Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
1
Modulateurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase dans le traitement
de
l'acné ou de l'hyperkératinisation
L'invention concerne l'identification et l'utilisation de composés modulateurs
de la UDP-
glucose céramide glucosyltransférase pour le traitement de l'acné, ainsi que
des
désordres cutanés associés à une hyperkératinisation. Elle concerne aussi des
méthodes
de diagnostic ou pronostic in vitro de ces pathologies.
L'acné est généralement due à l'implication de trois facteurs
- une production excessive de sébum (l'hyperséborrhée), sous l'effet des
hormones
et de la puberté,
- un épaississement de la peau (l'hyperkératinisation) dont les pores et plus
particulièrement les glandes sébacées se bouchent entraînant la formation des
points noirs et comédons, et
- le développement des bactéries, provoquant une inflammation et l'apparition
des
boutons rouges ou blancs souvent douloureux.
La cornification des kératinocytes est un processus complexe qui implique la
dégradation
d'un grand nombre de composants intracellulaires. Ce processus constitue
l'étape finale
de la différentiation épidermique et est associé à la formation de bicouches
lamellaires
organisées enrichies en céramides, cholestérol et acides gras. La formation
des
céramides est un point clé menant à la formation d'un stratum corneum normal
et
permettant de réguler la fonction barrière de la peau et la desquamation
(Holleran WM et
al., J. Lipid Res., 1994, 35, 905-912). La réduction du taux de céramides du
stratum
corneum et de la fonction barrière est observée chez les patients acnéiques
(Yamamoto A
et al., Arch. Dermatol. Res., 1995, 187, 214-218). II a été montré que
l'application topique
de rétinoïdes ou l'administration orale d'isotrétinoïne augmente le taux de
céramides chez
les patients acnéiques. L'augmentation de céramides est corrélée avec une
diminution
des comédons après traitement avec des rétinoïdes appliqués par voie topique
(Melnic B
et al., Arch. Dermatol. Res., 1988, 280, 97-102 ; Thielnitz A, Br. J.
Dermatol., 2001, 1995,
95, 2903-2909). Les rétinoïdes sont généralement des composés fortement
irritants et
décapants, provoquant des rougeurs au niveau du visage peu esthétiques.
Il existe donc un besoin d'identifier de nouveaux composés actifs, dont le
profil
thérapeutique sera similaire, mais avec des effets secondaires réduits.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
2
La demanderesse a maintenant découvert que le gène codant pour la UDP-glucose
céramide glucosyltransférase (UGCG) était exprimé dans l'épiderme et dans les
glandes
sébacées humaines, et que son expression était régulée par les androgènes, in
vivo,
dans un modèle de glande préputiale de souris. Elle propose dès lors de cibler
le gène
UGCG ou son produit d'expression, pour prévenir et/ou améliorer l'acné et/ou
tout
désordre cutané associé à une hyperkératinisation.
Par acné, on entend toutes les formes d'acné, à savoir notamment les acnés
vulgaires,
comédoniennes, polymorphes, les acnés nodulokystiques, conglobata, ou encore
les
acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou
professionnelle.
La demanderesse propose également des méthodes de diagnostic in vitro ou
pronostic in
vitro, basées sur la détection de l'expression ou de l'activité de UGCG.
UGCG
L'enzyme UGCG désigne la UDP-glucose céramide glucosyltransférase. Cette
enzyme
est impliquée dans le processus de kératinisation. Ce processus constitue la
dernière
étape de la différenciation épidermique, et est associé à la formation d'une
double couche
lamellaire très organisée enrichie en céramides, cholestérols et en acides
gras libres. Ces
lipides sont dérivés du corps lamellaire épidermique, des organites
sécrétoires contenant
des phospholipides, des glucosylcéramides et aussi des enzymes hydrolytiques.
La UDP-
glucose céramide glucosyltransférase est l'enzyme responsable de la formation
de
céramides à partir du pool cellulaire de glucosylcéramides. Il a été démontré
que la
production de céramides est une étape critique permettant la formation de
stratum
corneum normal, et de ce fait régule la barrière perméable et la desquamation
de la peau
(Hollerman WM et aL, J Lipid Res 1994,35:905-912). Un défaut de UDP-glucose
céramide glucosyltransférase provoque des anomalies de la peau décrites chez
les
patients atteints de la maladie de Gaucher. Récemment, un nouveau protocole
thérapeutique a été proposé pour la gestion de la maladie de Gaucher. Cette
approche a
comme but de réduire la biosynthèse de glucosylcéramide en utilisant des
inhibiteurs de
la glucosylcéramide synthase. Un de ces inhibiteurs, le N-
butyldeoxynojirimycin
(Miglustat), a été récemment approuvé par la FDA pour le traitement de la
maladie de
Gaucher. L'effet du traitement avec le miglustat sur l'acné n'a pas été étudié
jusqu'à
présent.
En plus de leurs propriétés structurales, les glycosylcéramides et les
céramides
apparaissent comme régulateurs de la prolifération et de la différenciation
cellulaire. Des
études In vitro ont montré que des changements dans le niveau de
glucosylcéramides
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
3
stimulaient la prolifération kératinocytaire (Uchida Y et al., J lnvest
Dermatol, 1994, 102 :
594a ; Marsh NL et ai, J Clin lnvest, 1995, 95 :2903-2909).
Dans le contexte de l'invention, le terme gène UGCG ou acide nucléique
UGCG
signifie le gène ou la séquence d'acide nucléique qui code pour la UDP-glucose
céramide
glucosyltransférase. Si la cible visée est de préférence le gène humain ou son
produit
d'expression, l'invention peut également faire appel à des cellules exprimant
une UDP-
glucose céramide glucosyltransférase hétérologue, par intégration génomique ou
expression transitoire d'un acide nucléique exogène codant pour l'enzyme.
Une séquence d'ADNc humain de UGCG est reproduite en annexe (SEQ ID No.1). Il
s'agit de la séquence NM003358.1 dont la partie codante se situe de l'acide
291 à 1475.
Applications diagnostiques
Un autre objet de l'invention concerne une méthode in vitro de diagnostic ou
de suivi de
l'évolution de lésions acnéiques ou d'un désordre cutané associé à une
hyperkératinisation chez un sujet, comprenant la comparaison de l'expression
ou de
l'activité de la protéine UDP glucose céramide glucosyltransférase (UGCG), de
l'expression de son gène ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs,
dans un
échantillon biologique d'un sujet par rapport à un échantillon biologique d'un
sujet
contrôle.
L'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage de cette
protéine
par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre méthode,
notamment
pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité d'ARNm
correspondant, par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage de
l'activité de la
protéine UGCG peut être également envisagé.
Dans le cadre d'un diagnostic, le sujet contrôle est un sujet sain .
Dans le cadre d'un suivi de l'évolution des lésions acnéiques ou d'un désordre
cutané lié
à une hyperkératinisation, le sujet contrôle fait référence au même sujet
à un temps
différent, qui correspond de préférence au début du traitement (To). Cette
mesure de la
différence d'expression ou de l'activité de la protéine UGCG, de l'expression
de son gène
ou de l'activité d'au moins un de ses promoteurs, permet notamment de suivre
l'efficacité
d'un traitement, notamment un traitement par un modulateur de la UGCG, tel
qu'envisagé
plus haut ou par un autre traitement contre l'acné ou un désordre cutané
associé à une
hyperkératinisation. Un tel suivi peut conforter le patient quant au bien
fondé, ou à la
nécessité, de poursuivre ce traitement.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
4
Un autre aspect de la présente invention concerne une méthode in vitro de
détermination
d'une susceptibilité d'un sujet à développer des lésions acnéiques ou un
désordre cutané
associé à une hyperkératinisation, comprenant la comparaison de l'expression
ou de
l'activité de la protéine UGCG, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un
de ses promoteurs, dans un échantillon biologique d'un sujet par rapport à un
échantillon
biologique d'un sujet contrôle.
Là encore, l'expression de la protéine UGCG peut être déterminée par un dosage
de cette
protéine par radioimmunoessai, par exemple par dosage ELISA. Une autre
méthode,
notamment pour mesurer l'expression du gène UGCG, est de mesurer la quantité
d'ARNm correspondant par toute méthode telle que décrit plus haut. Un dosage
de
l'activité de la UGCG peut être également envisagé.
Le sujet testé est ici un sujet asymptomatique, ne présentant aucun trouble
cutané lié à
une hyperkératinisation ou une acné. Le sujet contrôle , dans cette
méthode, signifie
un sujet ou une population de référence saine . La détection de cette
susceptibilité
permet la mise en place d'un traitement préventif et/ou d'une surveillance
accrue des
signes liés à l'acné ou à un désordre cutané associé à une
hyperkératinisation.
Dans ces méthodes de diagnostic ou pronostic in vitro, l'échantillon
biologique testé peut
être n'importe quel échantillon de liquide biologique ou un échantillon d'une
biopsie. De
préférence l'échantillon peut être une préparation de cellules de la peau,
obtenues par
exemple par desquamation ou biopsie. Il peut également s'agir de sébum.
Méthodes de criblage
Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de criblage de composés
candidats
pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés
associés à
une hyperkératinisation, comprenant la détermination de la capacité d'un
composé à
moduler l'expression ou l'activité de l'UDP-glucose céramide
glucosyltransférase ou
l'expression de son gène ou l'activité d'au moins un de ses promoteurs, ladite
modulation
indiquant l'utilité du composé pour le traitement préventif ou curatif de
l'acné ou des
désordres cutanés associés à une hyperkératinisation. La méthode permet donc
de
sélectionner les composés capables de moduler l'expression ou l'activité de
l'UDP-
glucose céramide glucosyltransférase, ou l'expression de son gène, ou
l'activité d'au
moins un de ses promoteurs.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode in vitro de criblage
de composés
candidats pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des
désordres cutanés
associés à une hyperkératinisation, comprenant les étapes suivantes :
a) Préparation d'au moins deux échantillons biologiques ou mélanges
5 réactionnels ;
b) Mise en contact d'un des échantillons ou mélanges réactionnels avec un
ou plusieurs des composés à tester ;
c) Mesure de l'expression ou de l'activité de la protéine UDP-glucose
céramide glucosyltransférase, de l'expression de son gène ou de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, dans les échantillons biologiques ou
mélanges réactionnels ;
d) Sélection des composés pour lesquels une modulation de l'expression ou
de l'activité de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, ou une
modulation de l'expression de son gène ou une modulation de l'activité
d'au moins un de ses promoteurs, est mesurée dans l'échantillon ou le
mélange traité en b) par rapport à l'échantillon ou au mélange non traité.
Par modulation , on entend tout effet sur l'expression ou l'activité de
l'enzyme, à savoir
éventuellement une stimulation, mais de préférence une inhibition, partielle
ou complète.
Ainsi, les composés testés à l'étape d) ci-dessus inhibent de préférence
l'expression ou
l'activité de la protéine UGCG, l'expression de son gène ou l'activité d'au
moins un de ses
promoteurs. La différence d'expression obtenue avec le composé testé par
rapport à un
contrôle réalisé en l'absence du composé est significative à partir de 25% ou
plus.
Dans l'ensemble du présent texte, à moins qu'il ne soit spécifié autrement,
par
expression d'une protéine , on entend la quantité de cette protéine
Par activité d'une protéine , on entend son activité biologique ;
Par activité d'un promoteur , on entend la capacité de ce promoteur à
déclencher la
transcription de la séquence d'ADN codée en aval de ce promoteur (et donc
indirectement
la synthèse de la protéine correspondante).
Les composés testés peuvent être de tout type. Ils peuvent être d'origine
naturelle ou
avoir été produits par synthèse chimique. Il peut s'agir d'une banque de
composés
chimiques structurellement définis, de composés ou de substances non
caractérisés, ou
d'un mélange de composés.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
6
Différentes techniques peuvent être mises en ceuvre pour tester ces composés
et
identifier les composés d'intérêt thérapeutique, modulateurs de l'expression
ou de
l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase.
Selon un premier mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules
transfectées avec un gène rapporteur lié de manière opérante à tout ou partie
du
promoteur du gène UGCG, et l'étape c) décrite ci-dessus consiste à mesurer le
niveau
d'expression dudit gène rapporteur.
Le gène rapporteur peut notamment coder pour une enzyme qui, en présence d'un
substrat donné, conduit à la formation de produits colorés, telle que CAT
(chloramphenicol acétyltransférase), GAL (beta galactosidase), ou GUS (beta
glucuronidase). Il peut également s'agir du gène de la luciférase ou de la GFP
(Green
Fluorescent Protein). Le dosage de la protéine codée par le gène rapporteur,
ou de son
activité, est réalisé classiquement, par des techniques colorimétriques,
fluorométriques,
ou de chimioluminescence, entre autres.
Selon un deuxième mode de réalisation, les échantillons biologiques sont des
cellules
exprimant le gène UGCG codant pour l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase,
et
l'étape c) ci-dessus consiste à mesurer l'expression dudit gène.
La cellule utilisée ici peut être de tout type. Il peut s'agir d'une cellule
exprimant le gène
UGCG de manière endogène, comme par exemple une cellule de foie, une cellule
ovarienne, ou encore mieux un kératinocyte ou un sébocyte. On peut également
utiliser
des organes d'origine humaine ou animale, comme par exemple la glande
préputiale,
clitoridienne, ou encore la glande sébacée de la peau.
II peut également s'agir d'une cellule transformée par un acide nucléique
hétérologue,
codant pour une UDP-glucose céramide glucosyltransférase, de préférence
humaine, ou
de mammifère.
Une grande variété de systèmes de cellules hôtes peut être utilisée, telle que
par
exemples les cellules Cos-7, CHO, BHK, 3T3, HEK293. L'acide nucléique peut
être
transfecté de manière stable ou transitoire, par toute méthode connue de
l'homme du
métier, par exemple par phosphate de calcium, DEAE-dextran, liposome, virus,
électroporation, ou microinjection.
Dans ces méthodes, l'expression du gène UGCG ou du gène rapporteur peut être
déterminée en évaluant le taux de transcription dudit gène, ou son taux de
traduction.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
7
Par taux de transcription d'un gène, on entend la quantité d'ARNm produite.
Par taux de
traduction d'un gène, on entend la quantité de protéine produite.
L'homme du métier est familier des techniques permettant la détection
quantitative ou
semi-quantitative de l'ARNm d'un gène d'intérêt. Les techniques basées sur
l'hybridation
de l'ARNm avec des sondes nucléotidiques spécifiques sont les plus usuelles
(Northern
Blot, RT-PCR, protection à la Rnase). Il peut être avantageux d'utiliser des
marqueurs de
détection, tels que des agents fluorescents, radioactifs, enzymatiques or
autres ligands
(par exemple, avidine/biotine).
En particulier, l'expression du gène peut être mesurée par PCR en temps réel
ou par
protection à la RNase. Par protection à la RNase, on entend la détection d'un
ARNm
connu parmi les ARN-poly(A) d'un tissu qui peut se faire à l'aide d'une
hybridation
spécifique avec une sonde marquée. La sonde est un ARN complémentaire marqué
(radioactif) du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d'un
ARNm connu
dont l'ADNc, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. De l'ARN-poly(A) du
tissu où la
séquence est à rechercher est incubé avec cette sonde dans des conditions
d'hybridation
lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides ARN:ARN entre l'ARNm
recherché et la
sonde antisens. Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de
ribonucléases
spécifiques de l'ARN simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés
avec la
sonde peuvent résister à cette digestion. Le produit de digestion est ensuite
déprotéinisé
et repurifié, avant d'être analysé par électrophorèse. Les ARN hybrides
marqués sont
détectés par autoradiographie.
Le taux de traduction du gène est évalué par exemple par dosage immunologique
du
produit dudit gène. Les anticorps utilisés à cet effet peuvent être de type
polyclonal ou
monoclonal. Leur production relève de techniques conventionnelles. Un
anticorps
polyclonal anti-UDP-glucose céramide glucosyltransférase peut, entre autres,
être obtenu
par immunisation d'un animal tel qu'un lapin ou une souris, à l'aide de
l'enzyme entière.
L'antisérum est prélevé puis épuisé selon des méthodes en soi connues de
l'homme du
métier. Un anticorps monoclonal peut, entre autres, être obtenu par la méthode
classique
de Kôhler et Milstein (Nature (London), 256: 495- 497 (1975)). D'autres
méthodes de
préparation d'anticorps monoclonaux sont également connues. On peut, par
exemple,
produire des anticorps monoclonaux par expression d'un acide nucléique clone à
partir
d'un hybridome. On peut également produire des anticorps par la technique
d'expression
sur phage ("phage display"), en introduisant des ADNc d'anticorps dans des
vecteurs, qui
sont typiquement des phages filamenteux qui présentent des banques de gènes V
à la
surface du phage (par exemple fUSE5 pour E.coli).
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
8
Le dosage immunologique peut être réalisé en phase solide ou en phase
homogène; en
un temps ou en deux temps; en méthode sandwich ou en méthode compétitive, à
titre
d'exemples non limitatifs. Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps
de capture est
immobilisé sur une phase solide. On peut utiliser, à titre d'exemples non
limitatifs de
phase solide, des microplaques, en particulier des microplaques de
polystyrène, ou des
particules ou des billes solides, des billes paramagnétiques.
Des dosages ELISA, des radioimmunoessais, ou toute autre technique de
détection
peuvent être mis en oeuvre pour révéler la présence des complexes antigènes-
anticorps
formés.
La caractérisation des complexes antigène/anticorps, et plus généralement des
protéines
isolées ou purifiées mais également recombinantes (obtenues in vitro et in
vivo) peut être
réalisée par analyse en spectrométrie de masse. Cette identification est
rendue possible
grâce à l'analyse (détermination de la masse) des peptides générée par
l'hydrolyse
enzymatique des protéines (trypsine en générale). De façon générale, les
protéines sont
isolées selon les méthodes connues de l'homme du métier, préalablement à la
digestion
enzymatique. L'analyse des peptides (sous forme d'hydrolysat) est effectuée
par
séparation des peptides par HPLC (nano-HPLC) basé sur leurs propriétés physico-
chimiques (phase inverse). La détermination de la masse des peptides ainsi
séparés est
réalisée par ionisation des peptides et soit par couplage direct au
spectromètre de masse
(mode electrospray ESI), soit après dépôt et cristallisation en présence d'une
matrice
connue de l'homme de l'art (analyse en mode MALDI). Les protéines sont ensuite
identifiées grâce à l'utilisation d'un logiciel approprié (par exemple
Mascot).
Selon un troisième mode de réalisation, l'étape a) décrite ci-dessus consiste
à préparer
des mélanges réactionnels comprenant chacun une enzyme UDP-glucose céramide
glucosyltransférase et un substrat de l'enzyme, et l'étape c) décrite ci-
dessus consiste à
mesurer l'activité enzymatique.
L'enzyme peut être produite selon des techniques usuelles en utilisant les
cellules Cos-7,
CHO, BHK, 3T3, HEK293. Elle peut également être produite à l'aide de
microorganismes
tels que des bactéries (par exemple E. coli ou B. subtilis), des levures (par
exemple
Saccharomyces, Pichia) ou des cellules d'insecte, telles que Sf9 ou Sf21.
La détermination de l'activité enzymatique comprend de préférence la
détermination de l'activité
transférase, par extraction des lipides produits et analyse chromatographique.
Des dosages de l'activité enzymatique de la UGCG sont décrits dans la
littérature (voir
par exemple Futerman et al., 1991, Biochem J, 280, 295-302)
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
9
Ainsi l'activité de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase peut être
évaluée de la
manière suivante : des fractions de foie sont incubées avec un complexe
BSA(sérumalbumine bovine)-[14C]hexanoyl-céramide en présence de UDP-glucose ,
puis
on analyse la quantité de [14C]héxanoyl glucose-céramides produits. Les
lipides sont
séparés par chromatographie sur couche mince (TLC) et récupérés de la plaque
par
frottement. La radioactivité est déterminée par mesure de la scintillation
liée à l'incubation
des lipides dans du scintillant. La mesure du bruit de fond est faite par
incubation de
[14C]hexanoyl -céramides dans une solution 25mM KCL/50mMTris pH 7.4 à 37 C en
absence d'extrait de foie.
Modulateurs de l'enzyme
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un modulateur de l'enzyme
humaine
UDP-glucose céramide glucosyltransférase susceptible d'être obtenu par l'une
des
méthodes ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement
préventif
et/ou curatif de l'acné ou des désordres cutanés associés à une
hyperkératinisation.
Il est ainsi décrit ici une méthode de traitement préventif et/ou curatif de
l'acné, ou des
désordres cutanés associés à une hyperkératinisation, méthode comprenant
l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un modulateur de
l'enzyme
humaine UDP-glucose céramide glucosyltransférase, à un patient nécessitant un
tel
traitement.
L'invention vise enfin l'utilisation cosmétique d'un modulateur de l'enzyme
humaine UDP-
glucose céramide glucosyltransférase, pour le traitement esthétique des
problèmes de
desquamation.
De manière préférentielle, le modulateur est un inhibiteur de l'enzyme. Le
terme
inhibiteur se réfère à un composé ou une substance chimique qui élimine ou
réduit
substantiellement l'activité enzymatique de la UDP-glucose céramide
glucosyltransférase.
Le terme substantiellement signifie une réduction d'au moins 25%, de
préférence d'au
moins 35%, de préférence encore d'au moins 50%, et de manière plus préférée
d'au
moins 70% ou 90%. Plus particulièrement il peut s'agir d'un composé qui
interagit avec, et
bloque, le site catalytique de l'enzyme, comme des composés de type inhibiteur
compétitif.
Un inhibiteur préféré interagit avec l'enzyme en solution à des concentrations
en inhibiteur
de moins de 1 M, de préférence moins de 0,1 M, de préférence encore moins de
0,01 M.
Le composé modulateur peut être un anticorps inhibiteur anti-UDP-glucose
céramide
glucosyltransférase, de préférence un anticorps monoclonal. De manière
avantageuse, un
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
tel anticorps inhibiteur est administré en une quantité suffisante pour
obtenir une
concentration plasmatique d'environ 0.01 g par ml à environ 100 g/ml, de
préférence
d'environ 1 g par ml à environ 5 g/ml.
Le composé modulateur peut également être un polypeptide, un polynucleotide
antisens
5 d'ADN OU d'ARN, un si-ARN, ou un PNA ("Peptide nucleic acid", chaîne
polypeptidique
substituée par des bases puriques et pyrimidiques, dont la structure spatiale
mime celle
de l'ADN et permet l'hybridation à celui-ci).
Plusieurs inhibiteurs de la UDP-glucose céramide glucosyltransférase sont
connus, et
10 proposés notamment pour le traitement de la maladie de Gaucher. L'invention
comprend
l'utilisation de tels composés inhibiteurs de la UDP-glucose céramide
glucosyltransférase
pour le traitement préventif et/ou curatif de l'acné, ou des désordres cutanés
associés à
une hyperkératinisation.
Plus particulièrement, à titre non limitatif, on peut citer comme exemples
d'inhibiteurs de
la UDP-glucose céramide glucosyltransférase, les composés suivants
N-butyldeoxynojirimycine (Miglustat)
D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -
propanol
1-Threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PDMP)
D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP),
D-threo-1-phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (P4),
D-threo-1-phenyl-2-benzyloxycarbonylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PBPP)
D-threo-4'-hydroxy- D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -
propanol (D-threo-
4'-hydroxy-P4)
D-threo-1-(3',4'-methylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -
propanol
D-threo-1-(3',4'-ethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -
propanol
D-threo-1 - (3',4'-trimethylenedioxy) phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -
propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-hexanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-heptanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-octanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-nonanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-undecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-dodecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-tridecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-tetradecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-pentadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
11
1-Threo-1-phenyl-2-hexadecanoylamino-3-morpholino-1-propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-heptadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
1 -Threo-1 -phenyl-2-octadecanoylamino-3-morpholino-1 -propanol
D'autres composés modulateurs identifiés par la méthode de criblage décrite
plus haut
sont également utiles.
Les composés modulateurs sont formulés au sein de composition pharmaceutique,
en
association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions
peuvent
être administrées par exemple par voie orale, entérale, parentérale, ou
topique. De
préférence, la composition pharmaceutique est appliquée par voie topique. Par
voie orale,
la composition pharmaceutique peut se présenter sous forme de comprimés, de
gélules,
de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granules,
d'émulsions, de suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules
lipidiques
ou polymériques permettant une libération contrôlée. Par voie parentérale, la
composition
pharmaceutique peut se présenter sous forme de solutions ou suspensions pour
perfusion ou pour injection.
Par voie topique, la composition pharmaceutique est plus particulièrement
destinée au
traitement de la peau et des muqueuses et peut se présenter sous forme
d'onguents, de
crèmes, de laits, de pommades, de poudres, de tampons imbibés, de solutions,
de gels,
de sprays, de lotions ou de suspensions. Elle peut également se présenter sous
forme de
suspensions de microsphères ou nanosphères ou de vésicules lipidiques ou
polymériques
ou de patchs polymériques ou d'hydrogels permettant une libération contrôlée.
Cette
composition pour application topique peut se présenter sous forme anhydre,
sous forme
aqueuse ou sous la forme d'une émulsion. Dans une variante préférée, la
composition
pharmaceutique se présente sous la forme d'un gel, d'une crème ou d'une
lotion.
La composition peut comprendre une teneur en modulateur de l'UGCG allant de
0,001 à
10 % en poids, notamment de 0,01 à 5 % en poids par rapport au poids total de
la
composition.
La composition pharmaceutique peut en outre contenir des additifs inertes ou
des
combinaisons de ces additifs, tels que
- des agents mouillants;
- des agents d'amélioration de la saveur;
- des agents conservateurs tels que les esters de l'acide
parahydroxybenzoïque;
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
12
- des agents stabilisants;
- des agents régulateurs d'humidité;
- des agents régulateurs de pH;
- des agents modificateurs de pression osmotique;
- des agents émulsionnants;
- des filtres UV-A et UV-B
- et des antioxydants, tels que l'alpha-tocophérol, le butylhydroxyanisole ou
le
butylhydroxytoluene, la Super Oxyde Dismutase, l'Ubiquinol ou certains
chelatants de
métaux.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la
portée.
Légende des figures :
Les Figures 1A et 1 B sont des graphes qui montrent la mesure de l'expression
du gène
UGCG chez des souris mâles gonadectomisées et traitées avec le véhicule, le
DHT, le
DHEA ou la combinaison de DHEA-Flutamide pendant une période de 7 jours une
fois par
jour (traitement long terme). Les résultats obtenus par la technique
Affymetrix (Figure 1A)
ont été confirmés par la technique de RT-PCR en temps réel (Figure 1 B).
GDX: souris gonadectomisées et traitées avec le véhicule
DHT: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydrotestosterone (agoniste
du
récepteur aux androgènes)
DHEA: souris gonadectomisées et traitées avec le Dihydroepiandrosterone
(précurseur
des hormones stéroïdiennes; dans les glandes préputiales métabolisé en
androgène actif)
DHEA-Flu: souris gonadectomisées et traitées avec une combinaison de
Dihydroepiandrosterone et Flutamide (antagoniste du récepteur aux Androgènes;
qui
bloque les effets des agonistes DHT et DHEA).
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
La figure 2 est un graphe rapportant une étude cinétique de 15 minutes à 96
heures.
Dans la Figure 2, les points 124a et 124b montrent le niveau d'expression
d'UGCG de
souris contrôles (= souris non gonadectomisées; duplicat) au point 24 heures.
Les points
suivants proviennent de souris gonadectomisées et indiquent les temps
successifs (en
heures) de l'étude cinétique.
Niveau d'expression : niveau d'expression de l'ARNm
Carré: expression dans les souris gonadectomisées suite au traitement avec le
DHT à
temps zéro.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
13
Losange: expression dans les souris gonadectomisées sans traitement DHT.
Exemples : DONNEES EXPERIMENTALES
Exemple 1 : Expression de l'UDP-glucose céramide glucosyltransférase (UGCG)
dans la glande sébacée humaine et dans l'épiderme humain.
Des glandes sébacées humaines ont été séparées de l'épiderme humain par
traitement à
la dispase et dissection sous une loupe binoculaire. Des échantillons d'ARN
totaux ont été
préparés à partir des glandes sébacées et à partir de l'épiderme.
L'expression des gènes a été analysée sur une station d'Affymetrix (module
microfluidic;
four à hybridation; scanner; ordinateur) en suivant les protocoles fournis par
la société. En
bref, l'ARN total isolé des tissus est transcrit en ADNc. A partir de l'ADNc
double brin, on
synthétise un ARNc marqué à la biotine en utilisant la polymérase T7 et un NTP
précurseur conjugué à la biotine. Les ARNc sont ensuite fragmentés en
fragments de
petites tailles. Toutes les étapes de biologie moléculaire sont contrôlées en
utilisant le
système lab on a chip d'Agilent pour confirmer les bonnes efficacités des
réactions
enzymatiques. La puce Affymetrix est hybridée avec l'ARNc biotinylé, rincée et
ensuite
marquée par fluorescence en utilisant un fluorophore conjugué à la
Streptavidine. Après
des lavages, la puce est scannée et les résultats sont calculés en utilisant
le logiciel
MAS5 fourni par Affymetrix. On obtient une valeur d'expression pour chaque
gène ainsi
que l'indication de la significativité de la valeur obtenue. Le calcul de la
significativité de
l'expression est basé sur l'analyse des signaux qui sont obtenus suite à
l'hybridation de
l'ARNc d'un gène donné avec un oligonucléotide hybridant parfaitement (
perfect
match ) versus un oligonucléotide qui contient une mutation ( single
mismatch ) dans
la région centrale de l'oligonucléotide (voir tableau 1).
Tableau 1 : mesure de l'expression de la UDP-glucose céramide
glycosyltransférase dans
l'épiderme et dans la glande sébacée humaine via l'utilisation de la
technologie des puces
Affymetrix.
Identifiant Nom du Expression Expression Significativité Significativité
Affymetrix gène dans la dans de de
glande l'épiderme l'expression* l'expression*
sébacée humain dans la dans
humaine glande épiderme
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
14
sébacée humain
humaine
204881 s at UDP- 299 695 1 1
glucose
céramide
glycosyltra
nsférase
*Indicateur de la significativité de l'expression du gène analysé dans
l'échantillon indiqué
présence (=1) ou absence (=0).
Résultats:
La UGCG est bien exprimée dans les deux tissus (glande sébacée, épiderme).
L'analyse
différentielle entre l'expression dans la glande sébacée humaine et l'épiderme
humain
montre que l'expression est significativement plus forte dans l'épiderme
(tableau 1).
Exemple 2: Expression de la UDP-glucose céramide alycosyltransférase dans la
glande préputiale de souris
A. Les glandes préputiales de souris montrent une différenciation du type
sébocytaire et
sont utilisées comme modèle expérimental de glande sébacée. Elles ont une
taille
suffisante pour permettre l'isolement d'ARN sans avoir recours à des
technologies de
microdissection.
L'analyse de l'expression de la UGCG dans les glandes préputiales de souris a
été
réalisée dans des conditions de déficiences en hormones stéroïdiennes
(notamment en
hormones androgéniques) suite à une gonadectomie. Les animaux gonadectomisés
ont
ensuite été traités avec des quantités physiologiques de Dihydrotestosterone
(DHT) ou de
Dihydroepiandrosterone (DHEA) pour restituer un niveau physiologique des
hormones
androgéniques, ou bien comme expérience de contrôle avec une combinaison de
DHEA-
Flutamide dans laquelle le Flutamide, un antagoniste du récepteur aux
Androgènes
bloque l'effet de la DHEA. La comparaison de l'expression génique dans ces
conditions
expérimentales permet d'identifier de façon non ambiguë la modulation ou non
de
l'expression génique d'un gène en question par les hormones androgéniques.
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
L'expression génique a été analysée en utilisant la technologie Affymetrix
décrite ci-
dessus (Figure 1A) et les résultats ont ensuite été confirmés par la technique
de PCR en
temps réel (Figure 1 B).
La PCR en temps réel a été menée en suivant les protocoles fournis par la
société
5 Applied Biosystems en utilisant le 7900HT Sequence Detection System .
L'ARN total
isolé des tissus est transcrit (RT) en ADNc et celui-ci est amplifié par PCR
(Réaction en
Chaine par Polymérase). La progression de la PCR est suivie en temps réel en
utilisant
des sondes TaqMan fluorescentes, permettant une quantification précise de la
quantité
d'ARNm d'un gène donné, présent dans l'échantillon biologique au départ.
Résultat: La quantité d'ARNm de l'UGCG est diminuée suite à un traitement
chronique
pendant 7 jours aux androgènes dans la glande préputiale.
B. Des souris males ont été gonadectomisées et traitées avec le véhicule, ou
le DHT. Les
glandes preputiales ont été prélevées pendant une période allant jusqu'à 4
jours
(traitement androgénique unique - observation d'une cinétique de court terme).
L'ARN a
été isolé et l'expression des gènes a été analysée par la technique
Affymetrix. La Figure 2
représente le niveau d'expression relative de l'ARNm en fonction du temps.
Résultats:
La gonadectomie (qui provoque une déficience d'hormones stéroïdiennes) induit
une
légère induction de l'expression de l'UGCG dans la glande préputiale de la
souris.
L'ARNm de l'UGCG dans la glande préputiale de la souris est diminué par un
traitement
moyen terme avec le DHT (effet visible à 96 heures).
Exemple 3 : Formulations
A- VOIE ORALE
Comprimé de 0,2 g
- D-threo-1 -phenyl-2-palmitoylamino-3-pyrrolidino-1 -propanol 0,001 g
- Amidon 0,114 g
- Phosphate bicalcique 0,020 g
- Silice 0,020 g
- Lactose 0,030 g
CA 02656842 2009-01-06
WO 2008/009857 PCT/FR2007/051684
16
- Talc 0,010 g
- Stéarate de magnésium 0,005 g
B- VOIE TOPIQUE
(a) Onguent
-1 -Threo-1 -phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1 -propanol 0,300 g
- Vaseline blanche codex qsp 100 g
(b) Lotion
- N-butyldeoxynojirimycine 0,100 g
- Polyéthylène glycol (PEG 400) 69,900 g
- Ethanol à 95% 30,000 g
