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TITRE DE L'INVENTION
Facteur VII/Vlla humain modifié et composition pharmaceutique contenant celui-
ci.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la fabrication de facteurs VII
(FVII)/facteurs VII activés (FVIIa) humains utilisables comme principes actifs
de
médicaments. L'invention est en particulier relative à des facteurs VII/Vlla
modifiés
possédant une haute stabilité, à des acides nucléiques codant pour de tels
FVII/Vlla
modifiés et à des procédés pour leur production.
ART ANTERIEUR
Le facteur VII (FVII) est une glycoprotéine vitamine K-dépendante qui, sous sa
forme activée (FVIIa), participe au processus de coagulation en activant le
facteur X et
le facteur IX en présence de calcium et de facteur tissulaire. Le FVII est
sécrété sous la
forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus d'acides aminés, dont la
masse
moléculaire est d'environ 50 kDa. Le FVII comporte quatre domaines structuraux
distincts : le domaine y-carboxylique (Gla) N-terminal, deux domaines
"epidermal
growth factor like" (EGF-like), ainsi qu'un domaine sérine protéase.
L'activation du FVII
en FVIIa est caractérisée par la coupure de la liaison Arg152-11e153 (Arginine
152-
Isoleucine 153). Le FVIIa est donc composé d'une chaîne légère de 152 acides
aminés
de masse moléculaire d'environ 20 kDa et d'une chaîne lourde de 254 acides
aminés
de masse moléculaire d'environ 30 kDa liées entre elles par un seul pont
disulfure
(Cystéine 135-Cystéine 262).
Le FVII/Vlla est utilisé dans le traitement des patients atteints
d'hémophilie,
présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX
(hémophilie
de type B), ainsi que des patients présentant d'autres déficiences des
facteurs de
coagulation, par exemple un déficit héréditaire en FVII. Le FVII/Vlla est
également
préconisé dans le traitement d'accidents vasculaires cérébraux.
La méthode la plus ancienne d'obtention de concentrés de FVIIa a consisté en
la
purification du FVIIa à partir de protéines plasmatiques issues du
fractionnement.
Le document EP 0 346 241 décrit à cet effet la préparation d'une fraction
enrichie
en FVIIa, obtenue après absorption puis élution d'un sous-produit du
fractionnement de
protéines plasmatiques contenant le FVII et le FVIIa et d'autres protéines
telles que les
facteurs IX, X et II, notamment le prééluat du PPSB (P = prothrombine ou FII,
P =
proconvertine ou FVII, S = facteur de Stuart ou FX et B = facteur
antihémophilique B ou
FIX).
De même, le document EP 0 547 932 décrit un procédé de fabrication d'un
concentré de FVIIa de haute pureté essentiellement dépourvu des facteurs
vitamine K
dépendants et du FVIII.
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L'un des inconvénients majeurs de ces procédés d'obtention du FVII/Vlla à
partir
du plasma sanguin est qu'il ne permet d'obtenir que de faibles quantités de
produit. Par
ailleurs, un inconvénient majeur réside dans la fragilité des produits obtenus
qui
présentent systématiquement des formes tronquées et donc moins actives et
susceptibles d'entraîner des effets secondaires non souhaitables. De plus,
l'approvisionnement en plasma collecté auprès des donneurs de sang reste
limité.
C'est pourquoi, dés les années 1980, l'ADN codant pour le facteur VII humain a
été isolé (Hagen et al. (1986) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA ; Apr 83(8):2412-
6) et la
protéine correspondante exprimée dans les cellules de mammifères BHK (Baby
Hamster Kidney) (document EP 0 200 421). La demande FR 06 04872 déposée par la
Demanderesse décrit également la production de FVIIa dans un animal
transgénique.
Ces méthodes de production permettent d'obtenir des protéines sécurisées en
terme de contamination par des virus ou d'autres agents pathogènes. De tels
procédés
permettent d'obtenir des protéines dont la séquence primaire est identique à
la
séquence primaire humaine.
Les préparations commerciales de FVIIa recombinant humain sont actuellement
disponibles sous l'appellation NovoSeven (NovoNordiskTM). Des doses
relativement
élevées, ainsi que des administrations fréquentes par voie intraveineuse, sont
nécessaires pour atteindre et conserver l'effet thérapeutique ou
prophylactique désiré.
Ce traitement reste donc à la fois contraignant pour les patients et très
onéreux.
Il a par ailleurs été montré que le FVII/Vlla est une protéine sensible au
clivage
protéolytique entraînant la formation de nombreux produits de dégradations
dépourvus
d'activité coagulante (clivages atypiques). Les clivages atypiques peuvent
intervenir à
différentes étapes du procédé d'obtention mais également pendant le stockage
du
FVII/Vlla. Les produits de dégradation ont été observés à la fois pour le
FVII/Vlla dérivé
du plasma, mais également pour le FVII/Vlla produit par recombinaison
génétique. Les
clivages atypiques peuvent intervenir avant l'activation du FVII en FVIIa, par
exemple
pendant la production et la purification du FVII, pendant l'étape d'activation
en elle-
même ou pendant la purification et/ou le stockage du produit activé (FVIIa).
Le brevet EP 0 370 036 concerne un FVII/Vlla modifié sur des résidus lysine,
arginine, isoleucine et/ou tyrosine impliqués dans le clivage atypique du
FVII/Vlla afin
de diminuer les clivages atypiques du FVII/Vlla et obtenir ainsi un FVII/Vlla
plus stable.
Néanmoins ce brevet ne résout que partiellement le problème de l'obtention
d'un
FVII/Vlla plus stable puisqu'il n'aborde pas le problème de l'altération de la
conformation du FVII/Vlla lié à la modification des acides aminés impliqués
dans le
clivage atypique. Ce brevet ne décrit ni ne suggère l'obtention d'un FVII/Vlla
modifié au
niveau de sites de clivage atypique dont la conformation n'est pas ou peu
altérée par la
modification de la séquence en acides aminés.
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En dépit de l'existence de documents relatifs à des FVII/Vlla humains
modifiés,
notamment au niveau de sites de clivage atypique, il existe encore un grand
besoin de
nouveaux FVII/Vlla humains aux propriétés améliorées.
RESUME DE L'INVENTION
L'invention a pour objet des facteurs FVII/Vlla possédant une haute stabilité,
modifiés sur au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi la lysine 38,
l'arginine 290 et l'arginine 315, lesdits résidus d'acides aminés étant (i)
substitués par
un résidu d'acide aminé distinct ou (ii) supprimés.
L'invention a aussi pour objet des acides nucléiques codant les facteurs
FVII/FVIIa modifiés ci-dessus, des vecteurs recombinants dans lesquels sont
insérés
lesdits acides nucléiques, des cellules hôtes transformées avec lesdits acides
nucléiques ou lesdits vecteurs recombinants et des organismes génétiquement
modifiés
exprimant lesdits facteurs FVII/Vlla modifiés.
L'invention est également relative à un procédé pour la production d'un
facteur
FVII/FVIIa modifié défini ci-dessus.
L'invention a également trait à l'utilisation des facteurs FVII/Vlla modifiés
ci-
dessus pour la fabrication de médicaments, ainsi qu'à des compositions
pharmaceutiques comprenant lesdits facteurs FVII/Vlla modifiés.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions natives montrant les
séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.
Figure 2 : Spectre de masse MALDI-TOF en conditions réductrices montrant les
séquences d'acides aminés résultant du clivage atypique du FVII.
Figure 3 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des
structures
du FVII humain natif contenant la lysine 38 (en blanc) et du FVII humain
modifié
contenant une glutamine en position 38 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl
7.2 (Tripos).
Figure 4 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des
structures
du FVII humain natif contenant l'arginine 290 (en blanc) et du FVII humain
modifié
contenant une glutamine en position 290 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl
7.2 (Tripos).
Figure 5 : Modélisation moléculaire représentant la superposition des
structures
du FVII humain natif contenant l'arginine 315 (en blanc) et du FVII humain
modifié
contenant une glutamine en position 315 (en noir) à l'aide du logiciel Sybyl
7.2 (Tripos).
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Des nouveaux facteurs FVII/Vlla modifiés sont fournis par la présente
invention,
qui possèdent une haute stabilité, à la fois (i) au cours de la durée de
stockage et (ii) in
vivo après leur administration aux patients.
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La Demanderesse a montré que, de manière surprenante, certaines mutations
des résidus d'acides aminés lysine 38 (Lys 38, K38), arginine 290 (Arg290,
R290) et
arginine 315 (Arg315, R315) dans la séquence d'acides aminés du FVII/FVIIa
humain
naturel n'altérent pas ou peu la conformation du FVII/Vlla humain ainsi
modifié, par
rapport à un FVII/Vlla humain naturel.
De plus, la Demanderesse a montré qu'un FVII/Vlla modifié selon l'invention,
dont la conformation tridimensionnelle est très proche, et parfois identique,
à la
conformation tridimensionnelle du FVII/FVIIa humain naturel, possède des
propriétés
améliorées, y compris un taux de clivage atypique diminué, de meilleurs
rendements de
production, une clairance diminuée et une stabilité accrue comparativement à
un de
FVII/Vlla humain naturel, tout en conservant une conformation proche de celle
du
FVII/Vlla humain naturel.
Par clivages atypiques, on désigne toutes coupures de liaisons peptidiques,
hors
clivage du site d'activation (coupure de la liaison Arg152-I1e,53),
intervenant sur la
molécule de FVII ou FVIIa. Ces coupures atypiques concernent en particulier
les acides
aminés lysine 38 (liaison lysine38-leucine39), arginine 290 (liaison
arginine290-
glycine291) et arginine 315 (liaison arginine315-lysine316) et provoquent des
modifications de structures se traduisant par une altération des propriétés
pharmacocinétiques du FVII/Vlla.
Par rendement de production, on désigne la quantité de FVII/Vlla
structurellement conforme et actif produit par volume de fermenteur (ou bio-
réacteur) ou
par volume de lait issu d'animaux transgéniques ou par masse d'une quelconque
bio-
masse (cellules animales, végétales, bactériennes ou d'insectes). Le coût de
production
d'un FVII/Vlla muté de la sorte est donc significativement plus faible qu'un
FVII/Vlla
dont la séquence primaire est identique à la séquence du FVII/Vlla humain
natif.
Par clairance, on désigne la fraction d'un volume théorique totalement épuré,
c'est-à-dire ne contenant plus le FVII/Vlla par unité de temps. La clairance
d'un
FVII/FVIIa représente un coefficient d'épuration plasmatique. Cela correspond
à la
capacité d'un organe à éliminer totalement le FVII/FVIIa d'un volume donné de
plasma
artériel par unité de temps. La clairance du FVII/FVIIa est le volume apparent
(virtuel)
de plasma artériel totalement débarrassé du FVII/FVIIa donnée par unité de
temps.
Par stabilité, on désigne l'aptitude du FVII/Vlla à conserver ses propriétés
chimiques, physiques, structurales, conformationnelles et/ou
biopharmaceutiques
pendant toute sa durée de validité.
Par conformation, on désigne la structure tertiaire d'une protéine, c'est à
dire le
repliement de la chaîne polypeptidique dans l'espace. On parle également de
structure
tridimensionnelle, ou structure 3D. La conformation d'une protéine est
intimement liée à
son activité biologique, ainsi lorsque cette structure est altérée la protéine
perd son
activité biologique, elle est dénaturée. Par altération de la conformation, on
désigne
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donc toute modification de la structure tridimensionnelle d'une protéine
entraînant une
perte de l'activité biologique de ladite protéine.
L'activité biologique du FVII/Vlla de l'invention peut être quantifiée en
mesurant
la capacité du FVII/Vlla à induire la coagulation sanguine au moyen d'un
plasma
5 déficient en FVII et de la thromboplastine, comme par exemple décrit dans le
brevet US
5,997,864. Dans le test décrit dans le brevet US 5,997,864, l'activité
biologique est
exprimée par une réduction du temps de coagulation par rapport à l'échantillon
contrôle,
et est convertie en unités de FVII/Vlla par comparaison avec un standard de
sérum
humain contenant 1 unité/ml d'activité de FVII/Vlla.
Le FVII/Vlla de l'invention possède des caractéristiques de modifications post-
traductionnelles similaires à celle du FVII/Vlla humain natif mais peut
également
posséder des modifications post-traductionnelles différentes de celles du
FVII/Vlla
humain natif plasmatique de manière à améliorer ses propriétés chimiques,
physiques,
structurales, conformationnelles et/ou biopharmaceutiques.
Dans son aspect le plus large, l'invention a pour objet un FVII/Vlla humain
modifié par rapport à la séquence peptidique du FVII/Vlla humain natif dont au
moins
deux acides aminés sélectionnés parmi la lysine 38, l'arginine 290 et
l'arginine 315 sont
substitués ou délétés, caractérisé en ce que :
(i) la lysine 38 est substituée par un acide aminé choisi parmi la glutamine,
l'alanine,
l'acide glutamique, la glycine, l'isoleucine, la leucine, la méthionine,
l'histidine, la
phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la
tyrosine ou la
valine, de préférence la glutamine, l'histidine ou l'acide glutamique ;
(ii) l'arginine 290 est substituée par un acide aminé choisi parmi la
glutamine,
l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la
leucine, la
méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la
thréonine, le
tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine,
l'histidine,
l'asparagine ou l'acide glutamique, et/ou
(iii) l'arginine 315 est substituée par un acide aminé choisi parmi la
glutamine,
l'alanine, l'acide glutamique, l'asparagine, la glycine, l'isoleucine, la
leucine, la
méthionine, l'histidine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la
thréonine, le
tryptophane, la tyrosine ou la valine, de préférence la glutamine,
l'histidine,
l'asparagine ou l'acide glutamique.
Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le FVII/Vlla
contient au moins deux substitutions choisies parmi la lysine 38 substituée
par une
glutamine, l'arginine 290 substituée par une glutamine et l'arginine 315
substituée par
une glutamine.
Dans un premier mode de réalisation particulier de la présente invention, le
FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 290.
Dans un deuxième mode de réalisation particulier de la présente invention, le
FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38 et l'arginine 315.
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Dans un troisième autre mode de réalisation particulier de la présente
invention,
le FVII/Vlla contient une mutation sur la l'arginine 290 et l'arginine 315.
Dans un quatrième mode de réalisation particulier de la présente invention, le
FVII/Vlla contient une mutation sur la lysine 38, l'arginine 290 et l'arginine
315.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la lysine 38
est
substituée par une glutamine, l'arginine 290 est substitué par une glutamine
et l'arginine
315 est substitué par une glutamine.
Le FVII/Vlla de la présente invention peut être produit en utilisant les
technologies de l'ADN recombinant (ou de recombinaison génétique). En règle
générale, la séquence nucléique d'un acide nucléique (ADN ou ARN) codant un
FVII/Vlla humain natif est modifiée afin de coder la protéine désirée, en
particulier un
FVII/FVIIa modifié selon l'invention. L'acide nucléique ainsi modifié peut
être ensuite
inséré dans un vecteur d'expression, lequel vecteur d'expression est ensuite
utilisé pour
transformer ou transfecter une cellule hôte. Un acide nucléique codant un
FVII/Vlla
humain natif ou naturel est illustré par l'acide nucléique de séquence SEQ ID
N 1.
Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un acide nucléique
codant pour un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention, ainsi
qu'un acide
nucléique de séquence complémentaire.. Un acide nucléique codant un FVII/Vlla
humain modifié selon l'invention peut être produit ou synthétisé en utilisant
l'une
quelconque des techniques conventionnelles faisant partie des connaissances
générales de l'homme du métier. A titre illustratif, un acide nucléique codant
un
FVII/Vlla humain modifié conforme à l'invention peut être fabriqué par
recombinaison
génétique à partir de l'acide nucléique codant le FVII/Vlla humain natif. De
préférence,
l'acide nucléique codant le FVII/Vlla humain modifié est obtenu par mutagenèse
dirigée
à partir de l'acide nucléique codant pour le FVII/Vlla humain natif. Des
techniques de
mutagenèse dirigée sont bien connues de l'homme du métier et permettent
d'obtenir
un ADN codant pour le FVII/Vlla humain modifié désiré. On peut notamment
mettre en
oeuvre des techniques de mutagenèse dirigée qui sont identiques ou dérivées de
la
technique de mutagenèse dirigée décrite par Michael Smith en 1978 (Smith et
al. ;
Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence ; J Biol Chem. (1978)
Sep
25;253(18):6551-60).
Avantageusement, le FVII/Vlla de l'invention est un polypeptide dont au moins
deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine 38,
arginine 290 et
arginine 315 du FVII humain natif de séquence SEQ ID N 2 sont mutés par des
acides
aminés choisis à dessein, ou bien sont délétés.
Dans un mode de réalisation particulier, le FVII/Vlla modifié de l'invention
peut
être obtenu à partir d'un variant du FVII/Vlla humain natif, dans la mesure où
ce variant
n'est pas plus immunogène que le FVII/Vlla humain natif. Ainsi, la séquence
peptidique
de ce variant peut posséder au moins 70% d'identité, et de manière avantageuse
au
moins 80% ou 90%, et de manière encore plus avantageuse au moins 99%
d'identité
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en acides aminés avec la séquence peptidique du FVII humain natif et
comprenant dont
au moins deux résidus d'acides aminés choisis parmi les acides aminés lysine
38,
arginine 290 et arginine 315, selon la numérotation en acides aminés du FVII
humain
natif de séquence SEQ ID N 2 sont mutés par des acides aminés choisis à
dessein, ou
bien sont délétés.. Un tel variant possède essentiellement la même ou une
meilleure
activité biologique que le FVII/Vlla humain natif.
Aux fins de la présente description, l'expression " séquence nucléotidique "
peut
être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide
nucléique.
L'expression " séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même
et n'est
donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou
encore
" séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou
encore
des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la
forme simple brin ou sous la forme de duplex. Le terme " nucléotide " désigne
les
nucléotides naturels [Adénine (A), Thymine (T), Guanine (G), Cytosine (C) et
Uracile
(U)] -
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré
comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base
du
premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second
polynucléotide
dont l'orientation est inversée. Les bases , complémentaires sont A avec T
(ou A
avec U), et C avec G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 90 % d'identité
avec un second acide nucléique de référence, possèdera au moins 90 %, de
préférence
au moins 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%,
99,6% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de
référence. Selon
l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 90 % d'identité avec un
second
polypeptide de référence, possèdera au moins 90 %, de préférence au moins 91%,
92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, 99,6% d'identité
en
acides aminés avec ledit second polypeptide de référence.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, ou
entre deux séquences d'acides aminés, au sens de la présente invention, est
déterminé
en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une
fenêtre
de comparaison.
La partie de la séquence nucléotidique, ou de la séquence d'acides aminés,
dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des
délétions
(par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne
comprend
pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal
entre
les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions
auxquelles une base nucléique identique, ou un acide aminé identique, est
observé
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pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions
auxquelles il y a identité entre les deux bases nucléiques, ou entre les deux
acides
aminés, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis
en
multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en
nucléotides, ou
en acides aminés, des deux séquences entre elles.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de
manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est
déterminé à l'aide du logiciel CLUSTAL W (version 1.82) les paramètres étant
fixés
comme suit : ( 1 ) CPU MODE = ClustalW mp ;(2) ALIGNMENT = full ;(3) OUTPUT
FORMAT = aln w/numbers ; (4) OUTPUT ORDER = aligned ; (5) COLOR
ALIGNMENT = no ; (6) KTUP (word size) = default ; (7) WINDOW LENGTH =
default ; (8) SCORE TYPE = percent ; (9) TOPDIAG = default ; (10)
PAIRGAP = default ; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = none ; (12)
MATRIX = default ; (13) GAP OPEN = default ; (14) END GAPS = default
;
(15) GAP EXTENSION = default ; (16) GAP DISTANCES = default ; (17)
TREE
TYPE = cladogram et (18) TREE GRAP DISTANCES = hide .
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression dans
lequel a été inséré un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié
selon la
présente invention.
Le vecteur d'expression utilisé dans la présente invention peut contenir un
promoteur capable de diriger la transcription de l'acide nucléique codant le
FVII/Vlla de
l'invention. Des promoteurs largement utilisés dans le cadre de cultures de
cellules de
mammifère comprennent des promoteurs viraux et des promoteurs cellulaires bien
connus dans l'état de la technique. Le vecteur d'expression peut également
contenir
des sites d'épissage situés en aval du promoteur et en amont du site
d'insertion de la
séquence ADN codant pour un FVII/Vlla de la présente invention. Le vecteur
d'expression peut également contenir une séquence de polyadénylation située en
aval
du site d'insertion de la séquence ADN codant pour le FVII/Vlla de la présente
invention. Le vecteur d'expression peut également contenir tout type de
séquence ADN
utile pour l'expression, la sélection et/ou l'insertion du FVII/Vlla, de la
séquence ADN
codant pour le FVII/Vlla de la présente invention et/ou du vecteur
d'expression
contenant la séquence ADN codant pour le FVII/Vlla de la présente invention.
Un objet supplémentaire de la présente invention concerne une cellule
transformée pour produire un FVII/Vlla humain modifié selon la présente
invention. Ces
cellules transformées sont fabriquées en transférant un acide nucléique codant
un
FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention dans le génome d'une
cellule hôte,
de préférence afin de faire exprimer cette séquence ADN par la cellule ainsi
transformée. Des techniques appropriées pour la transformation de cellules
sont bien
connues de l'homme du métier. Ces techniques comprennent et sans s'y limiter
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l'utilisation de liposomes, l'utilisation du polyéthylène glycol (PEG),
l'utilisation de
DEAE-dextran, l'utilisation du phosphate de calcium, l'utilisation de virus
(principalement les rétrovirus), l'utilisation d'un canon à ADN, la fusion
cellulaire, la
microinjection, l'électroporation etc. L'invention concerne donc également une
cellule
transformée par un acide nucléique codant un FVII/Vlla humain modifié défini
ci-dessus
et exprimant ledit facteur VII/Vlla humain modifié. Préférentiellement, ladite
cellule
transformée consiste en une cellule transformée de mammifère, et en
particulier une
cellule transformée d'un rongeur, d'un bovin, d'un caprin, d'un porcin, d'un
primate non
humain ou encore d'une cellule humaine.
Le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention peut être obtenu à
partir
d'une cellule transformée selon la présente invention et mise en culture. A
titre
d'exemple, on peut citer les cellules suivantes : BHK (Baby Hamster Kidney) et
notamment BHK tk-ts13 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Nati. Acad. Sci.
USA 79:1106-1110, 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), HEK293
(ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Rat Hep I(Rat
hepatoma; ATCC CRL 1600), Rat Hep Il (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK
(ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) and
DUKX cells (CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA
77:4216-
4220, 1980), cellules YB2/0, cellules 3T3, cellules Namalwa, ou des cellules
BHK
adaptées à la culture sans sérum (Document US 6,903,069).
La présente invention concerne également un organisme génétiquement modifié
pour produire un facteur VII/Vlla humain modifié selon la présente invention.
Selon la
définition donnée par l'Union Européenne, un organisme génétiquement modifié
est un
organisme (à l'exception des êtres humains) dont le matériel génétique a été
modifié
d'une manière qui ne peut s'effectuer naturellement par multiplication et/ou
par
recombinaison. En ce qui concerne la présente invention, un organisme
génétiquement
modifié intègre la séquence ADN codant pour un FVII/Vlla de la présente
invention et
exprime ladite séquence ADN du FVII humain modifié de manière à produire ledit
FVII/Vlla humain modifié de la présente invention. L'organisme génétiquement
modifié
est un microorganisme, un animal ou un végétal. L'invention concerne donc
aussi un
organisme génétiquement modifié comprenant dans son génome un acide nucléique
codant un facteur VII/Vlla humain modifié tel que défini dans la présente
description, et
exprimant ledit facteur VII/Vlla humain modifié.
Un microorganisme est un organisme microscopique, il peut s'agir d'une
bactérie, d'une levure ou d'un virus. La bactérie peut être, par exemple,
Bacillus subtilis
(Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582 ; EP 0 036 259 et EP 0
063
953; WO 84/04541) ; Escherichia coli (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128;
Amann
et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP 0
036 776, EP
0 136 829 et EP 0 136 907) ; Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988)
Appl.
Environ. Microbiol. 54:655] ; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988)
Appl. Environ.
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WO 2008/155509 PCT/FR2008/051055
Microbiol. 54:655) ; Streptomyces lividans (US 4,745,056). La levure peut
être, par
exemple, Candida (Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al.
(1985) J. Basic
Microbiol. 25:141) ; Hansenula (Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol.
132:3459;
Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302) ; Kluyveromyces (Das et al.
5 (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacterial.
154:1165; Van
den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135) ; Pichia (Cregg et al. (1985)
Mol. Cell.
Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; U.S. Pat. Nos.
4,837,148
and 4,929,555) ; Saccharomyces (Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
75;1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163) ; Schizosaccharomyces (Beach
and
10 Nurse (1981) Nature 300:706) ; Yarrowia (Davidow et al. (1985) Curr. Genet.
10:39;
Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49). Le virus utilisé peut être, par
exemple, un
rétrovirus comme Avian Leukosis Virus, Bovine Leukemia Virus, Murine Leukemia
Virus, Mink-Cell Focus-Inducing Virus, Murine Sarcoma Virus,
Reticuloendotheliosis
Virus et Rous Sarcoma Virus.
Un animal selon la présente invention est un organisme vivant pluricellulaire,
eucaryote, dépourvus de chloroplastes et non humain. Dans un mode de
réalisation
préféré, l'organisme génétiquement modifié utilisé dans la présente invention
est un
mammifère, de préférence une lapine. Avantageusement, le FVII/Vlla humain
modifié
de la présente invention peut être produit dans les glandes mammaires d'un
mammifère, de préférence une lapine, sous le contrôle d'un promoteur
spécifique
permettant l'expression dudit FVII/Vlla dans le lait de ladite lapine.
Une méthode de production d'un FVII/Vlla recombinant ou transgénique dans le
lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une
molécule
d'ADN comprenant un gène codant pour le FVII/Vlla humain modifié selon
l'invention,
ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée
naturellement
dans le lait (tels que le promoteur de la caséine, de la béta-caséine, de la
lactalbumine,
de la béta-lactoglobuline ou le promoteur WAP)est intégrée dans un embryon
d'un
mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de
mammifère
de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est
suffisamment
développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le
lait contient
alors ledit FVII/Vlla recombinant ou transgénique.
Un exemple de procédé de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de
mammifère autre que l'être humain est donné dans le document EP 0 527 063,
dont
l'enseignement peut être repris pour la production de la protéine de
l'invention. Un
plasmide contenant le promoteur WAP (Whey Acidic Protein) est fabriqué par
introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène WAP, ce plasmide
étant
réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la
dépendance du
promoteur WAP. Le plasmide contenant le promoteur et le gène codant pour la
protéine
de l'invention sont utilisés pour obtenir des lapines transgéniques, par
microinjection
dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines. Les embryons sont ensuite
transférés
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dans l'oviducte de femelles hormonalement préparées. La présence des
transgènes est
révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux
transgéniques obtenus. Les concentrations dans le lait des animaux sont
évaluées à
l'aide de tests radioimmunologiques spécifiques.
D'autres documents décrivent des procédés de préparation de protéines dans le
lait d'une femelle de mammifère autre que l'homme. On peut citer, sans s'y
limiter les
documents US 7,045,676 (souris transgénique) et EP 1 739 170. (production de
facteur
von Willebrand dans un mammifère transgénique). Ces procédés de préparations
sont
applicables à l'invention en utilisant l'ADN du FVII/Vlla modifié selon la
présente
invention.
Dans un mode de réalisation particulier, l'organisme génétiquement modifié est
un insecte, par exemple un moustique, une mouche etc.
Par FVII/Vlla recombinant ou transgénique , on désigne tout FVII/Vlla
obtenu
à partir d'une cellule transformée ou d'un organisme génétiquement modifié,
c'est à dire
à partir d'un microorganisme, d'un animal ou d'un végétal. Par opposition, le
FVII/Vlla
de l'invention n'est pas un FVII/Vlla plasmatique, c'est-à-dire qu'il n'est
pas un produit
purifié à partir de plasma humain ou animal.
Ainsi, le FVII/Vlla de l'invention est issu de la transcription puis de la
traduction
d'une molécule d'ADN codant pour un FVII modifié selon l'invention et produit
par une
cellule, un microorganisme, un animal ou un végétal transgénique. Ainsi le
FVII/Vlla
recombinant ou transgénique de l'invention peut être obtenu au moyen de
techniques
standard, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une
protéine
dans un système biologique.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un
FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention comprenant les étapes
suivantes :
a) transformation d'une cellule avec un acide nucléique codant pour un
FVII/Vlla humain modifié tel que défini dans la présente description,
b) mise en culture de la cellule obtenue à l'étape a) de manière à ce que la
cellule exprime ledit facteur VII/Vlla, et
c) purification du facteur VII/Vlla humain modifié exprimé par la cellule
transformée mise en culture à l'étape b).
La cellule transformée est mise en culture dans un milieu approprié lui
permettant d'exprimer le FVII/Vlla. Les milieux de cultures utilisés sont
choisi à dessein
par l'homme du métier en fonction des cellules cultivées. Des milieux
appropriés pour la
culture cellulaire comprennent l'IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium),
le DMEM
(Dulbecco's Modified Eagle Medium), le RPMI 1640 ou autres. Ces milieux de
culture
sont composées pour l'essentiel de sels inorganiques, d'acides aminés, de
vitamines et
d'autres composants, notamment le glucose pour son apport énergétique et
l'HEPES
pour son pouvoir tampon, des compléments de base tels que notamment des acides
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aminés, des minéraux, des éléments traces, des compléments moléculaires
spécifiques
de la croissance et des activités métaboliques pour chaque type cellulaire
cultivé etc.
La présente invention concerne également un procédé de fabrication d'un
FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention dans le lait d'un
mammifère
transgénique, comprenant les étapes suivantes :
a) obtenir un mammifère transgénique qui exprime dans ses glandes
mammaires un acide nucléique codant un facteur VII/Vlla humain modifié selon
la
présente invention,
b) collecter le lait du mammifère transgénique qui contient le facteur
VII/Vlla,
c) purifier le facteur VII/Vlla humain modifié à partir dudit lait collecté.
Avantageusement, le mammifère transgénique peut être une souris, une rate,
une lapine ou une chèvre. De préférence le mammifère transgénique est une
lapine.
L'obtention d'un mammifère transgénique peut se faire par des méthodes
classiques, comme par exemple microinjecter un embryon d'un mammifère avec une
séquence ADN codant pour un FVII/Vlla humain modifié selon la présente
invention,
placer ledit embryon microinjecté dans la lumière de l'oviducte d'une femelle
de
mammifère de la même espèce, attendre la naissance des petits mammifères issus
de
l'embryon microinjecté, vérifier si l'animal transgénique exprime bien le
FVII/Vlla
humain modifié dans son lait.
Le FVII/Vlla de la présente invention peut être purifié par des procédés de
purification bien connus de l'homme du métier, comprenant, mais sans s'en
limiter, la
chromatographie (échangeuse d'ion, d'affinité, hydrophobe, d'exclusion par la
taille), les
techniques électrophorétiques comme le preparative isoelectric focusing (IEF),
la
différence de solubilité (précipitation au sulfate d'amonium) ou l'extraction
(Protein
Purification J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York
(1989)).
De préférence, le FVII/Vlla de l'invention peut être purifié par
chromatographie d'affinité
sur une colonne contenant des anticorps anti-FVII ou sur une colonne contenant
des
aptamères anti-FVII. Une purification additionnelle peut être réalisée par des
techniques
conventionnelles de purification chimique, comme l'HPLC (High performance
liquid
chromatography). D'autres procédés de purification, dont la précipitation au
citrate de
barium, sont bien connus de l'homme du métier et peuvent être utilisés pour la
purification du FVII/Vlla de l'invention.
Le terme "anticorps" tel qu'utilisé ici se réfère à une immunoglobuline ou une
portion immunologiquement active de celle-ci, par exemple la région liant un
antigène.
Un anticorps fait donc référence à une protéine comprenant au moins une, et de
préférence deux, chaîne lourde et au moins une, de préférence deux chaines
légères.
Par aptamère, on désigne une molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) ayant
une structure tertiaire qui lui permet de lier spécifiquement une protéine
(Osborne, et al.
(1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1: 5-9; and Patel, D. J. (1997) Curr Opin Chem
Biol 1:32-
46)
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Un autre objet de la présente invention concerne une composition de FVII/Vlla
humain modifié selon la présente invention.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique
contenant un FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention et un
excipient et/ou
un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La composition pharmaceutique de la présente invention peut être utilisée pour
une administration parentérale, topique ou locale et de manière prophylactique
et/ou
thérapeutique. Ainsi le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention
est préparé
sous une forme adaptée au type d'administration choisi, par exemple sous forme
liquide
ou sous forme lyophilisée. Les compositions pharmaceutiques de FVII/Vlla
humain
modifié selon la présente invention peuvent contenir un excipient et/ou un
véhicule
pharmaceutiquement acceptable, de préférence aqueux. De nombreux excipients
et/ou
véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être utilisés, par exemple,
l'eau,
l'eau tamponnée, une solution saline, une solution de glycine et leurs dérivés
ainsi que
des agents nécessaires pour reproduire les conditions physiologiques comme par
exemple des agents tampons et ajusteurs de pH, des surfactants comme l'acétate
de
sodium, le lactate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium,
le
chlorure de calcium, cette liste n'étant pas limitative. De plus, la
composition
pharmaceutique peut être stérilisée par des techniques de stérilisation bien
connues de
l'homme du métier. De manière générale, pour fabriquer une composition
pharmaceutique conforme à l'invention, l'homme du métier peut avantageusement
se
référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne, par exemple à la
5è
édition de la Pharmacopée Européenne publiée en janvier 2005, ou bien encore à
la 6è
édition de la Pharmacopée Européenne, disponible au public en juin 2007.
Le FVII/Vlla humain modifié selon la présente invention et les compositions
pharmaceutiques de celui-ci sont particulièrement utiles pour la fabrication
d'un
médicament. En particulier le FVII/Vlla humain modifié selon la présente
invention et les
compositions pharmaceutiques de celui-ci sont utiles pour la fabrication d'un
médicament destiné au traitement des désordres de la coagulation chez un
patient.
Comme désordre de la coagulation traité par une composition pharmaceutique
selon la
présente invention on peut citer de manière non exhaustive les traumatismes
hémorragiques multiples, comme par exemple l'hémophilie A et B ou les
hémorragies
causées par un surdosage d'anticoagulant.
Le FVII/Vlla humain modifié selon l'invention peut être utilisé seul ou en
combinaison avec une ou plusieurs autres molécules pharmaceutiquement actives.
EXEMPLES
Exemple 1: Etablissement du modèle tridimensionnel du FVII humain
Le modèle tridimensionnel du FVII humain a été construit à partir d'une étude
exhaustive de l'ensemble des structures cristallisées disponibles au sein de
la Protein
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Data Bank (pdb). Ce sont 27 structures de FVII qui ont été analysées vis à vis
de divers
paramètres comme le système d'expression, l'intégrité des chaînes lourde et
légère, la
présence du facteur tissulaire, la résolution, la présence des O- et N-
glycosylations, la
présence des y-carboxylation et la date de publication à la banque de donnée
protéique
(pdb). A partir de cette étude, la structure protéique a été construite après
corrections,
assemblage et minimisation des structures. La suite logicielle utilisée est
Sybyl v7.2
(Tripos, Inc.). Sybyl est un logiciel de modélisation basé sur la minimisation
de l'énergie
totale permettant ainsi de définir la structure la plus stable et donc la plus
probable.
L'étape de minimisation globale comprenant la fixation du BackBone de la
protéine
en simulant la présence de facteur tissulaire, a été réalisée dans les
conditions
suivantes :
- paramètre d'arrêt : gradient d'énergie < 0,5 kCal/mol ou nombre d'itérations
maximum atteint = 10000
- méthode de minimisation : Powell
- champ de force : Amber7FF99
- méthode de calcul des charges pour la glycoprotéine : Amber7FF99,
- méthode de calcul des charges pour les ions et l'inhibiteur du site actif :
Gasteiger-
Hückel
- non-bonded cut-off : 8 Å.
Exemple 2: Extraction et purification du FVII obtenu dans du lait de lapine
transqénique
a) Extraction du FVII
Un volume de 500 ml de lait brut non écrémé a été dilué par 9 volumes de
tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 8,2. Après 30 minutes d'agitation à
température ambiante, la phase aqueuse enrichie en FVII a été centrifugée à 10
000g
durant 1 heure à 15 C (centrifugeuse Sorvall Evolution RC - 6700 tours/min -
rotor
SLC-6000). 6 pots d'environ 835 ml sont nécessaires.
Après centrifugation, trois phases sont présentes : une phase lipidique en
surface (crème), une phase aqueuse non lipidique claire enrichie en FVII
(phase
majoritaire) et une phase blanche solide en culot (précipités de caséines non
solubles
et de composés de calcium).
La phase aqueuse non lipidique FVII a été collectée à la pompe péristaltique
jusqu'à la phase crémeuse. La phase crémeuse a été collectée à part. La phase
solide
(précipité) a été éliminée.
La phase aqueuse non lipidique, comprenant toutefois encore de très faibles
quantités de lipides, a été filtrée sur une séquence de filtres (Pall
SLK7002U010ZP -
préfiltre en fibres de verre de taille de pores de 1 pm - puis Pall SLK7002NXP
- Nylon
66 de taille de pores de 0,45 pm). En fin de filtration, la phase lipidique a
été passée
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sur cette séquence de filtration qui retient complètement les globules
lipidiques du lait,
et le filtrat est clair.
La phase aqueuse non lipidique filtrée a ensuite été dialysée sur membrane
d'ultrafiltration (Millipore Biomax 50 kDa - 0,1 m2) pour la rendre compatible
avec la
5 phase de chromatographie. Le FVII de poids moléculaire d'environ 50 kDa ne
filtre pas
à travers la membrane, contrairement aux sels, sucres et peptides du lait.
Dans un
premier temps, la solution (environ 5 000 ml) est concentrée à 500 ml, puis
une
dialyse par ultrafiltration en maintenant le volume constant permet d'éliminer
les
électrolytes et de conditionner la matière biologique pour l'étape de
chromatographie.
10 Le tampon de dialyse est un tampon phosphate de sodium 0,025M, pH 8,2.
On peut assimiler cette phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à du
lactosérum enrichi en FVII-tg. Cette préparation est stockée à-30 C avant la
poursuite du procédé.
La phase aqueuse non lipidique comprenant le FVII à l'issue de cette étape est
15 parfaitement limpide et est compatible avec les étapes chromatographiques
qui font
suite.
Environ 93 000 UI de FVII-tg sont extraites à ce stade. La pureté en FVII de
cette préparation est de l'ordre de 0,2%.
b) Purification du FVII
1. Chromatographie sur gel d'hydroxyapatite
Une colonne Amicon 90 (9 cm de diamètre - 64 cm2 de section) a été remplie
avec du gel BioRad Ceramic Hydroxyapatite type I(CHT-1).
Le gel a été équilibré en tampon A constitué d'un mélange de phosphate de
sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,0. La totalité de la
préparation
conservée à-30 C est décongelée au bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution
complète
du glaçon puis a été injectée sur le gel (débit linéaire 100 cm/h, soit 105
ml/min). La
fraction non-retenue a été éliminée par passage d'un tampon constitué de
phosphate
de sodium 0,025 M et de chlorure de sodium 0,04 M, pH 8,2, jusqu'au retour à
la ligne
de base (RLB).
L'élution de la fraction contenant le FVII a été faite par le tampon B
constitué de
phosphate de sodium 0,25 M et de chlorure de sodium 0,4 M, pH 8,0. La fraction
éluée a été collectée jusqu'au retour à la ligne de base.
Cette chromatographie permet de récupérer plus de 90% du FVII, tout en
éliminant plus de 95% des protéines lactiques. L'activité spécifique (A.S.)
est
multipliée par 25. Environ 85 000 UI de FVII de pureté de 4% sont disponibles
à ce
stade.
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2. Filtration tangentielle 100 kDa et concentration/dialyse 50 kDa
La totalité de l'éluat de l'étape précédente a été filtrée en mode tangentiel
sur
une membrane d'ultrafiltration 100 kDa (Pall OMEGA SC 100K - 0,1 m2). Le FVII
a été
filtré à travers la membrane 100 kDa, alors que les protéines de poids
moléculaire
supérieur à 100 kDa ne sont pas filtrables.
La fraction filtrée a été ensuite concentrée à environ 500 ml, puis dialysée
sur
l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du
chlorure de
sodium 0,15 M.
A ce stade du procédé, le produit est stocké à-30 C avant passage en
chromatographie d'échange d'ions.
Cette étape a permis de réduire la charge en protéines de poids moléculaire
supérieur à 100 kDa et en particulier des pro-enzymes. Le traitement
membranaire
100 kDa permet de retenir environ 50% des protéines dont les protéines de haut
poids
moléculaire, tout en filtrant 95% du FVII, soit 82 000 UI de FVII.
Ce traitement permet de réduire les risques d'hydrolyse protéolytique lors des
étapes avales.
3.Chromatographies sur gel Q-Sepharose FF
Ces trois chromatographies successives sur gel échangeur d'ions Q-
Sepharose Fast Flow (QSFF) ont été réalisées pour purifier le principe actif,
permettre l'activation du FVII en FVII activé (FVIIa) et finalement concentrer
et
formuler la composition en FVII.
3.1 Etape Q-Sepharose FF 1 - élution High Calcium
Une colonne de 2,6 cm de diamètre (5,3 cm2 de section) a été remplie de 100
ml de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare).
Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La totalité de fraction conservée à-30 C a été décongelée au bain-marie à
37 C jusqu'à dissolution complète du glaçon. La fraction a été diluée au 1/2
[v/v] avec le
tampon d'équilibrage avant injection sur le gel (débit 13 ml/min, soit débit
linéaire de
150 cm/h), puis la fraction non retenue a été éliminée par passage du tampon
jusqu'au
RLB.
Une première fraction protéique à faible teneur en FVII a été éluée à 9 ml/min
(soit 100 cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M et de chlorure de sodium 0,15 M,
pH
7,5, et a été ensuite éliminée.
Une deuxième fraction protéique riche en FVII a été éluée à 9 ml/min (soit 100
cm/h) par un tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de
chlorure de
calcium 0,05 M, pH 7,5.
Cette deuxième fraction a été dialysée sur l'ultrafiltre 50 kDa déjà décrit à
l'Exemple 1. Le tampon de dialyse est du chlorure de sodium 0,15 M. Cette
fraction a
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été conservée à+4 C durant une nuit avant le 2ème passage en chromatographie
d'échange d'anions. Cette étape permet de récupérer 73% du FVII (soit 60000 UI
de
FVII), tout en éliminant 80% des protéines accompagnantes. Elle permet
également
l'activation du FVII en FVIIa.
3.2 Etape Q-Sepharose FF 2 - élution Low Calcium
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) a été remplie de 30 ml
de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare).
Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée précédente (deuxième fraction), conservée à+4 C, a été
diluée avant injection sur le gel (débit 9 ml/min, soit débit linéaire de 100
cm/h).
Une fraction contenant du FVII de très haute pureté a été éluée à 4,5 ml/min
(soit 50 cm/h) en tampon de Tris 0,05 M, de chlorure de sodium 0,05 M et de
chlorure
de calcium 0,005 M, pH 7,5.
Environ 23 000 UI de FVII ont été purifiées, soit 12 mg de FVII.
Cette étape permet d'éliminer plus de 95% des protéines accompagnantes
(protéines du lait de lapine).
Cet éluat, de pureté supérieure à 90%, présente des caractéristiques
structurales et fonctionnelles proches de celle du FVII humain natif. Il a été
concentré
et formulé par le troisième passage en chromatographie d'échanges d'ions.
3.3 Etape Q-Sepharose FF 3 - élution Sodium
Une colonne de 2,5 cm de diamètre (4,9 cm2 de section) a été remplie de 10 ml
de gel Q-Sepharose FF (GE Healthcare).
Le gel a été équilibré en tampon Tris 0,05 M, pH 7,5.
La fraction éluée purifiée de l'étape précédente a été diluée cinq fois avec
de
l'eau purifiée pour injection (PPI) avant injection sur le gel (débit 4,5
ml/min, soit débit
linéaire de 50 cm/h).
Le FVII a été ensuite élué à un débit de 3 ml/min (soit 36 cm/h) par le tampon
de Tris 0,02 M et de chlorure de sodium 0,28 M, pH 7,0.
Une composition de FVII sous forme de concentré a été préparée dont la pureté
est supérieure à 95%. Le produit est compatible avec une injection par voie
intraveineuse. Le procédé a un rendement cumulé de 22%, ce qui permet de
purifier
au moins 20 mg de FVII par litre de lait mis en ceuvre.
Les FVII peuvent ensuite être soumis à différentes analyses structurales,
telles
que développées dans les exemples qui suivent.
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Exemple 3 : identification des clivages atypiques du FVII par MALDI-TOFMS
La spectrométrie de masse MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser
Desorption/lonisation Time of Flight Mass Spectrometry) est une technique
permettant
de mesurer la masse moléculaire des molécules avec une grande précision.
Les protéines à analyser ont été mélangés à une matrice qui absorbe à la
longueur d'onde du laser utilisé. Les principales matrices sont l'acide ^-
cyano-4-
hydroxycinnamique (HCCA) pour l'analyse des peptides, l'acide sinapinique (SA)
pour
les protéines et l'acide 2,5-dihydroxybenzoTque (DHB) pour les
oligosaccharides.
La méthode consiste à irradier les co-cristaux matrice/analyte à l'aide d'un
laser,
ceci entraînant la désorption conjointe des molécules de matrice et d'analyte.
Après
ionisation en phase gazeuse, les molécules d'analyte atteignent un détecteur
de temps
de vol. Masse et temps de vol étant directement liés, la mesure de ce dernier
permet la
détermination de la masse de l'analyte. L'identification de chaque protéine ou
peptide
peut être réalisée par mesure de sa masse observée en spectrométrie de masse,
par
comparaison avec la masse théorique déduite de la séquence du FVII.
L'instrument
utilisé est un Bruker Autoflex Il fonctionnant dans les modes TOF et TOF/TOF.
Le spectre MALDI-TOF du FVII montre une forme à 14.7 kDa (figure 1,
polypeptide IV) qui correspond au peptide [GIy291-Pro4o6] C-terminal de la
chaîne lourde
contenant l'Asn322 glycosylée majoritairement par un oligosaccharide de type
bianténné
monosialylé (A1) et d'autres glycannes (Al F, A2, ...). On observe également
sur le
spectre la présence de la forme complémentaire (figure 1, polypeptide IV), N
terminale
du FVII, à 34.6 kDa se terminant par l'arginine 290. Un autre clivage atypique
est
également présente à 44.8 kDa (figure 1, polypeptide II) qui correspond à la
coupure de
la chaîne légère après la lysine 38, c'est-à-dire à une forme de FVII amputée
du
domaine Gla et donc dont l'affinité pour le facteur tissulaire est diminuée.
En conditions réductrices (figure 2) on note la présence des chaînes lourde et
légère du FVIIa à 29.9 et 19.3 kDa (polypeptide I), respectivement. Une autre
forme est
observée à 11.9 kDa correspondant au peptide [LyS316- Pro406] contenant
l'Asn322
glycosylée. A l'état natif, ce peptide est lié à la partie N-terminale de la
protéine par un
pont disulfure (Cys31o-Cys329).
Tous les échantillons de FVII analysés présentent une ou plusieurs de ces
formes tronquées. L'ensemble des formes identifiées résultent de coupures de
type
"sérine protéase". Ces différents clivages peuvent donc être d'origine
autocatalytique.
Exemple 4 : Quantification des clivages atypiques par séquençage d'Edman
Le séquençage N-terminal du FVII a été réalisé sur microséquenceur (Procise
491 HT ; Applied Biosystem) selon le principe de la dégradation chimique
d'Edman qui
consiste en trois étapes : couplage - clivage et conversion puis séparation
des acides
aminés générés sur colonne en phase inverse. Les acides aminés N-terminaux
ainsi
générés sont ensuite analysés et identifiés par l'intermédiaire d'acides
aminés
CA 02691110 2009-12-15
WO 2008/155509 PCT/FR2008/051055
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standards et comparés à la séquence théorique de la protéine étudiée.
L'exploitation
des résultats a été effectuée après acquisition des données et analyse par
comparaison
avec un chromatogramme d'acides aminés standards (SequencePro Applied
Biosystems). La séquence de FVII analysée a été comparée à la séquence
théorique
en acides aminés.
2 séquences majoritaires ont été identifiées systématiquement :
- séquence N terminale LC : ANAFLEELRPGSLERECKEEQCSF (SEQ ID N 3)
- séquence N terminale HC : IVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCG (SEQ ID
N 4)
3 autres séquences, présentes selon les produits, ont été identifiées
- séquence LC : LFWISYSDGDQ (SEQ ID N 5) (clivage atypique après la lysine
38).
- séquence HC : GATALELMVLNVPRLMTQ (SEQ ID N 6) (clivage atypique après
l'arginine 290).
- séquence HC : KVGDSPMTEYMFCAGYSDGS (SEQ ID N 7) (clivage atypique
après l'arginine 315).
Les acides aminés représentés en gras et italique indiquent des trous de
séquence, c'est à dire des acides aminés non identifiés en séquençage d'Edman
du fait
de la présence de modifications post-traductionnelles telles que les ^-
carboxylation, N-
ou 0-glycosylation. Une évaluation quantitative a été réalisée afin d'estimer
la
proportion des différentes coupures atypiques en fonction des FVII. Les
résultats sont
présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1. Pourcentages des différentes coupures atypiques comparativement à
la
totalité du produit, en fonction des origines du FVII. FVII-pd : FVII humain
plasmatique
FVII-Tg : FVII humain non muté transgénique ; FVII-rec : FVII humain
recombinant
commercial (non muté
FVII-Tg lot A FVII-Tg lot B
Séquence FVII-pd (%) ~ ~ FVII-rec (%)
K316VGDSP... 27 17 52 9
G291ATALEL
8.5 8 13 4
L39FWISYS... 12 26 8 4.5
La chaîne légère du FVII présente un taux de clivage atypique entre les acides
aminés K38 et L39 variant entre 4,5 et 26% suivant l'origine du produit. La
chaîne
lourde du FVII présente une coupure atypique entre R315 et K316 (variant entre
9 et
52% suivant l'origine du produit) et est également clivée entre R290 et G291
(variant
entre 4 et 13% suivant l'origine du produit) .
