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Utilisation du 10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine
pour
la préparation d'un médicament exerçant une inhibition sélective des
récepteurs
muscariniques M1, M2 et M3
La présente invention concerne l'utilisation du 10-[(3R)-1-
azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine ainsi que de ses sels
pharmaceutiquement acceptables pour la préparation d'un médicament permettant
en
particulier de prévenir ou de traiter l'incontinence urinaire, et ce par voie
locale et/ou
par voie orale. Le 10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-
phénothiazine
dont la synthèse est décrite dans le brevet dérive d'un racémate : la d,l-
méquitazine.
A l'origine la méquitazine est un médicament, efficace dans le traitement des
affections allergiques comme les rhinites allergiques saisonnières ou
permanentes,
les allergies médicamenteuses, ainsi que les manifestations dermatologiques
d'origine allergiques ou virales (prurit). La méquitazine est un anti-
histaminique de
type anti-Hl. Elle possède un carbone asymétrique conduisant à deux
configurations
spatiales distinctes : lévogyre et dextrogyre (configuration R). L'analyse
poussée des
propriétés des deux énantiomères a pu montrer que l'énantiomère dextrogyre
était
porteuse d'une très forte affinité pour les récepteurs muscariniques M1/M2/M3,
exemplifiés ci-après, alors que l'autre énantiomère montrait une plus faible
affinité
pour les récepteurs muscariniques. L'acétylcholine est le principal
neuromédiateur
du système nerveux parasympathique. Les actions physiologiques de
l'acétylcholine
sont médiées par les récepteurs muscariniques ou nicotiniques. Chacun de ces
récepteurs est hétérogènes: e.g., la famille des récepteurs muscariniques
comprend, à
ce jour, 5 sous-types (M<sub>l</sub>, M<sub>2</sub>, M<sub>3</sub>, M<sub>4</sub>, et M<sub>5</sub>) chacun
de
ces récepteurs est codé par un gène différent et possède une répartition et
une
fonction physiologique distincte. Cependant plusieurs récepteurs muscariniques
peuvent coopérer pour induire un effet physiologique commun, comme c'est le
cas
au niveau de la régulation de l'incontinence.
Le récepteur M3 est un des contributeurs de la contraction du muscle impliqué
dans le contrôle du sphincter vésical (détrusor : ensemble de la musculature
lisse de
la paroi vésicale/vessie).
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Il existe des causes responsables de l'incontinence qui peuvent être
supprimées lorsqu'elles sont identifiées : infection des voies urinaires,
lithiase
(calculs), constipation, par exemple. Il arrive aussi qu'un trouble de la
continence
soit lié à un traitement médicamenteux. L'incontinence peut, chez les
personnes
âgées, correspondre à un changement du cadre de vie, à une inadaptation de
l'environnement. Chez la femme ménopausée, la diminution de l'imprégnation
oestrogénique est souvent mise en cause dans l'apparition du phénomène
d'incontinence, les traitements hormonaux de substitution font partie de
l'arsenal
thérapeutique dans cette population de patientes. En dehors de ces
circonstances, la
cause de l'incontinence peut être identifiée par des examens particuliers. La
prise en
charge d'une incontinence peut faire appel à des médicaments, à la rééducation
ou,
dans certains cas, à la chirurgie. La réactivité excessive de la vessie peut
être traitée
par des médicaments antispasmodiques spécifiques. La faiblesse des sphincters
peut
être améliorée par des médicaments sympathomimétiques ou, chez les femmes, par
les hormones estrogènes. Des médicaments sympatholytiques peuvent être
utilisés
pour relâcher des sphincters trop contractés.
Il existe plusieurs types d'incontinences urinaires qui sont temporaires ou
continues suivant les facteurs étiologiques. Ainsi on distingue généralement :
- l'incontinence par miction impérieuse (hyper-réflexie du détrusor), les
contractions anormales de la vessie surviennent de façon involontaire et
entraînent une envie pressante d'uriner.
- l'incontinence urinaire d'effort
Il s'agit d'une incontinence passive par diminution des résistances urétrales.
La fuite d'urine survient lorsqu'une pression abdominale s'exerce lors d'une
toux, d'un
éternuement, . . . )
- l'incontinence des vessies neurologiques, liée à des dysfonctionnements
vésico-sphinctériens :
- l'incontinence par traumatisme.
- l'incontinence par abouchement ectopique de l'urètre.
- l'énurésie (chez l'enfant de plus de quatre ans).
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L'incontinence par impétuosité, l'incontinence urinaire d'effort et
l'incontinence par abouchement ectopique de l'uretère ne se retrouvent que
chez la
femme tandis que celle par regorgement est masculine.
Le traitement de première intention de la vessie hyperactive est basé sur
l'utilisation des drogues anticholinergiques ou encore nommées anti-
muscariniques.
Les méta-analyses récentes montrent que le bénéfice clinique versus placebo
est
incontestable même si le traitement est accompagné d'effets indésirables comme
la
tachycardie, la constipation ou la sècheresse buccale, pouvant expliquer la
faible
compliance des patients au traitement (Herbison P. et coll., BMJ, 2003). Cela
est
expliqué par le fait du manque de sélectivité vésicale des antimuscariniques
par
rapport aux autres organes. Même si les récepteurs muscariniques de type M2
sont
ceux qui sont quantitativement le plus exprimés au niveau de la vessie et du
bas
appareil urinaire, proportionnellement la petite part, de récepteurs
muscariniques M3
se montre de plus grande importance sur le plan de la régulation fonctionnelle
des
contractions du detrusor. Dans des études fonctionnelles basées sur les
modèles ex
vivo, utilisant des fragments de detrusor en survie, il a été montré que le
sous-type de
récepteur muscarinique M3 était identifié comme le seul sous-type réceptoriel
impliqué dans la contraction du muscle, chez le rat (Longhurst P.A. et coll.,
Br. J.
Pharmacol., 1995), chez le lapin (Choppin A., et coll., Brit. J. Pharmacol.,
1998) et
chez l'homme (Chess-Williams R., et coll., J. Auton. Pharmacol., 2002). Ces
données relatant l'importance en terme de régulation du récepteur M3 ont été
confirmées dans des modèles de souris transgéniques déficientes en récepteur
M3
(Matsui M., et coll., PNAS, 2000). Sur le plan mécanistique et à l'état
normal,
l'acétylcholine se fixe sur le récepteur M3 ce qui libère les messagers
secondaires IP3
(inositol triphosphate) et DAG (diacylgycerol) induisant la contraction du
muscle
lisse. L'acétylcholine induit également la contraction en inhibant la
libération
d'adénosine monophosphate et en inversant la relaxation induite par la
noradrénaline
via les récepteurs P.
Un des effets adverses majeur de l'utilisation des anticholinergiques dans
l'inhibition de l'incontinence est le phénomène de sècheresse buccale.
Paradoxalement, c'est grâce à cet effet que sont sélectionnées en
pharmacologie les
drogues candidates potentiellement utilisables dans l'incontinence, comme cela
est
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exposé ci-dessous. Dans les études animales précliniques l'oxybutynine et la
darifénacine, deux inhibiteurs utilisés contre l'incontinence, réduisent la
salivation et
sont plus sélectifs vis-à-vis du récepteur M3 que vis-à-vis du récepteur M2.
Par
opposition, la toltérodine réduit moins la salivation et, est plus active sur
les
contractions du detrusor. La toltérodine est plus spécifique du récepteur M2
que du
récepteur M3 (Gillberg P.G., et coll., Eur. J. Pharmacol., 1998). Cependant,
même
s'il était supposé qu'une sélectivité vis-à-vis des récepteurs M2 ou M3
pouvait
permettre de différencier les effets des inhibiteurs, en clinique les
résultats sont
moins nets et il apparaît qu'une action simultanée sur les récepteurs M2 et M3
serait
une association efficace vis-à-vis des syndromes d'incontinence. Ainsi, la
darifénacine qui montre une affinité 7 fois plus forte pour les récepteurs
muscariniques M3 que pour les récepteurs muscariniques M2, ne confirme pas de
sélectivité vésicale ou envers les glandes salivaires. En conclusion, les
récepteurs M3
régulent les contractions du muscle lisse de la vessie, les récepteurs M2
interviendraient dans l'initiation de cette contraction (Krichevski V.P., et
coll., J.
Urol., 1999).
Pour les raisons citées précédemment, il apparaît que le candidat inhibiteur
devrait posséder une action de liaison mixte à la fois sur le récepteur M2 et
sur le
récepteur M3 pour avoir une action complète vis à vis de l'induction de la
contraction
et sur sa régulation. De plus le récepteur muscarinique M1, qui avait été
déconsidéré
dans ce domaine, semble jouer également un rôle au niveau du detrusor
(Maruyama
S., et coll., J. Urol., 2006).
Dans le but de diminuer les effets adverses induits par les agents
antimuscariniques, divers dispositifs ont été utilisés. Ils sont
transdermiques, ou bien
disposés in situ chez la femme, sous la forme d'anneau vaginaux à libération
prolongée (Schrôder A., et coll., Urol, 2000). L'oxybutynine transdermique
sous
forme de dispositifs transdermiques a été expérimentée avec succès, afin de
limiter
les effets secondaires dus à une dissémination systémique du principe actif
(Stakmann J. S., et coll., Urol., 2006). Par cette voie, la limitation des
effets de
sécheresse buccale ou oculaire, troubles de la vision, constipation, migraines
est
moins observée ; en revanche les intolérances cutanées au dispositif
apparaissent.
Néanmoins, le phénomène de premier passage hépatique est annulé, ce qui limite
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l'activité secondaire induite par le métabolite hépatique très puissant de
l'oxibutynine (N-desoxybutynine) dont le taux plasmatique après administration
orale d'oxibutynine est 6 à 9 fois supérieur à celui de l'oxybutynine. C'est
la
conjugaison de ces deux entités qui déclenche les effets d'inhibition de
5 l'incontinence, mais également l'induction des effets secondaires.
Ainsi la limitation du taux plasmatique de métabolites actif des drogues
antimuscariniques peut également reposer, outre une spécificité de voie
d'administration, sur un métabolisme hépatique particulier ne produisant pas
de
métabolites actifs, pouvant exacerber l'effet de la drogue initialement
administrée,
mais également augmenter la fréquence et l'intensité des effets secondaires.
En outre, plus la demi-vie du produit sera longue, plus la fréquence
d'administration sera faible, facilitant ainsi la compliance au traitement.
L'objet de la présente invention est fondé sur les propriétés particulières et
inattendues du 10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine
(énantiomère dextrogyre de la méquitazine, codifiée ici sous le nom V0162).
Les
exemples ci-après montrent que :
- l'affinité vis-à-vis des récepteurs muscariniques M1, M2, M3 humains est
très puissante et de niveau nanomolaire
- l'énantiomère dextrogyre (V0162) est plus affiné que le racémate et que
l'énantiomère lévogyre, vis-à-vis des récepteurs muscariniques.
- le ciblage muscarinique est mixte avec par ordre d'affinité : M1>M3>M2,
cette inhibition étant qualitativement et quantitativement jugée optimale pour
l'inhibition du phénomène d'incontinence.
- in vivo l'énantiomère dextrogyre est anticholinergique par voie
intraveineuse alors que l'énantiomère lévogyre ne démontre pas d'activité
nette. Il en
est de même pour la voie orale.
- in vivo l'application mucosale du V0162 en suspension se traduit par un
passage systémique net entraînant un taux circulant compatible avec une
activité
pharmacologique vis-à-vis des cibles réceptorielles muscariniques.
- in vivo dans un modèle de sialorrhée chez le rat, le V0162 induit une
diminution significative des sécrétions salivaires après administration par
voie orale.
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- in vivo dans le modèle d'hyperactivité vésicale (incontinence d'urgence)
induite par exposition à l'acide acétique, le V0162 réduit la pression
intravésicale
évaluée par cystomanométrie.
La combinaison de toutes ces propriétés, reprises à titre d'exemples du
présent brevet montre de manière inattendue que le V0162 (10-[(3R)-1-
azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine) est un composé actif dans
l'incontinence urinaire et des troubles qui y sont associés.
EXEMPLE 1: affinité du V0162 (10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-
ylméthyl]-lOH-phénothiazine) vis-à-vis des récepteurs muscariniques humains,
in
vitro
Le but de cette étude est de déterminer une constante d'affinité du composé
vis-à-vis des trois classes de récepteurs humains muscariniques in vitro. Le
modèle
choisi est la cellule CHO transfectée de manière stable par les ADNc codant
pour
chacun des trois types de récepteurs humains muscariniques. Dans un premier
temps
est déterminée l'affinité des cellules exprimant chaque type de récepteur pour
un
ligand dont il a été établi par ailleurs qu'il se fixait à 100% sur le
récepteur
muscarinique cible. Le ligand optimal pour le récepteur recombinant M1 est la
pirenzépine tritiée à 2nM (Dorje F., et coll, JPET, 1991), celui du récepteur
recombinant Mz est la methoctramine tritiée à 2nM, celui du récepteur M3 est
le 4-
DAMP à 0.2nM (Peralta E.G., et coll., EMBO, 1987). La spécificité de liaison
des
récepteurs exprimés par chaque type cellulaire a été vérifiée en parallèle en
évaluant
la non-fixation de l'atropine à l M. La liaison vis-à-vis des récepteurs est
définie
comme suit : différence entre la liaison globale et la liaison non spécifique
déterminée en présence d'excès de ligand froid. Les résultats sont exprimés en
pourcentage de la liaison optimale obtenue avec le ligand modèle (100%). Les
IC50
(concentration nécessaire à inhiber 50% de la liaison du ligand optimal avec
sont
récepteur cible correspondant) et les coefficients de Hill (nH) ont été
déterminés par
analyse de régression non-linéaire des courbes de compétitions. Les constantes
d'inhibition (K;) ont été calculées grâce à l'équation de Cheng Prusoff (K; =
ICSO/(l+L/ KD)) ; où L est la concentration de radioligand et KD l'affinité du
radioligand pour le récepteur.
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Table 1: V0162 liaison réceptorielle in vitro
Récepteurs Composé testé IC50 Ki nx
humains (nM) (nM)
M1 (10-[(3S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H- 5.9 5.1 1.1
(h) phénothiazine) 1.6 1.4 1.0
(10-[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH- 2.1 1.8 0.8
phénothiazine)
(10-[(3R,3 S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H-
phénothiazine)
M2(h) (10-[(3S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H- 94 66 1.0
phénothiazine) 10 7 1.1
(10-[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH- 20 14 0.9
phénothiazine)
(10-[(3R,3 S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H-
phénothiazine)
M3(h) (10-[(3S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H- 17 12 1.0
phénothiazine) 5.5 3.9 1.1
(10-[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH- 8 5.7 1.2
phénothiazine)
(10-[(3R,3 S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H-
phénothiazine)
Ces résultats montrent que le V0162 ((10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-
ylméthyl]-lOH-phénothiazine) est un composé qui se lie fortement aux
récepteurs
muscariniques. Son ratio de spécificité M2/M3 est compris entre 1.5 et 2. Son
affinité
pour M1 est également au nanomolaire.
Ainsi in vitro ce composé démontre une très forte affinité vis-à-vis des
récepteurs muscariniques impliqués dans l'initiation, la régulation et le
maintien des
contractions du detrusor. Les différences entre énantioméres et racémate vis-à-
vis de
ces trois récepteurs varient entre un facteur 3 et un facteur 10, en termes de
Ki.
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EXEMPLE 2: Activité anticholinergique ex vivo du V0162 (10-[(3R)-1-
azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-l OH-phénothiazine).
Le but de cette expérimentation est de confirmer sur un organe en survie
l'activité anticholinergique du V0162. Pour ce faire, des explants prélevés
chez le
cobaye ont été mis en survie. La morphologie des préparations était homogène
de lot
à lot. Chaque explant était disposé dans une chambre de survie et immergé dans
une
solution physiologique de composition (mM): NaC1(118) ;KC1(4.7) ; MgSO4 (1.2)
;
CaC1z (2.5) ; KH2PO4 (1.2) ; NaHCO3 (25), glucose (11), à température de 37 C
et
respectant un pH de 7.4. Avant le test, les agents suivants ont été dispersés
dans le
tampon de survie afin de bloquer les réponses non spécifiques à
l'acétylcholine :
propanolol (10-6M) pour bloquer les réponses (3z-adrénergiques ; cimétidine
(10-5M)
pour bloquer les réponses histaminergiques de type 2; methysergide (10-6M)
pour
bloquer les réponses sérotoninergiques et indométhacine (3.10-6M) pour
prévenir
l'apparition d'un tonus musculaire dû à une libération de prostaglandines par
la
préparation elle-même. Lors des acquisitions, les tissus ont été connectés à
des
transpondeurs afin d'enregistrer en continu les variations de tension. Après
60 min de
calibration des préparations, les tissus ont été exposés à des concentrations
variables
de V0162. Les contractions induites par l'acétylcholine en dose réponses ont
été
réalisées afin de déterminer la réponse de la préparation à la stimulation en
absence
d'inhibiteur putatif.
Table 2 : V0162, effet anticholinergique ex vivo
Composé Concentration Réponse à 1'acetylcholine
testé (nM) Courbes Réponse max. EC50
(%) (x10-6M)
V0162 0 témoin 100 7.6+2
test 98+1 22.5+2.4*#
0 témoin 100 5.4+0.8
100 test 98+1 76.0+3.6*#
0 témoin 100 7.4+0.5
300 test 98+1 410+76.7*#
Expression des résultats sous forme de moyennes+sem avec n=6 par groupe
;*.p<0.05
intra et #.p<0.05 extra
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Le système d'évaluation anticholinergique est validé par les dose-effets
obtenus avec l'acétylcholine comme médiateur physiologique de la contraction
musculaire. Ces résultats analysés par le test t de Student pour valeurs non-
appariées montrent que le V0162 s'oppose à l'action contractile de
l'acétylcholine.
Dans ce modèle ex vivo on confirme les données obtenues in vitro : le V0162 se
comporte comme un compétiteur antagoniste de l'acétylcholine. Son action
débute à
partir de 30nM.
EXEMPLE 3 : Activité d'inhibition de la sialorrhée du V0162 (l0-[(3R)-l-
azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine), in vivo.
L'activité anticholinergique ayant été démontrée in vitro au niveau
réceptoriel
et cellulaire puis ex vivo au niveau du tissu cible, le but de ces
expérimentations est
de constater si après administration par voie orale, une inhibition de la
sécrétion
salivaire apparaît. Le blocage des récepteurs M3, impliqué dans les
contractions du
détrusor et dans la sécrétion salivaire, provoque souvent le phénomène de
sècheresse
buccale comme effet concomitant d'un traitement de l'incontinence par
l'oxybutynine ou la toltérodine. Les investigations sur les nouveaux agents
inhibiteurs de l'incontinence, ont été basées pendant longtemps sur la
sélectivité
réceptorielle. On supposait que la spécificité d'un agent vis-à-vis des
récepteur M3
plutôt que Mz, permettrait de limiter l'inhibition aux zones d'expression du
récepteur
et donc d'éviter l'inhibition au niveau des cibles physiologiques non
impliquées dans
l'incontinence, comme par exemple la sphère cardiaque ou les glandes
salivaires.
Cependant comme nous l'avons vu précédemment la sélectivité des agents de
lutte
contre l'incontinence ne dépend pas exclusivement de la sélectivité tissulaire
d'expression du sous-type de récepteurs muscariniques. En effet, la
répartition de ces
récepteurs n'est pas réellement liée à une différence tissulaire (ie : on
trouve des
récepteurs Mz également dans le détrusor). Sur le plan fonctionnel,
l'activation de
certains récepteurs contrôle le niveau d'activation d'autres récepteurs de la
même
famille muscarinique. Ainsi l'élimination des composés pouvant affecter la
sécrétion
salivaire, dans le but de sélectionner des composés exclusivement actifs sur
le
detrusor (et donc sur l'incontinence), aboutit à un non-sens. Aussi les
derniéres
évolutions poussent vers l'évaluation d'agent de lutte contre l'incontinence
sur les
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tests d'inhibition de la sécrétion salivaire. Un point capital est la capacité
du
composé à diffuser vers un tissu cible. Ainsi des composés pouvant inhiber la
sécrétion salivaire dans les modèles ex vivo ou même in vivo chez l'animal
peuvent
se révéler dénués d'effets sur la sècheresse buccale en clinique humaine. Il
n'en
5 demeure pas moins que l'activité d'inhibition de la sécrétion salivaire
constitue un
outil de choix et sûr de l'activité anticholinergique.
Dans le but d'évaluer l'activité anticholinergique dans le modèle validé de la
sialorrhée chez le rat induite par la pilocarpine, Des groupes d'animaux ont
été mis à
jeun, le lendemain, les produits ont été administrés par voie orale 90 min
avant
10 l'injection intra péritonéale de pilocarpine (0.5mg.kg'). Les composés
testés ont été
administrés aux doses de 2.5 ; 5 et 10 mg.kg-'. Au préalable le V0162 (10-
[(3R)-1-
azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine) a été mis en suspension
dans
un véhicule : la carboxymethylcellulose à 0.5%. L'atropine comme témoin
positif de
l'expérimentation a été administrée à la dose de lmg.kg-1. Les animaux ont été
anesthésiés puis la sécrétion salivaire a été collectée pendant 60 min, toutes
les dix
min. Les échantillons ont été ensuite séchés et pesés.
Table 3 : Inhibition de la sécrétion salivaire chez le rat après
administration po, effet
anticholinergique in vivo
Traitement n Dose Sécrétion Inhibition (%)
(mg=kg') (mg)
véhicule 10 - 1045.8 -
V0162 10 2.5 735.6 29
V0162 10 5 338.9 67*
V0162 10 10 45.1 95*
Atropine 10 1 17.9 98*
Expression des résultats sous forme de moyennes avec n=10 par groupe ;*.p<0.05
Le système d'évaluation de la sialorrhée est validé par l'action de l'atropine
dans le modèle. Les résultats montrent que le composé cité en exemple réduit
de
façon significative la sécrétion salivaire chez l'animal, après administration
par voie
orale. Les effets obtenus sont dose-dépendants. La puissance du composé V0162
(10-
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[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine) est similaire à
celle
obtenue avec l'atropine utilisé ici comme standard méthode. Ainsi, le composé
V0162 ainsi que ses sels pharmaceutiquement acceptables se révèlent utiles
pour la
fabrication de médicaments, en particulier sous une forme adoptée à
l'administration
nasale, destinés au traitement de rhinorées.
Dans un second temps, l'activité anticholinergique des deux énantiomères a
été comparée à une seule dose, après administration par voie orale selon le
même
schéma expérimental que celui précédemment décrit.
Table 4 : Inhibition de la sécrétion salivaire chez le rat après
administration po du
mélange racémique et des énantiomères, effet anticholinergique in vivo
Traitement n Dose Inhibition
(mg.kg') (%)
véhicule 7 - -
Énantiomère lévogyre 7 5 -4
(10-[(3 S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H-
phénothiazine)
Enantiomère dextrogyre (V0162) 7 5 77*
(10-[(3R)-1-azabicyclo [2.2.2] oct-3-ylméthyl]-lOH-
phénothiazine)
2Mélange racémique 6 5 73*
(1 0-[(3R,3 S)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-10H-
phénothiazine)
Expression des résultats sous forme de moyennes avec n =10 par groupe
;*.p<0.05
En conclusion, ces expérimentations confirment les résultats précédemment
obtenus in vitro et ex vivo, et démontrent de manière inattendue que le V0162
(10-
[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-1 OH-phénothiazine) est un puissant
anticholinergique per os. De plus il appartient à la classe des inhibiteurs
potentiels de
l'incontinence car, comme l'oxibutynine, la darifénacine ou la toltérodine, il
diminue
la sécrétion salivaire chez l'animal, après administration de doses
pharmacologiques
non toxiques et bien tolérées.
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En outre contrairement à ce qui était attendu, l'inhibition de la voie
cholinergique n'est effective qu'aprés traitement des animaux par
1'énantiomére
dextrogyre. L'énantiomère lévogyre démontre une activité anticholinergique in
vitro,
mais ces résultats ne sont pas les mêmes après administration per os.
Ainsi, ces résultats montrent que seul le V0162 exerce une activité
anticholinergique
in vivo.
EXEMPLE 4: Passage transmuqueux d'une suspension de V0162 (10-
[(3R)-1-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-1 OH-phénothiazine), in vivo chez le
lapin.
Nous avons vu que le composé était capable d'induire une activité
anticholinergique après administration par la voie orale. Par ailleurs il est
établi que
la sélectivité de l'action des anticholinergiques sur la sphère urinaire, dans
le but
d'inhiber les contractions du détrusor et donc l'incontinence, ne reposait pas
sur une
sélectivité vis-à-vis des sous-types de récepteurs muscariniques, car ils sont
exprimés
de manière ubiquitaire. Ainsi un des moyens de parvenir à une sélectivité est
de
réduire la circulation systémique des antimuscariniques tout en augmentant
leur
concentration au niveau de leur site d'action : le bas appareil urinaire.
L'application
vaginale de ce composé pourrait permettre de limiter les effets secondaires
tout en
augmentant l'efficacité. La vessie peut être sur le plan pharmacologique
séparée en
deux : le corps et la base. Les récepteurs muscariniques sont répartis
majoritairement
au niveau du corps, et la réponse contractile aux stimulations cholinergiques
se situe
au même niveau. De même l'autre mécanisme impliqué dans le maintien de la
continence, l'activité directe sur la relaxation du muscle, voit son contrôle
situé au
même endroit. De plus des travaux récents ont montré la possibilité de réduire
les
contractions de la vessie par injection locale d'agents anticholinergiques.
Ainsi les
anticholinergique pourraient agir non seulement comme antagoniste de
l'acétylcholine au niveau des contractions du detrusor, mais également en
bloquant
les récepteurs muscariniques des voies afférentes à la vessie.
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Dès lors, l'utilisation in situ d'un composé antagoniste constituerait une
approche de choix pour le traitement de l'incontinence notamment chez la femme
ménopausée. La restriction majeure est la capacité de l'agent antimuscarinique
à
traverser la muqueuse vaginale afin de cibler les afférences muscariniques au
voisinage de la vessie (Yongtae K., et coll., J. Urol., 2005).
Dans le but d'analyser la propension du composé d'intérêt à traverser une
muqueuse modèle, le V0162 a été administré par pulvérisation sur la muqueuse
nasale chez le lapin, puis des prélèvements sanguins ont été effectués dans le
but de
mesurer un éventuel taux circulant de V0162. 48 lapins ont été traités par
voie nasale
quotidiennement pendant 28 jours par une suspension titrée à 0.4%
masse/volume.
Les 3 groupes d'animaux étaient répartis de la façon suivante : solution
saline,
véhicule, V0162. Chaque groupe était constitué de mâles et de femelles, à part
égales. L'administration de la suspension par voie nasale a été effectuée deux
fois
par jour pendant 28 jours. Les prélèvements plasmatiques ont été réalisés à
Jl, J2, J7,
J28, J35. Les échantillons ont été analysés par une méthode LC/MS/MS validée
de
dosage du V0162.
Table 5: Taux circulant de VO162 après administrations répétées par voie
nasale
Date et heure de prélèvement Taux de V0162 (ng.mL-1)
Jour 1/avant administration BLQ
Jour 1/ 4 heures après administration 0.88
Jour 2/ avant administration 0.22
Jour 7/ avant administration 0.41
Jour 28/ 4 heures après administration 1.35
Jour 28/ 24 heures après administration 0.23
Jour 35/ avant administration BLQ
Expression des résultats sous forme de moyennes avec n=10 par groupe ; BLQ :
en dessous de la limite
de quantification.
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Les résultats montrent que l'administration par voie nasale d'une suspension
de V0162 induit un taux circulant voisin de 4 nM, compatible avec une action
pharmacologique. En effet, nous avons vu préalablement que l'IC50 du V0162
etait
de 5 nM au niveau du récepteur muscarinique M3 et de 1 nM pour ce qui concerne
le
récepteur muscarinique M1.
On peut donc conclure que l'administration par voie mucosale du V0162 se
traduit par un passage efficace compatible avec les taux circulants requis
pour son
activité anticholinergique. Cette administration n'induit pas d'effets
délétères sur la
muqueuse nasale. Les taux circulants obtenus n'entraînent pas d'effets
toxiques dans
ce modèle, ni sur le plan histologique ni sur celui des fonctions vitales :
rythme
respiratoire, fréquence cardiaque, comportement.
Ainsi il est possible d'administrer le composé d'intérêt par simple
application
sur la muqueuse dans le but de délivrer localement l'agent anticholinergique.
EXEMPLE 5: Activité d'inhibition de l'incontinence d'une suspension de
V0162 (10-[(3R)-l-azabicyclo[2.2.2]oct-3-ylméthyl]-lOH-phénothiazine), in
vivo.
L'objectif de cette étude a été de mesurer la pression intravésicale et la
salivation, chez l'animal, dans le but de tester l'urosélectivité d'anti-
muscariniques,
lorsque ceux-ci sont administrés par voie orale et par voie vaginale. Afin
d'évaluer la
pression intravésicale, les vessies des animaux ont été cathétérisées pour
permettre
l'enregistrement (cystomanométrie : enregistrement en continu de la pression
vésicale). Les produits à tester ont été administrés soit per os à une dose de
5mg.Kg-'
soit par application locale de suspension de V0162 à 0.4% dans un véhicule à
base de
cyclodextrine et d'arginine. La veine jugulaire a été également cannulée afin
d'administrer un agoniste muscarinique : béthanéchol (200 g/kg, iv). A chaque
administration de béthanéchol, la variation de pression vésicale (APV, mmHg)
et la
quantité de salive (mg) ont été évalués et quantifiés. Le témoin positif était
constitué
par un groupe d'animaux traités à l'oxybutynine (Ditropan(ffl; 10, 100 et 1000
g/kg,
iv).
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Les résultats (uniquement exprimés dans le texte) montrent que
comparativement à l'oxybutynine, le V0162 par voie orale ou par application
locale
réduit significativement l'augmentation de la pression intravésicale induite
par
l'agoniste de référence : le béthachol.
5 Les expérimentations qui précèdent montrent que le composé V0162 est
capable d'induire une activité anticholinergique après administration par voie
orale.
De plus le composé est capable de franchir la muqueuse. Le composé V0162
possède
les caractéristiques d'un anticholinergique puissant : nM in vitro et mg.kg-1
per os in
vivo. Il est actif par voie orale et peut également être administré par voie
locale au
10 niveau de la muqueuse sous la forme d'une préparation gélifiée dans le but
de cibler
la zone où sont représentés les récepteurs muscariniques contrôlant
directement ou
régulant la continence.
