précurseur des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales il est
métabolisé en androgène actif)
DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de
Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes;
qui
bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression: niveau d'expression de l'ARNm
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Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de l'enzyme SC4MOL dans la glande sébacée humaine
et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par
traitement à la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des
échantillons
d'ARN totaux ont été préparés à partir des glandes sébacées et à partir de
l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module
microfluidique; four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les
protocoles
fournis par la société. En bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en
ADNc. A
partir d'ADNc double brin, on synthétise un ARNc marqué à la biotine en
utilisant la
polymérase T7 et un précurseur NTP conjugué à la biotine. Les ARNc sont
ensuite
fragmentés en fragments de petites tailles. Toutes les étapes de biologie
moléculaire
sont contrôlées en utilisant le système Lab on a chip d'Agilent pour
confirmer la
bonne efficacité des réactions enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée
avec
l'ARNc biotinylé, rincée et ensuite marquée par fluorescence en utilisant un
fluorophore conjugué à la Streptavidine. Après des lavages la puce est scannée
et
les résultats sont calculés en utilisant le logiciel MAS5 fourni par
Affymetrix. On
obtient une valeur d'expression pour chaque gène ainsi que l'indication de la
significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la significativité de
l'expression est
basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à l'hybridation de
l'ARNc d'un
gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement ( perfect match )
versus un oligonucléotide qui contient une mutation,( single mismatch ) dans
la
région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1).
Tableau 1: mesure de l'expression de SC4MOL dans l'épiderme et dans la glande
sébacée humaine par utilisation de la technologie des puces Affymetrix.
Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité
Affymetrix gène dans la dans de de
glande l'épiderme l'expression* l'expression*
sébacée humain dans la dans
humaine glande l'épiderme
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sébacée humain
humaine
209146at La C-4 1023 348 1 1
méthyl
stérol
oxydase
*Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans
l'échantillon
indiqué : présence (=1) ou absence (=0).
Résultats:
L'enzyme SC4MOL est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée,
épiderme). L'analyse différentielle entre l'expression dans la glande sébacée
humaine et l'épiderme humain montre que l'expression est significativement
plus
forte dans la glande sébacée par rapport à l'épiderme.
Exemple 2: Expression de SC4MOL dans la glande sébacée de la peau de
souris par hybridation in situ
Méthodes :
Des sondes sens et antisens ont été préparées à partir du gène SC4MOL par
incubation du gène linéarisé (2pg) avec 63pCi de [35S] UTP (1250 Ci/mmol ;
NEN,
Massachusetts, USA) en présence de l'ARN polymérase T7 ou T3. L'hybridation in
situ a été réalisée sur un tissu de souris fixé au formaldéhyde et enveloppé
dans de
la paraffine. Des sections (4pm de large) ont ensuite été déparaffinées dans
du
toluène et réhydratées dans un gradient d'alcool. Après séchage, les
différentes
sections ont été incubées dans un tampon de préhybridation pendant deux
heures.
L'hybridation s'est déroulée sur la nuit dans un tampon d'hybridation (tampon
de
préhybridation avec 10mM DTT et 2X106 cpm ARN/pl 35Smarqué) à 53 C. L'excès de
sonde a été éliminé et les coupes ont été inclinées dans une émulsion LM1
(Amersham Biosciences, UK) et exposées dans le noir à 4 C pendant au moins un
mois. Les coupes ont alors été développées et contre colorées avec de
l'hématoxyline et de l'éosine. L'hybridation avec la sonde sens a été utilisée
comme
témoin négatif et on a uniquement détecté le bruit de fond. Ces sondes ont été
incubées avec des coupes histologiques de la peau de souris ou de la glande
préputiale de souris. Suite à l'incubation en présence d'une émulsion
photographique, les structures histologiques marquées de façon radioactive par
la
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sonde sont révélées (accumulation de grains argentés). Un signal spécifique se
manifeste par un marquage positif avec la sonde antisense (Figure 1B et Figure
1C)
et l'absence de marquage avec la sonde sens (Figure 1A) utilisé comme contrôle
négatif.
R ES U LTATS :
On observe sur la Figure 1A qu'il n'y a pas d'accumulation de grains argentés
(pas
de marquage) ce qui est en accord avec les attentes des inventeurs car elle
correspond au contrôle négatif. La Figure 1 B montre un très fort marquage de
la
couche basale de la glande sébacée, visible par accumulation de grains
argentés. La
Figure 1 C montre aussi un marquage de la couche basale de la glande sébacée.
SC4MOL est bien exprimée dans les couches basales des glandes sébacées de la
peau de souris. Une analyse fine basée sur l'observation de coupes
histologiques
obtenues pour 4 animaux intacts et 4 animaux gonadectomisés indique une
expression légèrement plus forte dans les glandes sébacées des animaux
intacts.
Exemple 3: Expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris par
hybridation in situ
Méthodes :
Les méthodes utilisées dans cet exemple sont identiques à celles de l'exemple
2.
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type
sébocytaire et
sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée.
R ES U LTATS :
La Figure 2A ne montre pas de marquage au niveau de la glande préputiale ce
qui
est en accord avec les attentes des inventeurs car elle correspond au contrôle
négatif. La Figure 2B montre un fort marquage dans les acini de la glande
préputiale
de souris dans un animal normal. La Figure 2C montre un marquage plus modéré
des acini de la glande préputiale dans un animal gonadéctomisé.
SC4MOL est exprimée dans les acini (Figure 2B) de la glande préputiale de
souris.
Une analyse de plusieurs coupes histologiques provenant de 4 animaux contrôles
et
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4 animaux gonadectomisés indique une expression légèrement plus forte dans les
glandes préputiales des animaux intacts (Figure 2B et 2C).
En résumé, ces résultats d'hybridation in situ indiquent que l'expression de
l'enzyme
SC4MOL diminue dans des conditions caractérisées par un manque de stimulation
androgénique (animaux gonadectomisés).
Exemple 4: Expression de SC4MOL dans la glande préputiale de souris suite à
une stimulation androgénigue
Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type
sébocytaire et
sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une
taille
suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des
technologies de
microdissection.
Les inventeurs ont analysé l'expression de l'enzyme SC4MOL dans les glandes
préputiales de souris dans des conditions de déficience en hormones
stéroïdiennes
(notamment d'hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux
gonadectomisés ont ensuite été traités avec des quantités physiologiques de
Dihydrotestosterone (DHT) ou de Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer
un
niveau physiologique des hormones androgéniques, ou bien comme expérience de
contrôle avec une combinaison de DHEA-Flutamide dans laquelle le Flutamide, un
antagoniste du récepteur aux androgènes, bloque l'effet de la DHEA. La
comparaison de l'expression génique dans ces conditions expérimentales permet
d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non de l'expression génique
d'un
gène en question par les hormones androgéniques.
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix
décrit ci-
dessus.
Résultat: La Figure 3 met en avant l'expression de SC4MOL en fonction du
traitement administré. On observe que l'ARNm de l'enzyme SC4MOL est induit par
un traitement chronique pendant 7 jours aux androgènes dans la glande
préputiale
de souris.
Exemple 5 : Exemples de Compositions
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A- VOIE ORALE
Comprimé de 0,2 g
- 6-((2S)-2-Hydroxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-
2,9-
dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 0,001 g
- Amidon 0,114 g
- Phosphate bicalcique 0,020 g
- Silice 0,020 g
- Lactose 0,030 g
- Talc 0,010 g
- Stéarate de magnésium 0,005 g
B- VOIE TOPIQUE
(a) Onguent
-6-((2S)-2-Hyd roxypentyl)(3S,9R)-2-aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-
2,9-
dimethyl-5-oxacyclotridecane-1,4-dione 0,300 g
- Vaseline blanche codex qsp 100 g
(b) Lotion
- (3S,9R)-2-Aza-3-{[4-(2-hydroxyethoxy)phenyl]methyl}-2,9-dimethyl-5-oxa-6-
pentylcyclotridecane-1,4-dione 0,100 g
- Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g
- Ethanol à 95% 30,000 g
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